專利名稱：編碼源于肝炎病毒orf2n端區(qū)域的加工組分以及抗原性多肽的核酸構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及增強(qiáng)對(duì)核酸疫苗免疫應(yīng)答的策略。本發(fā)明尤其涉及表達(dá)包含目的抗原性多肽和加工肽、可增強(qiáng)對(duì)該目的抗原性多肽的抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明用于設(shè)計(jì)和開發(fā)可調(diào)節(jié)對(duì)抗原免疫應(yīng)答的各類方法、構(gòu)建體和載體，并用于診斷、治療和/或預(yù)防病變、感染或疾病，例如而不限于癌癥、自身免疫疾病或動(dòng)物中(包括人及其它哺乳動(dòng)物、魚和鳥)細(xì)菌、病毒或寄生蟲感染。
概述本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，此處所述本發(fā)明除明確描述的以外，可以變更和修改。應(yīng)當(dāng)理解，此處所述本發(fā)明包括所有這類變更和修改。本發(fā)明也包括本說明書單獨(dú)或一起涉及或指明的所有這類方法、特征、組合物和化合物，以及任何和所有兩個(gè)或更多所述方法或特性的組合。
貫穿本說明書，除非上下文需要，否則單詞“包含”及其變化形式應(yīng)當(dāng)理解為，暗指包含所述整體或方法，或者一群整體或方法，但不排除其它任何整體或方法，或者整體或方法群。此處所述特定實(shí)施方案只是為了用來說明的目的，本發(fā)明不受其范圍限制。如此處所述，功能等價(jià)的產(chǎn)物、組合物和方法顯然都在本發(fā)明范疇之內(nèi)。
本說明書中作者涉及的出版物的文獻(xiàn)目錄細(xì)節(jié)匯總于說明書結(jié)尾處。此處參考的現(xiàn)有技術(shù)，包括任何一個(gè)或多個(gè)現(xiàn)有技術(shù)文件，不作為致謝或建議，所述現(xiàn)有技術(shù)是普通常識(shí)或組成普通常識(shí)的一部分。
此處所用術(shù)語“源于”，將用來表明來源于指定物種的特定整體或整體群，而不一定直接從指定來源獲得。
本說明書包含核苷酸和氨基酸序列信息，使用程序PatentIn版本3.0制作，此處在權(quán)利要求書之后給出。依據(jù)數(shù)字指示<210>(其后為序列標(biāo)識(shí)符[例如<210>1、<210>2等等])確定序列表中各個(gè)序列。數(shù)字指示區(qū)<211>、<212>和<213>分別提供的信息指明每個(gè)序列的長(zhǎng)度、序列類型[DNA、蛋白質(zhì)(PRT)等等]以及來源生物。說明書中涉及的核苷酸或氨基酸序列用術(shù)語“SEQ ID NO”來確定，其后是序列標(biāo)識(shí)符[例如SEQ ID NO1是指序列表中指定為<400>1的序列]。
依據(jù)IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)的推薦，命名此處涉及的核苷酸殘基，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T代表胸苷，Y代表嘧啶殘基，R代表嘌呤殘基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鳥嘌呤或胸苷，S代表鳥嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸苷，H代表除鳥嘌呤以外的核苷酸，B代表除腺嘌呤以外的核苷酸，V代表除胸苷以外的核苷酸，D代表除胞嘧啶以外的核苷酸，以及N代表任意核苷酸殘基。
背景技術(shù)：
“核酸疫苗”是反映通過給予或者DNA(質(zhì)粒)或者自我復(fù)制的亞基因組病毒核酸(病毒復(fù)制子)而指導(dǎo)受體細(xì)胞中靶(疫苗)蛋白質(zhì)合成的技術(shù)的上位術(shù)語。
由于觀測(cè)到裸DNA可以在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原合成，以致誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(Woff等，1990)，因此，核酸疫苗，特別是DNA疫苗(其中給予的是編碼蛋白質(zhì)抗原的質(zhì)粒DNA，而非蛋白質(zhì)本身)，已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)研究的焦點(diǎn)。利用核酸疫苗的兩個(gè)主要潛在優(yōu)勢(shì)為(a)蛋白質(zhì)在受體細(xì)胞中表達(dá)后，以天然表位呈遞給免疫系統(tǒng)，以及(b)核酸的化學(xué)均一性、易于制備和穩(wěn)定性，使其特別適合用于聯(lián)合疫苗以及用于缺少常規(guī)疫苗所需冷藏環(huán)節(jié)的情況。
大多數(shù)有效的“轉(zhuǎn)統(tǒng)”疫苗針對(duì)急性、自限感染，并激發(fā)酷似與相應(yīng)感染的恢復(fù)和免疫力相關(guān)的免疫應(yīng)答。即它們依賴針對(duì)來自感染物的、以其天然形式呈遞的抗原的正常免疫應(yīng)答。在這種系統(tǒng)中核酸疫苗具有重要的優(yōu)勢(shì)。過去，為達(dá)此目的，一般利用或者(i)活的減毒疫苗生物體(例如薩賓脊髓灰質(zhì)炎(Sabin polio)疫苗)；(ii)隨后是滅活的野生型生物體(或細(xì)菌毒素)(例如索爾克(Salk polio)脊髓灰質(zhì)炎疫苗)，或者(iii)使用重組DNA技術(shù)制造天然抗原(例如乙型肝炎疫苗亞基)。在本發(fā)明中，DNA疫苗具有巨大優(yōu)勢(shì)，其靶抗原是在受體細(xì)胞內(nèi)以天然形式合成的。這也適用于基于病毒復(fù)制子的投遞系統(tǒng)(例如，Kunjin復(fù)制子系統(tǒng)(Khromykh等人，1997；Varnavski等人，1999；Varnavski等人，2000)。但是，針對(duì)DNA疫苗所編碼抗原的抗體反應(yīng)常常很低或者檢測(cè)不到。
在針對(duì)正常免疫應(yīng)答所不能清除的感染的預(yù)防和治療性疫苗的開發(fā)中取得的進(jìn)展非常少。對(duì)于常規(guī)無法清除的感染因子，例如HCV和人類免疫缺陷性病毒(HIV)，那些能夠針對(duì)相應(yīng)抗原誘導(dǎo)正常免疫應(yīng)答的疫苗，幾乎沒有用處。對(duì)于通常被視為“自我”的腫瘤特異性抗原也如此，其正常免疫應(yīng)答就是一種耐受。盡管標(biāo)準(zhǔn)DNA或者復(fù)制子疫苗具有許多潛在的優(yōu)勢(shì)，但恰恰因?yàn)樗鼈兙幋a其天然形式的抗原，在所以這些情況下可能是無效的。
已經(jīng)利用多種方法調(diào)節(jié)對(duì)DNA疫苗的免疫應(yīng)答，包括(i)與細(xì)胞因子或編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒共投遞；(ii)在細(xì)菌(和質(zhì)粒)DNA中普遍發(fā)現(xiàn)的CpG二核苷酸免疫刺激作用(Hemmi等人，2000)；以及(iii)利用DNA疫苗連同痘病毒載體的引發(fā)-加強(qiáng)(Prime-Boost)方案。
現(xiàn)有的抗原靶向策略包括利用(a)泛素融合體(泛素-A76或-G76-K)以靶向蛋白質(zhì)進(jìn)行多聚泛素化、在蛋白酶體內(nèi)快速胞內(nèi)降解及有效的MHC-I呈遞；(b)與溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP-1)融合，以靶向MHC-II途徑；(c)與腺病毒E3前導(dǎo)序列融合，以靶向表位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)；以及(d)與CTLA4融合，以靶向表位進(jìn)行分泌，并由專職抗原呈遞細(xì)胞(APCs)攝取。
然而，許多DNA疫苗的效果較弱(Gurunathan S等人，2000)，需要開發(fā)改進(jìn)的技術(shù)和分子，以調(diào)節(jié)對(duì)引起恢復(fù)或保護(hù)的DNA疫苗所表達(dá)蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述在本發(fā)明的前序工作中，發(fā)明人已經(jīng)證明，當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)戊型肝炎病毒(HEV)的全長(zhǎng)衣殼蛋白質(zhì)PORF2時(shí)，大約80％新合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并快速降解，而20％蛋白質(zhì)以完整形式蓄積存在于胞質(zhì)溶膠中(4)。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了HEV PORF2的N端肽序列，其允許不均一多肽加工(“加工肽”或“加工組分”)，并且已經(jīng)利用這種加工肽序列開發(fā)了增強(qiáng)對(duì)目的抗原性多肽的免疫應(yīng)答的策略。
發(fā)明人使用一系列表達(dá)載體(其編碼無融合蛋白質(zhì)的ORF2.1片段(ORF2.1)或者融合HEV PORF2 N端序列的蛋白質(zhì))，在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)了HEV PORF2.1抗原性多肽片段；Sig1-ORF2.1具有PORF2的1-20位氨基酸，Sig2-ORF2.1具有PORF2的1-36位氨基酸，或者Sig3-ORF2.1具有PORF2的1-50位氨基酸。發(fā)明人確定，盡管發(fā)現(xiàn)ORF2.1蛋白質(zhì)幾乎專門存在于可溶性胞質(zhì)溶膠級(jí)分中，但Sig1肽幾乎專門被導(dǎo)向膜級(jí)分，而Sig2和Sig3肽引起不均一性定位。此外，就Sig2-ORF2.1和Sig3-ORF2.1多肽而言，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)溶膠相關(guān)蛋白質(zhì)穩(wěn)定，而膜相關(guān)蛋白質(zhì)則降解，與產(chǎn)生混合型免疫應(yīng)答相符(分別為抗體和CTL反應(yīng))。
將ORF2的N端序列(Sig1、Sig2和Sig3)與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合時(shí)，顯示其以同樣方式被不均一性加工(即，定位和加工)，從而證實(shí)此發(fā)現(xiàn)具有廣泛的共性。
在對(duì)PORF2.1的抗體反應(yīng)為可測(cè)定的大鼠模型中，測(cè)定較之未修飾蛋白質(zhì)，加工肽增強(qiáng)對(duì)抗原性多肽的免疫應(yīng)答的能力。Sig1-ORF2.1和Sig3-ORF-2.1誘導(dǎo)了增強(qiáng)的抗體反應(yīng)，就Sig3-ORF2.1而言，大部分轉(zhuǎn)運(yùn)的級(jí)分被快速降解，這有助于MHC-1途徑呈遞并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明一方面提供在動(dòng)物中增強(qiáng)對(duì)目的抗原性多肽免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給予該動(dòng)物有效量的包含編碼融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的組合物，該融合蛋白質(zhì)包含加工組分和所述抗原性多肽，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分提供對(duì)抗原性多肽的不均一性加工，并導(dǎo)致對(duì)抗原性多肽的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
本發(fā)明另一方面提供分離的核酸分子，其包含編碼加工肽的核苷酸序列，當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，所述加工肽能調(diào)節(jié)宿主對(duì)抗原性多肽的免疫應(yīng)答。
再一方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其包含編碼加工肽(其當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，所述加工肽能為目的抗原性多肽提供不均一性加工)的核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面提供編碼加工肽的分離的核酸分子，當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，該加工肽能夠增強(qiáng)宿主對(duì)抗原性多肽的免疫應(yīng)答，其中所述加工肽由戊型肝炎病毒ORF2核苷酸序列N端區(qū)域的毗鄰核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼。
本發(fā)明另一方面還提供編碼加工肽的分離的核酸分子，當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，該加工肽能夠調(diào)節(jié)宿主對(duì)抗原性多肽的免疫應(yīng)答，其中所述加工肽包含選自戊型肝炎病毒PORF2蛋白質(zhì)N端區(qū)域的大約5-100個(gè)毗鄰氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該分離的核酸分子包含基本上如SEQID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的的核苷酸序列或其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發(fā)明另一方面還提供分離的多肽，其包含選自戊型肝炎病毒PORF2蛋白質(zhì)N端區(qū)域的大約5-100個(gè)毗鄰氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優(yōu)選地，上述分離的多肽具有基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發(fā)明再一方面提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分和至少一個(gè)抗原性組分，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分為抗原性組分提供不均一性加工，并導(dǎo)致宿主中針對(duì)該抗原性組分的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
本發(fā)明另一相關(guān)方面提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分以及至少一個(gè)宿主中的抗原性組分，所述加工組分能夠增強(qiáng)對(duì)所述抗原性組分的免疫應(yīng)答，并包含信號(hào)序列以及任選的中間肽，該中間肽包含基本上對(duì)應(yīng)于能夠不均一性胞內(nèi)加工的蛋白質(zhì)的N端區(qū)域的氨基酸序列。
優(yōu)選地，上述加工組分包含信號(hào)序列和中間肽，該中間肽包含基本上對(duì)應(yīng)于能夠不均一性胞內(nèi)加工的蛋白質(zhì)的N端區(qū)域的氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面還提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分以及至少一個(gè)抗原性組分，所述加工組分能夠增強(qiáng)對(duì)所述抗原性組分的免疫應(yīng)答，所述加工組分包含信號(hào)序列以及任選的中間肽，該中間肽包含基本上對(duì)應(yīng)于戊型肝炎病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(PORF2)的N端區(qū)域的氨基酸序列，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優(yōu)選地，上述加工組分包含信號(hào)序列和來自戊型肝炎病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(PORF2)的N端區(qū)域的中間肽序列，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發(fā)明再一方面還提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分以及至少一個(gè)抗原性組分，所述加工組分能夠調(diào)節(jié)宿主中對(duì)所述抗原性組分的免疫應(yīng)答，并包含選自戊型肝炎病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(PORF2)的N端區(qū)域大約5-100個(gè)毗鄰氨基酸的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的一個(gè)方面，該融合蛋白質(zhì)的加工組分包含基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列，其分別對(duì)應(yīng)于PORF2的N端區(qū)域的1-22、1-36或1-50位氨基酸或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發(fā)明另一方面提供了分離的包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含由戊型肝炎病毒ORF2基因5’區(qū)編碼的加工組分以及抗原性組分，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述的加工組分可調(diào)節(jié)宿主中針對(duì)抗原性組分的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明再一方面還提供包含上述核酸構(gòu)建體的疫苗，例如病毒復(fù)制子或DNA分子。
本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面提供了用上述核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如抗原呈遞細(xì)胞。
本發(fā)明又一方面還提供了用于增強(qiáng)動(dòng)物中免疫應(yīng)答的組合物，其包含上述核酸構(gòu)建體以及一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。
本發(fā)明再一方面提供了調(diào)節(jié)動(dòng)物中針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含，在足以調(diào)節(jié)對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答的時(shí)間和條件下，給予動(dòng)物有效量的上述核酸構(gòu)建體、或者編碼或包含上述核酸構(gòu)建體的疫苗或細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及上述核酸分子或構(gòu)建體在制備治療或預(yù)防疾病或感染(包括而不限于癌癥或癌前病變、自身免疫疾病、動(dòng)物包括人及其它哺乳動(dòng)物、魚或鳥中病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染)的藥物中的應(yīng)用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1提供了相對(duì)于戊型肝炎病毒PORF2全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的sig1、sig2和sig3肽的圖譜，以及各個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。顯然可以預(yù)見到介于這些例子之間的中間大小蛋白質(zhì)具有類似用途。
圖2為放射性標(biāo)記的ORF2.1和sig1-2.1、sig2-2.1和sig3-2.1的免疫沉淀和PAGE示意圖，顯示編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠(c)或膜結(jié)合(m)部分的不同定位。注意ORF2.1和sig1-2.1具有均一性定位，而sig2-2.1和sig3-2.1具有不均一性定位。還應(yīng)注意不同遷移率的多個(gè)條帶，是由于轉(zhuǎn)運(yùn)到膜部分的蛋白質(zhì)的部分糖基化造成的。
圖3為放射性標(biāo)記的ORF2.1和sig1-2.1、sig2-2.1和sig3-2.1的免疫沉淀和PAGE分析示意圖，顯示編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠(cyto)或膜結(jié)合(memb)部分的不同定位(如圖2)，以及每一蛋白質(zhì)種類在標(biāo)記后0、1或4小時(shí)的不同穩(wěn)定性。注意ORF2.1和sig1-2.1具有均一性加工(分別在4小時(shí)后降解或保持穩(wěn)定)，而sig2-2.1和sig3-2.1具有與其不均一性定位(分別是cyto和memb)一致的不均一性加工(穩(wěn)定和降解的)。
圖4為放射性標(biāo)記的sig1-GST、sig2-GST和sig3-GST的免疫沉淀和PAGE分析示意圖，顯示編碼蛋白質(zhì)在細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠(cyto)或膜結(jié)合(memb)部分的不同定位，以及每一蛋白質(zhì)種類在標(biāo)記后0或3小時(shí)的不同穩(wěn)定性。注意sig1-GST具有不均一性定位(cyto加memb)但均一性加工(穩(wěn)定的)，而sig2-GST和sig3-GST具有不均一性定位(cyto加memb)并且不均一性加工(穩(wěn)定和降解的)。
圖5為動(dòng)物或人中針對(duì)基于核酸或病毒載體的疫苗的免疫應(yīng)答示意圖。(A).針對(duì)抗原蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的一般模式，取決于其胞內(nèi)加工和定位。注意大多數(shù)單一的蛋白質(zhì)種類可能只遵循所示四個(gè)途徑之一。(B)利用融合目的抗原的sig肽預(yù)測(cè)的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的模式。在使用的實(shí)施例中，HEV的ORF2.1抗原是靶抗原，包含線性和構(gòu)象性兩種B細(xì)胞表位，并可能包含T細(xì)胞表位，疫苗是基于質(zhì)粒的DNA疫苗，其編碼ORF2.1、sig1-2.1或sig3-2.1、或泛素-2.1，產(chǎn)生快速降解的產(chǎn)物(參考文獻(xiàn)8和9)。給出了對(duì)接受不同疫苗的動(dòng)物所預(yù)測(cè)的免疫應(yīng)答途徑。注意在體液(抗體)和細(xì)胞兩種免疫應(yīng)答的活化中，sig3-2.1不均一性定位和加工是獨(dú)特的，其兩種免疫應(yīng)答之間正反饋的可能性增加。
縮寫Ab，線性線性肽表位的抗體。Ab，構(gòu)象構(gòu)象性肽表位的抗體。CTL細(xì)胞免疫應(yīng)答。
圖6為表示用各種DNA疫苗構(gòu)建體免疫的大鼠中針對(duì)HEV ORF2.1的抗體的產(chǎn)生示意圖(vec；單獨(dú)載體；單獨(dú)ORF2.1，Ub.2.1；泛素-A76-ORF2.1，sig1.2.1；Sig1-ORF2.1，sig3.2.1；Sig3-ORF2.1)。每組兩只大鼠，在0、4和8周通過肌肉內(nèi)注射溶于鹽水的100μg DNA進(jìn)行免疫，并在指定時(shí)間利用ORF2.1 ELISA測(cè)定抗體反應(yīng)(安德森等人，1999)。
圖7為Western印跡示意圖，顯示在用DNA疫苗構(gòu)建體免疫的大鼠中HEV ORF2.1的抗體的產(chǎn)生。利用Riddel等人(2000)所述方法，通過針對(duì)全長(zhǎng)ORF2蛋白質(zhì)的各種片段的Western免疫印跡，測(cè)試來自經(jīng)Sig1-ORF2.1或Sig3-ORF2.1免疫的大鼠的抗體。注意Sig1-ORF2.1DNA疫苗誘導(dǎo)針對(duì)構(gòu)象性O(shè)RF2.1表位的抗體，而Sig3-ORF2.1 DNA疫苗誘導(dǎo)針對(duì)構(gòu)象性O(shè)RF2.1表位和線性表位兩種表位的高水平抗體，這與通過MHC-II途徑呈遞完整和降解的抗原相符。
表1SEQ ID NOS概述
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明部分依據(jù)對(duì)戊型肝炎病毒PORF2衣殼蛋白質(zhì)N端肽的鑒定，這些肽賦予包含與異源蛋白質(zhì)融合的這些肽之一的融合蛋白質(zhì)以獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工模式。產(chǎn)生合適的表達(dá)載體以及克隆策略的方法為本領(lǐng)域公知。這樣，可以同時(shí)加工DNA疫苗編碼的抗原，以達(dá)到細(xì)胞和體液兩種免疫應(yīng)答的最佳刺激。
可以預(yù)想到編碼與任何目的抗原性肽或多肽融合的本發(fā)明加工肽序列的核酸構(gòu)建體，當(dāng)其在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，將會(huì)調(diào)節(jié)對(duì)目的多肽的免疫應(yīng)答。
近來對(duì)核酸疫苗的研究表明，通過融合泛素，經(jīng)由蛋白酶體途徑快速降解蛋白質(zhì)，可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，但此種降解大大消除對(duì)同一蛋白質(zhì)的抗體(體液)免疫應(yīng)答(8和9)。類似地，通過以保持與細(xì)胞相結(jié)合的或者由細(xì)胞中分泌出來的形式表達(dá)相同抗原蛋白質(zhì)，可激發(fā)不同的免疫應(yīng)答(3)。因此，針對(duì)核酸疫苗的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答對(duì)抗原的胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工模式敏感。很多情況下，兩條免疫途徑均可能為疫苗的防護(hù)效力所必需，均衡的反應(yīng)可能需要特定抗原蛋白質(zhì)的不同加工。
在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)抗原時(shí)，其胞內(nèi)加工一般是均一性的。也就是說，蛋白質(zhì)的每個(gè)拷貝基本上按相同方式加工，例如通過轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并隨后于細(xì)胞表面表達(dá)或分泌而被加工，或者通過滯留在胞質(zhì)溶膠中或靶向蛋白酶體或其它降解途徑進(jìn)行降解而被加工。結(jié)果，在給予核酸疫苗之后，其蛋白質(zhì)表達(dá)將導(dǎo)致該編碼的蛋白質(zhì)以均一模式加工，依特定蛋白質(zhì)的加工途徑不同而偏向細(xì)胞或體液途徑的免疫應(yīng)答。
對(duì)許多疾病而言，并不了解是體液還是細(xì)胞免疫力更可能提供對(duì)疾病防護(hù)或治療效果，可能兩種免疫應(yīng)答通常均為最佳防護(hù)或治療效果所必需。另外，有許多疾病，其特征在于受侵襲個(gè)體中缺少防護(hù)或治療性免疫應(yīng)答，例如癌癥和慢性病毒感染，如丙型肝炎、乙型肝炎和人類免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)感染。對(duì)于這些疾病，顯然疾病相關(guān)蛋白質(zhì)抗原的常規(guī)蛋白質(zhì)加工模式不能激發(fā)可導(dǎo)致復(fù)原或保護(hù)的免疫應(yīng)答。
因此，本發(fā)明一方面提供增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)目的抗原性多肽的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給予所述動(dòng)物有效量的其中包含編碼融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的組合物，該融合蛋白質(zhì)包含加工組分和所述抗原性多肽，其中當(dāng)宿主細(xì)胞表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分提供對(duì)該抗原性多肽的不均一性加工，并導(dǎo)致對(duì)該抗原性多肽的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼加工組分的核酸構(gòu)建體編碼包含如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物的加工組分。
此處涉及的“增強(qiáng)免疫應(yīng)答”或“調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答”應(yīng)當(dāng)理解為，包含涉及上調(diào)和下調(diào)一種或多種免疫應(yīng)答，并包含細(xì)胞和/或體液(抗體)免疫應(yīng)答的最佳刺激，也可能包含兩種免疫應(yīng)答之間有利的反饋機(jī)制。除細(xì)胞免疫應(yīng)答之外還活化體液免疫應(yīng)答也可能具有可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和特別是TH1型免疫細(xì)胞的額外優(yōu)勢(shì)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，抗原性多肽的不均一性加工，可增強(qiáng)混合的免疫應(yīng)答，即抗體和細(xì)胞兩種反應(yīng)。
此處涉及融合蛋白質(zhì)“加工組分”或“加工肽”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為包含涉及特別影響融合蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位和/或蛋白酶解加工的肽或多肽。優(yōu)選地，該加工組分能使抗原性組分在胞內(nèi)不均一性定位。加工組分可來自HEV或者其它任何來源。加工肽可定位在抗原性多肽的5’處。可選地，加工多肽可在相對(duì)于抗原性多肽的3’位置起作用。再可選地，加工組分可從融合蛋白質(zhì)內(nèi)的嵌套位置起作用。很明顯，本發(fā)明人設(shè)想的融合蛋白質(zhì)不包括天然存在的分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，此處所述方法可用來鑒定另外的允許對(duì)包含它們的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行不均一性加工的加工肽。
本發(fā)明另一方面提供包含編碼加工肽的核苷酸序列的分離的核酸分子，當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，該加工肽能夠調(diào)節(jié)宿主針對(duì)該抗原性多肽的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明另一方面還提供上述分離的核酸分子，其包含基本上對(duì)應(yīng)于戊型肝炎病毒ORF2基因N端區(qū)域的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
本發(fā)明另一方面更提供上述分離的編碼加工肽的核酸分子，該加工肽包含選自戊型肝炎病毒PORF2蛋白質(zhì)N端區(qū)域的大約5-100個(gè)毗鄰氨基酸的序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)特定方面，氨基酸1是最N端的氨基酸。N端區(qū)域可包含多達(dá)約100個(gè)氨基酸。
優(yōu)選地，被試肽包含PORF2 N端區(qū)域1-22或1-36位氨基酸，更優(yōu)選地，被試肽包含PORF2的N端區(qū)域1-50位氨基酸，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，涉及“功能性”時(shí)，均包含多肽及其編碼多核苷酸，在宿主細(xì)胞表達(dá)該多核苷酸時(shí)，其能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明一方面提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分和至少一個(gè)抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分能夠增強(qiáng)宿主對(duì)該抗原性組分的免疫應(yīng)答。
適用于本發(fā)明的核酸分子可能是任何形式的核酸分子，例如DNA或者RNA。
在本發(fā)明這方面的一個(gè)特定實(shí)施方案中，該加工組分包含能在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)融合蛋白質(zhì)定位到膜和胞質(zhì)溶膠的信號(hào)序列，該融合蛋白質(zhì)在幾小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，并可有效增強(qiáng)對(duì)抗所述原組分的抗體反應(yīng)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，該加工組分提供不均一性胞內(nèi)定位(即胞質(zhì)溶膠和膜區(qū)室)和/或混合型胞內(nèi)蛋白酶解加工(穩(wěn)定和降解的)的特征。本發(fā)明不受任何一種作用模式或理論的限制，據(jù)認(rèn)為本發(fā)明的加工組分同時(shí)靶向融合蛋白質(zhì)，以達(dá)到細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的最佳刺激。
因此，本發(fā)明另一方面提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分以及至少一個(gè)抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，并能夠調(diào)節(jié)宿主中對(duì)所述抗原性組分的免疫應(yīng)答，所述加工組分包含信號(hào)序列以及任選的中間肽，其包含基本上對(duì)應(yīng)于能夠進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)不均一性翻譯后加工的蛋白質(zhì)N端區(qū)域的氨基酸序列。
優(yōu)選地，上述加工組分包含信號(hào)序列和中間肽，其包含基本上對(duì)應(yīng)于能夠進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)不均一性翻譯后加工的蛋白質(zhì)N端區(qū)域的氨基酸序列。
此處涉及“信號(hào)序列”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為包含涉及通常、但不一定必須位于新合成多肽的N端的肽。信號(hào)序列可指導(dǎo)細(xì)胞器的翻譯后攝取，并于蛋白質(zhì)成熟時(shí)被切掉。它包含任何真核或原核的信號(hào)序列，可以是天然存在形式時(shí)與目的抗原蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)或來自任何其它有用來源。根據(jù)本發(fā)明，信號(hào)序列可能是全功能的并完全斷裂的，或者其斷裂和/或信號(hào)序列功能可能無效。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，可以利用各種已知算法預(yù)測(cè)多肽的信號(hào)序列(G.von Heijne等人，1989)。
本發(fā)明另一方面還提供包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分以及至少一個(gè)宿主中的抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，能夠調(diào)節(jié)對(duì)所述抗原性組分的免疫應(yīng)答，所述加工組分包含信號(hào)序列以及任選的中間肽，其包含基本上對(duì)應(yīng)于戊型肝炎病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(PORF2)的N端區(qū)域的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優(yōu)選地，上述加工組分包含信號(hào)序列和中間肽，其肽包含基本上對(duì)應(yīng)于戊型肝炎病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(PORF2)的N端區(qū)域的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
此處涉及的“中間肽序列”應(yīng)當(dāng)理解為包含涉及位于信號(hào)序列3’端的序列，該3’序列可改變通過融合蛋白質(zhì)上的加工組分賦于的加工特性。如同信號(hào)序列一樣，中間肽序列可以來自任何來源，包括戊型肝炎病毒PORF2 N端區(qū)域的。
本發(fā)明又一方面還提供了包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含加工組分以及至少一個(gè)抗原性組分，所述加工組分位于抗原性組分的5’端，能夠調(diào)節(jié)對(duì)所述抗原性組分的免疫應(yīng)答，所述加工組分包含信號(hào)序列以及中間肽，其中所述加工組分包含基本上對(duì)應(yīng)于選自戊型肝炎病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(PORF2)N端區(qū)域的5-100個(gè)毗鄰氨基酸的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，加工組分包含選自PORF2 N端區(qū)域的大約5-100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選30-90個(gè)，再優(yōu)選20-60個(gè)氨基酸，或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
優(yōu)選地，加工組分包含基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述、分別相當(dāng)于PORF2蛋白質(zhì)N端區(qū)域的1-22、1-36或1-50位氨基酸的的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面涉及的“衍生物”，包含片段、部分、部分、等價(jià)物、類似物、突變體、模擬物或者同系物。多肽衍生物可能來自氨基酸插入、缺失或者置換。多核苷酸衍生物可以來源于單個(gè)或者多個(gè)核酸置換、缺失、和/或添加，包含與其它核酸分子融合。等價(jià)物應(yīng)當(dāng)理解為包含可作為功能類似物或激動(dòng)劑的分子。例如可通過天然產(chǎn)物篩選檢測(cè)到等價(jià)物。涉及的“變體”包含與多肽或多核苷酸序列具有至少50％，或優(yōu)選60％或65-80％，并最優(yōu)選至少90％相似性的分子。可以通過誘突研究或合理設(shè)計(jì)，建立功能性變體。此外，多核苷酸變體也可能包含在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與本發(fā)明多核苷酸雜交的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，融合蛋白質(zhì)的加工組分包含由基本上對(duì)應(yīng)于HEV ORF2基因N端區(qū)域毗鄰核苷酸的1-300個(gè)核苷酸的序列編碼的肽。
優(yōu)選地，該加工組分包含由基本上如SEQ ID NO4或SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼的肽。
本發(fā)明另一方面提供了包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中所述融合蛋白質(zhì)包含由戊型肝炎病毒ORF2 5’區(qū)編碼的加工組分以及抗原性組分，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分可調(diào)節(jié)宿主中針對(duì)該抗原性組分的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明再一方面還提供了包含上述核酸構(gòu)建體的疫苗。
本發(fā)明另一相關(guān)方面提供了用上述核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本發(fā)明適用的細(xì)胞可以是免疫細(xì)胞和/或呈遞細(xì)胞(其能夠在宿主生物內(nèi)呈遞或靶向或引導(dǎo)融合蛋白質(zhì)，以優(yōu)化對(duì)抗原性組分的免疫應(yīng)答)。根據(jù)這個(gè)方面，細(xì)胞可以在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染。特別優(yōu)選的細(xì)胞類型是樹突狀細(xì)胞。
本發(fā)明又一方面還提供了用于調(diào)節(jié)動(dòng)物中免疫應(yīng)答的組合物，其包含上述核酸構(gòu)建體以及一種或多種藥物可接受的載體和/或稀釋劑。
此處涉及的“動(dòng)物”廣義地包含哺乳動(dòng)物、鳥、魚和爬行動(dòng)物，并擴(kuò)展到例如而不限于人類、靈長(zhǎng)類、家畜動(dòng)物(例如羊、豬、牛、馬)相伴動(dòng)物(例如狗、貓)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠)、捕獲的野生動(dòng)物(例如狐貍、鹿)、籠養(yǎng)鳥類(例如鸚鵡)以及家禽鳥類(例如雞、鴨)動(dòng)物。優(yōu)選的被試動(dòng)物是人或靈長(zhǎng)類。最優(yōu)選的被試者是人。
適于注射使用的藥物形式包括無菌水溶液(當(dāng)水溶性時(shí))，以及可即時(shí)制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。在任何情況下，該形式必須是無菌的，并必須是易于注射的流體。它必須在生產(chǎn)和貯存條件下穩(wěn)定，并必須防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇、等等)、其適當(dāng)?shù)幕旌衔?、以及植物油?？梢酝ㄟ^例如利用卵磷脂包被、保持分散劑所需的顆粒大小以及利用表面活性劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。可以通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞(thirmerosal)等防止微生物作用。在很多情況下，其優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉?？梢栽诮M合物中使用延遲吸收的試劑，例如一硬脂酸鋁和明膠，來延長(zhǎng)該注射組合物的吸收。
如能適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)其活性成分，可以經(jīng)口服給藥，例如與惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起，或者裝入硬殼或軟殼膠囊中，或者壓成片劑，或者直接混入膳食中。對(duì)于口服治療給藥，該活性化合物可以與賦形劑混合，并以可食入的片劑、頰含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、糖漿劑、干膠片等形式應(yīng)用。這種組合物和制劑應(yīng)當(dāng)包含至少1％(重量)的活性化合物。當(dāng)然可以改變?cè)摻M合物和制劑的百分比，可以方便地介于單位重量的大約5-80％?；钚曰衔镌谶@種治療用組合物中的數(shù)量，應(yīng)使能夠獲得適當(dāng)?shù)膭┝?。根?jù)本發(fā)明制備優(yōu)選的組合物或者制劑，使得其口服單位劑型包含大約0.1μg-2000mg的活性化合物。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等也可以包含粘合劑例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑例如磷酸氫鈣；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂；以及甜味劑例如蔗糖、乳糖或可以添加糖精，或者調(diào)味劑例如薄荷油、冬青油、或櫻桃香精。如果單位劑型是膠囊劑，則除上述類型材料之外，還可以包含液體載體。其它多種材料可以用作包衣，或用于修飾劑量單位的外觀。例如，片劑、丸劑、或膠囊劑可以用蟲膠、糖或其兩者包被。糖漿劑或酏劑可包含活性化合物、甜味劑蔗糖、防腐劑對(duì)羥基苯甲酸甲酯和丙酯、染料以及香料，例如櫻桃或柑桔香料。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料應(yīng)該是藥物學(xué)純的，并在應(yīng)用劑量?jī)?nèi)基本上沒有毒性。此外，活性化合物可以摻入緩釋制劑。
藥物可接受的載體和/或稀釋劑包含任意及所有溶劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑或促進(jìn)劑等等。為藥學(xué)活性物質(zhì)應(yīng)用此類介質(zhì)和試劑為本領(lǐng)域所公知。除去與該活性成分或細(xì)胞不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，其均可考慮用于該治療組合物。補(bǔ)充的活性成分也可以摻入組合物中。
按照便于給藥和統(tǒng)一劑量的單位劑型配制非腸道組合物，特別有利。此處使用的單位劑型是指對(duì)于要被治療的哺乳動(dòng)物受試者適合作為單元?jiǎng)┝康奈锢砩系碾x散單元；每個(gè)單元包含經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生目的治療效果的預(yù)定量的活性物質(zhì)和所需藥物載體。對(duì)本發(fā)明新穎的單位劑型的說明取決并直接依賴于(a)活性物質(zhì)的獨(dú)特特征和欲達(dá)到的特定治療效果，以及(b)本領(lǐng)域?qū)旌洗祟惢钚晕镔|(zhì)用于治療活的受試者中的疾病所固有的限制，該活的受試者處于如此處詳述的身體健康失調(diào)的病態(tài)。
按照上文公開，將主要活性成分按有效量與藥學(xué)上可接受的合適載體混合，制成單位劑型，以方便和有效給藥。例如，每單位劑型可以包含總計(jì)0.5μg-約2000mg的主要活性化合物。按比例表示，通常每m1載體含活性化合物大約0.5μg-2000mg。就包含補(bǔ)充活性成分的組合物而言，參照所述成分的常用量和給藥方式，確定其劑量。
組合物形式的核酸構(gòu)建體或疫苗可以通過任何方便方式給藥，例如而不限于，基因槍直接給藥、脂質(zhì)體或聚合微球體傳送或者通過基于病毒的載體傳送。按特定情況的用量，藥用組合物制劑可預(yù)期展現(xiàn)其治療或預(yù)防活性。其變動(dòng)取決于例如動(dòng)物、給藥方法和治療需要。適用的劑量范圍很寬。例如，對(duì)于病人，每公斤體重可給予大約0.1μg-1mg的核酸構(gòu)建體?？梢哉{(diào)整劑量方案，以產(chǎn)生最佳的治療反應(yīng)?？砂凑杖魏畏奖愕姆绞浇o藥，例如通過口服、靜脈內(nèi)(當(dāng)水溶性時(shí))、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或栓劑途徑或者植入(例如利用緩釋分子)。
本發(fā)明又一方面提供了在動(dòng)物中調(diào)節(jié)對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含在足以調(diào)節(jié)對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答時(shí)間和條件下給予所述動(dòng)物有效量的上述核酸構(gòu)建體、或者編碼或包含上述核酸構(gòu)建體的疫苗或細(xì)胞。
上述方法可以提供包括在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或體外或體內(nèi)生產(chǎn)抗體、包括單克隆抗體的特別有用的方法。
本發(fā)明也提供上述核酸構(gòu)建體在制造治療或預(yù)防疾病或感染(包括而不限于癌癥或癌前病變、自身免疫疾病、病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染)的藥物中的用途。
以下非限制性實(shí)施例更完全地描述了本發(fā)明的其它特性。
實(shí)施例1HEV融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠或膜結(jié)合部分的不同定位使用一系列表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)HEV編碼的抗原蛋白質(zhì)ORF2.1，該表達(dá)載體編碼無融合蛋白質(zhì)(ORF2.1)、或者具有sig1(sig1-2.1)、sig2(sig2-2.1)或sig3(sig3-2.1)的N端融合蛋白質(zhì)的ORF2.1(圖1)。細(xì)胞在放射性甲硫氨酸和半胱氨酸存在下溫育，以標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì)，將細(xì)胞分成可溶性胞質(zhì)溶膠(c)和膜部分(m)，利用特異性O(shè)RF2.1多克隆抗體，通過免疫沉淀選擇包含ORF2.1序列的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE和放射自顯影檢測(cè)?？梢钥闯觯@然ORF2.1幾乎完全存在于可溶性胞質(zhì)溶膠部分，sig1-2.1幾乎完全存在于膜部分，而sig2-2.1和sig3-2.1以相近比例存在于兩個(gè)部分中。注意多條不同遷移率的條帶，是由于轉(zhuǎn)運(yùn)到膜部分的蛋白質(zhì)的部分糖基化作用引起的，因?yàn)楫?dāng)用衣霉素處理細(xì)胞以防止N-糖基化時(shí)，這些條帶消失了(未顯示)。此圖表明每個(gè)sig蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位所帶來的獨(dú)特效果，特別是sig2和sig3帶來不均一性定位。
實(shí)施例2HEV融合蛋白質(zhì)的不同穩(wěn)定性如圖2所示，表達(dá)每種蛋白質(zhì)的細(xì)胞在放射性氨基酸存在下溫育，然后在過量非放射性氨基酸存在下進(jìn)一步溫育不同時(shí)間，如前所述分級(jí)分離并分析。通過比較放射性標(biāo)記結(jié)束(時(shí)間0小時(shí))、進(jìn)一步溫育1或4小時(shí)后細(xì)胞中每種放射性蛋白質(zhì)的量，可以確定每種蛋白質(zhì)的加工模式?？梢钥闯?圖3)，蛋白質(zhì)ORF2.1主要發(fā)現(xiàn)于胞質(zhì)溶膠中(cyto)，合成之后1小時(shí)是穩(wěn)定的，而蛋白質(zhì)sig1-2.1主要發(fā)現(xiàn)于膜部分(memb)，合成之后4小時(shí)是穩(wěn)定的。相反，sig2-2.1和sig3-2.1于cyto和memb部分中均有發(fā)現(xiàn)，cyto-相關(guān)蛋白質(zhì)4小時(shí)后是穩(wěn)定的，而memb-相關(guān)蛋白質(zhì)4小時(shí)后幾乎完全降解。因此預(yù)計(jì)，在這些實(shí)施例中，sig2-2.1和sig3-2.1由于其不均一性加工和定位，將引起對(duì)ORF2.1蛋白質(zhì)的混合型免疫應(yīng)答，而ORF2.1和sig1-2.1由于其均一性加工和定位，每種會(huì)引起單一模式的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例3SIG.GST融合蛋白質(zhì)的不同定位和穩(wěn)定性如實(shí)施例2所述，為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，將sig1、sig2或sig3與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)融合。在這個(gè)實(shí)施例中可以看出，sig1-GST在cyto和memb部分具有相同比例的不均一性定位，而兩個(gè)部分的均一性加工在4小時(shí)后是穩(wěn)定的。相反，sig2-GST和sig3-GST在0小時(shí)時(shí)cyto和memb部分具有相同比例的不均一性定位，eyto部分的不均一性加工在3小時(shí)后是穩(wěn)定的，而memb部分在3小時(shí)后幾乎完全地降解。因此預(yù)計(jì)通過利用這些sig1、sig2或sig3融合蛋白質(zhì)，將會(huì)調(diào)節(jié)針對(duì)靶抗原例如GST的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例4Sig1、Sig2和Sig3的核酸序列利用帶有添加的限制性位點(diǎn)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF2序列的適當(dāng)片段得到以下序列。Sig1 SEQ ID NO4ATGCGCCCTCGGCCTATTITGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCSig2 SEQ ID NO5ATGCGCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTITCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTGGCCGCCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGTSig3 SEQ ID NO6ATGCGCCCTCGGCCTATTTTGCTGTTGCTCCTCATGTTTCTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGCCCGGTCAGCCGTCTGGCCGCGTCGTGGGCGGCGCAGCGGCGGTTCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGTTGATTCTCAGCCC用于表達(dá)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是pC1-neo(Promega)，其具有CMV立即早期啟動(dòng)子、SV40多聚腺苷酸化以及嵌合的剪接信號(hào)。
實(shí)施例5用質(zhì)粒構(gòu)建體免疫Balb/C小鼠通過標(biāo)準(zhǔn)方法例如基因槍或肌肉內(nèi)注射，將質(zhì)粒構(gòu)建體ORF2.1、sig1-2.1、sig2-2.1和sig3-2.1以及GST、sig1-GST、sig2-GST和sig3-GST中的每一種接種Balb/C小鼠證明sig1、sig2和sig3肽的活性，并利用例如特異性抗體同型方式、T細(xì)胞增殖反應(yīng)、以及溶細(xì)胞性T細(xì)胞反應(yīng)方法，比較接受每種疫苗的動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。可以預(yù)料，此處所示實(shí)施例中在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的不同胞內(nèi)加工方式，也會(huì)在接種DNA疫苗的小鼠細(xì)胞中發(fā)生，并將根據(jù)各個(gè)構(gòu)建體的蛋白質(zhì)加工，引起調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答。可以通過將每個(gè)sig肽與其它目的抗原融合進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，目的抗原包括而不限于流感病毒核蛋白(NP)和血細(xì)胞凝集素(HA)、丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒包膜和核心蛋白質(zhì)、人免疫缺陷病毒包膜和gag蛋白質(zhì)、以及源于人和動(dòng)物的其它病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲病原體的目的抗原、以及癌癥相關(guān)抗原。圖5為預(yù)期的每種疫苗構(gòu)建體的不同免疫應(yīng)答的示意圖。
總之，由核酸疫苗編碼的sig1、sig2和sig3以及源于HEV PORF2的相關(guān)肽，與單獨(dú)抗原或具有胞內(nèi)均一性加工和定位模式的肽-抗原融合蛋白質(zhì)(例如泛素-抗原融合蛋白質(zhì))相比，由于其不均一性的胞內(nèi)加工和定位模式，將可應(yīng)用于調(diào)節(jié)和增強(qiáng)對(duì)融合蛋白質(zhì)抗原的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例6對(duì)融合異源蛋白質(zhì)的HEV信號(hào)肽的免疫應(yīng)答在0、4和8周肌內(nèi)(IM)注射溶于鹽水中的100μgDNA，將ORF2.1系列質(zhì)粒構(gòu)建體給予大鼠，并利用ORF2.1 ELISA(Anderson等人，1999)測(cè)量抗體反應(yīng)(表1、圖6、圖7)。編碼單獨(dú)ORF2.1或融合有泛素-A76的質(zhì)粒未能激發(fā)任何可檢測(cè)的抗體，而Sig1-ORF2.1在2/2只大鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。最有趣的是，Sig3-ORF2.1在1/2只大鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。此外，大部分蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)運(yùn)的部分)在4h內(nèi)降解，這很可能有利于MHC-I途徑呈遞和CTL反應(yīng)的誘導(dǎo)。
通過針對(duì)ORF2蛋白質(zhì)的不同片段的Western免疫印跡檢測(cè)大鼠中的抗體反應(yīng)(Li等人，1997；Riddell等人，2000)，可以揭示對(duì)線性和構(gòu)象性表位的反應(yīng)性(圖7)。值得注意的是，Sig1-和Sig3-ORF2.1均誘導(dǎo)針對(duì)HEV ORF2.1構(gòu)象性表位的抗體(Riddel等人，2000)，其被認(rèn)為是對(duì)于DNA疫苗的廣泛效用重要的特性。還應(yīng)注意，Western免疫印跡中SIG3-ORF2.1誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)性水平高于SIG1-ORF2.1，大概是由于呈遞給B細(xì)胞的是完整(構(gòu)象性)和降解(線性)的抗原的混合物。
這些實(shí)驗(yàn)因此證明與DNA疫苗編碼的未修飾蛋白質(zhì)相比，Sig1和Sig3的融合可促進(jìn)增強(qiáng)的抗體反應(yīng)，并伴隨著一部分融合Sig3的蛋白質(zhì)快速降解，這將導(dǎo)致CTL反應(yīng)和抗體反應(yīng)兩者的平衡，其將繼而改善編碼抗原例如感染物或腫瘤的抗原的DNA疫苗效果。
實(shí)施例7HEV信號(hào)肽靶向系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用在pCI-neo中制備DNA疫苗構(gòu)建體來編碼Sig1和Sig3與下列抗原的融合體(i)HCV核心/E1/E2；(ii)HCV核心；(iii)HCV E1/E2；(iv)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；(v)流感核蛋白(NP)；(vi)流感血細(xì)胞凝集素(HA)。利用PCR從現(xiàn)有質(zhì)粒擴(kuò)增每種蛋白質(zhì)的編碼序列，在各種情況下，還構(gòu)建表達(dá)相應(yīng)的全長(zhǎng)(天然)蛋白質(zhì)以及與泛素-A76的C端融合的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)(對(duì)照，靶向MHC-I)的質(zhì)粒。用每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos細(xì)胞，通過脈沖追蹤放射性標(biāo)記、細(xì)胞分級(jí)分離、western免疫印跡以及免疫沉淀分析靶蛋白質(zhì)的命運(yùn)，以證明是否可以賦予各種靶抗原以HEV Sig1和Sig3的靶向作用。
每組6只小鼠，在0和4周每只通過肌內(nèi)注射100μg載體(pCI-neo質(zhì)粒，陰性對(duì)照)、或編碼形式為(a)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)(對(duì)照)；(b)Ub-A76-蛋白質(zhì)(對(duì)照)；(c)Sig1-蛋白質(zhì)；(d)Sig3-蛋白質(zhì)的靶抗原GST、ORF2.1、HBsAg、NP和HA之一的載體進(jìn)行免疫。對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)疫苗作為附加的對(duì)照。
在0、4、8和12周收集血液，在12周采集組織(淋巴結(jié)、脾)。通過ELISA確定全部以及同型特異性IgG反應(yīng)，分別表示體液免疫應(yīng)答的大小以及傾向Th1/Th2反應(yīng)的替代標(biāo)志。HA和NP的分析包括(a)CTL活性和(b)ELISPOT和/或胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，以確定其頻率以及特異性T細(xì)胞的Th1/Th2傾向性。
為更嚴(yán)格試驗(yàn)HEV Sig1或Sig3所致效能，利用流感感染的亞致死小鼠模型，檢測(cè)HA和NP的DNA疫苗構(gòu)建體。如前所述免疫動(dòng)物，并在12周通過鼻內(nèi)接種亞致死劑量的輕度流感病毒株激發(fā)全部動(dòng)物。五天后無痛處死小鼠，采集肺組織，通過噬斑分析測(cè)定病毒載荷。這些研究將證實(shí)，HEV Sig序列的混合型靶向作用導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。參考文獻(xiàn)1.Anderson，D.，et al.(1999)J.Virolgical Methods 81131-1422.Gurunathan，S.et.al.(2000)Ann Rev Immunol.18927-74.3.Forns，X.，S.U.et.al.(1999).Vaccine.171992-2002.4.von Heijne G.et al(1989)Protein Eng.，25315.Khromykh，A.A.，et al.(1997).J Virol.711497-505.6.Li，F(xiàn).，et al.(1997)J.Virological Methods 52289-3007.Riddell，M.，et al.(2000)J.Virol.748011-80178.Rodriguez F.，et.al.(1997).J Virol.718497-503.9.Rodriguez，F(xiàn).，et.al.(1998)J Virol.725174-81.10.Torresi，J.，F(xiàn).et.al.(1999).J Gen Virol.801185-8.11.Varnavski，A.N.et al.(1999)Virology.255366-75.12.Varnavski，A.N.et al.(2000).J Virol.744394-403.13.WolffJ.A.et.al.(1990)Science.2471465-8.
表2.DNA質(zhì)粒編碼的HEV信號(hào)肽融合蛋白質(zhì)的胞內(nèi)加工和免疫原性概述構(gòu)建體ER轉(zhuǎn)運(yùn) 快速降解a分泌 抗體誘導(dǎo)bORF2.1 - + - -Sig1-ORF2.1 ++ - - ++++Sig2-ORF2.1 + + - ntSig3-ORF2.1 + + - ++UbA76-ORF2.1- + - -GST - - - ntSig1-GST+ - + ntSig2-GST+ + + ntSig3-GST+ + + ntUbA76-GST -+ nt nta4hr后靶蛋白質(zhì)降解75％以上(即t1/2<2hr)。Sig2-和Sig3-蛋白質(zhì)只有轉(zhuǎn)運(yùn)部分降解。
b在0、4和8周肌內(nèi)注射100μg DNA，每組2只大鼠，在12周測(cè)定ORF2.1-特異性Ab。
序列表<212>PRT<213>戊型肝炎病毒<400>1Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Pro Pro20<210>2<211>36<212>PRT<213>戊型肝炎病毒<400>2Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg20 25 30Arg Ser Gly Gly35<210>3<211>50<212>PRT<213>戊型肝炎病毒<400>3Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met1 5 10 15Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg20 25 30Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser35 40 45Gln Pro50<210>4<211>66<212>DNA<213>戊型肝炎病毒<400>4atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca60ccgccc66<210>5<211>108<212>DNA<213>戊型肝炎病毒<400>5atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca60ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggt 108<210>6<211>150<212>DNA<213>戊型肝炎病毒<400>6atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca60ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt120ttctggggtg accgggttga ttctcagccc 150
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)動(dòng)物中對(duì)目的抗原性多肽免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予該動(dòng)物有效量包含編碼包含加工組分和目的抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的組合物，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分提供對(duì)抗原性多肽的不均一性加工，并導(dǎo)致對(duì)該抗原性多肽的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述加工組分來源于戊型肝炎病毒PORF2蛋白質(zhì)的N端區(qū)域。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的編碼加工組分的核酸構(gòu)建體編碼包含如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物的加工組分。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述加工組分包含基本上如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述加工組分包含由基本上如SEQ IDNO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼的氨基酸序列。
6.增強(qiáng)動(dòng)物中對(duì)病毒衣殼多肽的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含給予所述動(dòng)物有效量包含編碼包含加工組分和所述衣殼多肽的融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體的組合物，其中所述加工組分由基本上如SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼，并對(duì)所述衣殼蛋白質(zhì)提供不均一性加工，導(dǎo)致其免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述加工組分由SEQ ID NO6所述的核苷酸序列編碼。
8.包含編碼加工肽的核苷酸序列的分離的核酸分子，當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，該加工肽可增強(qiáng)宿主對(duì)目的抗原性多肽的免疫應(yīng)答。
9.包含編碼加工肽的核苷酸序列的分離的核酸分予，當(dāng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞中表達(dá)為包含加工肽和抗原性多肽的融合蛋白質(zhì)時(shí)，該加工肽可提供對(duì)目的抗原性多肽的不均一性加工。
10.權(quán)利要求8或9中的分離的核酸分子，其中所述加工組分來源于戊型肝炎病毒PORF2蛋白質(zhì)的N端區(qū)域。
11.權(quán)利要求8或9中的分離的核酸分子，其中所述加工組分由基本上如SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所述的核苷酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物編碼。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9中的分離的核酸分子，其中所述加工組分包含基本上如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列或者其功能性衍生物、變體、部分或同系物。
13.分離的核酸構(gòu)建體，其包含編碼融合蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該融合蛋白質(zhì)包含加工組分和至少一個(gè)抗原性組分，所述加工組分包含基本上如SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的氨基酸序列，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分提供對(duì)抗原性多肽成分的不均一性加工，并導(dǎo)致對(duì)該抗原性多肽的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
14.權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求13的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的分離的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中該細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。
16.包含權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的核酸分子或構(gòu)建體的核酸疫苗。
17.權(quán)利要求16的核酸疫苗，其中所述核酸疫苗包含病毒復(fù)制子。
全文摘要
本發(fā)明涉及增強(qiáng)對(duì)核酸疫苗的免疫應(yīng)答的方法，其包含給予動(dòng)物以編碼融合蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體，該融合蛋白質(zhì)包含加工組分和目的抗原性多肽，其中當(dāng)在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸構(gòu)建體時(shí)，所述加工組分對(duì)該抗原性多肽提供不均一性加工，并導(dǎo)致免疫應(yīng)答增強(qiáng)。該加工組分來源于戊型肝炎病毒PORF2的N端部分。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1426472SQ01808764
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者李凡, D·A·安德森, D·F·J·波塞爾 申請(qǐng)人:麥克法蘭布奈特醫(yī)療研究與公共健康研究所有限公司