專利名稱：治療內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法
本申請(qǐng)是1997年9月10日提交的、發(fā)明名稱為“治療內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法”的97199338.6號(hào)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
血管內(nèi)皮是一層貼附在內(nèi)層血管壁并與血液直接接觸的細(xì)胞，其在循環(huán)系統(tǒng)與血管外腔隙之間提供了一個(gè)有活性的天然屏障。內(nèi)皮在細(xì)胞、組織和器官水平上參與信號(hào)和信息的傳遞，在細(xì)胞介導(dǎo)以及體液免疫應(yīng)答中都起作用。內(nèi)皮細(xì)胞具有代謝活性，通常產(chǎn)生許多對(duì)血管腔以及血小板產(chǎn)生作用的物質(zhì)。內(nèi)皮血管舒張劑包括前列腺環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮衍生松馳因子(EDRF，它可能是一氧化氮或其較穩(wěn)定的加合物)；這兩種物質(zhì)還發(fā)揮作用以抑制血小板聚集。
由物理創(chuàng)傷或如形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病程導(dǎo)致的內(nèi)皮的創(chuàng)傷或破壞可減少EDRF的生成，從而導(dǎo)致血管收縮。更為擴(kuò)散和銳敏的內(nèi)皮創(chuàng)傷，例如由慢性高血壓或局部缺血后的血液再充滿導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷，也導(dǎo)致變化的EDRF的產(chǎn)生。被定位于管腔內(nèi)皮表面的內(nèi)皮產(chǎn)物包括外ADP酶(ectoADPase)和血栓調(diào)節(jié)蛋白。內(nèi)皮釋放的血管收縮劑包括內(nèi)皮縮血管肽。內(nèi)皮細(xì)胞還分泌增強(qiáng)內(nèi)皮有絲分裂發(fā)生并可誘導(dǎo)新血管形成(血管發(fā)生)的生長(zhǎng)因子。已報(bào)道粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。白介素-3(IL-3)也增強(qiáng)這些細(xì)胞的增殖。參見(jiàn)Bussolino等自然337471(1989)；Brizzi等臨床研究雜志(J.clin.Invest.)912887(1993)。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是一種在用化療劑治療的個(gè)體中增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抑制的方法，包括將化療劑與內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素聯(lián)合給藥。內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素可與化療劑同時(shí)或在化療劑給藥之前或之后給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種治療實(shí)體血管瘤的方法，包括將內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素與抗癌化療劑聯(lián)合給藥。內(nèi)皮抑制量的紅細(xì)胞生成素可與化療劑同時(shí)或在化療劑給藥之前或之后給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種治療由機(jī)械創(chuàng)傷、暴露于放射線下、炎癥、心臟病或癌癥導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法，包括將內(nèi)皮保護(hù)量的紅細(xì)胞生成素對(duì)需要這種治療的個(gè)體給藥。
本發(fā)明前面以及其它的目的將在下面提供的說(shuō)明書(shū)中詳細(xì)解釋。
圖2顯示與僅置于順鉑的對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物比較，同時(shí)置于鉑順和不同劑量的EPO的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)。
圖3顯示首先置于順鉑，兩小時(shí)后再置于不同劑量的EPO的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)(與僅置于順鉑的對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物比較)。
圖4顯示首先置于不同劑量的EPO，兩小時(shí)后再置于順鉑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物的反應(yīng)(與僅置于順鉑的對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物比較)。
發(fā)明詳述本發(fā)明人以前已證實(shí)重組人紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有促有絲分裂和化學(xué)引誘劑作用(遷移)。參見(jiàn)Anagnostou等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 875978(1990)。內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖是生成血管過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)EPO可有效地防止和/或修復(fù)由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與化療劑聯(lián)合給藥EPO產(chǎn)生雙相應(yīng)答一定劑量的EPO保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于化療劑的有害影響，同時(shí)劑量的增加增強(qiáng)由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制。
EPO在化療期間增強(qiáng)內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制中的用途可用于治療生血管腫瘤，這是希望阻止或減慢支持腫瘤生長(zhǎng)的新血管的形成。腫瘤需要充足的血液供應(yīng)，腫瘤組織分泌的生血管因子刺激了新血管在腫瘤實(shí)體中的生長(zhǎng)。在動(dòng)物模型中，已表明抑制腫瘤組織中的血管生成觸導(dǎo)致腫瘤退化。高度血管化的實(shí)體腫瘤包括小腦成血管細(xì)胞瘤、乳腺管癌和喉鱗狀上皮細(xì)胞癌。異常的血管生成與其它病理疾病有關(guān)，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、新血管性青光眼、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及牛皮癬。EPO降低或防止異常血管生成的能力在防止或降低與這些病情相關(guān)的血管生成中將是有用的。
根據(jù)本發(fā)明的一種方法是EPO作為致瘤性疾病化療中的輔助劑的用途。當(dāng)希望保護(hù)內(nèi)皮免于化療劑的不利影響時(shí)，EPO以內(nèi)皮保護(hù)量提供。根據(jù)本發(fā)明的第二種方法是EPO作為致瘤性疾病化療中的輔助劑的用途，其中希望增強(qiáng)化療劑對(duì)內(nèi)皮的不利影響(例如增強(qiáng)內(nèi)皮生長(zhǎng)的抑制)。在這種情況下，EPO以內(nèi)皮抑制量提供。
如本文所采用的，EPO的內(nèi)皮保護(hù)量指能降低或防止本來(lái)是由于暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或已知?jiǎng)?chuàng)傷內(nèi)皮的病情而另外產(chǎn)生的內(nèi)皮生長(zhǎng)的抑制的劑量。另一方面，EPO的內(nèi)皮保護(hù)量可定義為在暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或患有已知?jiǎng)?chuàng)傷內(nèi)皮的疾病后能增加可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的那些劑量；可存活細(xì)胞數(shù)目的增加是指與沒(méi)有EPO時(shí)所預(yù)期的數(shù)目進(jìn)行比較而有所增加。EPO最有效的內(nèi)皮保護(hù)量可隨給藥的時(shí)間以及內(nèi)皮創(chuàng)傷的病因，不同而發(fā)生變化。
在內(nèi)皮創(chuàng)傷是由于置于化療劑時(shí)，根據(jù)EPO是否與化療劑同時(shí)，或在其之前或之后給藥，EPO最有效的內(nèi)皮保擴(kuò)量將發(fā)生變化，并可能隨所用的具體化療劑的不同而發(fā)生變化。
如本文所采用的，EPO的內(nèi)皮抑制量指能增強(qiáng)或增加本來(lái)是由于暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或患有已知?jiǎng)?chuàng)傷內(nèi)皮的疾病而產(chǎn)生的內(nèi)皮生長(zhǎng)的抑制的劑量。另一方面，EPO的內(nèi)皮抑制量可定義為在暴露于化療劑或放射線、機(jī)械創(chuàng)傷或患有已知?jiǎng)?chuàng)傷內(nèi)皮的病情后減少可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的那些劑量；可存活細(xì)胞數(shù)目的減少是指與沒(méi)有EPO時(shí)所預(yù)期的數(shù)目進(jìn)行比較而有所減少。EPO最有效的內(nèi)皮抑制量可隨給藥的時(shí)間以及內(nèi)皮創(chuàng)傷的病因，不同而發(fā)生變化。
在內(nèi)皮創(chuàng)傷是由于置于化療劑時(shí)，根據(jù)EPO是否與化療劑同時(shí)，或在其之前或之后給藥，EPO最有效的內(nèi)皮抑制量將發(fā)生變化，并可隨所用的具體化療劑的不同而發(fā)生變化。
可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的減少和/或可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的減少來(lái)評(píng)價(jià)導(dǎo)致可存活內(nèi)皮細(xì)胞總的數(shù)目減少的內(nèi)皮創(chuàng)傷。這種可存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目的減少也可稱為內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制或內(nèi)皮細(xì)胞抑制或抑制作用。
如本文所采用的，一種減少由于對(duì)個(gè)體給藥化療劑而造成的個(gè)體內(nèi)皮創(chuàng)傷的方法指減少或防止本來(lái)由于給藥化療劑而造成的可存活內(nèi)皮細(xì)胞減少的方法。如本文所采用的，一種增強(qiáng)由于對(duì)個(gè)體給藥化療劑造成的個(gè)體中的內(nèi)皮抑制的方法指增加或增強(qiáng)本來(lái)是由于給藥化療劑而造成的可存活內(nèi)皮細(xì)胞減少的方法。
內(nèi)皮細(xì)胞的創(chuàng)傷也可由放療、機(jī)械創(chuàng)傷以及由如炎癥、心臟病(如動(dòng)脈粥樣硬化)和癌癥的疾病造成。例如在動(dòng)脈粥樣硬化中，內(nèi)皮創(chuàng)傷或功能異常導(dǎo)致血管舒張反應(yīng)減弱以及增加血小板在動(dòng)脈壁上的沉積。從沉積的血小板中釋放的血清緊張素和血栓烷A2引起動(dòng)脈收縮和痙攣，增加血小板的黏附和聚集，并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。通過(guò)生血管刺激而形成新的冠狀血管經(jīng)常使冠狀動(dòng)脈阻塞的后果得以改善。EPO在增強(qiáng)內(nèi)皮生長(zhǎng)和/或修復(fù)或防止內(nèi)皮創(chuàng)傷中的使用將使其成為一個(gè)有效的治療由于機(jī)械創(chuàng)傷、放療或由于對(duì)內(nèi)皮產(chǎn)生不利影響的疾病而造成的內(nèi)皮創(chuàng)傷劑。
如本文所采用的，人紅細(xì)胞生成素(EPO)指天然產(chǎn)生的人紅細(xì)胞生成素糖蛋白以及重組人紅細(xì)胞生成素(rHuEpo或epoetinα，可以Epogen(Amgen公司，Thousand Oaks，CA)和Procrit(Ortho生物技術(shù)公司，Ratitan，NJ)的形式商購(gòu)獲得)。EPO的肽類似物也可用于本發(fā)明的方法中。如本文所采用的，肽類似物為雖然不具有與EPO相同的氨基酸序列，但具有類似的三維結(jié)構(gòu)的那些化合物。在與受體相互作用的蛋白分子中，相互作用發(fā)生在穩(wěn)定的三維分子的表面可這位點(diǎn)?？筛鶕?jù)已知方法，通過(guò)以適宜構(gòu)象排列關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)殘基，設(shè)計(jì)和合成模擬EPO結(jié)合區(qū)的必需的表面特征的肽。具有與EPO結(jié)合表面基本相同的分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表面區(qū)域的分子將能夠模擬EPO與EPO受體的相互作用。業(yè)已知確定肽三維結(jié)構(gòu)以及其類似物的方法，有時(shí)被稱為‘合理的藥物設(shè)計(jì)技術(shù)’。參見(jiàn)例如Geysen的美國(guó)專利號(hào)4,833,092；Nestor的美國(guó)專利號(hào)4,859,765；Pantoliano的美國(guó)專利號(hào)4,853,871；Blalock的美國(guó)專利號(hào)4,863,857(申請(qǐng)人特別說(shuō)明本文所引用的全部美國(guó)專利公開(kāi)被全文引作參考)。
在本發(fā)明的方法中，模擬紅細(xì)胞生成素生物活性的肽(EPO受體肽配體)可替代EPO。這些肽的序列可代表全長(zhǎng)EPO蛋白序列的片段，其中該片段能與EPO受體結(jié)合以及活化它。此外，在這些肽模擬EPO生物活性時(shí)，具有不類似于EPO的序列的肽可用于本發(fā)明的方法中。Wrighton等報(bào)道了結(jié)合并活化靶細(xì)胞表面上的紅細(xì)胞生成素受體的小分子肽的鑒定和表征，雖然這些肽序列不類似于EPO的一級(jí)結(jié)構(gòu)(Wrighton等科學(xué)273458(1996，7，26))。(用二硫鍵結(jié)合的14氨基酸環(huán)肽代表這些肽激動(dòng)劑，其中環(huán)肽具有已鑒定的最小共有序列。Livnah等，科學(xué)273464(1996，7，26)描述了一種這樣的肽模擬物與紅細(xì)胞生成素受體的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
如本文所采用的，術(shù)語(yǔ)化療劑指細(xì)胞毒性抗腫瘤劑，即治療上用來(lái)阻止或降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，優(yōu)先殺死腫瘤細(xì)胞或打斷迅速增殖細(xì)胞的細(xì)胞周期的化學(xué)物質(zhì)。化療劑也稱為抗腫瘤藥物或細(xì)胞毒性劑并為本領(lǐng)域所熟知。如本文所采用的，化療包括用一種化療劑或用化療劑的組合物進(jìn)行治療。在需要治療的個(gè)體中，化療可與外科治療或放療或與其它抗腫瘤治療方法結(jié)合。
作為實(shí)例的化療劑為長(zhǎng)春花生物堿、表鬼臼毒素、蒽環(huán)霉素抗生素、放線菌素D、普卡霉素、(嘌呤霉素、短桿菌肽D、paclitaxel(Taxol@，Bristol Myers Squibb)、秋水仙堿、細(xì)胞松弛素B、依米啶、美登素以及安吖啶(或“mAMSA”)。長(zhǎng)春花生物堿類描述在Goodman和Gilman的治療的藥物學(xué)基礎(chǔ)，1227-1280(第7版，1985)(下文為“Goodman和Gilman”)。長(zhǎng)春花生物堿的實(shí)例為長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春地辛。表鬼臼毒素類描述在Goodman和Gilman，見(jiàn)上文1280-1281。表鬼臼毒素的實(shí)例為依托泊甙、依托泊甙正醌和替尼泊甙。蒽環(huán)霉素抗生素類描述在Goodman和Gilman，見(jiàn)上文1283-1285。蒽環(huán)霉素抗生素的實(shí)例為柔紅霉素、阿霉素、米托蒽醌和比生群。放線菌素D，也稱為更生菌素描述在Goodman和Gilman，見(jiàn)上文1281-1283。普卡霉素，也稱為光神霉素，描述在Goodman和Gilman，見(jiàn)上文1287-1288。其它的化療劑包括順鉑(Platinol，Bristol Myers Squibb)；卡鉑(Paraplatin，Bristol Myers Squibb)；絲裂霉素(Mutamycin，Bristol MyersSquibb)；六甲蜜胺(Hexalen，U.S.Bioscience，Inc.)；環(huán)磷酰胺(Cytoxan，Bristol Myers Squibb)；洛莫司叮[CCNU](CeeNU，Bristol Myers Squibb)；卡莫司叮[BCNU](BiCNU，Bristol Myers Squibb).
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，化療藥物的給藥方法根據(jù)所使用的具體的化療劑而發(fā)生變化。根據(jù)所使用的化療劑，例如可通過(guò)注射(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、胸膜內(nèi))或口服給藥化療劑。
如本文所采用的，一種化合物與另一種化合物“聯(lián)合”給藥指以足夠接近的時(shí)間給藥兩種化合物，這樣一種化合物的存在改變另一種的生物作用。兩種化合物可同步(同時(shí))或依次給藥?？赏ㄟ^(guò)在給藥前混合化合物，或通過(guò)在相同時(shí)間點(diǎn)但在不同的組織位點(diǎn)給藥化合物或使用不同的給藥途徑來(lái)完成同時(shí)給藥。
如本文所采用的短語(yǔ)“同時(shí)的給藥”、“同步的給藥”或“同時(shí)給藥”指化合物在相同的時(shí)間點(diǎn)或彼此緊接著給藥。在后一種情況下，兩種化合物在足夠接近的時(shí)間內(nèi)給藥，以致觀察到的結(jié)果與化合物在相同時(shí)間點(diǎn)給藥時(shí)獲得的結(jié)果難以區(qū)別。
用本發(fā)明方法治療的個(gè)體包括人和動(dòng)物(例如狗、貓、牛、馬)個(gè)體，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物個(gè)體。
許多化療劑在細(xì)胞周期的特定時(shí)期起作用，并僅對(duì)處于分裂過(guò)程中的細(xì)胞具有活性。對(duì)化療最敏感的腫瘤為具有高百分比處于細(xì)胞分裂過(guò)程的細(xì)胞的腫瘤，包括但不局限于乳腺、肝、腦、肺以及卵巢癌。高度血管化的實(shí)體瘤適宜于用內(nèi)皮抑制量的EPO結(jié)合化療劑治療，因?yàn)檫@些腫瘤依賴于血管生成以為生長(zhǎng)的腫瘤組織提供足夠的血液供應(yīng)。
可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的任何適宜的方式給藥根據(jù)本發(fā)明所使用的EPO?？扇?例如靜脈內(nèi))或局部(例如注射至腫瘤、緊圍繞腫瘤的組織中或注射至包含腫瘤的解剖學(xué)腔隙中)給藥EPO。例如，在內(nèi)皮抑制量的EPO作為化療的輔助劑使用時(shí)，可將EPO局部給藥至希望防止血管生成的腫瘤(或緊圍繞腫瘤的組織)中。例如在全身性地遞送化療劑時(shí)，可通過(guò)靜脈注射全身性地給藥內(nèi)皮保護(hù)量的EPO。
與化療劑結(jié)合使用的EPO的給藥劑量和給藥時(shí)間將類似地取決于所希望達(dá)到的效果。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)根據(jù)EPO的給藥時(shí)間(同時(shí)、在化療劑給藥之前或之后)以及給藥劑量的不同，EPO既能起保護(hù)內(nèi)皮免受化療劑的生長(zhǎng)抑制作用，又能起增強(qiáng)使用化療劑所見(jiàn)到的內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制的作用。如何通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定與特定的化療劑結(jié)合使用以獲得所需效果的EPO的給藥劑量和時(shí)間對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講是顯而易見(jiàn)的。
未確定可以單次量或多次量給藥的EPO的最大量。在三至四周中已給藥高達(dá)1,500單位/kg的劑量而沒(méi)有由于EPO本身引起的毒性作用。參見(jiàn)Eschbach等，慢性尿毒癥的預(yù)防(Prevention of ChronicUremia)(Friedman等編)，F(xiàn)ield and Wood Inc.，Philadelphia，pp 148-155(1989)。在本方法中，在希望保護(hù)內(nèi)皮免受由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷和/或內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制時(shí)，以內(nèi)皮保護(hù)量給藥EPO。適宜的內(nèi)皮保護(hù)劑量為約100U/kg-約200U/kg。在本方法中，在希望增強(qiáng)由化療劑導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷和/或內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制時(shí)，EPO以內(nèi)皮抑制量給藥，其可為約750U/kg-約2000U/kg。如上所述，與化療劑結(jié)合使用的EPO的給藥劑量和時(shí)間將取決于所需效果以及使用的化療劑。
提供下面的實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明，不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)它們的限定。
收集在完全(補(bǔ)充)M199培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期內(nèi)皮細(xì)胞。在80-90％完全鋪滿時(shí)，將EC培養(yǎng)物單細(xì)胞層用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，用0.25％胰蛋白酶的1mM EDTA溶液處理1-2分鐘，接著將細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基中。分別使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和錐蟲(chóng)藍(lán)染色確定細(xì)胞的數(shù)目和存活率。制備7.22×104細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液，將90ul(6.5×103細(xì)胞)分散在96井平板的各井中。在37℃，5％CO2，增濕空氣下培養(yǎng)過(guò)夜后，以在下面描述的實(shí)施例中說(shuō)明的濃度和順序加入EPO和/或化療劑。接著再將平板保溫24小時(shí)。如制造商所推薦，在保溫末期，將20ul新制備的混合MTS/PMS(20∶1比例)溶液加入到各井中，將平板再保溫1-4小時(shí)。使用ELIAS平板計(jì)數(shù)器記錄在490nm處各井的吸光率。通過(guò)將490nm處的校正的吸光率對(duì)加入物(EPO、化療劑或其混合物)的濃度作圖確定LD50以及各種處理對(duì)細(xì)胞存活率以及化學(xué)敏感性的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)研究對(duì)于保護(hù)/抑制分析，將實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。所有其它實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少5次。將結(jié)果取平均值并以平均值±SD表示。所有實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組包括用下面一種處理的1-2個(gè)重復(fù)三次的井1)1ug/ml順鉑；2)50ug/ml順鉑；3)10或20U/ml EPO；4)0.6或1.2U/ml EPO。
因此，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，3-6個(gè)井獲得了上面四種對(duì)照組處理(總共12-24個(gè)對(duì)照組井)。還對(duì)由重復(fù)三次的未處理細(xì)胞井構(gòu)成的其它對(duì)照組進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)上面的發(fā)現(xiàn)，如下面實(shí)施例所提供的，用1ug/ml劑量的順鉑來(lái)測(cè)定EPO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
如實(shí)施例1描述地制備內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物。將順鉑(最終濃度為1ug/ml)與5ul各種濃度的EPO制備物(最終EPO濃度從0.15變化至20U/ml)同時(shí)加入到各試驗(yàn)井中。使用實(shí)施例1描述的MTS/PMS比色分析法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。將結(jié)果與對(duì)照組井比較(僅用1ug/ml順鉑處理的內(nèi)皮細(xì)胞，其被當(dāng)作基線并在圖2中以0％代表)。結(jié)果提供在圖2中；“對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)”為相對(duì)于對(duì)照組，490nm處的光密度變化的百分?jǐn)?shù)，這樣“0％”說(shuō)明試驗(yàn)井具有與對(duì)照組類似數(shù)目的代謝活性細(xì)胞，而“50％”說(shuō)明多50％，“-50％”說(shuō)明少50％的代謝活性細(xì)胞。
如圖2所示，當(dāng)EPO與順鉑同時(shí)加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，觀察到雙相反應(yīng)。當(dāng)EPO與順鉑同時(shí)加入時(shí)，用0.15-1.25U/mlEPO處理的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物被保護(hù)免于順鉑的創(chuàng)傷作用。當(dāng)EPO與順鉑同時(shí)加入時(shí)，0.3U/ml的EPO濃度提供內(nèi)皮細(xì)胞的最大保護(hù)；存活細(xì)胞的數(shù)目比在僅用順鉑處理的對(duì)照組培養(yǎng)物中觀察到的高約30％。
還如圖2所示，與單獨(dú)用順鉑處理的培養(yǎng)物比較，當(dāng)EPO與順鉑同時(shí)加入時(shí)，在用5-20U/ml EPO處理的培養(yǎng)物中的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制。與僅暴露于順鉑的對(duì)照組細(xì)胞相比，用5U/ml EPO和1ug/ml順鉑處理的培養(yǎng)物顯示存活細(xì)胞的數(shù)目減少了33％。
如實(shí)施例1描述地制備內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。將順鉑加入到各試驗(yàn)井中(順鉑的最終濃度為1ug/ml)；2小時(shí)后，加入最終濃度變化范圍為0.15-20U/ml的EPO制備物。使用如實(shí)施例描述的MTS/PMS比色法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。將結(jié)果與對(duì)照組井(僅用1ug/ml順鉑處理的內(nèi)皮細(xì)胞)比較。
結(jié)果提供在圖3中，表明當(dāng)在加入順鉑后將EPO加入到細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)觀察到了雙相反應(yīng)。當(dāng)在暴露于順鉑2小時(shí)后加入EPO時(shí)，用0.15-5U/ml EPO處理的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物被保護(hù)免于順鉑的創(chuàng)傷作用。在暴露于順鉑之后用1.25U/mlEPO處理過(guò)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中，存活細(xì)胞的數(shù)目比對(duì)照組高34％。相反，在暴露于順鉑2小時(shí)后給藥10-20U/ml EPO的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中，細(xì)胞的存活率比在對(duì)照組(僅暴露于順鉑中)中所觀察到的要低。
如實(shí)施例1描述地制備內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)物。每個(gè)試驗(yàn)井加入5ul濃度為0.15-20U/ml的EPO制備物；2小時(shí)后，將順鉑加入到各試驗(yàn)井中(5ul 1ug/ml的順鉑)。使用如實(shí)施例描述的MTS/PMS比色法確定內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。將結(jié)果與對(duì)照組井(僅用1ug/ml順鉑處理的細(xì)胞)比較。
結(jié)果提供在圖4中，表明了在暴露于順鉑之前2小時(shí)暴露于EPO后的存活內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目的降低(與僅暴露于順鉑的對(duì)照組細(xì)胞比較)。與對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖和存活率降低了81％。抑制為劑量依賴性的；與對(duì)照組比較，低如5和2.5U/ml的EPO濃度分別降低細(xì)胞生長(zhǎng)58％和48％。
前面是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)它們的限定。本發(fā)明用下面的權(quán)利要求來(lái)定義，權(quán)利要求的等效物應(yīng)被包括在其中。
權(quán)利要求
1.紅細(xì)胞生成素在制備一種藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于與化療劑聯(lián)合給藥以增強(qiáng)用化療劑治療的個(gè)體的內(nèi)皮細(xì)胞抑制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述紅細(xì)胞生成素與所述化療劑同時(shí)給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之前給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之后給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述化療劑為順鉑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述個(gè)體患有選自小腦成血管細(xì)胞瘤、乳腺管癌以及喉鱗狀上皮細(xì)胞癌的腫瘤生長(zhǎng)。
7.紅細(xì)胞生成素在制備一種藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于與抗癌化療劑聯(lián)合給藥以治療個(gè)體的實(shí)體血管瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述紅細(xì)胞生成素與化療劑同時(shí)給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之前給藥。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述紅細(xì)胞生成素在所述化療劑之后給藥。
11.紅細(xì)胞生成素在制備一種藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療個(gè)體的由機(jī)械創(chuàng)傷、暴露于放射線下、炎癥、心臟病或癌癥導(dǎo)致的內(nèi)皮創(chuàng)傷。
全文摘要
描述了人紅細(xì)胞生成素(EPO)在預(yù)防或治療由于化療、放療、機(jī)械創(chuàng)傷或由于損害內(nèi)皮的疾病(如炎癥、心臟病或癌癥)造成的內(nèi)皮創(chuàng)傷中的用途。描述了EPO在與化療劑聯(lián)合給藥中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/22GK1429623SQ02150688
公開(kāi)日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月11日
發(fā)明者阿塔納修斯A·阿納諾斯托, 喬治·西高納斯 申請(qǐng)人:東卡羅萊娜大學(xué)