專利名稱：具有提高的活性的組合基序免疫刺激寡肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫刺激核苷酸，及其組合物，以及使用該免疫刺激核苷酸的方法。
背景技術(shù)：
已知兩類主要的免疫刺激序列，它們具有不同的免疫刺激活性機制。Krieg AM(2001)Trends Microbiol 9249-52.其中包括所謂的B類CpG寡核苷酸(ODN)，它們是B細胞的強激活劑，以及A類CpG ODN，它們是天然殺傷(NK)細胞的強激活劑。除了這些免疫刺激序列以外，還有至少兩類中和序列，包括其CG之前有一個C或者之后有一個G的CpG序列(Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 9512631-12636)，以及其中CG被甲基化的DNA序列。中和基序是指當存在其它非刺激性基序的時候具有某種程度的免疫刺激能力，但是當存在其它免疫刺激基序時又降低其它基序的免疫刺激能力的基序。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一類新的免疫刺激核酸。在某些實例中這些核酸有一個富含CG的回文結(jié)構(gòu)或者富含CG的中和基序。申請人已經(jīng)描述過包含中和基序的寡核苷酸(ODN)，該中和基序由CG重復(fù)序列例如CGCGCG或一個前面有一個C(即CCG)和/或后面有一個G(即CGG，CCGG)的CG二核苷酸構(gòu)成。這些中和基序被認為可以減弱含有CpG的ODN對多重識別的刺激效果，例如IL-6，IL-12，IFN-γ，TNΦ-α的分泌以及抗原特異性免疫反應(yīng)的誘導。Krieg AM et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA9512631-6。
本發(fā)明部分基于申請人發(fā)現(xiàn)了包含刺激基序和中和基序的組合的特定ODN具有高的免疫刺激性。本發(fā)明還部分基于申請人發(fā)現(xiàn)了具有特定的富含CG的回文序列的ODN具有高的免疫刺激性，其中所述回文序列包括含有中和基序的回文序列。因此具有高免疫刺激性的回文序列可能但不必需含有中和基序。
而且，本發(fā)明的免疫刺激ODN的免疫刺激效果與兩類不同的CpG ODN都相關(guān)，其中一類激活B細胞(B類CpG ODN)，另一類激活NK細胞，并誘導干擾素(IFN)-α產(chǎn)生(A類CpGODN)。本發(fā)明的新的免疫刺激ODN還具有與A類CpG ODN或B類CpG ODN都不同的廣譜免疫刺激效果。本發(fā)明的新的免疫刺激ODN被稱作C類CpG ODN。更詳細的描述如下，在特定的實施方案中，本發(fā)明的ODN包括基序組合，其中一個基序是富含CG的回文結(jié)構(gòu)或是中和基序，另一個基序是刺激基序，例如CpG基序或TCGTCG序列。
本發(fā)明提供了一種14-100個核苷酸長的免疫刺激核酸。該核酸具有下列通式5’X1DCGHX23’。X1和X2獨立地是任意0-10個核苷酸長的序列。D是非C的核苷酸。C是胞嘧啶。G是鳥嘌呤。H是非G的核苷酸。該核酸序列還包括選自P和N的核酸序列，所述P和N緊鄰X1的5’端或緊鄰X2的3’端。N是一種起始為CGG三核苷酸并且至少有10個核苷酸長的B細胞中和序列。P是一種包含至少10個核苷酸長的序列的富含GC的回文結(jié)構(gòu)。
在某些實施方案中，該免疫刺激核酸是5’NX1DCGHX23’，5’X1DCGHX2N 3’，5’PX1DCGHX23’，5’X1DCGHX2P 3’，5’X1DCGHX2PX33’，5’X1DCGHPX33’，5’DCGHX2PX33’，5’TCGHX2PX33’，或5’DCGHPX33’。X3是任意0-10個核苷酸長的序列。在其它一些實施方案中，該免疫刺激核酸是5’DCGHP 3’。
可選擇地，D和/或H是胸腺嘧啶(T)。
在其它一些實施方案中H是T，X2是CG，CGT，CGTT，CGTTT，或CGTTTT。
在其它一些實施方案中H是T，X2是CG或CGTTTT在其它一些實施方案中C未被甲基化。
在某些實施方案中N包括至少4個CG二核苷酸和不超過2個CCG三核苷酸。
可選擇地，P包括至少一個次黃嘌呤。
該核酸還包括在5’末端或3’末端的poly-T序列。
本發(fā)明還提供了具有13-100個核苷酸的免疫刺激核酸。該核酸通式為5’N1PyGN2P 3’。G是鳥嘌呤。
N1是任意1-6個核苷酸長的序列。在某些實施方案中，N1至少50％是嘧啶，優(yōu)選至少50％是T。在其它一些實施方案中，N1包括至少一個CG基序，至少一個TCG基序，至少一個CI基序，至少一個TCI基序，至少一個IG基序，或者至少一個TIG基序。在其它一些實施方案中N1是TCGG或TCGH。H是非G的核苷酸。
Py是嘧啶。在某些實施方案中Py是未甲基化的C。
N2是任意0-30個核苷酸長的序列。在某些實施方案中N2至少50％是嘧啶或至少50％是T。在其它一些實施方案中N2不包括任何polyG或polyA基序。
P是富含GC的回文結(jié)構(gòu)，包含至少10個核苷酸長的序列。在某些實施方案中，P完全是回文結(jié)構(gòu)。在其它一些實施方案中，P是有1到3個連續(xù)插入核苷酸的回文結(jié)構(gòu)?？蛇x擇地，該插入核苷酸可以是TG。在其它一些實施方案中P包括至少3，4或5個C，至少3，4或5個G。在其它一些實施方案中P包括至少一個次黃嘌呤。
在一個實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)的堿基組成中至少有2/3是G和C。在另一個實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)的堿基組成中至少有81％是G和C。在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)有至少12個核苷酸。富含GC的回文結(jié)構(gòu)可以完全由C和G組成。在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)包括至少一個非C也非G的核苷酸。
在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)包括至少一個CGG三聚體，至少一個CCG三聚體，或者至少一個CGCG四聚體。在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)包含至少四個CG二核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)有一個中心CG二核苷酸。
在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)是CGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO23)，CGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO28)，CGACGATCGTCG(SEQ ID NO68)或者CGACGTACGTCG(SEQID NO69)。
在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)不是CGCGCGCGCGCG(SEQ ID NO29)，GCGCGCGCGCGC(SEQ ID NO30)，CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO31)，GGGGGGCCCCCC(SEQID NO32)，CCCCCGGGGG(SEQ ID NO33)或GGGGGCCCCC(SEQ ID NO34)。
在一些實施方案中N1PyGN2是選自下組的序列TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT和TCGTCGT。
本發(fā)明還提供了13-100個核苷酸長的免疫刺激核酸。所述核酸具有下列通式5’N1PyG/IN2P 3’。G/I指單個核苷酸，其是G或I。G是鳥嘌呤，I是次黃嘌呤。
N1是任意1-6個核苷酸長的核酸。Py是嘧啶。N2是任意0-30個核苷酸長的核酸。
P是包含至少10個核苷酸長的序列的回文結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，P是富含GC的回文結(jié)構(gòu)。在另一些實施方案中，P是富含IC的回文結(jié)構(gòu)。
在某些實施方案中N1PyIN2是TCITCITTTT(SEQ ID NO47).
所述的核酸分子可以具有任何類型的骨架組合物。在一些實施方案中該免疫刺激核酸具有完全抗核酸酶的骨架。所述抗核酸酶骨架可以由硫代磷酸酯鍵組成。在其它一些實施方案中該免疫刺激核酸具有一個完全是磷酸二酯的骨架。在另一些實施方案中，該免疫刺激核酸具有嵌合骨架。在一個實施方案中，所述免疫刺激核酸在CG，CI或IG基序之間至少有一個磷酸二酯鍵。除此之外，本發(fā)明的ODN可以制成微粒，乳劑，或其它能夠避免在體內(nèi)被快速分解的制劑。
所述免疫刺激核酸具有不同的長度。在一些實施方案中，所述免疫刺激核酸是13-100，13-40，13-30，14-100，14-40，或者14-30或者是在其之間的任意整數(shù)個核苷酸長。
本發(fā)明還包括具有下述序列的免疫刺激核酸TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO1)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO4)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(SEQ ID NO5)，TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(SEQ ID NO6)，TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(SEQ ID NO7)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(SEQ ID NO12)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO13)，TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(SEQ ID NO14)，其中Z是5-甲基月包嘧啶，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(SEQ ID NO19)，TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(SEQ ID NO11)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(ODN 2136，SEQ ID NO19)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513，SEQ ID NO64)，TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514，SEQ ID NO65)，TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515，SEQ ID NO66)，和TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516，SEQ ID NO67)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫刺激核酸具有下述序列TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(ODN 2395)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 2429)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(ODN 2430)，TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(ODN 2431)，TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(ODN 2432)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(ODN 2452)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(ODN 5315)，
TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(ODN 5327，其中Z是5-甲基胞嘧啶)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(ODN 2136)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513)，TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514)，TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(ODN 2395)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 2429)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(ODN 2430)，TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(ODN 2431)，TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(ODN 2432)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(ODN 2452)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(ODN 5315)，TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(ODN 5327，其中Z是5-甲基胞嘧啶)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(ODN 2136)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513)，TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514)，TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516)，TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451)，TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20173，SEQ ID NO71)，TCGTCGTTTCGACGATCGTCG(ODN 20176，SEQ ID NO72)，TCGTCGTTTCGACGTACGTCG(ODN 20177，SEQ ID NO73)，TCGTCGCGACGGCCGTCG(ODN 20178，SEQ ID NO74)，TCGTCGCGACGATCGTCG(ODN 20179，SEQ ID NO75)，TCGTCGCGACGTACGTCG(ODN 20180，SEQ ID NO76)，TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20184，SEQ ID NO77)，TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG(ODN 20185，SEQ ID NO78)，和TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG(ODN 20186，SEQ ID NO79)。
在一些實施方案中，所述免疫刺激核酸包括序列TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451，SEQ ID NO11)。在一些特定的實施方案中所述免疫刺激核酸是TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451)。
本發(fā)明還包括含有所述免疫刺激核酸和藥學可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明還包括誘導1型干擾素(IFN)表達的方法。所述方法包括使能表達1型IFN的細胞與有效量的免疫刺激核酸接觸以誘導1型IFN的表達。
本發(fā)明還包括激活天然殺傷(NK)細胞的方法。所述方法包括使NK細胞與有效量的免疫刺激核酸接觸以激活NK細胞。
本發(fā)明還包括通過給已感染或有感染危險的患者施用有效量的所述免疫刺激核酸以治療或預(yù)防感染的方法。在一些實施方案中，所述的感染是病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染。
在一些實施方案中，所述方法包括單獨施用本發(fā)明的免疫刺激核酸以治療或預(yù)防感染。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步還包括給患者施用抗生素，所述抗生素可以是抗細菌劑，抗病毒劑，抗真菌劑或抗寄生蟲劑。
本發(fā)明還包括通過給已發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或有發(fā)生變態(tài)反應(yīng)危險的患者施用有效量的所述免疫刺激核酸以治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)的方法。在一些實施方案中，所述變態(tài)反應(yīng)是變應(yīng)性哮喘。在一個實施方案中，所述變態(tài)反應(yīng)是哮喘。在一些實施方案中所述方法包括單獨施用本發(fā)明的免疫刺激核酸以治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。本發(fā)明的方法進一步還包括給患者施用哮喘/變態(tài)反應(yīng)藥物，例如甾族化合物，抗組胺劑，和前列腺素誘導劑。
本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法。所述方法包括通過給已患癌癥或有患癌癥危險的患者施用有效量的所述免疫刺激核酸以治療或預(yù)防癌癥的方法。在一些實施方案中，所述癌癥選自基底細胞癌，膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦癌和CNS癌；乳腺癌；宮頸癌；惡性合體細胞瘤；結(jié)腸癌和直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌癥；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；眼癌；頭部和頸部癌癥；胃癌；內(nèi)皮腫瘤；腎癌；喉癌；白血??；肝癌；肺癌(如小細胞肺癌和非小細胞肺癌)；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神經(jīng)細胞瘤；口腔癌(如嘴唇，舌，口和咽)；卵巢癌；胰癌；前列腺癌；成視網(wǎng)膜細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；腎癌；呼吸系統(tǒng)癌癥；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌癥，以及其它癌擴散和肉瘤。
在一些實施方案中，所述方法包括單獨施用本發(fā)明的免疫刺激核酸以治療或預(yù)防癌癥。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步還包括給患者施用抗癌藥物或治療，例如使用化療劑和放射療法。
本發(fā)明的每一個限定都包含不同的實施方案。也就是說本發(fā)明包含任一個元素或其組合限定的方案。
附圖描述下述附圖僅用于對發(fā)明目的進行解釋說明，而并非理解和實施本發(fā)明所必需的。


圖1是人PBMC單獨培養(yǎng)，用IL-2或者加入指定量的指定ODN培養(yǎng)24小時以后誘導的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖2是人PBMC單獨培養(yǎng)，用IL-2或者加入指定量的指定ODN培養(yǎng)24小時以后誘導的MCP-1(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖3是人PBMC單獨培養(yǎng)，用IL-2或者加入指定量的指定ODN培養(yǎng)24小時以后誘導的IP-10(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖4人PBMC是單獨培養(yǎng)(N/A)或者加入指定量的指定ODN培養(yǎng)48小時以后誘導的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖5是單獨培養(yǎng)(N/A)或加入0.25μg/ml(A)或1.0μg/ml(B)的指定ODN培養(yǎng)48小時后B細胞表面染色顯示的CD86(MFI)的柱狀圖。
圖6是單獨培養(yǎng)(N/A)或加入0.25μg/ml(A)或1.0μg/ml(B)的指定ODN培養(yǎng)的72小時B細胞增殖檢測(cpm 3H-胸腺嘧啶標記)結(jié)果的柱狀圖。
圖7是人PBMC單獨培養(yǎng)(N/A)或加入0.25μg/ml(A)或1.0μg/ml(B)的指定ODN培養(yǎng)誘導產(chǎn)生的IL-10(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖8是來自兩個供體的PBMC(D127，實心柱，D124，空心柱)單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(1或6μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后誘導產(chǎn)生的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖9是人PBMC單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(0.4，1.0或10.0μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后以CD86陽性細胞百分比表征的B細胞激活的柱狀圖。
圖10是來自兩個供體的PBMC(D141，空心柱，D142，實心柱)單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(1或6μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后誘導產(chǎn)生的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖11是來自兩個供體的PBMC(D141，空心柱，D142，實心柱)單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(1或6μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后分泌產(chǎn)生的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖12是來自兩個供體的PBMC(D141，陰影柱，D142，空心柱)單獨培養(yǎng)(w/o)或加入6μg/ml的指定ODN培養(yǎng)24小時后分泌產(chǎn)生的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖13是PBMC單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(1，3或10μg/ml，分別在A，B，C中表示)的指定ODN培養(yǎng)24小時后分泌產(chǎn)生的IFN-γ(pg/ml)的量的三個柱狀圖。
圖14是單獨培養(yǎng)(NA)或加入指定ODN培養(yǎng)48小時后CD3+細胞染色陽性百分率表征的IFN-γ的柱狀圖。
圖15是單獨培養(yǎng)(NA)或加入指定ODN培養(yǎng)48小時后T細胞IFN-γ染色的平均熒光密度(MFI)的柱狀圖。
圖16是人PBMC單獨培養(yǎng)(N/A)或加入1.0μg/ml的指定ODN培養(yǎng)24小時后分泌產(chǎn)生的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖17是人PBMC單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(1或6μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后分泌產(chǎn)生的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。A是兩個供體組合的PBMC的結(jié)果。B是分別來自兩個供體(D141和D142)的PBMC的結(jié)果。
圖18是單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(0.4或1.0μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后CD86陽性的B細胞百分數(shù)的柱狀圖。
圖19是人PBMC單獨培養(yǎng)(w/o)，用LPS或用指定濃度(0.2到1.0μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)6個小時(A)，24個小時(B)，或48個小時(C)以后的培養(yǎng)上清液中的IFN-γ(pg/ml)濃度的柱狀圖。
圖20是兩元混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)產(chǎn)生的IFN-γ(pg/ml)量的柱狀圖，其中來自兩個供體的淋巴細胞單獨培養(yǎng)(w/o)或加入6μg/ml的指定ODN培養(yǎng)24小時后混合。
圖21是人PBMC單獨培養(yǎng)(w/o)，用LPS或用指定濃度(0.2到1.0μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)6個小時(A)，24個小時(B)，或48個小時(C)以后的培養(yǎng)上清液中的IL-10(pg/ml)濃度的柱狀圖。
圖22是PBMC單獨培養(yǎng)(n/a)，或加入0.6μg/ml(空心柱)或3.0μg/ml(實心柱)的對照(IL-2，ODN 1585(GGGGTCAACGTTGAGGGGGG，SEQ ID NO35)和ODN 2118(GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG，SEQ ID NO36))或不同指定ODN培養(yǎng)24小時后上清液中的IP-10(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖23是PBMC單獨培養(yǎng)(n/a)，或加入0.6μg/ml(A)或3.0μg/ml(B)的對照(IL-2，ODN 1585和ODN 2118)或不同指定ODN培養(yǎng)24小時后上清液中的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖24是PBMC單獨培養(yǎng)(n/a)，或加入0.6μg/ml(空心柱)或3.0μg/ml(填充柱)的對照(IL-2，ODN 1585和ODN 2118)或不同指定ODN培養(yǎng)24小時后上清液中的IFN-γ(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖25是PBMC單獨培養(yǎng)(n/a)，或加入0.6μg/ml(空心柱)或3.0μg/ml(填充柱)的對照(IL-2，ODN 1585和ODN 2118)或不同指定ODN培養(yǎng)24小時后上清液中的IL-6(pg/ml)的量的柱狀圖。
圖26是PBMC單獨培養(yǎng)(w/o)或加入指定濃度(3.0或6.0μg/ml)的指定ODN培養(yǎng)24小時后分泌的IFN-α(pg/ml)的量的柱狀圖。
發(fā)明詳述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)特定的包含至少兩個不同基序的寡核苷酸(ODN)具有獨特的對免疫系統(tǒng)細胞的刺激作用。其中一些ODN同時具有一個傳統(tǒng)的“刺激”CpG序列和一個“富含GC的”或“B細胞中和”基序。這些組合基序核酸具有免疫刺激效果，其效果在兩種免疫刺激核酸相關(guān)的效果之間，其中一種免疫刺激核酸是能強烈誘導B細胞激活和樹突細胞(DC)激活的傳統(tǒng)的“B類”CpG ODN，另一種是較晚發(fā)現(xiàn)的能強烈誘導IFN-和天然殺傷(NK)細胞的激活，但是誘導B細胞和DC激活的能力較弱的一類免疫刺激核酸(“A類”CpG ODN)。Krieg AM et al.(1995)Nature 374546-9；Ballas ZK et al.(1996)J Immunol 1571840-5；Yamamoto S et al.(1 992)J Immunol 1484072-6.優(yōu)選的B類CpGODN通常具有硫代磷酸酯骨架，優(yōu)選的A類CpG ODN通常具有混合或嵌合骨架，新的這類組合基序免疫刺激核酸可以具有任何一種穩(wěn)定的骨架，如硫代磷酸酯，嵌合，或磷酸二酯骨架。
本發(fā)明提供了屬于這類新的組合基序免疫刺激核酸的免疫刺激核酸。B細胞刺激域由下述通式表示5’X1DCGHX23’。D是非C的核苷酸，C是胞嘧啶。G是鳥嘌呤。H是非G的核苷酸。
X1和X2是任意0-10個核苷酸長的核酸。X1可以包括一個CG，其中優(yōu)選CG前緊鄰著一個T。在一些實施方案中DCG是TCG。X1優(yōu)選是0-6個核苷酸長的核酸。在一些實施方案中，X2不包含任何polyG或polyA基序。在其它一些實施方案中，該免疫刺激核酸的5’端或3’端具有polyT序列。這里所說的“polyA”或“polyT”分別指四個或更多個連續(xù)的A或T，如5’AAAA 3’或5’TTTT 3’。
這里所說的“polyG端”指四個或更多個連續(xù)的G，如5’GGGG 3’，一般位于核酸的5’端或3’端。這里所說的“polyG核酸”指具有結(jié)構(gòu)式5’X1X2GGGX3X43’的核酸，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸，優(yōu)選X3和X4中至少有一個是G。
根據(jù)此結(jié)構(gòu)式，B細胞刺激域的一些優(yōu)選方案包括TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT，TCGTCGT。
該核酸的第二個基序是P或N，并且緊鄰X1的5’端或X2的3’端。
N是B細胞中和序列，起始是CGG三核苷酸，并且至少有10個核苷酸長。B細胞中和基序包括至少一個CpG序列，其中CG之前有一個C或者之后有一個G(Krieg AM et al.(1998)ProcNatl Acad Sci USA 9512631-12636)或者CG包含其中CG的C被甲基化的DNA序列。這里所說的“CpG”指5’胞嘧啶(C)后面有一個3’鳥嘌呤(G)，并且二者以磷酸鍵相連。至少5’CG 3’中的C是未被甲基化的。中和基序是指當存在其它非刺激性基序的時候具有某種程度的免疫刺激能力，但是當存在其它免疫刺激基序時又降低其它基序的免疫刺激能力的基序。
P是富含GC的回文結(jié)構(gòu)，其包含至少10個核苷酸長的序列。這里所說的“回文結(jié)構(gòu)”等同于“回文序列”，是指一種反向重復(fù)序列，即一種類似ABCDEE’D’C’B’A’的序列，其中A和A’，B和B’等都是能夠形成通常的Watson-Crick堿基對的堿基。
這里所說的“富含GC的回文結(jié)構(gòu)”指堿基組成中至少有2/3是G和C的回文結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中富含GC的結(jié)構(gòu)域優(yōu)選在“B細胞刺激域”的3’端。在一個10堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)中，該回文結(jié)構(gòu)至少含有8個G和C。在一個12堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)中，該回文結(jié)構(gòu)也至少含有8個G和C。在一個14堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)中，該回文結(jié)構(gòu)至少有10個堿基是G和C。在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)完全由G和C組成。
在一些實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)的堿基組成中至少有81％的G和C。在這樣一個10堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)中，該回文結(jié)構(gòu)完全由G和C組成。在這樣一個12堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)中，優(yōu)選至少有10個堿基(83％)是G和C。在一些優(yōu)選的實施方案中，一個12堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)完全由G和C組成。在一個14堿基的富含GC的回文結(jié)構(gòu)中，至少有12個堿基(86％)是G和C。在一些優(yōu)選的實施方案中，14堿基長的富含GC的回文結(jié)構(gòu)完全由G和C組成。富含GC的回文結(jié)構(gòu)中的C可以是未甲基化的也可以是甲基化的。
通常這個結(jié)構(gòu)域有至少3個C和G，更優(yōu)選的是兩者都有4個，最優(yōu)選的是兩者都有5個或更多。此結(jié)構(gòu)域中C和G的數(shù)目不必相同。優(yōu)選C和G的分布使得它們能夠形成自互補的雙鏈，或者回文結(jié)構(gòu)，例如CCGCGCGG。這種結(jié)構(gòu)可以通過插入A或T而被破壞，但是優(yōu)選至少保持部分自互補結(jié)構(gòu)，例如基序CGACGTTCGTCG(SEQ ID NO80)或CGGCGCCGTGCCG(SEQID NO8)。當不能保持互補的時候，優(yōu)選非互補堿基是TG。在一個優(yōu)選的實施方案中，不包括在回文結(jié)構(gòu)中的不超過3個連續(xù)堿基，優(yōu)選不超過2個，最優(yōu)選只有1個。在一些實施方案中富含GC的回文結(jié)構(gòu)包含至少一個CGG三聚體，至少一個CCG三聚體，或者至少一個CGCG四聚體。在另一個實施方案中，富含GC的回文結(jié)構(gòu)不是CCCCCCGGGGGG(SEQ ID NO31)或GGGGGGCCCCCC(SEQ ID NO32)，CCCCCGGGGG(SEQ IDNO33)或GGGGGCCCCC(SEQ ID NO34)。
富含GC的區(qū)域中至少有一個G可以被次黃嘌呤(I)取代。在一些實施方案中，P包括不止一個I。
在特定的實施方案中，所述免疫刺激核酸具有下述通式5’NX1DCGHX23’，5’X1DCGHX2N 3’，5’PX1DCGHX23’，5’X1DCGHX2P 3’，5’X1DCGHX2PX33’，5’X1DCGHPX33’，5’DCGHX2PX33’，5’TCGHX2PX33’，5’DCGHPX33’，或者5’DCGHP 3’。
本發(fā)明的免疫刺激核酸還可以由下述通式表示5’N1PyGN2P3’。N1是任意1到6個核苷酸長的序列。Py是嘧啶。G是鳥嘌呤。N2是任意0到30個核苷酸長的序列。P是富含GC的回文結(jié)構(gòu)，包含至少10個核苷酸長的序列。
N1和N2可以包含多于50％的嘧啶，更優(yōu)選包含多于50％的T。N1可以包含一個CG，其中優(yōu)選T在CG之前并緊鄰CG。在一些實施方案中N1PyG是TCG(例如ODN 5376，其中5’端是TCGG)，更優(yōu)選是TCGN2，其中N2不是G。
N1PyGN2P可以包含一個或多個次黃嘌呤(I)核苷酸。N1中的C或G可以被次黃嘌呤替換，但是相對于IpG來說更優(yōu)選CpI。被次黃嘌呤替換后，例如IpG，可以用“半柔性”或嵌合骨架使之達到其最大活性，其中IG或CI之間通過磷酸二酯連接。N1可以包括至少一個CI，TCI，IG或TIG基序。
在特定的實施方案中，N1PyGN2是選自下組的序列TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT和TCGTCGT。
本發(fā)明的免疫刺激核酸還可以由下述通式表示5’N1PyG/IN2P 3’。N1是任意1到6個核苷酸長的序列。Py是嘧啶，G/I是單個核苷酸，可以是G或I。G是鳥嘌呤，I是次黃嘌呤。N2是任意0到30個核苷酸長的序列。P是富含GC或IC的回文結(jié)構(gòu)，包含至少10個核苷酸長的序列。在一些實施方案中，N1PyIN2是TCITCITTTT(SEQ ID NO47)。
具有上述通式的組合基序免疫刺激核酸的一些非限制性的實例的結(jié)構(gòu)式如下TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(ODN2395)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 2429)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(ODN 2430)，TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(ODN 2431)，TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(ODN 2432)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(ODN 2452)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(ODN 5315)，TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(ODN 5327，其中Z是5-甲基月包嘧啶)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(ODN 2136)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGACG(ODN 5513)，TCGTCGTTTTCGTCGGCCGCCG(ODN 5514)，TCGTCGTTTTCGACGGCCGCCG(ODN 5515)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGTCG(ODN 5516)，TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(ODN 2451)，TCGTCGTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20173)，TCGTCGTTTCGACGATCGTCG(ODN 20176)，TCGTCGTTTCGACGTACGTCG(ODN 20177)，
TCGTCGCGACGGCCGTCG(ODN 20178)，TCGTCGCGACGATCGTCG(ODN 20179)，TCGTCGCGACGTACGTCG(ODN 20180)，TCGTTTTTTTCGACGGCCGTCG(ODN 20184)，TCGTTTTTTTCGACGATCGTCG(ODN 20185)，和TCGTTTTTTTCGACGTACGTCG(ODN 20186)，TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 5569，SEQ ID NO63)，和TCITCITTTTCGGCGGCCGCCG(ODN 5570，SEQ ID NO70)。
這里所說的“核酸”等同于“寡核苷酸”，都表示與磷酸基團和可互換的有機堿相連的多核苷酸(即由一個糖(如核糖和脫氧核糖)與一個磷酸基團和一個可替換的有機堿相連組成的分子，其中有機堿是取代的嘧啶(如胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)，或者尿嘧啶(U))或者取代的嘌呤(如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)))。該術(shù)語不但表示寡核糖核酸，也表示寡脫氧核糖核酸(ODN)。此術(shù)語還包括多核苷(即多核苷酸去掉磷酸)以及任何其它包含聚合物的有機堿。核酸分子可以從現(xiàn)有的核酸來源獲得(例如基因組或cDNA)，但優(yōu)選通過合成(例如通過核酸合成)獲得。
術(shù)語核酸和寡核苷酸也包括那些有取代和修飾的核酸或者寡核苷酸，例如在堿基和/或糖上進行取代和修飾。例如，核酸的骨架糖在3’端與低分子量的非羥基的有機基團共價結(jié)合，在5’端與非磷酸基團的有機基團共價結(jié)合。修飾的核酸可以包含2’-O-烷基化核糖基團。除此之外，修飾的核酸還可以用阿拉伯糖替換核糖。因此核酸的骨架組分可以是異質(zhì)的，其中可以包含任何可能的彼此相連的聚合物單位的組合，例如肽-核酸(具有氨基酸骨架和核酸堿基)。在一些實施方案中，核酸的骨架組分是同質(zhì)的。核酸還可以包含取代的嘌呤和嘧啶，例如C-5丙炔取代的堿基。Wagner R W et al.(1996)Nat Biotechnol 14840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，2-氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，次黃嘌呤，以及其它天然和非天然的核酸堿基，取代或未取代的芳香族分子。其它類似修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
與天然RNA和DNA相比，本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸含有不同的化學修飾和取代，包括核苷間的磷酸二酯連接，β-D-核糖單位和/或天然核苷堿基(腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶)?；瘜W修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在Uhlmann E etal.(1990)Chem Rev 90543；“Protocols for Oligonucleotides andAnalogs”Synthesis and Properties & Synthesis and AnalyticalTechniques，S.Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993；Crooke ST et al.(1996)Annu Rev Pharmacol Toxicol 36107-129；和Hunziker J et al.(1995)Mod Synth Methods 7331-417.中也有描述。與具有同樣序列的由天然DNA和RNA組成的寡核苷酸相比，本發(fā)明的寡核苷酸可以有一個或多個修飾，每個修飾都在特定的核苷間的磷酸二酯連接和/或特定的β-Δ-核糖單位和/或特定的天然核苷堿基上。
例如，本發(fā)明的寡核苷酸可以包含一個或多個修飾，其中每個修飾都獨立地選自a)將糖磷酸骨架上的糖磷酸單位用其它單位取代，b)將β-Δ-核糖單位用修飾的糖單位取代，c)將天然核苷堿基用修飾的核苷堿基取代。
下面是具體的化學修飾的寡核苷酸的示例。
糖磷酸骨架上的糖磷酸單位(即β-Δ-核糖和核苷間的磷酸二酯連接一起形成的糖磷酸單位)(糖磷酸骨架由糖磷酸單位組成)可以被其它單位取代，其中所述的其它單位可以是適于構(gòu)建“嗎啉代衍生物”寡聚物(例如在Stirchak EP et al.(1989)NucleicAcids Res 176129-41所描述的)，也就是說，用嗎啉代衍生物單位取代；或者適于構(gòu)建聚酰胺核酸(“PNA”；如在Nielsen PE et al.(1994)Bioconjug Chem 53-7中所述的)，也就是說用PNA骨架單位取代，例如用2-氨基乙基甘氨酸取代。
β-核糖單位或β-D-2’-脫氧核糖單位可以用修飾的糖單位取代，其中修飾的糖單位選自β-D-核糖，α-D-2’-脫氧核糖，L-2’-脫氧核糖，2’-F-2’-脫氧核糖，2’-O-(C1-C6)烷基-核糖，優(yōu)選的2’-O-(C1-C6)烷基-核糖是2’-O-甲基核糖，2’-O-(C2-C6)烯基-核糖，2’-[O-(C1-C6)烷基]-O-(C1-C6)烷基]-核酸，2’-NH2-2’-脫氧核糖，β-D-木-呋喃糖，α-阿拉伯呋喃糖，2，4-二脫氧-β-D-赤-己-吡喃糖，和碳環(huán)(如Froehler J(1992)Am Chem Soc 1148320中所述)和/或開鏈糖類似物(如Vandendriessche et al.(1993)Tetrahedron497223)和/或兩環(huán)糖類似物(如Tarkov M et al.(1993)Helv ChimActa 76481中所述)。
天然核苷堿基可以被修飾的核苷堿基取代，其中修飾的核苷堿基選自次黃嘌呤，尿嘧啶，二氫尿嘧啶，假尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-氨基尿嘧啶，5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶，5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶，5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶，5-(羥甲基)尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶，5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶，5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-溴胞嘧啶，N2-二甲基鳥嘌呤，2，4-二氨基-嘌呤，8-氮雜嘌呤，取代的7-去氮雜嘌呤，優(yōu)選7-去氮雜-7-取代的和/或7-去氮雜-8取代的嘌呤或者其它天然核苷堿基的修飾。上述列舉只是舉例說明而并非限制本發(fā)明。
這里所說的“免疫刺激核酸”指核糖核酸或脫氧核糖核酸分子，其衍生物或類似物，它們能夠誘導免疫系統(tǒng)的細胞發(fā)揮作用。所述免疫系統(tǒng)細胞的作用包括細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，細胞表面標記的表達，抗體的分泌，增殖，或其它對抗原的應(yīng)答活性或者直接針對抗原或帶有抗原的膜結(jié)合的靶的活性。
本發(fā)明中所用的核酸可以用任何現(xiàn)有技術(shù)中熟知的方法合成，例如，β-氰乙基亞磷酰胺方法(Beaucage SL and Caruthers MH(1981)Tetrahedron Lett 221859)；和核苷H-膦酸鹽方法(Garegget al.(1986)Tetrahedron Lett 274051-4；Froehler et al.(1986)NuclAcid Res 145399-407；Garegg et al.(1986)Tetrahedron Lett274055-8；Gaffney et al.(1988)Tetrahedron Lett 292619-22)。這些化學方法可以通過市場上有的各種自動核酸合成儀實現(xiàn)。這些核酸稱為合成核酸。除此之外，本發(fā)明的核酸還可以用質(zhì)粒進行大規(guī)模生產(chǎn)，(見Sambrook T et al.，”Molecular CloningALaboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989)然后分成小量或整體使用。核酸可以用現(xiàn)有的核酸序列(例如基因組或cDNA)用已知的方法制備，例如用限制性內(nèi)切酶，核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶。用此方法制備的核酸是分離的核酸。分離的核酸一般是指與其天然狀態(tài)下相連的物質(zhì)分開的核酸。例如，分離的核酸可以是從細胞，從細胞核，從線粒體或從染色質(zhì)中分離出來的。本發(fā)明的組合基序核酸包括合成和分離的組合基序核酸。
要能在體內(nèi)使用，所述組合基序核酸可選擇地是相對抗降解的(即是穩(wěn)定的)?！胺€(wěn)定的核酸分子”指一個核酸分子在體內(nèi)相對地能抵抗降解(例如核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的降解)。核酸穩(wěn)定性可以通過磷酸骨架的修飾實現(xiàn)。優(yōu)選本發(fā)明的穩(wěn)定核酸具有修飾的骨架。已經(jīng)證明核酸骨架的修飾可以增強組合基序免疫刺激核酸體內(nèi)給藥時的活性。一些具有硫代磷酸酯鍵的組合基序免疫刺激核酸具有最大活性，并能保護核酸免受細胞內(nèi)的核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶的降解。其它一些修飾的核酸包括修飾的磷酸二酯核酸，磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的組合(即嵌合)，甲基膦酸鹽，甲基硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，p-乙氧基，及其組合。
修飾的骨架，例如硫代磷酸酯可以用亞磷酰胺或H-膦酸鹽方法的自動技術(shù)合成?？梢灾苽浞蓟⑺猁}和烷基膦酸鹽，例如如美國專利No.4469863中所述；烷基磷酸三酯(其中帶電的氧基團被烷基化，如美國專利No.5,023,243和歐洲專利No.092574中所述)可以利用商業(yè)可獲得的試劑用自動固相合成方法制備。其它DNA骨架修飾和取代的方法在現(xiàn)有技術(shù)中也有描述。UhlmannE and Peyman A(1990)Chem Rev 90544；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem 1165。
其它穩(wěn)定的核酸包括非離子DNA類似物，例如烷基膦酸鹽和芳基膦酸鹽(其中帶電的膦酸鹽中的氧被烷基或芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中帶電的氧基團被烷基化。核酸可以含有二醇，例如三水縮四乙二醇或三水縮六乙二醇，其末端均可以抵抗核酸酶的降解。
在其它一些實施方案中免疫刺激核酸可以具有磷酸二酯或嵌合，例如柔性或半柔性骨架。嵌合骨架包括磷酸二酯鍵和修飾的骨架連接的組合。嵌合寡核苷酸可以是柔性寡核苷酸或者半柔性寡核苷酸。
柔性寡核苷酸是指具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中磷酸二酯鍵或者核苷間的類磷酸二酯鍵只是在至少一個內(nèi)部嘧啶核苷-鳥嘌呤(YG)二核苷酸的內(nèi)部或其鄰位。所述至少一個內(nèi)部YG二核苷酸本身有一個磷酸二酯或核苷間的類磷酸二酯鍵。緊鄰著至少一個內(nèi)部YG二核苷酸的磷酸二酯鍵或核苷間的類磷酸二酯鍵可以是在所述至少一個內(nèi)部YG二核苷酸的5’，3’，或者5’和3’端。優(yōu)選緊鄰著至少一個內(nèi)部YG二核苷酸的磷酸二酯鍵或核苷間類磷酸二酯鍵本身就是內(nèi)部核苷間連接。因此對于N1YGN2序列，YG二核苷酸具有磷酸二酯鍵或核苷間的類磷酸二酯鍵，其中N1和N2分別彼此獨立地是任意的單個核苷酸，除此之外(a)當N1是內(nèi)部核苷酸時，N1和Y通過磷酸二酯鍵或核苷間的類磷酸二酯鍵連接，(b)當N2是內(nèi)部核苷酸時，G和N2通過磷酸二酯鍵或核苷間的類磷酸二酯鍵連接，或(c)當N1是內(nèi)部核苷酸時，N1和Y通過磷酸二酯鍵或核苷間的類磷酸二酯鍵連接，當N2是內(nèi)部核苷酸時，G和N2通過磷酸二酯鍵或核苷間的類磷酸二酯鍵連接。
半柔性寡核苷酸是指具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中磷酸二酯鍵或者核苷間的類磷酸二酯鍵只是在至少一個內(nèi)部嘧啶核苷-鳥嘌呤(YG)二核苷酸內(nèi)。半柔性寡核苷酸比具有完全穩(wěn)定骨架的免疫刺激寡核苷酸具有更多的優(yōu)點。例如，半柔性寡核苷酸比相應(yīng)的完全穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸的免疫刺激能力更強。
免疫刺激核酸可以用于誘導患者的免疫反應(yīng)，或者治療免疫相關(guān)疾病，例如傳染病，癌癥，和變應(yīng)性紊亂。這里所說的“患者”是指人或脊椎動物，脊椎動物包括但不限于狗，貓，馬，牛，豬，綿羊，山羊，雞，猴，兔，大鼠，小鼠等。
這里所用的術(shù)語“治療”是指能增強患者對疾病的抵抗力的預(yù)防性治療，或者，換句話說，是減少患者患病可能性或減緩疾病發(fā)展的治療，也指在患者已患病后進行抵抗疾病的治療，例如，減輕或完全消除疾病或者防止疾病惡化。例如，當治療傳染病時，該術(shù)語指能增強患者對于微生物的抵抗力，或者換句話說，降低患者感染微生物傳染疾病的可能性的治療，同樣也是指在患者已被感染以后進行抵抗該傳染病的治療，例如減輕或完全消除傳染病或者防止傳染病惡化。當治療癌癥的時候，該術(shù)語指防止或延緩癌癥的發(fā)展，減輕癌癥的癥狀，和/或抑制或減緩已發(fā)生的癌癥的發(fā)展。
因此，所述核酸可有效發(fā)揮預(yù)防性作用，誘導有被傳染性微生物感染危險的患者或者有患變應(yīng)性紊亂或癌癥危險的患者的免疫能力。這里所說的“有患病危險的患者”指那些有暴露在能引發(fā)感染的傳染病病原中的危險，暴露在變態(tài)反應(yīng)原中的危險或者發(fā)生癌癥的危險的患者。例如，有患病危險的患者可以是一個到某地區(qū)旅行的患者，所述地區(qū)有特定類型的傳染物或者變態(tài)反應(yīng)原，也可以是一個由于其生活方式或者醫(yī)療程序而和含有傳染性微生物的體液相接觸的患者，或者任何生活在具有傳染源或變態(tài)反應(yīng)原的地區(qū)并直接暴露在傳染物和變態(tài)反應(yīng)原中的患者。還可能是面臨細菌戰(zhàn)危險的患者，例如軍事人員或者生活在有恐怖襲擊的地方的人。有感染危險的患者還包括醫(yī)療機構(gòu)推薦接種特定傳染源抗體的一般人群。如果抗原是變態(tài)反應(yīng)原，患者對該抗原有變態(tài)反應(yīng)，并且患者暴露于該抗原中，例如在花粉傳播季節(jié)，那么該患者就處在暴露于該抗原的危險中。有患癌癥危險的患者包括那些具有遺傳性的易患病體質(zhì)的，或者曾經(jīng)接受過癌癥治療的，以及那些接觸致癌物質(zhì)，例如煙草，石棉，和其它化學毒素或者過量日照以及其它類型的輻射的。所述核酸還可有效用作治療劑，治療傳染病，癌癥和變應(yīng)性紊亂。
“已感染患者”是指暴露于傳染病原，并且體內(nèi)具有可檢出量的急性或慢性的感染病原的患者。該核酸可以單獨使用，或者和其它治療劑例如抗原或抗菌藥物聯(lián)合使用以誘發(fā)免疫反應(yīng)，減少或消除傳染病原。方法是給已感染或有感染危險的患者施用本發(fā)明的有效量的組合基序免疫刺激核酸以治療感染。該方法可以用于治療人或非人脊椎動物患者的病毒，細菌，真菌和寄生蟲感染。
這里所用的“感染”與“傳染病”同意，指由于患者體內(nèi)存在外源微生物而引起的疾病。外源微生物可以是病毒，細菌，真菌或者寄生蟲。
傳染病的實例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也稱為HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分離物，例如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒；腸道病毒；人柯薩奇病毒，鼻病毒，人腸道孤病毒)；杯狀病毒科(例如能引起胃腸炎的病毒)；披膜病毒科(例如馬腦炎病毒，風疹病毒)；黃病毒科(例如登革熱病毒，腦炎病毒，黃熱病病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)；彈狀病毒科(例如水泡性口膜炎病毒，狂犬病病毒)；絲狀病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒；腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亞病毒科(漢坦病毒，布尼亞病毒，靜脈病毒和內(nèi)羅病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒，環(huán)狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科；嗜肝病毒科(乙型肝炎病毒)；細小病毒科(細小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大部分腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV)1和2，水痘帶狀皰疹病毒，巨細胞病毒(CMV)，皰疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如海綿狀腦病的病原體，丁型肝炎的病原體(認為是乙型肝炎病毒的缺陷性衛(wèi)星病毒)，非甲非乙型肝炎的病原體(分類1是遺傳；分類2是外部傳染(即丙型肝炎)；諾沃克因子及相關(guān)病毒，和星狀病毒)。
傳染性細菌的實例包括以色列放線菌，炭疽桿菌，擬桿菌，伯氏疏螺旋菌，沙眼衣原體，產(chǎn)氣莢膜梭菌，破傷風梭菌，白喉棒狀桿菌，棒狀桿菌，產(chǎn)氣腸桿菌，腸球菌，豬丹毒絲菌，具核梭桿菌，流感嗜血桿菌，幽門螺桿菌，肺炎克雷伯氏菌，侵肺軍團菌，鉤端螺旋體，單核細胞增多性李氏菌，分枝桿菌(例如結(jié)核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌，戈氏分枝桿菌)，淋病耐瑟氏球菌，腦膜炎耐瑟氏球菌，多殺性巴氏桿菌，病原性彎曲桿菌，金黃色葡萄球菌，念珠狀鏈桿菌，鏈球菌(厭氧性)，鏈球菌(微小菌落)，無乳鏈球菌(B族鏈球菌)，牛鏈球菌，糞鏈球菌，肺炎鏈球菌，化膿鏈球菌(A族鏈球菌)，蒼白密螺旋體，和纖細密螺旋體。
傳染性真菌包括白假絲酵母，新型串酵母，莢膜組織胞漿菌，粗球孢子菌，和皮炎芽生菌。
其它傳染性生物(原生生物)包括瘧原蟲例如惡性瘧原蟲，三日瘧原蟲，卵形瘧原蟲，和間日瘧原蟲，和鼠弓形體。血液和/或組織寄生物包括瘧原蟲，田鼠巴貝蟲，分歧巴貝蟲，熱帶利什曼蟲，利什曼蟲，巴西利什曼蟲，杜氏利什曼蟲，岡比亞錐蟲和羅氏錐蟲(非洲昏睡病)，克氏錐蟲(恰加斯氏病)，和鼠弓形體。
應(yīng)當理解，上述病毒，細菌，真菌和其它傳染性微生物都是舉例而并非限制本發(fā)明。其它商業(yè)可獲得的相關(guān)微生物在許多文獻中都有描述，例如，參見C.G.A Thomas，Medical Microbiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，在此引入其全文作為參考。
雖然上述許多微生物都是和人的疾病相關(guān)的，但是本發(fā)明也可用于治療非人的脊椎動物。非人的脊椎動物也可以用本發(fā)明的免疫刺激核酸來預(yù)防和治療疾病。例如，除了治療人的傳染性疾病以外，本發(fā)明的方法還可用于治療動物的傳染病。
人和非人的脊椎動物的傳染性病毒包括逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，RNA病毒和DNA病毒。逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包括簡單逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄酶病毒。簡單逆轉(zhuǎn)錄酶病毒還包括B型逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，C型逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，D型逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的亞組。B型逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的實例包括鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C型逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包括亞組C型A組(包括勞氏肉瘤病毒(RSV)，禽白血病病毒(ALV)，和禽類成髓細胞瘤病毒(AMV))和C型B組(包括貓白血病毒(FeLV)，長臂猿白血病毒(GALV)，脾壞死病毒(SNV)，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(RV)和猴肉瘤病毒(SSV))。D型逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿逆轉(zhuǎn)錄酶病毒1型(SRV-1)。復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄酶病毒包括慢病毒，T細胞白血病毒和泡沫病毒的亞組。慢病毒包括HIV-1，也包括HIV-2，SIV，綿羊髓鞘脫落病毒，貓免疫缺陷病毒(FIV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)。T細胞白血病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿T細胞白血病毒(STLV)，和牛白血病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
其它脊椎動物傳染物中的RNA病毒的實例包括但不限于呼腸孤病毒科家族的成員，包括呼腸孤病毒屬(哺乳動物和禽逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的多血清型)，環(huán)狀病毒屬(藍舌病病毒，eugenangee病毒，克米羅沃病毒，非洲馬疫病毒和科羅拉多蜱熱病毒)，輪狀病毒屬(人輪狀病毒，內(nèi)布拉斯加小牛痢疾病毒，猿輪狀病毒，?；蜓蜉啝畈《荆葺啝畈《?；小核糖核酸病毒家族，包括腸病毒屬(脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒A和B，腸細胞病變的人孤生(ECHO)病毒，甲型肝炎病毒，猿腸病毒，鼠腦脊髓炎(ME)病毒，鼠脊髓灰質(zhì)炎病毒，牛腸病毒，豬腸病毒，心病毒屬(腦心肌炎病毒(EMC)，門戈病毒)，鼻病毒屬(人鼻病毒，其包含至少113個亞型；其它鼻病毒)，口瘡病毒屬(口蹄疫病毒(FMDV)；杯狀病毒科家族，包括豬水泡疹病毒，san miguel sealion病毒，貓小核糖核酸病毒和諾沃克病毒；披膜病毒科家族，包括病毒屬(東方馬腦炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德畢斯病毒，基孔肯亞病毒，O′nyong nyong病毒，羅斯河病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳播的黃熱病病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，圣路易斯腦炎病毒，墨累谷腦炎病毒，西尼羅河病毒，kunjin病毒，中歐蜱傳播病毒，遠東蜱傳播病毒，科薩努爾森林病毒，跳躍病病毒，玻瓦桑病毒，鄂木斯克出血熱病毒)，風疹病毒屬(風疹病毒)，瘟疫病毒屬(粘膜病病毒，豬霍亂病毒，邊界病病毒)；布尼亞病毒科家族，包括布尼亞病毒屬(布尼奧羅及相關(guān)病毒，加利福尼亞腦炎族病毒)，靜脈病毒屬(白蛉熱西西里島病毒，立谷熱病毒)，內(nèi)羅病毒屬(克里米亞-剛果出血熱病毒，奈洛比綿羊癥病毒)，和uukuvirus屬(uukuniemi及相關(guān)病毒)；正粘病毒科家族，包括流感病毒屬(流感病毒A型，有許多種人亞型)；豬流感病毒和禽和馬流感病毒；流感B型(有許多種人亞型)，和流感C型(也可能是獨立的屬)；副粘病毒科家族，包括副粘病毒屬(副流感病毒1型，仙臺病毒，血細胞吸附病毒，副流感病毒2至5型，新城雞瘟病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒(麻疹病毒，亞急性硬化性全腦炎病毒，大瘟熱病毒，牛瘟病毒)，肺病毒(呼吸道合胞體病毒(RSV)，牛呼吸道合胞體病毒和肺炎病毒)；彈狀病毒科家族，包括水皰病毒屬(VSV)，錢迪普拉病毒，flander-shart park病毒)，狂犬病病毒屬(狂犬病病毒)，魚棒狀病毒，和兩種可能的棒狀病毒(馬爾堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒狀病毒科家族，包括淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCM)，tacaribe病毒復(fù)合物，和拉沙病毒；冠狀病毒科家族，包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)，肝炎病毒，人腸冠狀病毒，和貓傳染性腹膜炎(貓冠狀病毒)。
其它脊椎動物傳染物中的DNA病毒的實例包括但不限于痘病毒科家族，包括正痘病毒屬(重型天花，類天花，猴痘，牛痘，水牛痘，兔痘，鼠痘)，leporipoxvirus屬(粘液瘤，纖維瘤)，禽痘病毒屬(禽痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒屬(綿羊痘，山羊痘)，豬痘病毒屬(豬痘)，副痘病毒屬(傳染性膿皰皮炎病毒，偽牛痘，丘疹口腔病毒)；虹彩病毒科家族(非洲豬瘟病毒，蛙病毒2和3，魚淋巴囊腫病毒)；皰疹病毒科家族，包括-皰疹病毒(單純皰疹1型和2型，水痘帶狀皰疹，馬流產(chǎn)病毒，馬皰疹病毒2和3，假狂犬病毒，傳染性牛角膜結(jié)膜炎病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒，貓鼻氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒)，-皰疹病毒(人細胞巨化病毒和豬猴細胞巨化病毒)；-皰疹病毒(epstein-barr病毒(EBV)，馬立克病病毒；皰疹松鼠猴屬，皰疹病毒蛛猴屬，皰疹病毒棉尾兔屬，豚鼠皰疹病毒，lucke tumor病毒)；腺病毒科家族，包括巨大腺病毒屬(人A，B，C，D，E亞組和未分組；猿腺病毒(至少23種血清型)，傳染性狗肝炎，和牛，豬，羊，蛙以及其它物種的腺病毒，禽腺病毒屬(禽腺病毒)；和不可培養(yǎng)的腺病毒；papoviridae家族，包括乳頭瘤病毒家族(人乳頭瘤病毒，牛乳頭瘤病毒，shope兔乳頭瘤病毒，和不同物種的不同病原的乳頭瘤病毒)，多瘤病毒屬(多瘤病毒，猿猴空泡病毒(SV-40)，兔空泡病毒(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒和其它靈長類多瘤病毒例如淋巴乳頭瘤病毒)；細小病毒科家族，包括腺病毒群，細小病毒屬(貓瘟病毒，牛細小病毒，犬細小病毒，阿留申貂病病毒等)。最后，DNA病毒還包括不在上述家族內(nèi)的病毒，例如庫魯病和庫賈氏癥病毒和慢性傳染性神經(jīng)病病毒(CHINA病毒)。
所述核酸可以和抗菌劑一同給藥。這里所說的抗菌劑指天然的，合成的或半合成的，能夠殺死或抑制傳染性微生物的化合物。本發(fā)明的有效的抗菌劑的類型取決于患者感染或可能感染的微生物的類型?？咕鷦┌ǖ幌抻诳辜毦鷦共《緞?，抗真菌劑和抗寄生蟲劑。詞語“抗傳染劑”，“抗細菌劑”，“抗病毒劑”，“抗真菌劑”，“抗寄生蟲劑”和“殺寄生蟲藥”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，在標準的醫(yī)學教科書中也有定義。簡單來講，抗細菌劑可以殺死或抑制細菌，包括抗生素和其它具有相似功能的合成的或天然的化合物?？股厥堑头肿恿康奈镔|(zhì)，是細胞如微生物所產(chǎn)生的二級代謝物。通常，抗生物可以擾亂一種或多種細菌特有而宿主細胞沒有的功能或結(jié)構(gòu)?？共《緞┛梢詮奶烊粊碓粗蟹蛛x，也可以合成，它可以有效殺死或抑制病毒?？拐婢鷦┛捎糜谥委煴砥さ恼婢腥?，也可以治療機會性和初級系統(tǒng)性真菌感染?？辜纳x劑可以殺死或抑制寄生蟲。
抗細菌劑可以殺死細菌或抑制細菌的生長或功能?？辜毦鷦┯幸淮箢愂强股??？捎行⑺阑蛞种贫喾N細菌的抗生素被稱為廣譜抗生素。其他類型的抗生素的效果主要是針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌。這些抗生素被稱為窄譜抗生素。其它針對某一種微生物或疾病，而對其它細菌均沒有效果的抗生物被稱為限譜抗生素。抗細菌劑有時候也根據(jù)它們的基本作用方式進行分類。通常抗細菌劑可是細胞壁的合成抑制劑，細胞膜抑制劑，蛋白質(zhì)合成抑制劑，核酸合成或功能抑制劑以及綜合性抑制劑。
抗病毒劑是可以防止細胞被病毒感染或者防止病毒在細胞內(nèi)復(fù)制的化合物?？共《舅幬锉瓤辜毦幬锷俚亩啵@是因為病毒復(fù)制的過程與宿主細胞內(nèi)的DNA復(fù)制密切相關(guān)，因此非特異性的抗病毒劑一般對宿主都具有毒性。在病毒感染的過程中有幾個階段是抗病毒劑可以阻斷或抑制的。這些階段包括病毒與宿主細胞的連接(免疫球蛋白或連接多肽)，病毒的脫殼(例如金剛胺)，病毒mRNA的合成或翻譯(例如干擾素)，病毒RNA或DNA的復(fù)制(例如核苷類似物)，新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制劑)，病毒的出芽和釋放。
核苷酸類似物是與核苷酸類似的合成化合物，它具有不完全或非正常的脫氧核糖或核糖基團。一旦核苷酸類似物進入到細胞中，它們就會被磷酸化，產(chǎn)生三磷酸形式，與正常核苷酸競爭地與病毒DNA和RNA結(jié)合。一旦核苷酸類似物的三磷酸形式插入到發(fā)展中的核酸鏈中，它就會引發(fā)與病毒聚合酶的不可逆的結(jié)合，從而使核酸鏈終止。核苷酸類似物包括但不限于無環(huán)鳥苷(用于治療單純皰疹病毒和水痘帶狀皰疹病毒)，丙氧鳥苷(用于治療細胞巨化病毒)，碘苷，三氮唑核苷(用于治療呼吸道合胞病毒)，雙脫氧次黃苷，雙脫氧胞苷和齊多夫定(疊氮胸苷)。
抗真菌劑可用于治療和預(yù)防真菌感染。抗真菌劑有時是根據(jù)其作用原理分類的。一些抗真菌劑起細胞壁抑制劑的作用，抑制葡萄糖合酶。這樣的抗真菌劑包括但不限于basiungin/ECB。其它一些抗真菌劑可破壞膜的完整性。這樣的抗真菌劑包括但不限于immidazoles，例如克霉唑，sertaconzole，氟康唑，伊曲康唑，酮康唑，霉康唑，和voriconacole，還有FK463，兩性霉素B，BAY38-9502，MK991，帕地霉素，UK292，布替萘酚，和特比萘芬。其它一些抗真菌劑可分解幾丁質(zhì)(例如幾丁質(zhì)酶)或者進行免疫抑制(501乳劑)。
所述免疫刺激核酸可以單獨使用也可以與抗癌治療聯(lián)合使用以治療癌癥。方法包括給患有癌癥或有患癌癥危險的患者施用有效量的本發(fā)明的組合基序免疫刺激核酸以治療癌癥。
“患有癌癥的患者”指體內(nèi)有可檢出的癌癥細胞的患者。所述癌癥可以是惡性的或是非惡性的癌癥。癌癥或腫瘤包括但不限于膽道癌；腦癌；乳腺癌；宮頸癌；惡性合體細胞瘤；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；胃癌；上皮內(nèi)新生瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如小細胞和非小細胞的)；黑色素瘤；成神經(jīng)細胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤；皮膚癌；睪丸癌；甲狀腺癌；和腎癌，還包括其它癌癥和腫瘤。在一個實施方案中，所述癌癥是毛細胞白血病，慢性骨髓性白血病，皮膚T細胞白血病，多發(fā)性骨髓瘤，濾泡性淋巴瘤，惡性黑色素瘤，鱗狀細胞癌，腎細胞癌，前列腺癌，膀胱狀細胞癌或結(jié)腸癌。
在群居動物(即貓和狗)中癌癥是引起死亡的主要原因之一。一般在狗和貓中診斷出的惡性病癥包括但不限于淋巴肉瘤，骨肉瘤，乳房腫瘤，肥大細胞瘤，腦腫瘤，黑色素瘤，腺鱗狀上皮癌，良性肺腫瘤，支氣管腺體瘤，支氣管腺癌，纖維瘤，粘液軟骨瘤，肺肉瘤，神經(jīng)肉瘤，骨瘤，乳頭瘤，成視網(wǎng)膜細胞瘤，尤因氏肉瘤，維爾姆斯氏瘤，伯基特氏淋巴瘤，小神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤，成神經(jīng)細胞瘤，破骨細胞瘤，口腔瘤，纖維肉瘤，骨肉瘤和橫紋肌肉瘤。其它狗中發(fā)生的腫瘤包括生殖鱗狀細胞癌，可遺傳的性病腫瘤，睪丸腫瘤，精原細胞瘤，塞爾托利細胞瘤，血管外皮細胞瘤，組織細胞瘤，綠色瘤(粒細胞瘤)，角膜乳頭瘤，角膜鱗狀細胞癌，血管肉瘤，胸膜間皮瘤，基底細胞瘤，胸腺瘤，胃瘤，腎上腺癌，口腔乳頭瘤，血管內(nèi)皮瘤和囊腺瘤。其它貓中發(fā)生的腫瘤包括濾泡性淋巴瘤，腸淋巴肉瘤，纖維肉瘤和肺鱗狀細胞癌。已知雪貂，一種更普遍的家養(yǎng)寵物可能患胰島瘤，淋巴瘤，肉瘤，神經(jīng)瘤，胰島細胞瘤，胃MALT淋巴瘤和胃腺癌。
所述免疫刺激核酸還可以聯(lián)合抗癌治療進行給藥。抗癌治療包括癌癥藥物，放射療法和手術(shù)療法。這里所說的“癌癥藥物”指為治療癌癥的目的給予患者的藥物。在此將介紹治療癌癥的不同類型的藥物。為方便描述，癌癥藥物被分為化療劑，免疫治療劑，癌疫苗，激素治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
將免疫刺激核酸和免疫治療劑例如單克隆抗體聯(lián)合使用可以通過多種機制延長生命，這些機制包括抗體依賴的細胞毒性(ADCC)的顯著增強，NK細胞的激活和IFN-α水平的提高。ADCC可以通過將免疫刺激核酸與靶細胞特異性抗體聯(lián)合使用來實現(xiàn)，例如癌細胞特異性抗體。當免疫刺激核酸與抗體聯(lián)合給藥時，可以誘導患者的免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞。在ADCC過程中有效的抗體包括可與體內(nèi)細胞相互作用的抗體。許多這種細胞特異性抗體都是本領(lǐng)域已知的，其中一些是商業(yè)可獲得的。所述核酸與單克隆抗體聯(lián)合給藥時可以減少抗體的用量還達到同樣的生物學效果。
本發(fā)明中可以使用的其它化療劑包括氨魯米特，天冬酰胺酶，白消安，卡波鉑，苯丁酸氮芥，鹽酸阿糖胞苷，放線菌素，鹽酸紅比霉素，雌氮芥磷酸鈉，依托泊甙(VP16-213)，氟尿苷，氟尿嘧啶(5-FU)，氟他米特，羥基脲(羥基尿素)，異環(huán)磷酰胺，干擾素α-2a，α-2b，醋酸亮丙瑞林(LHRH-釋放因子類似物)，環(huán)已亞硝脲(CCNU)，二氯甲基二乙胺鹽酸(氮芥)，巰基嘌呤，巰乙磺酸鈉，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷(o.p’-DDD)，鹽酸米托蒽醌，奧曲肽，普卡霉素，鹽酸甲基芐肼，鏈脲霉素，苯氧胺枸櫞酸，硫鳥嘌呤，噻替派，硫酸長春堿，安吖啶(mAMSA)，阿扎胞苷，促紅細胞生成素，六甲密胺(HMM)，白介素2，丙脒腙(甲基-GAG；甲基乙二醛二脒基腙；MGBG，戊糖苷(2’脫氧柯福霉素)，甲基環(huán)己亞硝脲(甲基-CCNU)，替尼泊甙(VM-26)和硫酸長春堿酰胺。
癌疫苗是可以刺激自身免疫系統(tǒng)對癌細胞的反應(yīng)的藥物?，F(xiàn)有的疫苗主要是刺激體液免疫系統(tǒng)(即抗體依賴的免疫反應(yīng))。其它正在研發(fā)的疫苗主要目的是激活細胞調(diào)節(jié)的免疫系統(tǒng)，包括可以殺死腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞。癌疫苗一般可增強癌抗原向抗原呈遞細胞(例如巨噬細胞和樹突細胞)和/或其它免疫細胞如T細胞，B細胞和NK細胞的呈遞。在一些實例中，癌疫苗可以單獨使用或和如上面所述的佐劑一起使用。
一些癌細胞是抗原性的，因此能被免疫系統(tǒng)靶定。免疫刺激核酸和癌癥藥物聯(lián)合給藥，特別是和那些癌癥免疫治療劑，可有效刺激對癌抗原的特異性免疫反應(yīng)。這里所說的術(shù)語“癌抗原”和“腫瘤抗原”可以互換使用，意指腫瘤細胞差異表達的抗原，可以用于靶定癌細胞。癌抗原是可以明顯刺激腫瘤特異性免疫反應(yīng)的抗原。正常細胞中也編碼一些這樣的抗原，雖然不一定表達。這些抗原可以分為在正常細胞中保持沉默的(即不表達)，只在分化的特定階段表達的和那些暫時性表達的例如在胚胎期和胎兒期表達的抗原。其它癌抗原由突變的細胞基因編碼，例如致癌基因(例如激活的ras致癌基因)，抑制基因(例如突變p53)，由于內(nèi)部缺失或染色體移動造成的融合蛋白。還有其它一些癌抗原是由病毒基因，例如RNA和DNA腫瘤病毒上攜帶的基因編碼的?！澳[瘤相關(guān)”抗原在腫瘤細胞和正常細胞中都存在，但是在腫瘤細胞中其數(shù)量和形式都不同。這樣的抗原的實例包括胚抗原(例如癌胚抗原)，分化抗原(例如T和Tn抗原)和致癌基因產(chǎn)物(例如HER/neu)。
癌抗原，例如那些用于癌疫苗的或者那些用于制備癌癥免疫藥物的，可以從癌細胞的粗提物中制備，如Cohen PA et al.(1994)Cancer Res 541055-8中所述，或者用重組技術(shù)部分純化該抗原，或者根據(jù)已知的抗原從頭合成。癌抗原可以使用特定抗原的免疫原性部分，或者在一些實例中，整個細胞或腫瘤體也可以作為抗原使用。這樣的抗原可以分離得到或者用重組技術(shù)制備，或者用本領(lǐng)域已知的其它方法制備。
其它一些疫苗采用在體外直接暴露于癌抗原中的樹突細胞的形式，對抗原進行處理，并在存在MHC分子的時候在細胞表面表達癌抗原，并有效地將抗原呈遞給其它免疫系統(tǒng)細胞。樹突細胞通過抗原呈遞，并通過表達模式識別受體在天然和獲得性免疫系統(tǒng)之間形成連接，其中所述模式識別受體可以在局部環(huán)境中檢測如LPS的微生物分子。
組合基序免疫刺激核酸可用于治療變態(tài)反應(yīng)，包括哮喘。組合基序免疫刺激核酸可以單獨使用或者和變態(tài)反應(yīng)/哮喘藥物聯(lián)合使用以治療變態(tài)反應(yīng)。方法包括給發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或著有變態(tài)反應(yīng)或哮喘危險的的患者施用有效量的本發(fā)明的組合基序免疫刺激核酸以治療變態(tài)反應(yīng)或哮喘。
這里所說的“變態(tài)反應(yīng)”指獲得性的對物質(zhì)(變態(tài)反應(yīng)原)的超敏性。變態(tài)反應(yīng)包括濕疹，過敏性鼻炎或鼻傷風，枯草熱，支氣管哮喘，風疹(蕁麻疹)和食物過敏，以及其它的遺傳性過敏?！鞍l(fā)生變態(tài)反應(yīng)的患者”指因?qū)ψ儜B(tài)反應(yīng)原的應(yīng)答而發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或者具有發(fā)生變態(tài)反應(yīng)危險的患者。“變態(tài)反應(yīng)原”是指可以導致易感患者發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或者哮喘的物質(zhì)。變態(tài)反應(yīng)原非常多，包括花粉，昆蟲毒素，動物鱗屑，灰塵，真菌孢子和藥物(例如青霉素)。
天然動物和植物變態(tài)反應(yīng)原包括對下列物種特異性的蛋白犬(家犬)；表皮螨屬(例如粉塵螨)；貓屬(家貓)；豚草屬(ambrosiaartemiisfolia；黑麥草屬(例如多年生黑麥草或多花黑麥草)；柳杉屬(日本柳杉)；鏈格孢屬(細鏈格孢)；榿木屬；赤楊屬(alnusgultinosa)；樺屬(疣枝樺)；櫟屬(白橡樹)；木犀欖屬(油橄欖)；艾屬(野艾)；車前屬(例如鹿角車前)；墻草屬(例如parietariaofficinalis或parietaria judaica)；小蠊屬(例如德國小蠊)；蜜蜂屬(例如apis multiflorum)；柏木屬(例如意大利柏木，cupressusarizonica和大果柏)；刺柏屬(例如juniperus sabinoides，juniperusvirginiana，歐洲刺柏和雪松)；金鐘柏(例如thuya orientalis)；扁柏屬(例如日本扁柏)；大蠊屬(例如美洲大蠊)；冰草屬(例如匍匐冰草)；黑麥屬(例如黑麥)；小麥屬(例如普通小麥)；鴨茅屬(例如鴨茅)；羊茅屬(例如牛尾草)；早熟禾屬(例如草地早熟禾或加拿大早熟禾)；燕麥屬(例如皮燕麥)；holcus(例如白毛茅)；黃花茅屬(例如黃花茅)；燕麥草屬(例如燕麥草)；剪股穎屬(例如小糠草)；梯牧草屬(例如梯牧草)；草蘆屬(例如草蘆)；雀稗屬(例如百喜草)；高梁屬(例如假高粱)和雀麥屬(例如無芒雀麥)。
這里所說的“哮喘”指呼吸系統(tǒng)的失調(diào)，癥狀是發(fā)炎，呼吸道變窄以及呼吸道對吸入物的反應(yīng)性增強。哮喘常常但不是只與遺傳性過敏或變態(tài)反應(yīng)癥狀有關(guān)。
這里所說的“哮喘/變態(tài)反應(yīng)藥物”指可以減輕癥狀，抑制哮喘或變態(tài)反應(yīng)，或者預(yù)防變態(tài)反應(yīng)或哮喘的發(fā)生的組合物。治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)的不同類型的藥物在Guidelines For TheDiagnosis and Management of Asthma，Expert Panel Report 2，NIHPublication No.97/4051，July 19，1997中有描述，在此引入其全文作為參考。下面將對NIH出版物中描述的藥物概要做一介紹。
在大多數(shù)實施方案中，哮喘/變態(tài)反應(yīng)藥物在某種程度上可有效用于治療哮喘和變態(tài)反應(yīng)。一些哮喘/變態(tài)反應(yīng)藥物優(yōu)選與免疫刺激核酸聯(lián)合使用以治療哮喘。這被稱為哮喘藥物。哮喘藥物包括但不限于PDE-4抑制劑，支氣管擴張劑/β-2激動劑，K+通道開啟劑，VLA-4拮抗劑，神經(jīng)激肽拮抗劑，TXA2合成抑制劑，xanthanines，花生四烯酸拮抗劑，5脂肪氧化酶抑制劑，血栓素A2受體拮抗劑，凝血惡烷A2拮抗劑，5-脂肪氧化酶激活蛋白抑制劑，和蛋白酶抑制劑。
其它哮喘/變態(tài)反應(yīng)藥物優(yōu)選與免疫刺激核酸聯(lián)合使用以治療變態(tài)反應(yīng)。這被稱為變態(tài)反應(yīng)藥物。變態(tài)反應(yīng)藥物包括但不限于抗組胺，甾族化合物，免疫調(diào)節(jié)劑，和前列腺素誘導物?？菇M胺是可以抵抗肥大細胞或嗜堿細胞釋放的組胺的化合物。這些化合物是本領(lǐng)域熟知的，也已普遍應(yīng)用于變態(tài)反應(yīng)的治療中。抗組胺包括但不限于氯雷他定，西替利嗪，氯苯丁嗪，ceterizine類似物，非索非那定，特非那定，地洛他定，去甲阿司咪唑，依匹斯汀，依巴斯汀，阿司咪唑，左卡巴斯汀，氮卓斯汀，曲尼司特，特非那定，咪唑斯汀，betatastine，CS560，和HSR609。前列腺素誘導物是可以誘導前列腺活性的化合物。前列腺素通過調(diào)節(jié)平滑肌的放松發(fā)揮作用。前列腺素誘導物包括但不限于S-5751。
甾族化合物包括但不限于倍氯米松，氟替卡松，曲安縮松，布地縮松，皮質(zhì)類固醇激素和布地縮松。免疫刺激核酸和甾族化合物聯(lián)合給藥特別適于治療年輕患者(例如兒童)。但至今甾族化合物在兒童中的使用還是收到限制的，這是因為觀察到某些甾族化合物的治療與生長遲緩有關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明，免疫刺激核酸可以和導致生長遲緩的甾族化合物聯(lián)合使用，可以達到“少量使用甾族化合物的作用”。這兩種藥物聯(lián)合使用可以降低甾族化合物的需要劑量。
免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于抗炎癥藥物，白細胞三烯拮抗劑，IL-4突變型，可溶IL-4受體，免疫抑制劑(例如耐受多肽疫苗)，抗IL-4抗體，IL-4拮抗劑，抗IL-5抗體，可溶IL-13受體Fc融合蛋白，抗IL-9抗體，CCR3拮抗劑，CCR5拮抗劑，VLA-4抑制劑，和IgE下調(diào)劑。
本發(fā)明的免疫刺激核酸可用于誘導1型IFN，即IFN-α和IFN-β。方法是用有效量的本發(fā)明的組合基序免疫刺激核酸與能表達1型IFN的細胞接觸以誘導1型IFN的表達。目前主要用于生產(chǎn)人IFN-α的細胞是類漿細胞的樹突細胞(pDC)。這種細胞在PBMC中的發(fā)生率非常少(0.2-0.4％)，其表型是lin陰性(沒有CD3，CD14，CD19或CD56)和CD11c陰性，但是是CD4，CD123(IL-3Rα)，和II類主要組織相容性復(fù)合物(II類MHC)陽性。Grouard G et al.(1997)J Exp Med 1851101-11；Rissoan M-C etal.(1999)Science 2831183-6；Siegal FP et al.(1 999)Science2841835-7；Cella M et al.(1999)Nat Med 5919-23。測量1型IFN的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括酶連免疫吸附檢測(ELISA)，生物檢測，和熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)。這些檢測都可以使用商業(yè)可獲得的試劑和試劑盒完成。
本發(fā)明的免疫刺激核酸可用于激活NK細胞。方法是用有效量的本發(fā)明的組合基序免疫刺激核酸與NK細胞接觸以激活NK細胞。NK細胞的激活可以是直接激活或是間接激活。間接激活指誘導能繼續(xù)激活NK細胞的細胞因子和其它因子。NK細胞的激活可以用多種方法來測定，包括溶胞活性的測定，激活標記例如CD69的誘導的測定，以及特定細胞因子的誘導的測定。除了能夠自發(fā)地殺死特定的腫瘤目標以外，NK細胞還參與ADCC，是產(chǎn)生IFN-γ，IFN-α，GM-CSF和IL-3的細胞。
鼠NK細胞靶定的原型NK敏感細胞是酵母人造染色體(YAC)-1，一種源于莫洛尼氏病毒感染的A株鼠的胸腺瘤。對于人NK細胞，標準的靶細胞是K562，一種來自紅白血病血統(tǒng)的細胞系。在微量滴定板中，恒定數(shù)目的放射標記的靶細胞(例如51Cr-標記的K562)單獨培育(自發(fā)性的)，或者和去垢劑一起培育(最大量的)，或者和可變數(shù)目的效應(yīng)物細胞一起培育(試驗組)。效應(yīng)物對靶細胞的比值稱為E∶T比值。通常富集的激活的NK細胞在E∶T比值低于10∶1時有效，而未分離的PBMC或者脾細胞都要求E∶T比值是100∶1或更高。
免疫刺激核酸也可有效作為系統(tǒng)和/或粘膜免疫反應(yīng)的佐劑。本發(fā)明的組合基序免疫刺激核酸可以遞送給暴露于抗原中的患者，以增強患者對于該抗原的免疫反應(yīng)。例如組合基序免疫刺激核酸可有效用作疫苗佐劑。
免疫刺激核酸可以和非核酸佐劑聯(lián)合給藥。非核酸佐劑可以是任何分子或化合物，除了在此所述的可以刺激體液和/或細胞免疫反應(yīng)的免疫刺激核酸。非核酸佐劑包括有儲存效應(yīng)的佐劑，免疫刺激佐劑，以及具有儲存效應(yīng)并能刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。這里所說的非核酸粘膜佐劑是一種非免疫刺激核酸的佐劑，所述免疫刺激核酸當接觸與抗原連接的粘膜表面的時候可以在患者中誘導粘膜免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的免疫刺激核酸可以與藥學可接受的載體一起組成藥物組合物。免疫刺激核酸可以直接給予患者，也可以通過核酸遞送復(fù)合物給藥。核酸遞送復(fù)合物指與一種靶定物(例如一種與靶細胞(例如B細胞表面)有高親和力和/或能增加靶細胞吸收的分子)相結(jié)合(例如離子或共價結(jié)合；或者包在膠囊中)的核酸。核酸遞送復(fù)合物的實例包括與甾醇(例如膽固醇)，脂質(zhì)(例如陽離子脂質(zhì)，病毒顆?；蛑|(zhì)體)，或者靶細胞特異性結(jié)合試劑(例如一種能被靶細胞特異性受體識別的鍵)相結(jié)合。優(yōu)選的復(fù)合物應(yīng)該在體內(nèi)足夠穩(wěn)定，不會在進入靶細胞之前發(fā)生顯著的解偶聯(lián)。但是，該復(fù)合物在細胞內(nèi)在適當條件下應(yīng)是可解離的，這樣使得所述核酸可以以其功能型被釋放。
免疫刺激核酸和/或抗原和/或其它治療劑都可以單獨給藥(例如它們的鹽或用緩沖液)，或者用任意本領(lǐng)域已知的遞送載體給藥。例如下述的遞送載體Cochleates(Gould-Fogerite et al.，1994，1996)；emulsomes(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1997)；ISCOM(Mowat et al.，1993，Carlsson et al.，1991，Hu et.，1998，Morein et al.，1999)；脂質(zhì)體(Childers et al.，1999，Michalek et al.，1989，1992，de Haan 1995a，1995b)；微球(Gupta et al.，1998，Joneset al.，1996，Maloy et al.，1994，Moore et al.，1995，O’Hagan et al.，1994，Eldridge et al.，1989)；聚合物(例如羧甲纖維素，殼聚糖)(Hamajima et al.，1998，Jabbal-Gill et al.，1998)；聚合環(huán)形物(Wyatt et al.，1998)；蛋白體(Vancott et al.，1998，Lowell et al.，1988，1996，1997)；病毒顆粒(Gluck et al.，1992，Mengiardi et al.，1995，Cryz et al.，1998)；病毒樣顆粒(Jianng et al.，1999，Leibi etal.，1998)。其它遞送載體是本領(lǐng)域已知的。
粘膜或局部遞送的化合物劑量是每次給藥大約0.1μg到10mg，具體劑量取決于是每日，每周，每月還是以其它任意的時間間隔給藥。更典型的粘膜或局部給藥劑量是每次給藥大約10μg到5mg，最典型的是大約100μg到1mg，每2-4次給藥后之間間隔幾天或幾周。更典型的，免疫刺激物的劑量是每次給藥1μg到10mg，最典型地是10μg到1mg，每天或每周給藥。為了誘導抗原特異性免疫反應(yīng)而進行的胃腸外化合物給藥的劑量通常是疫苗佐劑或免疫刺激物的粘膜用有效量的5到10,000倍，更典型的是10到1000倍，最典型的是20到100倍，其中所述化合物與抗原而非治療劑一起遞送。當所述免疫刺激核酸與其它治療劑或者特殊的遞送載體一起給藥的時候，為了誘導自發(fā)的免疫反應(yīng)或者增加ADCC或者誘導抗原特異性免疫反應(yīng)，胃腸外給藥所用的化合物劑量通常是每次給藥大約0.1μg到10mg，具體的劑量取決于是每日，每周，每月還是以其它任意的時間間隔給藥。更典型的胃腸外給藥劑量是每次給藥大約10μg到5mg，最典型的是大約100μg到1mg，每2-4次給藥之間間隔幾天或幾周。在一些實施方案中，胃腸外給藥的劑量是上述典型劑量的5-10,000倍。
這里所述的“有效量”指足以達到其生物學功能所必需的量。例如，治療感染的有效量的免疫刺激核酸是指治療感染所必需的量。通過選擇不同的活性化合物和加權(quán)系數(shù)例如藥力，相對生物利用率，患者體重，不良副作用的嚴重程度以及優(yōu)選的給藥方式，可以設(shè)計出不引起過量毒性還能夠有效治療特定患者的有效預(yù)防或治療的給藥方案。對任何特定的治療方案來說，有效量都隨各種因素例如要治療的疾病，施用的特定的免疫刺激核酸，抗原，患者體積，或者疾病的嚴重程度而不同。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不需要過度的實驗就可以根據(jù)經(jīng)驗決定特定免疫刺激核酸和/或抗原和/或其它治療劑的有效量。
這里所述的任何化合物的治療有效量都可以根據(jù)動物模型來確定。治療有效量還可以根據(jù)CpG寡核苷酸在人中測試(人的臨床試驗)得到的試驗數(shù)據(jù)，具有類似藥物活性的化合物，例如其它粘膜佐劑如LT和其它疫苗抗原的人試驗數(shù)據(jù)，以及粘膜或局部給藥的人試驗數(shù)據(jù)確定。胃腸外給藥需要更大的劑量。使用的劑量可以根據(jù)相對所用化合物的相對生物利用率和藥效進行調(diào)整。根據(jù)上面介紹過的方法和其它本領(lǐng)域熟知的方法調(diào)整劑量以達到最大藥效是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易做到的。
本發(fā)明的組合物可以藥學可接受的溶液的方式給藥，所述溶液包括藥學可接受濃度的鹽，緩沖液，防腐劑，相容載體，佐劑，以及可選擇地其它治療成分。
用于治療的時候有效量的免疫刺激核酸可以以任何可以將核酸輸送到期望表面的方式給藥，例如粘膜表面，全身組織表面。本發(fā)明的藥物組合物可以以任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法給藥。優(yōu)選的給藥方式包括但不限于口服，胃腸外，肌肉內(nèi)，鼻內(nèi)，氣管內(nèi)，吸入，眼部，舌下，陰道，和直腸。
進行口服給藥時，所述化合物(即免疫刺激核酸，抗原和其它治療劑)可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學可接受的載體混合來配制。這些載體使得本發(fā)明的化合物可以制成片劑，丸劑，糖衣丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，淤漿，懸液等，使被治療的患者可以口服?？诜乃幬镏苿┛梢约尤牍腆w賦形劑，可選擇地研磨得到混合物，，處理混合物顆粒，加入適當?shù)闹鷦?，最后制成片劑或糖衣丸芯。適當?shù)馁x形劑特別可以是充填物例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇；纖維素制劑如玉米淀粉，小麥淀粉，米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃耆膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要還可以添加分離試劑，例如交連聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或褐藻酸或其鹽例如褐藻酸鈉?？蛇x擇地口服制劑還可以制成鹽或者使用緩沖液以中和其酸性，或者也可以不加入任何載體給藥。
糖衣丸芯可加上合適的包衣?？梢允褂脻饪s糖溶液，其中可選擇地含有阿拉伯樹膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液以及適合的有機溶劑或溶劑混合物。片劑或糖衣丸的包衣中可以加入染料或色素以標志不同活性組合物劑量的組合。
可口服的藥物制劑包括由明膠制成的推入配合的膠囊，以及由明膠和增塑劑例如甘露醇和山梨醇制成的軟密封膠囊。推入配合的膠囊可包含活性成分與充填物例如乳糖，粘合劑例如淀粉，和/或潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂，以及可選擇地還包含穩(wěn)定劑的混合物。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸于適當?shù)囊后w例如脂肪油，液體石蠟，或液體聚乙二醇中。另外還可以添加穩(wěn)定劑?？诜o藥也可以使用微球。微球在本領(lǐng)域中的意義是明確的。所有口服給藥的配方都以各自的適當劑量送服。
在口腔給藥中，組合物可以作成傳統(tǒng)的片劑或錠劑。
吸入給藥時，本發(fā)明的化合物可以用氣溶膠罐或噴霧器以氣溶膠噴射的形式遞送，并使用合適的推進劑，例如二氧二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體。使用壓力氣溶膠時其使用劑量是通過閥門進行調(diào)配。吸入器或吹藥器中的膠囊和明膠藥桶可含有所述化合物的粉末混合物以及適當?shù)姆勰┗|(zhì)例如乳糖或淀粉。
當需要進行全身給藥時，所述化合物可以通過注射進行胃腸外給藥，例如，快速濃注或連續(xù)輸注。制劑以單位劑量形式注射，例如，安瓿或多劑量容器，并添加防腐劑。組合物的形式可以是懸液，溶液或油乳劑或水乳劑，還可以含有配方試劑，例如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。
胃腸外給藥的藥物制劑包括活性化合物的水溶液，除此之外，活性組合物懸液也可制成適當?shù)挠唾|(zhì)注射懸液。適當?shù)挠H脂性溶劑或載體包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯，或者甘油三酯，或脂質(zhì)體。注射用水懸液可以含有能增加懸液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖?？蛇x擇地，懸液還可以含有適當?shù)姆€(wěn)定劑或者能增加化合物溶解度的試劑，以制備高濃度的溶液。
另外，活性化合物還可以以粉末形式與適當?shù)妮d體例如無菌無熱源的水混合。
所述化合物也可以制成直腸或陰道用組合物，例如含有傳統(tǒng)拴劑主劑如可可脂或其它甘油酯的拴劑或保留灌腸劑。
除了上述制劑以外，所述化合物還可以制成長效制劑。這種長期作用的制劑可以用適當?shù)木酆匣蚴杷牧?例如油乳化劑)或者離子交換樹脂配制，或者制成可溶性衍生物如可溶性鹽。
所述的藥物組合物還可以包含適當?shù)墓腆w或凝膠狀載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，淀粉，纖維素衍生物，明膠，和聚合物如聚乙二醇。
適當?shù)囊后w或固體藥物制劑可以是可吸入的水溶液或鹽溶液，微膠囊，encochleated，包在微金顆粒外，包在脂質(zhì)體內(nèi)，噴霧，氣溶膠，植入皮膚的藥丸，或者干燥凝固在尖銳物體表面并劃入皮膚。所述藥物組合物還包括顆粒，粉末，片劑，包衣片劑，(微)膠囊，拴劑，淤漿，乳劑，懸液，乳膏，滴劑或緩釋活性物質(zhì)制備物，在制備過程中照例還可以如上所述地加入賦形劑和添加劑和/或助劑，例如崩解劑，粘合劑，涂層劑，溶脹劑，潤滑劑，調(diào)味劑，甜味劑或增溶劑。所述藥物組合物適用于多種藥物遞送系統(tǒng)。關(guān)于藥物遞送方法的介紹見Langer(1990)Science2491527-33，通過在此引述將其全文引入本文。
免疫刺激核酸和任選的其它治療劑和/或抗原可以以其自身(不摻雜質(zhì))或其藥學可接受的鹽給藥。當在藥物中使用時所述的鹽必須是藥學可接受的，但是非藥學可接受的鹽也可以用于制備藥學可接受的鹽。這樣的鹽包括但不限于用下列酸制備的鹽鹽酸，溴化氫，含硫的酸，含氮的酸，含磷的酸，馬來酸，乙酸，水楊酸，p-甲苯磺酸，酒石酸，檸檬酸，甲基磺酸，蟻酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸，和苯磺酸。這些鹽也可制成堿金屬或堿土金屬的鹽，例如羧酸基團的鈉，鉀或鈣鹽。
適合的緩沖液包括乙酸鹽緩沖液(1-2％w/v)；檸檬酸鹽緩沖液(1-3％w/v)；硼酸鹽緩沖液(0.5-2.5％w/v)；和磷酸鹽緩沖液(0.8-2％w/v)。適當?shù)姆栏瘎┌认峦殇@(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；對羥基苯甲酸酯類(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
本發(fā)明的藥物組合物包含有效量的免疫刺激核酸和任選的抗原和/或其它治療劑，并且任選地包括藥學可接受的載體。術(shù)語“藥學可接受的載體”指一種或多種適于給人或其它脊椎動物施用的可配伍的固體或液體充填物，稀釋劑或膠囊封裝物質(zhì)。術(shù)語“載體”表示天然的或合成的有機或無機成分，活性物質(zhì)與其混合后會更便于使用。所述藥物組合物的成分也可以和本發(fā)明的化合物以不發(fā)生相互作用的方式相互混合。
患者的治療取決于化合物的活性，給藥的方式，免疫的目的(即預(yù)防性的還是治療性的)，疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者的年齡和體重，因此使用的劑量各不相同。給定劑量的給藥可以一次性全劑量給藥或者多次小劑量給藥。特定時間間隔的多次給藥方式通常用于促進抗原特異性反應(yīng)。
其它遞送系統(tǒng)包括長效緩釋，延時釋放或持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)。這種系統(tǒng)避免了反復(fù)進行化合物給藥，對于患者和醫(yī)師來說都更為便利。許多類型的釋放遞送系統(tǒng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是熟知的并且是容易獲得的。包括聚合物基質(zhì)系統(tǒng)例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己酸內(nèi)酯，聚酰胺酯，聚原酸酯，聚羥基丁酸，和聚酐。在美國專利5,075,109中描述了含有藥物的前述聚合物的微膠囊。遞送系統(tǒng)還可以包括非聚合物系統(tǒng)脂質(zhì)，包括甾醇如膽固醇，膽固醇酯和脂肪酸，或中性脂如單，二和三甘油酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠系統(tǒng)；基于肽的系統(tǒng)；蠟包衣；用傳統(tǒng)粘合劑和賦形劑制作的壓縮片劑；半融合的植入物等。其實例包括但不限于(a)侵蝕系統(tǒng)，其中本發(fā)明的試劑被包于基質(zhì)中，如美國專利No.4,452,775，4,675,189和5,736,152中所述；(b)擴散系統(tǒng)，其中活性組分以控制的速度從聚合物中擴散，如美國專利No.3,854,480，5,133,974和5,407,686中所述。除此之外，也可以使用泵送的遞送系統(tǒng)，某些這種系統(tǒng)適于植入。
本發(fā)明進一步通過實施例進行舉例說明，實施例不應(yīng)被視為對本發(fā)明的進一步限定。本申請中所有引用的文獻(包括參考文獻書目，公布的專利，公開的專利申請，以及共同未決的專利申請)的全文都通過在此引述而合并于本文。
實施例實施例1.ODN2395是NK細月包和IFN-α生成的強烈激活劑我們已經(jīng)描述了包含中和基序的寡脫氧核苷酸(ODN)，其中所述的中和基序由CG重復(fù)序列組成例如CGCGCG或者CG之前有個C和/或CG之后有個G。這些中和基序可以減少ODN對多重識別，例如IL-6，IL-12，IFN-γ，IFN-α的分泌，和對抗原特異性免疫反應(yīng)的誘導的刺激效果。Krieg AM et al.(1998)ProcNatl Acad Sci USA 9512631-6。
在許多情況下，寡核苷酸中中和基序和刺激基序的同時存在可預(yù)防免疫激活。一種同時包含刺激和中和基序的ODN是ODN2136，其序列是TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(SEQ IDNO19)。該ODN的3’端包括一個相對典型的中和基序，CGGCGCGCGCCC(SEQ ID NO37)，其源于抑制ODN 2010的3’端(GCGGCGGGCGGCGCGCGCCC，SEQ ID NO38)。令人驚訝的是，ODN 2136具有強烈的誘導NK細胞裂解活性(裂解單位，L.U.)的活性。如表1所示，3g/ml的ODN 2136的活性比標準的B細胞和NK細胞刺激硫代磷酸酯ODN 2006(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT，SEQ ID NO39)誘導L.U.的作用還要強烈。更令人驚奇地是，ODN 2006誘導的IFN-α的產(chǎn)量是2396pg/ml，ODN 2136誘導的產(chǎn)量是14278pg/ml(圖1)。這說明并不需要避免此中和序列的存在。
表1.人PBL與不同的ODN培育過夜
表1中的ODN序列1585 GGGGTCAACGTTGAGGGGGG(SEQ ID NO35)1758 TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO40)1760 ATAATCGACGTTCAAGCAAG(SEQ ID NO41)2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO39)2118GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO36)
2136TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(SEQ ID NO19)2169TCTATCGACGTTCAAGCAAG (SEQ ID NO42)2395TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO1)2396TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT(SEQ ID NO43)2397TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTTT(SEQ ID NO44)2398TTCGTGTTTTCGTGTTTTCGTCGT (SEQ ID NO45)然而，在對此現(xiàn)象的研究過程中，卻由ODN 2136的3’端和ODN 2006的5’端組合形成了一種更強的NK激活劑和IFN-α誘導劑。偶然發(fā)現(xiàn)可將得到的ODN 2395(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO1)的3’末端的最后一個堿基C變?yōu)镚。這種單個堿基的變化在ODN 2395的3’末端產(chǎn)生了一個完美的12堿基長的回文結(jié)構(gòu)，在ODN 2136中這個回文結(jié)構(gòu)只有10個堿基長。
表2顯示了另一個例子，其中ODN 2395比大部分其它全是硫代磷酸酯骨架的ODN更能誘導NK細胞L.U.。其中ODN 2395比正對照ODN 1585的作用稍弱，其中ODN 1585具有嵌合硫代磷酸酯/磷酸二酯(SOS)骨架。ODN 1585(ggGGTCAACGTTGAgggggG，SEQ ID NO35)在已公開的PCT申請WO01/22990中已有描述。在本實驗中，在0.6μg/ml的低濃度下，ODN 2136并沒有誘導L.U.，其無ODN對照的背景是0.03。圖2和圖3顯示了表2中各NK細胞培養(yǎng)物上清中的單核細胞趨化蛋白(MCP)-1和IFN-誘導蛋白(IP)-10的含量。MCP-1是一種連接CCR2并與Th1和Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的趨化因子。IP-10是一種連接CXCR3并與Th1反應(yīng)相關(guān)的CXC趨化因子。Loetscher P et al.(2001)J Biol Chem 2762986-91。這些數(shù)據(jù)表明ODN 2395對IP-10生成的誘導能力較強，而誘導MCP-1只是平均水平。
表2.人PBL與不同的ODN培育過夜
表2中的ODN序列1585GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO35)2006TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO39)2007TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO46)2013TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID NO48)2102TCGTCGTTTTGACGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO49)
2103TCGTCGTTTTGACGTTTTGACGTT(SEQ ID NO50)2117TZGTZGTTTTGTZGTTTTGTZGTT(SEQ ID NO51)2118GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG(SEQ ID NO36)2133TCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTT(SEQ ID NO17)2135ACCATGGACGAGCTGTTTCCCCTC(SEQ ID NO18)2136TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC (SEQ ID NO19)2137TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT(SEQ ID NO20)2139TCGTCGTTTCGTCGTTTTGACGTT(SEQ ID NO21)2142TCGCGTGCGTTTTGTCGTTTTGACGTT (SEQ ID NO22)2180TCGTCGTTTTTTGTCGTTTTTTGTCGTT(SEQ ID NO52)2183TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO53)2186TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC (SEQ ID NO54)2395TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NQ1)2396TCGTCGTTTTTGTCGTTTTTGTCGTT (SEQ ID NO43)2397TCGTCGTTTTGTCGTTTTTGTCGTTT (SEQ ID NO44)2398TTCGTGTTTTCGTGTTTTCGTCGT(SEQ ID NO45)基于這些數(shù)據(jù)，我們推測ODN 2395序列是NK細胞和IFN-α生成的強激活劑。
實施例2.與ODN 2395相關(guān)的ODN也是NK細胞和IFN-α生成的強激活劑設(shè)計并合成了ODN 2427-2433(SEQ ID NO2-8)，用于檢測ODN 2395的3’末端的回文結(jié)構(gòu)對于其免疫刺激活性的重要性。表3比較了這些不同ODN激活NK L.U.的能力。從這些數(shù)據(jù)明顯可以看出，濃度為1μg/ml時作用最強的是ODN 2429(TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG，SEQ ID NO4)，其誘導NK活性為2.85 L.U.。ODN 2006的作用非常小，除了不合CG的對照ODN 2118(GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG，SEQ ID NO36)以外，其它寡核苷酸的作用都比2006強。ODN 2429的效果非常明顯，因為它是僅有的具有12個堿基回文序列的ODN，雖然它的回文序列與2395中的回文序列不同。ODN 2430(TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG，SEQ ID NO5)與ODN2429類似，是濃度為1μg/ml時作用第二強烈的；但是它的回文序列稍短，有10個堿基長。其余的ODN沒有回文序列或者含有的回文序列比較短，其誘導的NK活性也較低。
表3.人PBL與不同的ODN培育過夜
表3中的ODN序列1585GGGGTCAACGTTGAGGGGGG (SEQ ID NO35)2006TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO39)2118GGGGTCAAGCTTGAGGGGGG (SEQ ID NO36)2395TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO1)2427TCGTCGTTTTCGTCGCGCGCCG(SEQ ID NO2)2428TCGTCGTTTTCGTCGCGCGGCG(SEQ ID NO3)2429TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO4)2430TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(SEQ ID NO5)2431TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(SEQ ID NO6)2432TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(SEQ ID NO7)2433TCGTCGTTTTCCGCCGCCGGGG(SEQ ID NO8)圖4顯示了這些寡核苷酸與正對照SOS ODN 2216(GGGGGACGATCGTCGGGGG，SEQ ID NO55)，2334(GGGGTCGACGTCGACGTCGAGGGGGGG，SEQ ID NO56)和2336(GGGGACGACGTCGTGGGGGGG，SEQ ID NO57)相比誘導IFN-α生成的能力。所有2395相關(guān)的ODN誘導IFN-α產(chǎn)生的水平都比ODN 2006高，雖然其誘導水平還在嵌合SOS ODN的誘導水平之下。其誘導IFN-α表達的次序大概與NK L.U.相同，ODN 2395和2429作用最強。
實施例3.對NK細胞和IFN-α表達的強刺激效果與B細胞的效果不相符如圖5A所示，ODN 2395及其相關(guān)ODN在濃度為0.25μg/ml時，在48小時后誘導B細胞表達CD86的能力顯著比ODN 2006及其相關(guān)的2397差。正如我們之前所觀察到的，ODN濃度越高，比如1μg/ml，不同ODN之間的差異越小(圖5B)。在同樣的實驗中，我們還用增殖檢測(3H-胸腺嘧啶摻入)測定了B細胞的激活(圖6)。而且，在濃度為0.25μg/ml時，ODN 2006和ODN2397(SEQ ID NO44)的作用是最強的(圖6A)。但是當濃度更高時，2395相關(guān)的ODN的效果都很相似(圖6B)。
實施例4.ODN 2395及其相關(guān)ODN誘導IL-10的能力較弱我們前面的研究已經(jīng)表明大部分由CpG誘導的IL-10的產(chǎn)生都來自于B細胞。如圖7所示，IL-10表達與B細胞增殖的相關(guān)性非常好。而且ODN 2006及其相關(guān)ODN 2397在0.25μg/ml的低濃度時作用最強。在這個濃度下，ODN 2395及其相關(guān)ODN誘導IL-10生成則較少。
實施例5.免疫刺激效果的濃度依賴性這里我們使用的寡核苷酸及其衍生物包括ODN 2427-2433(SEQ ID NO2-8)。這些ODN的數(shù)據(jù)如圖8所示。這再一次證明ODN 2006在濃度為1或6μg/ml時誘導IFN-α生成的能力較弱。但是ODN 2395誘導IFN-α生成的量較多，特別是在濃度為1μg/ml時。我們有時候會觀察到ODN在高濃度，例如6μg/ml時，其免疫刺激活性與濃度為1μg/ml時相比有所下降。在圖8所示的實驗中，ODN 2395在低濃度比高濃度的作用更強，而ODN2429在高濃度的作用更強。與通常的硫代磷酸酯ODN的反向劑量-反應(yīng)曲線相反，嵌合ODN例如ODN 2336在高濃度時免疫刺激作用增強。圖8所示的ODN 2432的免疫刺激效果表明此ODN并沒有有效的回文結(jié)構(gòu)。此系統(tǒng)還具有相對較弱的B細胞刺激活性，如圖5和圖6所示。
實施例6.B細胞刺激和NK刺激和IFN-α分泌之間的互反關(guān)系圖9顯示了另一個實驗，其中ODN 2395在0.4μg/ml的低濃度下誘導B細胞表達CD86的能力顯著比ODN 2006差。其它2395的相關(guān)ODN對B細胞的刺激能力稍強一些。有趣的是，B細胞刺激能力降低的次序與前面所觀察到的NK刺激的次序相同ODN 2429，然后是ODN 2430，最弱的B細胞激活劑是2395相關(guān)ODN。這表明很有可能2395樣ODN的B細胞刺激活性的降低與NK刺激活性和IFN-α分泌活性的獲得密切相關(guān)。圖10和圖11顯示了ODN 2395和ODN 2429以及ODN 2430對IFN-α的誘導。表4和圖12分別是獨立的實驗，都顯示出了ODN 2395和ODN 2429在兩個不同的人供體(D141和D142)中對IFN-α分泌的強誘導能力。
表4.ODN 2395變體的IFN-α分泌1
1單位是pg/ml，以平均值±標準差的形式表示表4中的ODN序列2006 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO39)2336 GGGGACGACGTCGTGGGGGGG (SEQ ID NO57)2395 TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO1)2429 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO4)5293 TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCC (SEQ ID NO58)5294 TCGTCGTTTTCGGCCGCCGCC (SEQ ID NO59)5295 TCGTCGTTTTCGGCCGCCGCCG (SEQ ID NO60)5296 TCGTCGTTTTCGCCGCCGCCG (SEQ ID NO61)5297 TGCTGCTTTTCGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO62)實施例7.富含GC區(qū)域的特性令人驚訝地是，ODN 5293-5297都沒有強免疫刺激反應(yīng)。ODN5293包含一個10個堿基的回文結(jié)構(gòu)，但是此回文結(jié)構(gòu)與2395中的不同，將其中心的CG變?yōu)镚C。但是，這個改變本身并不能解釋這種活性的喪失，因為ODN 2429也有這樣一個變化。而且，通常12個堿基的回文結(jié)構(gòu)都會有比較高的活性，除非在該回文結(jié)構(gòu)中心有一個CG。然而，ODN 2430也是只有一個10堿基的回文結(jié)構(gòu)，并且其中心是GC二核苷酸。ODN 2430的免疫刺激活性的增加是由于它3’末端含有5個CpG，而ODN 5293只有3個。
ODN 5294只有一個6堿基的回文結(jié)構(gòu)，這可能與其活性較低有關(guān)系。ODN 5295同樣也沒有有效的回文結(jié)構(gòu)。ODN 5296的低活性表明簡單的CCG重復(fù)不足以獲得ODN 2395的免疫刺激效果。ODN 2397在3’端具有完美的12堿基的回文結(jié)構(gòu)，但是5’末端沒有CpG基序。由于ODN 5297的12堿基回文結(jié)構(gòu)與ODN2429的相同，可以推斷ODN 2429的5’端TCGTCG基序?qū)τ谄涿庖叽碳せ钚允欠浅Ｖ匾摹＿@就是說，如果一個寡核苷酸的一端存在ODN 2429的中和回文結(jié)構(gòu)，那么即使另一端缺少至少一個刺激基序，也足以提供免疫刺激活性。
實施例8.對IFN-γ生成的作用為了更好地研究這類新的免疫刺激核酸的免疫刺激效果，另外還進行了幾組檢測。圖13顯示了這些ODN對于人PBMC上清中IFN-γ生成的作用。這些細胞與表3的實驗中所用的細胞相同，不同的是培養(yǎng)物的上清液用于檢測IFN-γ水平。圖13的C顯示了SOS CpG ODN例如ODN 1585可誘導IFN-γ生成，但是沒有CpG基序的ODN(例如對照ODN 2118)卻不能。圖13的A和B顯示了ODN 2006誘導IFN-γ生成的能力相對較弱，而ODN2395及其相關(guān)ODN的能力較強。
另一組研究是檢查這些不同的ODN對于樹突細胞的效果。類漿細胞DC(pDC)是ODN 2395及其相關(guān)ODN誘導的IFN-α的來源。不同ODN對于骨髓DC(mDC)的效果相對比較類似，所有的ODN都能夠誘導部分純化的mDC激活CD4+T細胞產(chǎn)生IFN-γ(圖14和圖15)。骨髓DC是從白細胞層分離出來的，與GM-CSF(4.4ng/ml)和不同的ODN共培育2天。然后從不同的供體中分離CD4+天然T細胞，以選定的效應(yīng)物對靶細胞(E∶T)比值與DC混合，然后培育6天或更長時間。然后進行細胞染色并用熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)進行分析。結(jié)果用IFN-γ染色陽性細胞的百分比表示，圖15顯示了這些T細胞中IFN-γ染色的平均熒光密度(MFI)。
實施例9.不是所有的富含GC的回文結(jié)構(gòu)都是有效的為了更好地研究這種新的ODN的結(jié)構(gòu)需求，我們合成了另外一些ODN。由于我們認為能有效進行免疫刺激的ODN具有富含GC的回文結(jié)構(gòu)，因此合成了ODN 2449(TCGTCGTTTTCGGGGGGCCCCC，SEQ ID NO9)和2450(TCGTCGTTTTCCCCCCGGGGGG，SEQ ID NO10)，它們具有富含GC的回文結(jié)構(gòu)，該回文結(jié)構(gòu)是連續(xù)的G后面跟連續(xù)的C，或者連續(xù)的C后面跟連續(xù)的G。如圖16所示，這些ODN都無法誘導IFN-γ生成。
實施例10.免疫刺激序列和中和基序的取向的效果我們合成了ODN 2451(TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT，SEQ ID NO11)用于檢測“刺激”TCGTCG基序和“中和”CGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO23)回文結(jié)構(gòu)的5’和3’方向是否可以逆轉(zhuǎn)，同時也不失去其免疫刺激活性。ODN 2451確實具有很高的刺激性(圖16)。我們合成了ODN 2452(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT，SEQ ID NO12)用于確定是否能在CGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO23)回文結(jié)構(gòu)的3’端加入其它序列而不減弱其免疫刺激活性，在其5’端具有刺激TCGTCG基序。該ODN也具有高的免疫刺激性(圖16)。
實施例11.ODN 2395的變體及其對IFN-α的誘導。
為了研究這種新的ODN誘導IFN-α分泌的結(jié)構(gòu)需求，我們合成了ODN 2395的變體并驗證其免疫刺激活性。表5總結(jié)了IFN-α誘導實驗的數(shù)據(jù)。
表5.ODN 2395的變體及其對IFN-α的誘導1，2
1下劃線是不同于2395的核苷酸；回文結(jié)構(gòu)以斜體表示。
2除了ODN 2336具有嵌合骨架(大寫字母表示磷酸二酯鍵，小寫字母表示硫代磷酸酯鍵)之外，所有的ODN都完全是硫代磷酸酯骨架。
從用硫代磷酸酯ODN 2395和2427-2433進行的第一組實驗可以看出，ODN的3’端的回文序列在誘導樹突細胞分泌IFN-α上起著重要的作用，其中樹突細胞是IFN-α的主要生產(chǎn)者(見2395和2429)，雖然一些在3’端沒有回文結(jié)構(gòu)的ODN(例如ODN2430和ODN 2432)有時候在較低濃度下也能誘導IFN-α(見圖17A)。ODN 2395和ODN 2429誘導IFN-的量最多，而2006(B類ODN)不誘導或者誘導量最少，ODN 2336(A類ODN)誘導的量較多。大部分實驗都證明ODN 2429誘導這種細胞因子的量更多(圖17B)。引入TCG基序(例如ODN 2427和ODN 2428)對IFN-α的分泌具有負效果。根據(jù)這些數(shù)據(jù)和對ODN 2186的其它研究，3’末端的gcc似乎也可能起到某種作用。
因此，我們檢驗了另一組都在3’端具有GCC的ODN。這些ODN均不能誘導IFN-α。因此在回文結(jié)構(gòu)中只有GCC似乎并不足以產(chǎn)生預(yù)期效果。
除此之外，5’末端具有TGC的ODN 5297也不能誘導IFN-α，盡管它具有回文結(jié)構(gòu)的3’序列。這結(jié)果表明對于這些ODN的活性來說，不只是3’回文序列而且5’的TCG基序也起重要的作用。
用ODN 5328(2395加上5’端的TGC基序)也證明了這一點。與A類ODN的甲基化相比，至少5’基序的甲基化減少了，但沒有完全破壞IFN-的分泌。這個發(fā)現(xiàn)與B類ODN的結(jié)果一致。盡管如此，具有部分3’端回文結(jié)構(gòu)但是5’端序列只有一個CpG二核苷酸(ODN 2136)的ODN也能誘導IFN-α。在先前對此ODN和具有完全3’回文結(jié)構(gòu)的ODN(ODN 5315)的研究結(jié)果中，ODN 5315比ODN 2136的活性強，但是不如ODN 2395。
ODN 5329雖然在3’端具有完全的CG回文結(jié)構(gòu)，但是卻不能誘導IFN-α或者誘導量很低，這表明對IFN-α活性來說存在優(yōu)選的特定回文序列。
實施例12.B細胞激活和IFN-α誘導之間的互反關(guān)系在實施例11中還用一些ODN做了B細胞激活實驗(圖18)。結(jié)果表明ODN誘導IFN-α的活性越高，激活B細胞的活性就越低(特別比較了ODN 2006，2336，2395和2429)。然而也證明所有這些ODN在刺激B細胞方面都比2336(A類ODN)活性高。
實施例13.對IFN-γ分泌的效果我們還將不同濃度的ODN與PBMC共培育不同的時間以檢測IFN-γ分泌(圖19A-C)。這些ODN誘導IFN-γ分泌的次序是2336＞2395，2429＞2006。但是在以IFN-α做為示值時這些ODN之間的差異并不明顯。
實施例14.對MLR中IFN-γ的效果我們還檢測了在混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中這些ODN誘導IFN-γ的效果。在這組實驗中，來自一個供體的淋巴細胞可對來自另一個供體的細胞表達的抗原發(fā)生反應(yīng)。結(jié)果證明ODN2006，2336和2395在這樣一個抗原特異性反應(yīng)中都能夠增強IFN-γ分泌(圖20)。這表明所有這些ODN都能增強對特定抗原的反應(yīng)性。
實施例15.ODN 2395比ODN 2006誘導的IL-10少另一組實驗是檢測促炎細胞因子IL-10的誘導。與前面IFN-的實驗一樣，PBMC與不同濃度的ODN共培育不同的時間(圖21A-C)。結(jié)果表明，ODN 2006誘導的IL-10量較多，相比之下ODN 2336誘導的量最少或較低。而ODN 2395和ODN 2429比ODN 2336誘導IL-10的量多，但是比ODN 2006的少。這再一次證明了這一類新的免疫刺激ODN具有免疫刺激活性，這種活性介于A類和B類ODN之間。
實施例16.ODN 2395比ODN 2006誘導TNF-α的量少，但是比ODN 8954多人PBMC與1.6μg/ml ODN 2006，8954，2395，2429，或LPS共培育6小時，然后收集上清，用特異性ELISA檢測TNF-α。結(jié)果如表6所示。
表6.不同類的代表性O(shè)DN對TNF-α的誘導
實驗表明在PBMC與這些ODN共培育的實驗組中檢測不出細胞因子IL-5和IL-15。
實施例17.IP-10的誘導人PBMC單獨培養(yǎng)，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的對照ODN 1585或?qū)φ誒DN 2118，或者加入0.6或3.0μg/ml的各種ODN培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)測定IP-10。結(jié)果如圖22所示。3.0μg/ml的ODN 2395，2429，2430，2432和2451，0.6μg/ml的ODN 2452都能夠誘導大量IP-10。
實施例18.IFN-α的誘導人PBMC單獨培養(yǎng)，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的對照ODN 1585或?qū)φ誒DN 2118，或者加入0.6或3.0μg/ml的各種ODN培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IFN-α。結(jié)果如圖23A(ODN濃度為0.6μg/ml)和圖23B(ODN濃度為3.0μg/ml)所示。3.0μg/ml的ODN 2395，2427，2429，2430，2431，2432和2451，0.6μg/ml的ODN 2452都能夠誘導大量IFN-α。
實施例19.IFN-γ的誘導人PBMC單獨培養(yǎng)，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的對照ODN 1585或?qū)φ誒DN 2118，或者加入0.6或3.0μg/ml的各種ODN培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IFN-γ。結(jié)果如圖24所示。3.0μg/ml的ODN 2395，2427，2429，2430，2431，2432，2451和2452，0.6μg/ml的ODN 2352都能夠誘導大量IFN-γ。
實施例20.IL-6的誘導人PBMC單獨培養(yǎng)，或者加入IL-2，或者加入10μg/ml的對照ODN 1585或?qū)φ誒DN 2118，或者加入0.6或3.0μg/ml的各種ODN培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IL-6。結(jié)果如圖25所示。0.6μg/ml的ODN 2395，2430，2432，2433，2136，2449，2450，2451和2452，3.0μg/ml的ODN 2449和ODN2451都能夠誘導大量IL-6。
實施例21.IFN-α的誘導人PBMC單獨培養(yǎng)，或者加入3.0或6.0μg/ml的各種ODN培養(yǎng)。ODN包括2006，8954，2395，2449，2450，2451，2452，5373(CGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO23)，5374(CGGCGCGCGCCGCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO24)，5375(CGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT，SEQ ID NO25)，5376(TCGGCGCGCGCCGTGCTGCTTT，SEQ ID NO26)和5377(CCGCCGTTTTCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO27)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IFN-α。結(jié)果如圖26所示。ODN 2395，2451，2452和5376都能夠誘導IFN-α。
實施例22.ODN 5515和ODN 5516對IFN-α的誘導得自兩個供體(D346和D240)的人PBMC單獨培養(yǎng)，或加入0.8，2.4或6.0μg/ml的ODN 2006，ODN 5515或ODN 5516培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IFN-α。結(jié)果如表7所示。ODN 5515和ODN 5516比ODN 2006更能有效誘導IFN-α，特別是在ODN濃度為2.4和6.0μg/ml的時候。
實施例23.ODN 20184，20185和20186對IFN-α的誘導得自三個供體(D445，D446和D448)的人PBMC單獨培養(yǎng)，或加入0.05，0.1，0.2，0.5或1.0μg/ml的ODN 2006，ODN 20184，ODN 20185或ODN 20186培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IFN-α。結(jié)果如表8所示。ODN 20184，ODN 20185或ODN 20186比ODN 2006更能有效誘導IFN-α，特別是在濃度為0.2-0.5μg/ml的時候。
表7.ODN 5515和ODN 5516對IFN-α的誘導(pg/ml)
表8.ODN 20184，20185和20186對IFN-α的誘導(pg/ml)
實施例24.ODN 8954，5569，和5570對IFN-α的誘導得自三個供體(D521，D525和D526)的人PBMC單獨培養(yǎng)，或加入0.03，0.06，0.125，0.25或1.0μg/ml的ODN 2006(SEQ IDNO39)，ODN 8954，ODN 5569(TIGTIGTTTTCGGCGGCCGCCGSEQ ID NO63)或ODN 5570(TCITCITTTTCGGCGGCCGCCGSEQ ID NO70)培養(yǎng)。24小時后收集上清，用特異ELISA測定IFN-α和IL-10。結(jié)果如表9和表10所示。
表9.ODN 8954，5569，和5570對IFN-α的誘導(pg/ml)
表10.ODN 8954，10101-2，5569，和5570對IL-10的誘導(pg/ml)
前述的書面描述足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。本發(fā)明并不限于實施例的范圍，由于實施例只是對本發(fā)明的各個方面進行舉例說明，其它功能上等同的實施方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。根據(jù)前面的描述，對本發(fā)明做適當修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，也落在權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。每一個實施方案并不需要完全囊括本發(fā)明的優(yōu)點和目的。
本申請中所有引用的參考文獻，專利和專利出版物都通過在此引述而合并于本文。
序列表<110>科勒制藥集團有限公司科勒制藥股份公司衣阿華大學研究基金會<120>具有提高的活性的組合基序免疫刺激寡肽<130>C01039/70063WO(HCL/AWS)<150>US 60/313,273<151>2001-08-17<150>US 60/393,952<151>2002-07-03<160>81<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>1tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2tcgtcgtttt cgtcgcgcgc cg22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>3tcgtcgtttt cgtcgcgcgg cg22
<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>4tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>5tcgtcgtttt cggcgcgccg cg 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>6tcgtcgtttt cggcgccggc cg 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>7tcgtcgtttt cggcccgcgc gg 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>8tcgtcgtttt ccgccgccgg gg22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>9tcgtcgtttt cggggggccc cc22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>10tcgtcgtttt ccccccgggg gg 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>11tcggcgcgcg ccgtcgtcgt tt 22<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>12tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgttttt27<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>13tcctgacgtt cggcgcgcgc cg 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>混合特征<222>(2)..(2)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(5)..(5)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(11)..(11)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(14)..(14)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(16)..(16)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(18)..(18)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(20)..(21)<223>n為5-甲基胞嘧啶<400>14tngtngtttt nggngngngn ng 22<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>15tgctgctttt cggcgcgcgc cg 22<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>16tcgtcgtttt cgcgcgcgcg cg 22<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>17tcgtcgttgg ttgtcgtttt ggtt 24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>18accatggacg agctgtttcc cctc 24<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>19tcctgacgtt cggcgcgcgc cc 22<210>20
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>20tgctgctttt gtgcttttgt gctt 24<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>21tcgtcgtttc gtcgttttga cgtt 24<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>22tcgcgtgcgt tttgtcgttt tgacgtt27<210>23<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>23cggcgcgcgc cg12<210>24<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>24
cggcgcgcgc cgcggcgcgc gccg 24<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>25cggcgcgcgc cgtcgtcgtt t 21<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>26tcggcgcgcg ccgtgctgcttt 22<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>27ccgccgtttt cggcgcgcgc cg 22<210>28<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>28cggcggccgc cg12<210>29<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>29cgcgcgcgcg cg12<210>30<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>30gcgcgcgcgc gc12<210>31<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>31ccccccgggg gg12<210>32<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>32ggggggcccc cc12<210>33<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>33cccccggggg 10<210>34<211>10<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>34gggggccccc 10<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>35ggggtcaacg ttgagggggg20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>36ggggtcaagc ttgagggggg20<210>37<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>37cggcgcgcgc cc12<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>38gcggcgggcg gcgcgcgccc20<210>39
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>39tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24<210>40<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>40tctcccagcg tgcgccat 18<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>41ataatcgacg ttcaagcaag20<210>42<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>42tctatcgacg ttcaagcaag20<210>43<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>43
tcgtcgtttt tgtcgttttt gtcgtt 26<210>44<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>44tcgtcgtttt gtcgtttttg tcgttt 26<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>45ttcgtgtttt cgtgttttcg tcgt 24<210>46<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>46tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22<210>47<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>混合特征<222>(3)..(3)<223>n為次黃嘌呤<220>
<221>混合特征<222>(6)..(6)<223>n為次黃嘌呤
<400>47tcntcntttt 10<210>48<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>48tgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt 25<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>49tcgtcgtttt gacgttttgt cgtt 24<210>50<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>50tcgtcgtttt gacgttttga cgtt 24<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>混合特征<222>(2)..(2)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(5)..(5)<223>n為5-甲基胞嘧啶
<220>
<221>混合特征<222>(13)..(13)<223>n為5-甲基胞嘧啶<220>
<221>混合特征<222>(21)..(21)<223>n為5-甲基胞嘧啶<400>51tngtngtttt gtngttttgt ngtt 24<210>52<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>52tcgtcgtttt ttgtcgtttt ttgtcgtt 28<210>53<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>53tttttttttt tttttttttt tttt 24<210>54<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>54tcgtcgctgt ctccgcttct tcttgcc27<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>55gggggacgat cgtcggggg 19<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>56ggggtcgacg tcgacgtcga ggggggg27<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>57ggggacgacg tcctgggggg g 21<210>58<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>58tcgtcgtttt cggcggccgc c 21<210>59<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>59tcgtcgtttt cggccgccgc c 21<210>60<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸<400>60tcgtcgtttt cggccgccgc cg 22<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>61tcgtcgtttt cgccgccgcc g 21<210>62<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>62tgctgctttt cggcggccgc cg 22<210>63<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>混合特征<222>(2)..(2)<223>n為次黃嘌呤<220>
<221>混合特征<222>(5)..(5)<223>n為次黃嘌呤<400>63tngtngtttt cggcggccgc cg 22<210>64<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>64tcgtcgtttt cggcggccga cg 22<210>65<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>65tcgtcgtttt cgtcggccgc cg 22<210>66<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>66tcgtcgtttt cgacggccgc cg 22<210>67<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>67tcgtcgtttt cggcggccgt cg 22<210>68<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>68cgacgatcgt cg12
<210>69<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>69cgacgtacgt cg12<210>70<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>混合特征<222>(3)..(3)<223>n為次黃嘌呤<220>
<221>混合特征<222>(6)..(6)<223>n為次黃嘌呤<400>70tcntcntttt cggcggccgc cg 22<210>71<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>71tcgtcgtttc gacggccgtc g 21<210>72<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>72tcgtcgtttc gacgatcgtc g 2權(quán)利要求
1.一種14-100個核苷酸長的免疫核酸，其包含下述結(jié)構(gòu)5’X1DCGHX23’其中X1和X2獨立地是任意0-10個核苷酸長的序列，D是非C的核苷酸，C是胞嘧啶，G是鳥嘌呤，H是非G的核苷酸，所述核酸進一步包括選自P和N的核酸序列，其中所述P和N緊鄰X1的5’端或緊鄰X2的3’端，N是一種B細胞中和序列，起始為CGG三核苷酸并且至少有10個核苷酸長，P是一種富含GC的回文結(jié)構(gòu)，包含至少10個核苷酸長的序列。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’NX1DCGHX23’。
3.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’X1DCGHX2N 3’。
4.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’PX1DCGHX23’。
5.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’X1DCGHX2P 3’。
6.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’X1DCGHX2PX33’，其中X3是任意0-10個核苷酸長的序列。
7.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’X1DCGHPX33’，其中X3是任意0-10個核苷酸長的序列。
8.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’DCGHX2PX33’，其中X3是任意0-10個核苷酸長的序列。
9.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’TCGHX2PX33’，其中X3是任意0-10個核苷酸長的序列。
10.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’DCGHPX33’，其中X3是任意0-10個核苷酸長的序列。
11.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸包含5’DCGHP3’。
12.權(quán)利要求1的核酸，其中D是胸腺嘧啶(T)。
13.權(quán)利要求1的核酸，其中H是T。
14.權(quán)利要求1的核酸，其中H是T，X2選自CG，CGT，CGTT，CGTTT，和CGTTTT。
15.權(quán)利要求1的核酸，其中H是T，X2是CG。
16.權(quán)利要求1的核酸，其中H是T，X2是CGTTTT。
17.權(quán)利要求1的核酸，其中C未被甲基化。
18.權(quán)利要求1的核酸，其中N包括至少四個CG二核苷酸和不超過兩個CCG三核苷酸。
19.權(quán)利要求1的核酸，其中P包括至少一個次黃嘌呤。
20.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸具有抗核酸酶骨架。
21.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸具有硫代磷酸酯骨架。
22.權(quán)利要求1的核酸，進一步在5’端包括一個polyT序列。
23.權(quán)利要求1的核酸，進一步在3’端包括一個polyT序列。
24.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸是14-40個核苷酸長。
25.權(quán)利要求1的核酸，其中所述免疫刺激核酸是14-30個核苷酸長。
26.一種13-100個核苷酸長的免疫核酸，其包含下述結(jié)構(gòu)5’N1PyGN2P 3’其中N1是任意1-6個核苷酸長的序列，Py是嘧啶，G是鳥嘌呤，N2是任意0-30個核苷酸長的序列，P是包含至少10個核苷酸長的序列的富含GC的回文結(jié)構(gòu)。
27.權(quán)利要求26的核酸，其中N1至少50％是嘧啶。
28.權(quán)利要求26的核酸，其中N1至少50％是T。
29.權(quán)利要求26的核酸，其中N1包括至少一個CG基序。
30.權(quán)利要求26的核酸，其中N1包括至少一個TCG基序。
31.權(quán)利要求26的核酸，其中N1包括至少一個CI基序。
32.權(quán)利要求26的核酸，其中N1包括至少一個TCI基序。
33.權(quán)利要求26的核酸，其中N1包括至少一個IG基序。
34.權(quán)利要求26的核酸，其中N1包括至少一個TIG基序。
35.權(quán)利要求26的核酸，其中N1是TCGG。
36.權(quán)利要求26的核酸，其中N1是TCGH，其中H是非G的核苷酸。
37.權(quán)利要求26的核酸，其中Py是未甲基化的C。
38.權(quán)利要求26的核酸，其中N2至少50％是嘧啶。
39.權(quán)利要求26的核酸，其中N2至少50％是T。
40.權(quán)利要求26的核酸，其中N2不包括任何polyG或polyA基序。
41.權(quán)利要求26的核酸，其中N1PyGN2選自TTTTTCG，TCG，TTCG，TTTCG，TTTTCG，TCGT，TTCGT，TTTCGT，和TCGTCGT。
42.權(quán)利要求26的核酸，其中所述免疫刺激核酸具有完全抗核酸酶的骨架。
43.權(quán)利要求26的核酸，其中所述抗核酸酶的骨架由硫代磷酸酯鍵組成。
44.權(quán)利要求26的核酸，其中所述免疫刺激核酸完全是磷酸二酯骨架。
45.權(quán)利要求26的核酸，其中所述免疫刺激核酸具有嵌合骨架。
46.權(quán)利要求45的核酸，其中所述免疫刺激核酸在CG，CI或IG基序之間具有至少一個磷酸二酯鍵。
47.權(quán)利要求26的核酸，其中P完全是回文的。
48.權(quán)利要求26的核酸，其中P是具有1到3個連續(xù)插入核苷酸的回文結(jié)構(gòu)。
49.權(quán)利要求48的核酸，其中所述插入核苷酸是TG。
50.權(quán)利要求26的核酸，其中P包括至少3個C和至少3個G。
51.權(quán)利要求26的核酸，其中P包括至少4個C和至少4個G。
52.權(quán)利要求26的核酸，其中P包括至少5個C和至少5個G。
53.權(quán)利要求26的核酸，其中P包括至少一個次黃嘌呤。
54.權(quán)利要求26的核酸，其中所述免疫刺激核酸是13-40個核苷酸長。
55.權(quán)利要求26的核酸，其中所述免疫刺激核酸是13-30個核苷酸長。
56.一種13-100個核苷酸長的免疫核酸，其包含下述結(jié)構(gòu)5’N1PyG/IN2P 3’其中N1是任意1-6個核苷酸長的序列，Py是嘧啶，G/I單個核苷酸，其是G或I，G是鳥嘌呤，I是次黃嘌呤，N2是任意0-30個核苷酸長的序列，P是包含至少10個核苷酸長的序列的富含GC的回文結(jié)構(gòu)。
57.權(quán)利要求56的核酸，其中N1PyIN2是TCITCITTTT(SEQ IDNO47)。
58.權(quán)利要求56的核酸，其中P是富含GC的回文結(jié)構(gòu)。
59.權(quán)利要求56的核酸，其中P是富含IC的回文結(jié)構(gòu)。
60.權(quán)利要求56的核酸，其中G/I是G。
61.權(quán)利要求56的核酸，其中G/I是I。
62.權(quán)利要求56的核酸，其中所述免疫刺激核酸是13-30個核苷酸長。
63.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-62任一項的免疫刺激核酸，和一種藥學可接受的載體。
64.一種誘導1型干擾素(IFN)表達的方法，包括將能表達1型干擾素的細胞與有效量的權(quán)利要求1-62任一項的免疫刺激核酸接觸以誘導1型IFN的表達。
65.一種激活天然殺傷(NK)細胞的方法，包括將NK細胞與有效量的權(quán)利要求1-62任一項的免疫刺激核酸接觸以激活NK細胞。
66.一種治療感染的方法，包括給已感染或有感染危險的患者施用有效量的權(quán)利要求1-62任一項的免疫刺激核酸以治療或預(yù)防感染。
67.權(quán)利要求66的方法，其中患者的感染或具有的感染危險是來自病毒，細菌，真菌和寄生蟲的感染。
68.一種治療變態(tài)反應(yīng)的方法，包括給已發(fā)生變態(tài)反應(yīng)或有發(fā)生變態(tài)反應(yīng)危險的患者施用有效量的權(quán)利要求1-62任一項的免疫刺激核酸以治療或預(yù)防態(tài)反應(yīng)。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述變態(tài)反應(yīng)是變應(yīng)性哮喘。
70.一種治療癌癥的方法，包括給已患癌癥或有患癌癥危險的患者施用有效量的權(quán)利要求1-62任一項的免疫刺激核酸以治療或預(yù)防癌癥。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述癌癥選自基底細胞癌，膽道癌；膀胱癌；骨癌；腦癌和CNS癌；乳腺癌；宮頸癌；惡性合體細胞瘤；結(jié)腸癌和直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌癥；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；眼癌；頭部和頸部癌癥；胃癌；內(nèi)皮腫瘤；腎癌；喉癌；白血??；肝癌；肺癌；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；成神經(jīng)細胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰癌；前列腺癌；成視網(wǎng)膜細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；腎癌；呼吸系統(tǒng)癌癥；肉瘤；皮膚癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌癥，以及其它癌擴散和肉瘤。
72.一種免疫刺激核酸，包含選自下組的序列TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO1)，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG(SEQ ID NO4)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCCGCG(SEQ ID NO5)，TCGTCGTTTTCGGCGCCGGCCG(SEQ ID NO6)，TCGTCGTTTTCGGCCCGCGCGG(SEQ ID NO7)，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTTT(SEQ IDNO12)，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ ID NO13)，TZGTZGTTTTZGGZGZGZGZZG(SEQ ID NO14)，其中Z是5-甲基胞嘧啶，TCCTGACGTTCGGCGCGCGCCC(SEQ ID NO19)，和TCGGCGCGCGCCGTCGTCGTTT(SEQ ID NO11)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類具有至少兩個功能結(jié)構(gòu)域的免疫刺激核苷酸。這一類組合基序免疫刺激核苷酸可以激活免疫反應(yīng)，可用于治療各種免疫相關(guān)的疾病，如癌癥，傳染病，變應(yīng)性紊亂。該核苷酸也可以激活天然殺傷細胞，并刺激1型干擾素的產(chǎn)生。
文檔編號A61P37/04GK1604795SQ02818213
公開日2005年4月6日 申請日期2002年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月17日
發(fā)明者阿瑟·M·克里格, 喬格·沃爾默, 歐金·尤爾曼 申請人:科勒制藥股份公司, 衣阿華大學研究基金會