專利名稱：用于生產現(xiàn)成可用的加載抗原或未加載抗原的冷藏成熟樹突細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于制備現(xiàn)成可用的冷藏成熟樹突細胞的方法，尤其是用于制備含有這類樹突細胞的疫苗的方法，其中在合適的成熟刺激物存在下培養(yǎng)未成熟樹突細胞，并且將如此獲得的成熟樹突細胞冷凍。在冷凍之前或之后，可以給所述樹突細胞加載抗原。本發(fā)明也涉及用按照本發(fā)明的方法獲得的疫苗，還涉及含有加載抗原的冷凍成熟樹突細胞的組合物。
背景技術：
樹突細胞(在下文簡稱為“DC”)是抗原呈遞細胞，通過與淋巴細胞相互作用而影響免疫系統(tǒng)。大多數(shù)DC表現(xiàn)出免疫刺激活性。這些典型的DC在體內可以以不同方式誘導輔助性T細胞和殺傷性T細胞的形成(“天然佐劑”)。特別是，在外周組織中存在的未成熟DC具有結合抗原并且由其制備免疫原性MHC肽復合體(“抗原加工模式”)的能力。當成熟誘導刺激物例如炎性細胞因子作用時，這些未成熟DC發(fā)育為通過增加粘著分子和共同刺激分子的形成的有效T細胞刺激物(“T細胞刺激模式”)。同時，所述細胞遷移到二級淋巴器官，以選擇并刺激罕見的抗原特異性T細胞。可以表明，從組織或血液分離出并且在體外加載抗原的DC在作為成熟DC注射回體內之后具有免疫原性。最近，已經表明DC在健康人和癌癥患者體內都可以誘導CD4+T細胞免疫和CD8+T細胞免疫。在有免疫能力的健康受治療者中，一次加強注射成熟DC，可以不僅增強CD8+T細胞應答的頻率，而且也增強其官能親和力。由于這些原因，DC(尤其是成熟DC)是目前極具前景的誘導人類抗腫瘤和抗感染的有效T細胞應答的佐劑。
DC應用于免疫治療的一個先決條件是開發(fā)允許從增殖性CD34+前體細胞或從非增殖性或很少增殖的CD14+單核細胞前體細胞產生大量培養(yǎng)DC的技術。衍生于單核細胞的DC目前是常用的，因為它們容易制備，無需用任何細胞因子預處理供體，并且所得的DC群體相當均一并且已被很好地表征。例如，可以在(GM-CSF+IL-4)中培養(yǎng)通常6-7天的培養(yǎng)期間，在無胎牛血清(FCS)的情況下，可以從貼壁單核細胞制備未成熟DC，然后通常讓其成熟1-3天，用自體單核細胞條件培養(yǎng)基誘導所述成熟。已經證明為樹突細胞或其前體細胞提供有效的冷藏是極其困難的，除非在FCS存在下(Taylor等(1990)Cryobiology 27，269；Makino等(1997)Scand.J.Immunol.45，618)。然而，由于在疫苗接種時必須不能存在FCS，所以仍必需從新鮮血液、新鮮的白細胞提取(leucapheresate)產物或者從新鮮白細胞提取產物的冷凍PBMC(“外周血單核細胞”)等份樣品新鮮制備DC，以供每次DC疫苗接種用(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。冷凍PBMC也有在解凍后所述細胞必須首先培養(yǎng)數(shù)天以便分化為DC的缺點。Lewalle等(2000)J.Immunol.Methods 240，69-78公開了一種冷凍未成熟DC的方法，但僅獲得收率不好的存活細胞(第71頁，左欄頂部)。在WO 99/46984中也公開了借助GM-CSF和IL-4冷凍從單核細胞制備的未成熟樹突細胞。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種含有成熟DC的組合物，例如疫苗，所述DC可以貯存延長的時間，而活性沒有相當大的損失，并且可以在需要時在短時間內給予。
按照本發(fā)明使用的DC最好來源于用所述疫苗治療的同一患者(自體的)。另一方面，所述DC也可以來源于其它患者(異體的)，例如來源于正常志愿者的白細胞提取物，如例如Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 283，1-15中所述。
出乎意料的是，已經發(fā)現(xiàn)僅通過在具有特定成熟刺激物的合適“成熟混合劑”存在下培養(yǎng)獲得的完全成熟的DC(在下文也簡稱為“天然DC”)，在無FCS下冷凍和解凍后以高百分比存活，并且具有與新鮮制備的成熟DC相當?shù)拿庖叽碳せ钚?。在用所述成熟混合劑培養(yǎng)期間，未成熟DC分化為成熟DC。一種特別優(yōu)選的成熟混合劑含有白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和“腫瘤壞死因子α”(TNFα)。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種制備現(xiàn)成可用的冷藏成熟樹突細胞的方法，所述方法包括(a)提供未成熟的樹突細胞(DC)；(b)在含有成熟混合劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟DC以獲得成熟DC，其中所述成熟混合劑具有一種或多種成熟刺激物；(c)在不含任何異種血清的冷凍介質中冷凍所述成熟DC；(2)一種上述(1)中限定的適用于從冷藏成熟DC制備疫苗的方法；(3)冷凍的加載抗原的成熟樹突細胞，尤其是可用方法(1)獲得那些樹突細胞；(4)一種疫苗，所述疫苗包含(3)中限定的樹突細胞；和(5)一種發(fā)現(xiàn)冷凍DC的有利條件的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供未成熟DC；(b)在不同成熟刺激物存在下用所述未成熟DC進行不同的培養(yǎng)；(c)然后在有或無細胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述DC，優(yōu)選在無細胞因子的情況下進行培養(yǎng)；(d)在有或無細胞因子的所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1天后，測定活細胞的比率；且(e)確立給出最高存活率的成熟刺激物。
在本發(fā)明的方法(1)和(2)中，首先培養(yǎng)未成熟DC，在所述培養(yǎng)基中加入具有一種或多種成熟刺激物的合適成熟混合劑。合適的成熟刺激物包括IL-1例如IL-1β等、IL-6、TNF-α、前列腺素例如PGE2等、IFN-α、脂多糖和其它細菌細胞產物例如MPL(單磷酰脂質A)、脂磷壁酸質等、磷酸膽堿、鈣離子載體、佛波醇酯例如PMA、熱激蛋白、核苷酸例如ATP等、脂肽、Toll樣受體的人工配體、雙鏈RNA例如poly-IC等、免疫刺激性DNA序列、CD40配體等。按照本發(fā)明，尤其優(yōu)選所述培養(yǎng)基或成熟混合劑含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα，或者所述成熟混合劑是單核細胞條件培養(yǎng)基(MCM)或補充PGE2的MCM。在方法(1)和(2)的一個優(yōu)選實施方案中，可以在所述培養(yǎng)步驟期間或之后給所述DC加載抗原。在成熟和任選地加載抗原后，將所述DC在不含任何異種血清例如FCS的冷凍介質中冷凍。在本申請含義內的“異種血清”是一種不是來源于人類的血清。然而，按照本發(fā)明，有可能使用自體血清或血漿(它來源于與所述DC相同的人)和異體血清或血漿(它來源于與所述DC不同的人)。
本申請含義內的未成熟DC是與所述成熟DC相比僅表達少量I類和II類MHC分子以及粘著或共同刺激分子(例如特別是CVD86、CD80、CD40)、在合適成熟刺激物下將分化為成熟DC的CD83(和/或p55/fascin和/或DC-LAMP)陰性(或僅弱陽性和/或至一定的低百分比)白細胞。
本申請含義內的成熟DC是在成熟刺激物作用下已經從未成熟DC發(fā)育的、表現(xiàn)出CD83(和/或p55/fascin和/或DC-LAMP)以及II類和I類MHC分子和粘著或共同刺激分子(尤其是CD86、CD80、CD40)的表達增強的白細胞。此外，成熟DC與未成熟DC相比表現(xiàn)出T細胞刺激能力明顯增強(例如與未成熟DC相反，它們甚至在DC∶T之比為大約≤1∶100的同種異體MLR中也表現(xiàn)出明顯刺激活性；另外，本申請含義內的成熟DC的一個特征是這樣一種事實這些DC是穩(wěn)定的，即即使在無細胞因子的情況下培養(yǎng)1-2天或更長時間，這些DC也將保持其成熟表型和強T細胞刺激能力的特性。相反，尚未完全成熟的DC不穩(wěn)定，將分化為未成熟DC，即例如分化為貼壁巨噬細胞。
所述未成熟DC可以由各種已知來源提供。未成熟DC的前體細胞通常是非增殖性CD14陽性單核細胞(PBMC；單核細胞)或增殖性CD34陽性細胞。例如，PBMC可以從白細胞提取產物中分離。正如已描述的，PBMC可以分化為未成熟DC(Thurner等(1999)J.Exp.Med.190，1669)。因此，可以在IL-4(或IL-13；Romani等(1996)J.Immunol.Methods 196，137-151)和GM-CSF(“粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子”)存在下，培養(yǎng)所述PBMC。從CD14陽性細胞，通過在GM-CSF和IFNα存在下培養(yǎng)，也可以制備未成熟DC(Santini等(2000)J.Exp.Med.191，1777-1788)。從CD34陽性單核細胞，通過在GM-CSF、SCF(“干細胞生長因子”)和TNFα存在下培養(yǎng)，可以獲得未成熟DC。也可以直接從新鮮血液中獲得未成熟樹突細胞，例如在Nestle等(1998)Nat.Med.4,328中所述。預先生成的CD11c+和CD11c-DC(O-Doherty等(1994)Immunology 82，487-493)和M-DC8-DC(Schakel等(1999)Pathobiology67，287-290)也存在于血液中。這些DC也可以從血液中分離，可以進一步用于按照本發(fā)明的方法中。
所述培養(yǎng)基中各種成熟刺激物的優(yōu)選濃度在0.1ng/ml至100μg/ml、優(yōu)選1ng/ml至10μg/ml的范圍。對于本發(fā)明的特別優(yōu)選的成熟混合劑而言，成熟刺激物的濃度為0.1-100ng/ml IL-1β、0.1-100ng/mlIL-6、0.1-10μg/ml PGE2和0.1-100ng/ml TNFα(最優(yōu)選這些特定成熟刺激物的濃度為大約10ng/ml IL-1β、10 ng/ml IL-6、1μg/ml PGE2和10ng/ml TNFα)。所述的濃度是所述物質在培養(yǎng)所述DC的細胞培養(yǎng)基中的終濃度。在上述活性物質存在下使所述DC成熟的一種可能是在單核細胞條件培養(yǎng)基(MCM)存在下培養(yǎng)所述未成熟DC。MCM含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα。它可以通過在無細胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)PBMC而獲得，如例如在Romani等(1996)J.Immunol.Methods 196，137中所述。當用MCM使所述DC成熟時，所述培養(yǎng)基含有1-100％、優(yōu)選5-25％的MCM。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述DC的成熟通過添加MCM和限定量的PGE2來實現(xiàn)。換句話說，已經發(fā)現(xiàn)，MCM以最佳的可能方式使DC成熟的能力的變化可以通過添加PGE2(最好在上述濃度范圍內)來抵消。然而，按照本發(fā)明，最好通過添加已確定的最適量的活性物質IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα來使所述DC成熟。這意味著用所述各種活性物質的純化制劑制備所述成熟組合物。從而與用MCM或MCM+PGE2成熟相比，獲得更好的結果。IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα是可得到的，為GMP(“良好生產操作規(guī)程”)級。通常，通過在所述物質存在下培養(yǎng)至少1小時、優(yōu)選2小時、更優(yōu)選至少6小時，實現(xiàn)所述成熟。按照本發(fā)明，特別優(yōu)選成熟時間為6-96小時，優(yōu)選18-36小時(當使用白細胞提取物用作原料時)或36-60小時(當用新鮮血液或血沉棕黃層作為原料時)。
按照本發(fā)明，在上述成熟步驟期間和/或之后，給所述DC加載至少一種抗原或抗原-抗體復合體。按照本發(fā)明，可以在冷凍期間或者之后，完成所述抗原加載。如果在冷凍之后實現(xiàn)加載，則僅在解凍之后給所述DC加載抗原。然而，優(yōu)選在將所述DC冷凍之前加載抗原。其優(yōu)點是，所述DC在解凍后立即可用。
本申請含義內的抗原是蛋白質、蛋白質片段、肽和由其衍生的分子(例如糖基化化合物或具有其它化學修飾的化合物)，但也可以是編碼它們的核酸、病毒、完整的原核或真核細胞或其片段或凋亡的細胞。“加載抗原”是指使所述DC細胞表面的MHC分子“呈遞”肽、即肽與所述MHC分子形成復合體的過程。雖然有可能通過特定的肽直接加載所述MHC分子，但是必須首先加工蛋白質(或蛋白質片段)，即首先由所述細胞攝取蛋白質(或蛋白質片段)。在胞內切割所述蛋白質并給MHC加載肽后，MHCII-肽復合體呈遞到細胞表面。合適的抗原主要包括蛋白質或蛋白質片段。所述蛋白質可以是天然來源的，或者是重組制備的。由于成熟和加載蛋白質抗原，包含加入的所述抗原的肽片段的MHCII-肽復合體將在細胞表面上形成。培養(yǎng)基中所述蛋白質抗原的濃度通常為0.1-100μg/ml，優(yōu)選為1-50μg/ml、最優(yōu)選為1-10μg/ml。
如果用蛋白質(即具有超過50個氨基酸殘基的多肽)作為抗原，則所述加載最好在所述DC成熟期間進行。這使得由MHCII分子特別有效地呈遞所述抗原片段。所述蛋白質(片段)不必在整個成熟期期間存在，但在成熟期的至少部分時間內存在，所述成熟組合物和所述蛋白質(片段)應該同時存在。蛋白質抗原的實例包括通常用作陽性對照抗原的KLH(匙孔血藍蛋白)。MAGE-3蛋白質為腫瘤抗原的實例，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或HIV-1 gp-160蛋白質是適用于病毒性疾病治療的蛋白質的實例。
當所述加載用“短多肽”或蛋白質片段(例如具有至多50個氨基酸殘基、準確嵌入所述DC表面的MHC分子中的短多肽)進行時，除上述在成熟期間加載之外，也有可能在成熟后、即在冷凍之前或再解凍之后進行加載。在這種成熟后加載時，將所述短多肽加入到經洗滌的DC中。
加載抗原的另一種可能是在培養(yǎng)基中添加凋亡的或裂解的細胞。然后所添加的細胞被所述DC吞噬。這種方法的優(yōu)點是，除MHCII類分子外，也可以有效地加載I類分子。例如，已經表明，甚至在加入蛋白質(尤其是具有顆粒性質的蛋白質)時，呈遞也發(fā)生于MHC I類分子上。例如，不在Mage-3腫瘤蛋白或肽存在下培養(yǎng)所述DC，而是可以將含有Mage-3的細胞片段(或壞死的或凋亡的腫瘤細胞)加入到所述DC。
通過使DC例如與腫瘤細胞融合，也可以給DC加載抗原。這種融合可以用聚乙二醇或電穿孔來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過轉染或病毒感染，給所述DC加載抗原。從而將編碼抗原的核酸導入到所述DC中或誘導其表達。例如，可以以合適的方式進行DNA或RNA轉染或者用腺病毒感染。因此，加載MHC I類分子也是可能的。例如，也可以轉染從腫瘤細胞制備的RNA。關于轉染，可以使用常用的方法，例如電穿孔。
如上所述，可以在成熟期期間或成熟期之后加入特定的抗原肽(即“短多肽”)，以便直接加載I類或II類MHC分子?？梢栽诩尤胨龀墒旖M合物之前將所述肽抗原加入至所述細胞，但最好是同時或者在此后加入所述肽抗原。所述抗原加載優(yōu)選進行至少10分鐘，更優(yōu)選進行1-24小時，最優(yōu)選進行3-12小時。
所述肽(即“短多肽”)通常具有至少8個氨基酸。這類肽最好具有8-12個氨基酸(MHCI)或8-25個氨基酸(MHCII)。在培養(yǎng)基中用于加載的所述肽的濃度通常為0.01-1000μM，優(yōu)選為0.1-100μM，最優(yōu)選為1-20μM。
可以由MHC分子呈遞的所有肽都可以認為是可以使用的肽。優(yōu)選來源于得自病原體的蛋白質的肽。這些肽也可以是表現(xiàn)出天然存在的氨基酸序列變異的肽。這類變異通常是一個或兩個氨基酸取代。肽抗原的實例是氨基酸序列為GILGFVFTL(SEQ ID NO1)的流感病毒基質肽(IMP)、或者序列為ELAGIGILTV(SEQ ID NO2)的Melan-A類似肽。其它可能的肽的實例示于圖26中。
除“肽/蛋白質脈沖”之外，也可以進行“肽/蛋白質轉載(transloading)”，來給DC加載抗原。
如上所述，也可以給所述DC加載抗原-抗體復合體。用于此目的的合適抗原包括所有上述抗原。按照本發(fā)明的“抗原-抗體復合體”是這類抗原與合適抗體的復合體，例如抗原-IgG或抗原-IgE復合體。在Reynault，A.等，J.Exp.Med.189(2)371-80(1999)中描述了給DC加載這類抗原，該文獻通過引用結合到本文中。
在成熟和任選的給所述DC加載抗原后，可以在冷凍介質中冷凍所述成熟DC。除所述血清組分外，冷凍介質還可以含有一種或多種低溫防護劑(例如0.1-35％(v/v)，優(yōu)選5-25％)。合適的低溫防護劑最好包括以下化合物DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯、無機鹽等。優(yōu)選的低溫防護劑是DMSO，它優(yōu)選以5-25％(v/v)、更優(yōu)選10-20％(v/v)、最優(yōu)選約10％DMSO的濃度包含于冷凍介質中。所述冷凍介質可以含有非異種血清組分，優(yōu)選濃度為2-90％(w/v)，優(yōu)選5-80％(w/v)，其中特別優(yōu)選人血清白蛋白，優(yōu)選濃度為10-30％(w/v)。然而，更優(yōu)選冷凍介質含有自體血清或血漿來代替人血清白蛋白。它也可以含有人異體血清或混合血清。此外，冷凍介質也可以含有作為添加劑的一種或多種衍生于糖類的多元醇化合物，尤其是選自葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤蘚醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇、D-乳糖等的多元醇化合物，濃度優(yōu)選為2-30％、更優(yōu)選5-10％、最優(yōu)選約5％(w/v)。最優(yōu)選的冷凍介質是含有約10％DMSO和約5％葡萄糖的純自體血清。通常，在冷凍之前將所述細胞離心以將其濃縮，然后溶解于冷凍介質中。
冷凍介質中細胞的優(yōu)選濃度為1-100×106細胞/ml，最優(yōu)選的濃度范圍為約5×106細胞/ml至20×106細胞/ml。
也已經發(fā)現(xiàn)，通過在冷凍之前或解凍之后使所述DC與抗凋亡分子接觸，提高了DC存活率。因此，在按照本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案中，在冷凍之前或解凍之后，使所述DC與一種能夠抑制細胞凋亡的分子接觸。優(yōu)選的抗凋亡分子包括CD40配體(CD40L)(Morris等(1999)J.Biol.Chem.274，418)、TRANCE(Wong等(1997)J.Exp.Med.186，2075)或RANKL(Anderson等(1997)Nature 390，175)。最好是，將至少一種所述分子在所述DC冷凍之前或解凍之后加入到培養(yǎng)基中達至少10分鐘，優(yōu)選至少1小時，更優(yōu)選至少4小時。在培養(yǎng)基中的優(yōu)選濃度是1ng/ml至5μg/ml(RANKL/TRANCE)和1ng/ml至1μg/ml(CD40L)。特別優(yōu)選的濃度為0.5-1μg/ml(RANKL/TRANCE)和0.1-0.5μg/ml(CD40L)。
在所述方法的一個優(yōu)選實施方案中，在免疫抑制性白介素-10(IL-10)或其它免疫/成熟調節(jié)劑例如維生素D3及其衍生物、富馬酸及其衍生物例如酯等、霉酚酸mofetil等存在下，進一步培養(yǎng)所述DC。如此處理的細胞不用于刺激免疫系統(tǒng)，而是誘導對特定抗原的耐受。所述介質中這些調節(jié)劑和IL-10的濃度為1-1000ng/ml，優(yōu)選10-100ng/ml。
按照實施方案(4)，本發(fā)明也涉及可按照本發(fā)明的方法獲得的疫苗。除所述加載抗原的成熟DC外，按照本發(fā)明的疫苗還可以含有藥學上可接受的佐劑。在將按照本發(fā)明的疫苗解凍后，可以加入藥學上可接受的并且有利于給藥的各種物質。
按照實施方案(3)，本發(fā)明也涉及冷凍的加載抗原的成熟樹突細胞。按照本發(fā)明的這些細胞可以是藥用組合物的一部分，所述藥用組合物除含有所述細胞外，還含有適用于給予人類的有用的添加劑。
本發(fā)明首次提供了含有加載抗原的成熟DC并且可以冷凍的疫苗。本發(fā)明的主要優(yōu)點是所述DC在解凍后的存活率非常高。在所述冷凍DC解凍后，基于冷凍DC的數(shù)目，通常獲得高于75％、優(yōu)選高于85％的存活DC。先前在未加入FCS的情況下，未曾達到解凍DC的這樣高存活率。然而，這是達到有效免疫刺激的一個重要先決條件。將加載抗原的成熟DC冷凍的一個顯著的優(yōu)點是可以制備并冷凍多個等份的疫苗。因此，所述疫苗在需要可立即獲得，并且可以無需漫長的培養(yǎng)步驟而在非常短的時間內應用。通過僅在冷凍和再解凍后給成熟DC加載抗原，有可能根據(jù)相應的環(huán)境，對所述DC進行可變的加載。例如，當發(fā)生疫苗接種所用的肽之一過度刺激或對所述肽之一產生變態(tài)反應時，可以在加載中去除這種肽。
令人驚訝的是，已經發(fā)現(xiàn)，為了發(fā)現(xiàn)冷凍DC的合適方法，改變立即冷凍參數(shù)例如冷凍介質和冷卻速率和在解凍后立即測定存活率是不夠的。這種立即存活率不一定對應于在無細胞因子的情況下培養(yǎng)數(shù)天的新鮮制備DC的存活率。
而是，在冷凍之前所用的成熟方法或成熟刺激物也對所述細胞存活率起重要作用。因此，本發(fā)明也基于這樣的一種認識按照本發(fā)明的成熟刺激物不僅導致DC完全成熟，而且產生可以比通過其它刺激物成熟的DC存活率更佳的DC。迄今為止，由所述冷凍來看，根本未考慮過所述成熟刺激物。
也已經發(fā)現(xiàn)，使冷凍DC的方法優(yōu)選的良好方法是借助不同的成熟刺激物使DC成熟，然后測試在不加入任何細胞因子的情況下在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的存活率作為示值讀數(shù)。使用誘導最具活力的DC的成熟刺激物來制備DC制劑，然后將所述制劑冷凍。
因此，本發(fā)明的另一方面是發(fā)現(xiàn)冷凍DC的有利條件的方法，其中提供未成熟DC，并且在各種成熟刺激物存在下培養(yǎng)所述細胞，隨后在有或無細胞因子(最好是無細胞因子)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞，在有或無細胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1天后測定存活細胞的比率，最后確定給出最高DC存活率的成熟刺激物。然后用這種成熟刺激物制備DC，并將所述DC冷凍。最好僅在無細胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2天、最優(yōu)選在培養(yǎng)至少3天后，測定活細胞數(shù)目。
附圖描述

圖1顯示了冷凍容器中的細胞濃度對解凍后DC收率的影響。從健康成人的白細胞提取產物制備成熟DC，其中首先通過在GM-CSF+IL-4中培養(yǎng)6天，將貼壁單核細胞轉變?yōu)槲闯墒霥C，然后用由TNFα+IL-1β+IL-6+PGE2組成的四組分混合劑(參見實施例1)培養(yǎng)1天使其成熟。將成熟(第7天)DC以-1℃/min的冷凍速率，在純自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中以不同的細胞密度(DC數(shù)目/ml)冷凍。在使所述成熟DC解凍后，立即(＝d7)和在培養(yǎng)數(shù)天(1天后＝d8，2天后＝d9等)后，測定活DC的收率(以冷凍DC數(shù)目的百分率表示)。后一種測定在完全培養(yǎng)基中但在不加入GM-CSF或IL-4的情況下進行，因為這種硬“洗出試驗”是一種已經建立的確定DC是否實際完全成熟和穩(wěn)定的方法。以10×106成熟DC/ml冷凍，得到最佳結果(第7天時p＜0.05，在所有其它天時p＜0.01；n＝3)。
圖2顯示了各種冷凍介質對再解凍后DC收率的影響。如圖1的圖解說明中所述制備DC，將等分樣品以10×106DC/ml的濃度在HSA+10％DMSO、自體血清+10％DMSO以及自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖(終濃度)中冷凍。如關于圖1所述的方法測定冷凍和再解凍后的DC收率。在自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中冷凍，得到最佳結果(第8天時p＜0.05；n＝4)。
圖3顯示了與“洗出試驗”中冷凍和再解凍的DC相比的新鮮DC的存活率。如關于圖1所述方法制備成熟d7 DC，然后新鮮制備所述DC以及冷凍(-1℃/min)，在純自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中，細胞密度為10×106DC/ml)并且在液氮氣相中貯存3小時以上后再解凍。如在圖1中所述，DC在無細胞因子的培養(yǎng)基中(“洗出試驗”)培養(yǎng)數(shù)天?；頓C的收率以第7天時占接種到各孔中的DC總數(shù)的百分比表示。在新鮮制備的DC和冷凍/解凍DC之間沒有統(tǒng)計學顯著差異(n＝4)。
圖4表明，所述冷凍和再解凍沒有改變成熟DC的特征性形態(tài)。如圖1中所述制備的成熟d7 DC或者立即再進一步培養(yǎng)2天，或者在冷凍、在也到液氮氣相中貯存至少3小時然后再解凍后進一步培養(yǎng)。甚至在無細胞因子(“洗出試驗”)的情況下進一步培養(yǎng)48小時后，未冷凍DC(左圖)和冷凍/再解凍DC(右圖)都保持穩(wěn)定的非貼壁細胞。
圖5表明，所述冷凍和再解凍沒有改變成熟DC的特征性表型。通過FACS分析，分析如關于圖1所述的方法新鮮制備的成熟d7 DC的表型(新鮮DC，第7天)。將等分樣品冷凍，在液氮氣相中貯存至少3小時，再解凍，隨后立即(冷凍/再解凍d7 DC)或者在無細胞因子(“洗出試驗”)的情況下再培養(yǎng)3天后(冷凍/再解凍d10 DC)，測定其表型。甚至在除去細胞因子和再培養(yǎng)3天后，冷凍/再解凍成熟d7 DC仍保持成熟DC的特征性表型(CD14-，CD83均一的++)。
圖6表明，所述冷凍和再解凍沒有改變成熟DC在初次同種異體MLR(“混合白細胞反應”)中的刺激能力。如關于圖1所述方法制備成熟d7 DC，新鮮制備的未冷凍DC的同種刺激功效與等份的已經經過冷凍和再解凍(在液氮中貯存3小時后)的這些DC的同種刺激功效相當。
圖7表明，所述冷凍和再解凍沒有改變成熟DC誘導強IMP特異性CTL應答的能力。給新鮮制備的或冷凍/再解凍的HLA-A2.1+成熟d7 DC加載流感病毒基質肽(＝IMP)GILGFVFTL(SEQ ID NO1)或者不經超聲處理，然后不添加任何細胞因子用自體CD8+T細胞(T∶DC之比＝10∶1)培養(yǎng)。另外，純化CD8+T細胞在無DC±加入IMP的情況下培養(yǎng)。7天后，收獲所述T細胞，用標準51Cr釋放測定，檢查其細胞學活性。經過或未經10μg/ml IMP脈沖處理的T2細胞用作靶細胞。
圖8表明，所述冷凍和再解凍沒有改變成熟DC誘導強IMP特異性CD8+T細胞應答(HLA-A2.1/肽四聚體分析)的能力。給新鮮制備的或冷凍/再解凍的HLA-A2.1+成熟d7 DC加載IMP(就冷凍/再解凍細胞而言，在冷凍之前或解凍之后)，或者所述細胞不經超聲處理而在不添加任何細胞因子的情況下與自體PBMC的非貼壁部分(PBMC∶DC之比＝30∶1)共同培養(yǎng)7天后，收獲所述細胞，用HLA-A2.1/IMP四聚體(X軸)和抗CD8(Y軸)雙染色。對于新鮮DC和冷凍DC而言，IMP-肽特異性CD8+T細胞的擴充(在該圖中以四聚體結合CD8+T細胞的百分比表示)相當。在冷凍之前或解凍之后給DC加載沒有產生差異。
圖9表明，與CD40L接觸進一步提高了解凍DC的存活率。如關于圖1所述方法制備成熟d7-DC。在解凍后，加入可溶性初級(primary)CD40L(100ng/ml)達4小時，然后洗滌DC，并且如圖3的圖解說明中所述在無細胞因子(“洗出試驗”)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)天。立即(＝d7)和在培養(yǎng)數(shù)天(1天后＝d8，2天后＝d9等)后，測定活DC的收率(以冷凍DC的百分率表示)。用CD40L處理DC，得到提高的存活率，尤其是在進一步培養(yǎng)2天之后(第10天和第11天p＜0.01；n＝5)。
圖10表明，可以在冷凍之前給DC成功地加載蛋白質抗原。通過的第6天加入模型抗原破傷風類毒素(TT)(10μg/ml)，在未成熟期中對DC進行脈沖處理。然后在第7天收獲成熟DC，并如圖3的圖解說明中所述將其冷凍。TT脈沖處理的冷凍DC同新鮮制備的TT脈沖處理的成熟DC一樣，具有刺激性。
圖11表明，可以在冷凍之前給DC成功地加載蛋白質抗原?；蛘咴诶鋬鲋盎蚪鈨鲋?，給冷凍/解凍(參見圖3)的HLA-A2.1+成熟d7DC加載melan-A類似肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO2)，或者所述細胞不經超聲處理而在不添加任何細胞因子的情況下與自體PBMC的非貼壁部分(PBMC∶DC之比＝20∶1)共同培養(yǎng)7天后，收獲所述細胞，用HLA-A2.1/Melan-A四聚體(X軸)和抗CD8(Y軸)雙染色。對于在冷凍之前或者在解凍之后已經加載的冷凍DC而言，Melan-A-肽特異性CD8+T細胞的擴充(在該圖中以四聚體結合CD8+T細胞的百分比表示)相當。也參見圖8。
圖12顯示了實施例6中所述的在接種疫苗的患者體內誘導針對KLH的輔助細胞1型應答。
圖13-15顯示了實施例7的結果。
圖16顯示了實施例8實驗建立的圖解說明。在圖17和18中總結了實施例8的結果。
圖17A顯示了加載腫瘤細胞裂解液或壞死腫瘤細胞并且隨后冷藏后的DC總數(shù)。
圖17B顯示了加載腫瘤細胞裂解液或壞死腫瘤細胞并且隨后冷藏后的DC的同種刺激功效。
圖17C顯示了腫瘤加載和冷藏后FACS分析的結果。
圖18A顯示了加載凋亡腫瘤細胞并且隨后冷藏后的DC總數(shù)測定結果。
圖18B顯示了加載凋亡MEL 526黑素瘤細胞并且隨后冷藏后的DC的同種刺激功效。
圖18C顯示了在冷藏之前和之后Mage-1肽脈沖處理的DC上MAGE-1/HLA-A1 Ag表達的FACS分析結果。
圖18D顯示了以不同方式加載的DC上在冷藏之前和之后MAGE-1/HLA-A1復合體表達(通過抗MAGE-1/HLA-A1復合體的抗體檢測)的比較。
圖19顯示了實施例9實驗建立的圖解說明，其中比較了冷藏或未冷藏的腺病毒感染的樹突細胞。在圖20-23中總結了實施例9的結果。
圖20顯示了冷藏后腺病毒感染的樹突細胞的回收率。腺病毒-GFP感染的DC在冷凍和再解凍后的回收率與經模擬處理(未轉染的)DC的回收率相當。
圖21冷藏后腺病毒感染的樹突細胞的CD4 T細胞刺激活性?？梢钥闯觯洳貨]有改變腺病毒感染的DC的同種刺激活性。
圖22A和22B表明，在冷藏或未冷藏的腺病毒感染的DC中觀察到相似的表型。
圖23A和23B顯示了冷藏或未冷藏的腺病毒感染的DC的表型。
圖24圖示了與冷藏或未冷藏的RNA電穿孔DC相比的實施例10的實驗過程。結果總結于圖25-27中。
圖25表明，EGFP-RNA電穿孔DC冷藏后的回收率與對照實驗中的回收率相似。
圖26表明，冷藏沒有改變EGFP-RNA轉染DC的同種刺激能力。
圖27表明，RNA轉染的DC的表型與對照實驗中的所述表型相似。
圖28顯示了可以用于本發(fā)明方法中的MHCI類和II類限制的黑素瘤和流感病毒肽?？s寫AS＝氨基酸，NT＝核苷酸，NP＝核蛋白，ana*＝類似肽a頻率最高的DR4亞型，大約80％b頻率最高的DR4亞型，大約80％c迄今為止，已經描述了30種不同的HLA DR13等位基因。顯示了DRB1*1301和DRB1*1302的限制，DRB1*1301和DRB1*1302結合在一起占DR13等位基因的80％。有可能其它DR13等位基因也呈遞所述肽。d所述表位由這第二種HLA DP4等位基因的呈遞不如等位基因DPB1*0401有效。
以下實施例用來進一步說明本發(fā)明，但對本發(fā)明并沒有任何的限制。實施例1測定新鮮制備的未成熟DC和用不同成熟刺激物成熟的DC的存活率。
測試以下不同的成熟刺激物-單核細胞條件培養(yǎng)基，如已描述的制備和使用(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)；-10ng/ml TNFα；-10ng/ml TNFα+1μg/ml PGE2；-10ng/ml TNFα+10ng/ml IL-1β+100U/ml IL-6+1μg/ml PGE2(“成熟混合劑”)；-至多1.0μg/ml馬流產沙門氏菌(Salmonella abortus equi)的LPS；-雙鏈RNA(poly-IC，20μg/ml)；-50-1000ng/ml CD40L。
從PBMC制備單核細胞衍生DC作為完全培養(yǎng)基，使用具有20μg/ml慶大霉素、2mM谷氨酰胺和1％熱失活(56℃，30分鐘)的人自體血漿的RPMI 1640。按照已描述的方法，從健康細胞提取供體制備白細胞提取產物，作為單核細胞分離產物(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。然后在淋巴細胞制備(lymphoprep)時，通過離心分離外周血單核細胞(PBMC)，按照已描述的方法，從所述PBMC的粘附塑料的部分制備DC(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。為此，通過在具有重組人GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得未成熟DC。第6天，向所述DC中加入上述不同的成熟刺激物，第7天，收獲成熟DC，在無細胞因子的情況下再進一步培養(yǎng)2天。培養(yǎng)2天后的存活率(以接種的DC的百分比)為未成熟DC為38.25％；(IL-1β+IL-6+PGE2+TNFα)成熟的DC為76.2％；TNFα成熟的DC為13.5％；(TNFα+PGF2)成熟的DC為37.0％；(poly-IC)成熟的DC為31.8％；和CD40L成熟的DC為49.6％(在500ng/ml下)。
所述差異是統(tǒng)計學上顯著性差異。實施例2成熟(第7天)DC如下冷凍將DC以不同的濃度(5、20、40、60和100×106/ml)重懸于冷凍容器內的或者純自體血清或者20％人血清白蛋白(HSA；由補充200g人血漿蛋白與至少95％白蛋白的1000ml電解質溶液構成；DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg，Baden-Baden，Germany)中。將所形成的DC懸浮液與下文所述的不同冷凍溶液以1∶1混合，然后立即轉移到1.0ml或1.8ml冷凍容器中。此后，立即將容器在“低溫冷凍容器(Cryo Freezing Container)”(Nalgene Cryo1℃Freezing Container，冷卻速率-1℃/ml)冷卻至-80℃，最后轉移到液氮氣相中，在此將其保持至多數(shù)月。a)冷凍介質-HSA+DMSO±葡萄糖[由20％HSA溶液(參見上文)+10、15、20和25％(v/v)DMSO±葡萄糖(Glukosteril 40％TM，F(xiàn)resenius，Germany，有效成分葡萄糖一水合物)構成，以2％、4％、6％、10％、20％或30％(v/v)加入]；-血清+DMSO±葡萄糖[由純自體血清+20％(v/v)DMSO±葡萄糖構成，以2％、4％、6％、10％、20％或30％加入]；-紅細胞冷凍液(Erythrocyte Freezing SolutionTM)[Erythrocyte
Freezing SolutionTM(Fresenius，Dreieich，Germany)，由38％甘油、2.9％山梨醇和0.63％氯化鈉的無菌水溶液構成]；-細胞加工液(Cell Processing SolutionTM)+DMSO(Fresenius，Dreieich，Germany，由6％羥乙基淀粉在0.9％氯化鈉中的溶液構成，通常用于紅細胞的沉降)+10％或15％(v/v)DMSO。b)解凍條件對于使冷凍成熟(第7天)DC解凍，檢查以下四種方法1.使DC在56℃水浴中解凍，然后不經洗滌，于37℃和5％CO2下，在Teflon培養(yǎng)皿(Rotilabo boxes，Roth，Karlsruhe，Germany)內的10-20ml冰冷的完全培養(yǎng)基(補充800 U/ml GM-CSF和500 U/ml IL-4)中孵育2小時，然后收獲DC，并且以150×g于22℃離心10分鐘。隨后，對所述細胞計數(shù)，再次接種到Teflon培養(yǎng)皿上的具有GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中(細胞密度1×106/ml)，培養(yǎng)過夜。第二天，收獲細胞以供進一步使用。
2.如1中所述，在Teflon培養(yǎng)皿上于37℃和5％CO2下2小時的靜息期后，使冷凍成熟(第7天)DC解凍，收獲細胞(以150×g，22℃下離心10分鐘)以供進一步使用。
3.如1中所述，在組織培養(yǎng)皿(Falcon Becton Dickinson Labware，New Jersey，USA)上于37℃和5％CO2下2小時的靜息期后，使冷凍成熟(第7天)DC解凍，收獲細胞(以150×g，22℃下離心10分鐘)以供進一步使用。
4.使冷凍成熟(第7天)DC在56℃水浴中解凍，然后加入到10ml冰冷的“Hank氏平衡鹽溶液”(Bio Whitaker)中，立即于4℃以133g離心12分鐘。隨后，收獲細胞以供進一步使用。c DC存活率的確立通過在未添加GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少4天以上(＝“洗出試驗”)，檢查冷凍和再解凍DC的存活率，將其與按照已描述的方法(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)從未冷凍或冷凍的等份PBMC中新鮮制備的DC的存活率相比。用細胞計數(shù)器(CassyCell Counter and Analyser System，Model TT，Scharfe System，Reutlingen，Germany；該系統(tǒng)使用“脈沖面積分析”并且允許測定細胞計數(shù)、細胞大小和體積以及是否存在活細胞)，并且也通過標準錐蟲藍染色作為對照，測定活DC的相應量。
首先，檢查DC濃度的影響，其中以10×106成熟DC/ml冷凍，得到最佳結果。結果示于圖1中。
其次，檢查DMSO濃度(5-12.5％v/v終濃度)的影響。DMSO濃度的變化對解凍DC的存活率沒有顯著性影響。
下一步，檢查HSA或純自體血清是否得到更好的存活率，以及添加葡萄糖(終濃度1％、2％、3％、5％、10％和15％v/v)是否提高存活率。結果示于圖2中。如果HSA被自體血清所替代，則數(shù)天后DC的存活率可再現(xiàn)地提高。以5％(v/v)的終濃度加入葡萄糖，進一步改善了所述結果。
也檢查了各種市售的冷凍介質例如Erythrocyte FreezingSolutionTM或Cell Processing Solutin Freseniu)。然而，與已經測試的所述冷凍介質相比，這些冷凍介質得到結果較差。
此外，檢查了在b)下所述的各種解凍條件，以將在解凍后所述細胞經歷的逆境減至最小。所測試的四種方法中沒有一種顯示出明顯優(yōu)于其它方法。
成熟(第7天)DC如實施例1中所述方法制備，并且在以下條件下冷凍冷卻速率1℃/min，在純自體血清+10％DMSO+5％葡萄糖中，細胞密度10×106/ml。在液氮氣相中貯存至少3小時后，將細胞解凍。解凍后，直接測定活DC的百分比(＝D7)。接種等份的DC，如實施例1c)中所述，在無細胞因子的培養(yǎng)基(“洗出試驗”)中培養(yǎng)至多4天后，測定存活率(n＝20)。結果示于下表中。
在解凍(第7天)和在“洗出試驗”(第8-11天)后冷凍/解凍DC的收率。
實施例3在存活率和T細胞刺激活性方面，最佳成熟和冷凍的DC等同于新鮮制備的DC。
a)首先，檢查冷凍和再解凍DC的存活率是否與從同一供體新鮮制備的DC的存活率相當。因此，如實施例2)中所述使用“洗出試驗”。結果示于圖3中。發(fā)現(xiàn)在解凍的DC和從同一供體新鮮制備的DC之間沒有差異。
此外，解凍DC的形態(tài)和表型可與新鮮制備的DC相比。用倒置顯微鏡(Leika DM IRB，Leika Mikroskopie und Systeme GmbH，Wetzler，Germany)檢查細胞的形態(tài)，并通過照相術記錄。用一系列單克隆抗體檢查并且在FACScan設備(Becton Dickinson，New Jersey，USA)上，如已描述的方法(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)檢查細胞群體的表型。死細胞由于其散射光的特性而被分選出。結果示于圖4和圖5中。冷凍和再解凍DC在數(shù)天內保持其特征性形態(tài)特性及其表型。
b)然后，也檢查再解凍DC是否也保持其功能特性。
1.因此，檢查再解凍DC是否可以與新鮮制備的未冷凍成熟DC一樣有效地誘導初次同種異體MLR。該試驗如已描述的方法進行(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。以直至2×105同種異體T細胞/孔的分級劑量，將DC加入到平底96孔板中，在RPMI 1640(補充慶大霉素、谷氨酰胺和5％同種異體熱失活人血清(混合血清))中共同培養(yǎng)4-5天，通過在共同培養(yǎng)的最后12-16小時內加入3H-胸苷(4μCi終濃度/ml)，測定增殖。結果示于圖6中。冷凍和再解凍DC與新鮮制備的成熟DC一樣有效地誘導初級同種異體MLR。
2.也檢查冷凍和再解凍DC可以有多有效地誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。為此，測量了IMP脈沖處理的成熟DC對IMP(流感病毒基質肽)特異性CTL的誘導。這種方法當在無T細胞輔助和外源IL-2的情況下進行時，對于成熟DC是特異性的。通過刺激純化CD8+T細胞(按照供應商的說明，用磁性細胞分選/MACS和CD8微珠，從PBMC中分離的，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，或者在具有DC的非貼壁PBMC部分(從來自HLA-A2.1+供體的自體PBMC制備)的其它實驗中，實現(xiàn)流感病毒基質A2.1肽(IMP)或Melan-AA2.1肽特異性的CD8+T細胞的誘導，其中所述具有DC的非貼壁PBMC部分在不加入細胞因子的情況下，用HLA-A2.1限制的IMP(GILGFVFTL[SEQ ID NO1]，10μM，于37℃1小時，以1×106DC/ml的完全培養(yǎng)基)脈沖處理或者用Melan-A類似肽(ELAGIGILTV[SEQ IDNO2]，10μM)以1∶10或1∶30的DC/T比脈沖處理7天，或者未經所述脈沖處理。通過標準裂解測定(Bhardwaj等(1994)J.Clin.Invest.94，797)，或者通過于37℃四聚體染色(Whelan等(1999)J.Immunol.163，4342)，對CTL定量。以不同效應細胞/靶細胞比進行的標準4小時51Cr釋放測定的靶細胞，是IMP脈沖處理(10μg/ml，37℃，1小時)的T2A1細胞、未經脈沖處理的T2A1細胞和K562靶細胞(所有細胞都用51Cr標記)。所有實驗以80倍過量的K562細胞進行，以便阻斷自然殺傷細胞活性。用公式(特異性釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)×100，計算特異性裂解(％)。制備可溶性IMP和Melan A/HLA A2.1四聚體，如已描述的方法(Whelan等，1999)采用流式細胞術，于37℃分析T細胞的生成。將1μl四聚體(0.5-1mg/ml)加入到約60μl(在離心和傾注上清液后在容器中剩下的體積)培養(yǎng)基中的2×106細胞中于37℃達15分鐘，所述培養(yǎng)基由補充慶大霉素、谷氨酰胺和5％同種異體熱失活人血清(混合血清)的RPMI 1640構成。隨后，不經洗滌，將細胞冷卻，并在冰上與抗人CD8的三重染色單克隆抗體(Caltag Laboratories，Burlingame，California)一起孵育15分鐘。在3個洗滌步驟之后，在FACScan設備(Becton Dickinson)上分析細胞。
結果示于圖7和圖8中。
DC的冷凍和解凍并不改變成熟DC誘導強IMP特異性CTL反應的能力。此外，所述冷凍和解凍也沒有改變成熟DC誘導強IMP特異性CD8+T細胞應答的能力，如HLA-A2.1/肽四聚體分析所示。
這些實驗表明，在冷凍和解凍后，獲得與新鮮制備的DC絕對等同的活DC。實施例4為了達到提高的冷凍和再解凍DC的存活率，將以下不同的抗凋亡刺激物以不同的濃度和在不同時間加入到所述DC中1.重組鼠或人三聚體TRANCE(Wong等(1997)J.Exp.Med.
186，2075)，以100、200、500ng/ml加入；2.RANKL(Anderson等(1997)Nature 390，175)，以10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和1μg/ml加入；3.可溶性三聚體CD40L(Morris等(1999)J.Biol.Chem.274，418)，以50、100和500ng/ml加入。
所述DC于37℃經過所述不同的抗凋亡刺激物在冷凍前培養(yǎng)的最后12-16小時過夜處理、在冷凍前處理4小時(細胞密度1×106，在具有GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中)、以及在解凍后處理4小時(細胞密度1×106，在具有GM-CSF和IL-4的完全培養(yǎng)基中)。
將解凍DC短暫暴露于所述抗凋亡刺激物，與在冷凍前處理DC一樣有效，達到提高的存活率，然而通常在“洗出試驗”中僅在3天后可見。然而，CD40L(圖9)和TRANCE/RANKL(結果未顯示)得到相似的結果。結果表明，加入CD40L或TRANCE/RANKL將DC的存活率提高至超過第3天。實施例5為了檢查是否可以在冷凍前成功地給DC加載抗原，給DC加載破傷風類毒素(TT)(作為蛋白質抗原的例子)或IMP(作為模型肽)。對于用TT脈沖處理，從得自白細胞提取產物的新鮮的或冷凍的等份PBMC制備DC(參見上文)。在第5天將10μg/ml TT加入所述未成熟細胞中。第7天收獲成熟DC，所述DC或者不冷凍，或者在冷凍和解凍后(4小時后)，檢查其在PBMC中誘導TT特異性增殖反應的能力。因此，將分級劑量的未經脈沖處理和TT脈沖處理的DC加入到PBMC中(10×104/孔)，在第5天，按照已描述的方法用3H-胸苷脈沖處理(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。對于加載IMP，或者在冷凍之前，或者在解凍之后，DC用10μM肽脈沖處理(1小時，37℃，1×106DC/ml完全培養(yǎng)基)。如上所述測試成功呈遞IMP的能力。
冷凍的TT脈沖處理DC具有與新鮮制備的TT脈沖處理DC相同的刺激特性(圖10)。兩種DC都在冷凍前加載了IMP或Melan A，在解凍后加載的那些DC同樣好地刺激IMP特異性CTL或Melan-A特異性CTL(圖8和圖11)。這些結果表明，有可能制備已經加載抗原并且在解凍后可以立即使用的等份冷凍成熟DC。實施例6對IV期黑素瘤患者，用按照本文所示方法制備和加載抗原的加載肽和加載蛋白質的DC進行疫苗接種。圖12表明在所有接種的患者體內都誘導了抗KLH的輔助細胞1型應答。每位患者都接受一次4×106成熟DC和本申請中所述的成熟組合物(例如圖1和圖3)的皮下給藥，所述成熟DC是用GM-CSF和白介素-4從白細胞提取產物制備的。為此，同時加入10μg/ml的濃度的對照抗原KLH和所述成熟組合物，然后分成多份冷凍所述DC。在接種前和所述4×106DC的一次給藥后14天，取血，通過標準Elispot測定進行檢查(加入10μg/ml KLH至500,000 PBMC中，并測量產生干擾素-γ或IL-4的細胞數(shù)；未加入KLH的背景幾乎為0)。發(fā)現(xiàn)在接種之前，在KLH呈遞時，沒有產生干擾素-γ或白介素-4，而在一次接種加載KLH的DC后14天，在所有患者體內都誘導了產生干擾素-γ、但不產生白介素-4或僅產生極少量的T細胞(在對照實驗中，通過從PBMC取出CD4細胞表明，所述反應性細胞是CD4陽性輔助性T細胞)。實施例7來自實施例6研究的一位患者接受了數(shù)次DC接種，其中4×106的每種再解凍DC加載了在圖13、14或1 5中所述的肽(即分別為每4×106DC僅一種肽)，并且經皮下注射。分別在第一次接種之前和各個后續(xù)接種后14天、以及在下一次接種的臨接種前，取血，并且如Thurner等(1999)J.Exp.Med.190，1669-1678的材料和方法中所述的方法進行標準Elispot測定。用于接種的DC如圖8和圖11的圖面說明中以及實施例5中所述的方法制備，并且僅在解凍后加載相應的肽。正如從圖13-15中可以看出的，誘導了針對幾種I類肽(圖13和圖14)和II肽(圖15)的免疫。從表I可以看出所使用肽的特征。注意到，所述特定患者的HLA型為HLA-A2.1+和HLA-A3+以及HLA-DR 13+、HLA-DP4+(但為DR4-)。圖13表明在一次接種后，誘導了針對流感病毒肽NP-A3和IMP-A2的免疫(#2是指取血并且在給予第二次疫苗接種之前不久進行Elispot測量)，并且顯示了在另一次接種后免疫增強，但對于未用于接種的EBV-A2和IV-9-A2肽沒有變化。圖14表明誘導了針對4種I類限制的腫瘤肽、明顯且明確針對Melan A-A2.1肽的免疫。圖15表明誘導了針對兩種II類限制的腫瘤肽(Mage 3-DR13和Mage 3-DP4)的免疫，但沒有誘導針對酪氨酸酶-DR4和GP 100 DR4(這是陰性對照，因為所述患者是DR4陰性的，因此所述DC不能加載這些肽)的免疫。實施例8在用腫瘤細胞制劑(腫瘤細胞裂解液、壞死或凋亡的腫瘤細胞)進行抗原加載后樹突細胞的冷藏可以從白細胞提取法中，大量產生樹突細胞(DC)。已經開發(fā)了允許分次使用這些細胞來接種的冷藏成熟DC的方法。迄今為止，成熟DC在使用前加載對應于腫瘤相關抗原(TAA)的免疫優(yōu)勢序列的肽。在此處所述實驗中(參見圖16)，檢查加載了不同腫瘤細胞制劑并且隨后成熟的未成熟DC是否也可以冷藏。
腫瘤細胞制劑為了制備腫瘤細胞制劑，使用Me1526黑素瘤細胞系。Me1526細胞用RPMI洗滌，通過重復于57℃加熱和隨后在液氮中冷卻來處理。然后，借助超聲裝置破碎所述細胞材料。由于加熱/冷凍循環(huán)誘導壞死，所以含有所有細胞組分的這種腫瘤細胞制劑在下文中被稱為壞死細胞材料。為了獲得裂解液，我們在這些步驟之后進行了超離心，以除去細胞組分，并且在Centricon離心管中進行所述蛋白質的純化。根據(jù)Bradford分析的結果，我們使用具有較高活性的蛋白質部分，即≥10kDa的蛋白質部分。凋亡腫瘤細胞用寬范圍的UVB輻射裝置誘導，并且用AnnexinV試驗證實。
DC的產生按照實驗性免疫治療中所用的技術，從白細胞提取法產生DC。將PBMC接種到Nunc Cell Factories中，用補充1000 IU/mlGM-CSF和500 IU/ml IL-4的RPMI(1％自體熱失活血漿)培養(yǎng)。第5天，使用未成熟的DC，然后用所述的腫瘤細胞制劑以1∶1的濃度加載4小時。
加載在5ml聚丙烯反應容器中于37℃和5％CO2下進行加載。加載后，將所述DC接種到12ml組織培養(yǎng)皿中，用由TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2構成的成熟混合劑培養(yǎng)24小時。
冷凍/解凍按照已描述的方法(Feuerstein B.等，J.Immunol.Methods 24515-29(2000))，將一半相應加載的DC分別在1.8ml Nunc冷凍小瓶中于-80℃冷藏3小時。此后，按照所述已描述的方法將所述細胞再次解凍，并且于37℃和5％CO2下在RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時。隨后，分析DC的該部分以及未冷凍的部分，并用于其它實驗中。
所述的實驗建立在圖16中以流程表顯示。
細胞計數(shù)和活力在進行所述加載和冷藏后，用錐蟲藍和顯微鏡，確定所述DC的總細胞計數(shù)和活力。最初，使用5×105DC。我們發(fā)現(xiàn)與未冷藏細胞相比相當?shù)募毎嫈?shù)以及加載且冷藏的DC的活力沒有差異(圖17A、18A)。可以觀察到，加載使細胞計數(shù)減少，但冷藏沒有使細胞計數(shù)降低，尤其是使用壞死細胞時。
功能性為了測試功能能力，進行混合白細胞反應試驗(MLR)。在同種異體MLR中使用加載DC(與同種異體白細胞一起孵育4天)，然后用放射性胸苷(3H-胸苷)脈沖處理13小時。對于冷藏和未冷藏加載DC而言，獲得了相當?shù)耐N刺激功效(圖17B、18B)。
表型為了評價與抗原呈遞相關的表面分子的表達和所述DC的功能條件，用相應的抗體進行FACS分析。對于不同加載方法和在冷藏后，都發(fā)現(xiàn)了相當?shù)谋砻姹磉_模式(圖17C)。
直接抗原檢測為了直接檢測腫瘤抗原，使用識別HLA-A1環(huán)境(即Mage-1肽和HLA-A1分子的復合體)中的MAGE-1的抗體。不同加載的DC用該抗體染色，并且在FACS中分析。當使用加載肽(20μgMAGE-1肽3小時/ml)的DC時，發(fā)現(xiàn)在冷藏后，可以檢測到一定百分比的MAGE-1/A1抗原，所述百分比與未冷藏時檢測的百分比相當(圖18C)。根據(jù)這一實驗可以斷定，所述冷藏并不導致抗原的損失。
在另一實驗中，用MAGE-1/A1抗體測定不同加載方法的效力。用所述腫瘤細胞制劑(所用的黑素瘤細胞系表達Mage-1抗原)，可以達到顯著的加載，達到所述肽脈沖處理的大約20％的抗原密度(圖18D)?？梢砸韵喈?shù)牧繖z測到冷藏前后MAGE-1/HLA-A1復合體的表達(相對于未加載DC的背景計算為陽性)。
結論也可以表明，本發(fā)明的方法不僅允許有效地冷藏未加載DC或加載肽或蛋白質的DC(如實施例1-7所示)，而且也允許同樣有效地冷藏加載(腫瘤)細胞制劑(簡單的壞死腫瘤細胞、從腫瘤細胞制備的裂解液、或者凋亡腫瘤細胞)的DC?！坝行У亍笔侵冈诶鋬鰰r，i)解凍后與未冷凍DC相比，細胞的損失≤25％，ii)解凍DC具有與未冷凍DC相當?shù)腡細胞刺激能力(在同種異體MLR中測試)，和iii)抗原和T細胞受體的配體(即特異性MHC肽復合體)的表面表達在所述冷凍和解凍過程后得以保留(在一種模型中，通過借助特異性識別特定肽/MHC復合體即MAGE-1/HLA-A1復合體的單克隆抗體直接檢測所述復合體所示的)。實施例9在借助腺病毒轉染加載抗原后冷藏樹突細胞可以采用按照本發(fā)明的方法，以這樣的方式冷凍用腺病毒轉染的樹突細胞，使得樹突細胞的特性與未轉染樹突細胞的特性不相上下。為此，成熟DC用含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA的腺病毒載體(AD5)，以500的感染復數(shù)(MO)感染2小時。洗滌2次后，將細胞以10×106DC/ml的濃度在HSA和10％DMSO的5％葡萄糖(終濃度)溶液中冷凍并貯存4小時。解凍后，通過錐蟲藍排除測定細胞活力?；罴毎幕厥章室岳鋬鯠C的百分比示于圖20中。
此外，可以表明，腺病毒感染的DC的同種刺激或性未因冷藏而改變。因此，用adeno-GFP以500的MOI感染成熟DC，并且如上所述進行冷藏。在再解凍并且培養(yǎng)24小時或72小時后，所述樹突細胞與同種異體CD4+T細胞(2×105/孔)在圖21所述的條件下共同培養(yǎng)。4天后，所述細胞用[3H]-胸苷脈沖處理16小時，然后測定摻入的放射性。在圖21中，顯示了三次計數(shù)的平均值與對應的標準偏差。單獨的T細胞或單獨的DC的所述數(shù)值總是低于1000/min。
此外，如上所述將成熟DC與adeno-GFP以500的MOI一起冷藏。在再解凍和所述的培養(yǎng)時間后，所述細胞用CD83、CD25、CD86、CD80特異性抗體、然后用PE綴合的山羊/小鼠IG(Fab’)2片段復染。結果示于圖22A中。在使用HLA 1類、HLA-DR和CD40特異性抗體的一個類似的實驗中，獲得示于圖22B中的結果。實施例10在借助RNA轉染加載抗原后冷藏樹突細胞可以采用按照本發(fā)明的方法，以這樣的方式冷凍用RNA轉染的樹突細胞，使得樹突細胞的特性與未轉染樹突細胞的特性不相上下。所述DC在未成熟期可以用RNA轉染，然后使其成熟，以成熟DC冷凍(未顯示)。最好是用RNA轉染已經成熟的DC，然后冷藏。結果總結于圖25-27中。
因此，成熟的樹突細胞用RPMI洗滌2次，在Optimix試劑盒(EQUIBIO，Maidstone Kent，UK)的洗滌溶液中洗滌1次。使DC在Opttimix培養(yǎng)基中的終濃度為40×106DC/ml。然后將0.1ml細胞懸浮液與40μg體外轉錄的EGFp RNA在1.5ml反應容器中混合。于室溫孵育最多3分鐘后，將細胞懸浮液轉移到一個0.4cm間距的電穿孔比色杯中，用Gene PulserII(Biorad，Munich，Germany)以260V的電壓和150μF電容脈沖處理。對照DC未加RNA而進行脈沖處理。將細胞以10×106DC/ml的濃度在HSA(與10％DMSO和5％葡萄糖(終濃度))中冷凍并貯存4小時。解凍后，通過錐蟲藍排除測定細胞活力?；罴毎幕厥章室岳鋬鯠C的百分比示于圖25中。
在EGFP RNA存在下電穿孔處理成熟DC，并且如上所述進行冷藏。在再解凍并且培養(yǎng)48小時后，所述樹突細胞與同種異體CD4+T細胞(2×105/孔)在圖26所述的條件下共同培養(yǎng)。4天后，所述細胞用[3H]-胸苷脈沖處理16小時，然后測定摻入的放射性。在圖26中，顯示了三次重復測定的平均值(與標準偏差)。單獨的T細胞或單獨的DC的所述數(shù)值總是低于1000/min。
RNA電穿孔處理的DC的冷藏，并不改變DC表型標記。因此，在有或無EGFP RNA時電穿孔處理成熟DC并如上所述冷藏。在再解凍并且培養(yǎng)48小時后，用圖27中所述的小鼠單克隆抗體和PE綴合的抗小鼠IG(Fab’)2片段復染，然后進行FACS分析。圖27中的右下圖涉及EGFP陽性DC，而右上圖涉及EGFP/DC標記雙陽性DC。
序列表<110>Schuler，Gerold<120>用于生產現(xiàn)成可用的加載抗原或未加載抗原的冷藏成熟樹突細胞的方法<130>010589wo/JH/ml<140><141><160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>1Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>Mart1/MelanA類似肽(AA 26-35)<400>2Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>流感病毒<400>3Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met1 5 10<210>4<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述gp100類似肽，AA 209-217<400>5Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val1 5<210>7<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val1 5 10<210>8<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu1 5<210>9<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val1 5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>10Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>11Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>12Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述酪氨酸酶類似肽，AA 243-251<400>14Lys Ser Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>15Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Val Tyr Phe Phe Leu Pro Asp His Leu1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe1 5<210>23<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5 10<210>24<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述酪氨酸酶類似肽，AA 450-462<400>24Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Val Pro Asp Ser Phe Gln Asp1 5 10<210>25<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Trp Asn Arg Gln Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp1 5 10 15<210>26<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu1 5 10<210>27<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr1 5 10 1權利要求
1.一種制備現(xiàn)成可用的冷藏成熟樹突細胞的方法，所述方法包括(a)提供未成熟的樹突細胞(DC)；(b)在含有成熟混合劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述未成熟DC以獲得成熟DC，其中所述成熟混合劑具有一種或多種成熟刺激物；(c)在不含任何異種血清的冷凍介質中冷凍所述成熟DC。
2.權利要求1的方法，其中在所述冷凍之前或在將所述冷凍DC再解凍之后，給所述DC加載抗原或抗原-抗體復合體。
3.權利要求1或2的方法，其中(i)所述未成熟DC從CD14+單核細胞或者從CD34+細胞制備；和/或(ii)所述未成熟DC直接從血液中分離；和/或(iii)所述未成熟DC或其前體細胞通過白細胞提取法獲得；和/或(iv)所述未成熟DC或其前體細胞從新鮮血液或骨髓獲得。
4.權利要求1-3中一項或多項的方法，其中所述成熟刺激物選自IL-1例如IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素例如PGE2、IFN-α、脂多糖和其它細菌細胞產物例如MPL(單磷酰脂質A)和脂磷壁酸質、磷酸膽堿、鈣離子載體、佛波醇酯例如PMA、熱激蛋白、核苷酸例如ATP、脂肽、Toll樣受體的人工配體、雙鏈RNA例如poly-IC、免疫刺激性DNA序列、CD40配體等，所述培養(yǎng)基或所述成熟混合劑尤其含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα，或者所述成熟混合劑是單核細胞條件培養(yǎng)基(MCM)或補充PGE2的MCM。
5.權利要求4的方法，其中所述未成熟DC在存在0.1-100ng/mlIL-1β、0.1-100ng/ml IL-6、0.1-10μg/ml PGE2和0.1-100ng/ml TNF-α的情況下培養(yǎng)。
6.權利要求4或5的方法，其特征在于，加入到所述DC中以使其成熟的所述活性物質IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα得自所述各種活性物質的純化制劑。
7.權利要求1-6中一項或多項的方法，其中(i)所述成熟進行至少1小時，最好進行至少6小時；和/或(ii)在所述成熟期間，更換所述培養(yǎng)基中的所述成熟混合劑，和/或將額外的成熟刺激物加入到所述培養(yǎng)基中；和/或(iii)向所述培養(yǎng)基中加入免疫/成熟調節(jié)劑，尤其是選自IL-10、富馬酸及其酯、霉酚酸mofetil和維生素D3的免疫/成熟調節(jié)劑。
8.任一前述權利要求的方法，其中所述冷凍介質含有(i)5-25％(v/v)的一種或多種低溫防護劑，尤其是選自DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯和無機鹽的低溫防護劑，更優(yōu)選DMSO；和/或(ii)2-30％(w/v)的一種或多種多元醇化合物，尤其是選自葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤蘚醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇和D-乳糖的多元醇化合物，更優(yōu)選葡萄糖；和/或(iii)2-90％(w/v)的非異種血清組分，尤其是自體血清或血漿或者同種異體血清或血漿，更優(yōu)選人血清白蛋白、自體血清、同種異體人血清或混合血清。
9.任一前述權利要求的方法，其特征在于，所述細胞以5×106至100×106細胞/ml的濃度冷凍。
10.權利要求2-9中一項或多項的方法，其中在冷凍之前給所述DC加載抗原或抗原-抗體復合體。
11.權利要求2-10中一項或多項的方法，其中給所述DC加載的所述抗原是一種蛋白質或具有至少8個氨基酸的其片段，將所述蛋白質或片段加入到所述培養(yǎng)基中，尤其是以0.01-1000μM的濃度加入，最好同時在所述培養(yǎng)基中含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α。
12.權利要求2-10中一項的方法，其中給所述DC加載編碼所述抗原的DNA分子或RNA分子。
13.權利要求2-10中一項或多項的方法，其中蛋白質片段、細胞或細胞碎片或核酸序列用作所述抗原-抗體復合體中的所述抗原，并且所述抗體是IgG或IgE類之一。
14.權利要求1-13中一項或多項的方法，其中所述DC在冷凍之前或者在再解凍之后，接觸能夠抑制細胞凋亡的分子，其中所述能夠抑制細胞凋亡的分子最好選自CD40配體、TRANCE和RANKL。
15.權利要求1-14中一項或多項的方法，其中超過所述冷凍DC數(shù)目的75％、最好超過85％的所述DC在所述DC的所述冷凍和再解凍之后存活。
16.權利要求1-15中一項或多項的方法，其中所述方法適用于從成熟冷藏DC制備疫苗。
17.一種發(fā)現(xiàn)冷凍DC的有利條件的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供未成熟DC；(b)在不同成熟刺激物存在下用所述未成熟DC進行不同的培養(yǎng)；(c)然后在有或無細胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述DC，優(yōu)選在無細胞因子的情況下進行培養(yǎng)；(d)在有或無細胞因子的所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少1天后，測定活細胞的比率；且(e)確立給出最高存活率的成熟刺激物。
18.權利要求17的方法，其中在有或無細胞因子的所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少2天、優(yōu)選至少3天后，測定所述活細胞的比率。
19.冷凍的加載抗原的成熟樹突細胞。
20.權利要求19的細胞，所述細胞可采用權利要求1-16中一項或多項的方法獲得。
21.一種疫苗，所述疫苗包含權利要求19或20的樹突細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產現(xiàn)成可用的、加載抗原或未加載抗原的冷藏成熟樹突細胞的方法，尤其是用于生產含有所述樹突細胞的疫苗的方法，其中在合適的成熟刺激物存在下培養(yǎng)未成熟的樹突細胞，并且將如此獲得的成熟樹突細胞冷凍。可以在冷凍之前給所述樹突細胞加載抗原。本發(fā)明也涉及可以按照本發(fā)明的方法獲得的疫苗，還涉及含有加載抗原的冷凍成熟樹突細胞的組合物。
文檔編號A61K39/00GK1471575SQ01817741
公開日2004年1月28日 申請日期2001年8月24日 優(yōu)先權日2000年8月24日
發(fā)明者杰羅爾德·許勒, B·許勒圖爾納, 杰羅爾德 許勒, 脹級 申請人:杰羅爾德·許勒, 杰羅爾德 許勒