專利名稱：編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有藥學(xué)作用的含生理活性物質(zhì)作為有效組分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑，有效組分源自動物、微生物或植物以有利于增進健康；涉及含有上述生理活性物質(zhì)的功能性食物或飲料；并涉及生產(chǎn)它們的方法。
現(xiàn)有技術(shù)近年來，編程性細胞死亡的模式一直是有關(guān)細胞組織死亡的注意點。
與病理性細胞死亡的壞死不同，認(rèn)為編程性細胞死亡是一種從開始就被整合進細胞本身基因的死亡。這樣，認(rèn)為決定編程性細胞死亡程序的基因在一些外源或內(nèi)源性原因作為觸發(fā)器發(fā)揮作用的地方被激活，在該基因的基礎(chǔ)上生物合成一種程序性死亡基因蛋白質(zhì)，并且細胞本身被所產(chǎn)生的程序性死亡蛋白質(zhì)降解，由此引起細胞的死亡。
如果能在所需組織或細胞中表達這樣的編程性細胞死亡，將有可能從活的機體中以其天然形式排除不必要的或病原性細胞，這將具有顯著的意義。
近年來，編程性細胞死亡與鞘脂例如神經(jīng)酰胺之間的關(guān)系引起關(guān)注并且有人報道通過軟脂酸和硬脂酸發(fā)生神經(jīng)酰胺的從頭合成，籍此引起編程性細胞死亡[生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)，272卷，3324-3329頁(1997)]。
本發(fā)明所要解決的問題盡管期望神經(jīng)酰胺和游離脂肪酸被發(fā)展為編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑，但是源自活的機體的其它脂溶性物質(zhì)的編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用卻完全不明確。
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的高度安全的源自植物、微生物或動物的提取組分，以及提供一種含有該組分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑，一種含有該組分作為組成組分的功能性食物或飲料，和生產(chǎn)它們的方法。
解決問題的方法本發(fā)明的發(fā)明者為達到以下的目的和結(jié)論進行了深入的調(diào)查，結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)得自植物、微生物或動物的分子結(jié)構(gòu)中無磷酸酯和膦酸酯的甘油脂和甘油糖脂顯示了強編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用，并因此完成本發(fā)明。
這樣，本發(fā)明的第一個方面涉及一種編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑，并且其特征在于含有分子結(jié)構(gòu)中無磷酸酯和膦酸酯的甘油脂和/或甘油糖脂作為有效組分。
本發(fā)明的第二個方面涉及生產(chǎn)本發(fā)明第一個方面的制劑的方法，并且其特征在于在生產(chǎn)本發(fā)明第一個方面的制劑的方法中，包括用一種有機溶劑提取源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
本發(fā)明的第三個方面涉及用于誘導(dǎo)編程性細胞死亡的食物或飲料，其中含有、向其中加入有和/或在其中稀釋有分子結(jié)構(gòu)中無磷酸酯和膦酸酯的甘油脂和/或甘油糖脂。
本發(fā)明的第四個方面涉及生產(chǎn)本發(fā)明第三個方面的食物或飲料的方法，其特征在于在生產(chǎn)本發(fā)明第三個方面的食物或飲料的方法中，包括用一種有機溶劑提取源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的步驟。
附圖的簡短說明

圖1顯示了透析后的DEAE-Sepharose Fast Flow柱的內(nèi)部溶液洗脫模式。
圖2顯示了級分B和純物質(zhì)的編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用。
圖3顯示了純物質(zhì)NMR圖譜。
圖4顯示了樣品A完全離子色譜圖。
圖5顯示了樣品B完全離子色譜圖。
圖6顯示了Sepharose LH-60柱色譜圖。
圖7顯示了級分No.20脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖8顯示了級分No.21脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖9顯示了級分No.23脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖10顯示了級分No.20糖組分的完全離子色譜圖。
圖11顯示了級分No.21糖組分的完全離子色譜圖。
圖12顯示了級分No.23糖組分的完全離子色譜圖。
圖13顯示了用氯仿洗脫的級分之脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖14顯示了用比例為80∶20的氯仿和丙酮洗脫的級分之脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖15顯示了用氯仿洗脫的級分之糖組分的完全離子色譜圖。
圖16顯示了用比例為80∶20的氯仿和丙酮洗脫的級分之糖組分的完全離子色譜圖。
圖17顯示了Rf值為約0.25的斑點之脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖18顯示了Rf值為約0.25的斑點之糖組分的完全離子色譜圖。
圖19顯示了Rf值為約0.33的斑點之脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖20顯示了Rf值為約0.33的斑點之糖組分的完全離子色譜圖。
圖21顯示了Lyophyllum ulmarium乙醇提取物的脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖22是顯示了Lyophyllum ulmarium乙醇提取物之糖組分的完全離子色譜圖。
圖23是顯示了粉末狀綠茶(matcha)乙醇提取物之脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖24是顯示了粉末狀綠茶乙醇提取物之糖組分的完全離子色譜圖。
圖25是顯示了米糠75％乙醇提取物之脂質(zhì)組分的完全離子色譜圖。
圖26是顯示了米糠75％乙醇提取物之糖組分的完全離子色譜圖。
進行本發(fā)明的模式本發(fā)明將如下文特別說明。
對于本發(fā)明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂無特殊限制，并且它們/它可從植物、微生物或動物中生產(chǎn)或化學(xué)合成。
可在本發(fā)明中使用的植物、微生物或動物無特殊限制，只要它們其中含有甘油脂和/或甘油糖脂。植物的實例有蔬菜例如菠菜、胡蘿卜和洋蔥；雙子葉植物例如茶；單子葉植物例如大麥和水稻；調(diào)味品例如胡椒、肉桂蔻、大蒜、月桂葉、芹菜、芥末、姜、紅胡椒、百里香、藏紅花、桂皮、香草、allspice、日本芥末、西洋菜、日本胡椒、牛排植物、草藥、八角茴香、羅勒、日本韭菜、蛇麻草和日本辣根；從例如谷物的那些植物的殘留物中加工出來的產(chǎn)物；藻類例如棕色海藻(褐藻類)、紅色海藻(紅藻類)、綠色海藻(綠藻類)和單細胞綠色海藻；微生物例如蘑菇、酵母、絲狀真菌(例如曲霉屬)和細菌(例如納豆芽孢桿菌和乳酸菌)；以及動物例如脊椎動物和無脊椎動物。
本發(fā)明說明書中使用的術(shù)語“茶”可以是通常稱為茶的任何物質(zhì)并且它的實例有未發(fā)酵的茶例如綠茶、煎茶(中級綠茶)、粗茶(低級茶)、焙粗茶(烘焙茶)、粉末狀綠茶；半發(fā)酵茶例如paipao茶、烏龍茶和泡沖茶(paochong tea)；以及后發(fā)酵茶例如普洱茶。除它們以外，術(shù)語“茶”包括冬青茶、kuko(中國婚姻藤)茶、adley茶和大麥茶。
對于本發(fā)明使用的蘑菇無特殊限制盡管優(yōu)先選擇通常食用的蘑菇并且實例有擔(dān)子菌(Basidiomysetes)例如Lyophyllum ulmarium，荷葉離褶傘(Lyophyllum decastes)，香茹(Lentinus edodes)，Tricholowa matsutake，Lyophyllum shimeji，F(xiàn)lammulina velutipes，光帽磷傘(Pholiota nameko)，Gyrophora esculenta，木耳(Auricularia auricula)，純黃竹蓀(Dictyophoraindusiata)，亞磚紅沿絲傘(Naematoloma sublateritium)，Boletopsisleucomelas，Sarcodon aspratus，紅根須腹菌(Rhizopogon rubescens)，Amanita hemibapha，多汁乳茹(Lactarius volemus)，假蜜環(huán)菌(Armillariamellea)，紅汁乳茹(Lactarius hatsudake)，糙皮側(cè)耳(Pleurotus ostreatus)，Grifola frondosa，潔麗香茹(Lentinus lepideus)和普通蘑菇(Agaricusbisporus或諸如此類)；以及子囊菌(Ascomycetes)例如tochukaso(無性黃蜂或植物蠕蟲)。
對于本說明書中使用的藻類無特殊限制，其實例有棕色海藻例如囊藻(Colpomenia sinuosa)，海蘊(Nemacystus decipiens以及索藻科(Chordariaceae)中的其它種類)，海帶(Laminaria japonica)，Kjellmaniellacrassifolia，裙帶菜(Undaria pinnatifida)，Eisenia pinnatifida和Hizikiafusiforme；紅色海藻例如石花菜(Gelidium)和三叉仙菜(Ceramiumkondoi)；綠色海藻例如孔石莼(Ulva pertusa)，Prasiola japonica和刺松藻(Codium fragile)；以及單細胞綠色海藻例如Chlorella。
對于本發(fā)明中使用的谷物殘留物無特殊限制，并且其實例有米糠、麥糠、大麥根和豆腐的渣滓(okara)。
在本發(fā)明中優(yōu)選從那些茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物中制備的甘油脂和或甘油糖脂，并用作編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑或功能性食物或飲料有效組分。
對于本發(fā)明中使用的有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的甘油脂和甘油糖脂無特殊限制，并且可應(yīng)用的甘油脂實例有單、雙和三脂酰甘油，而可應(yīng)用的甘油糖脂的實例有在疏水性基序帶有甘油的糖脂，例如以單脂?；鶊F、雙脂?；鶊F、烷脂酰基團、雙烷脂?；鶊F、鏈烯脂?；鶊F或二聯(lián)植烷酯等的基團作為疏水基團的甘油糖脂。這樣，單半乳糖二脂酰基甘油、單葡萄糖二脂?；视?、雙半乳糖二脂酰基甘油、雙葡萄糖二脂?；视汀㈦p甘露糖二脂酰基甘油、三葡萄糖二脂?；视汀⑺钠咸烟嵌；视汀⒍嗑燮咸烟嵌；视突蛑T如此類的物質(zhì)可用作中性甘油糖脂，而cenolipid、磺基異鼠李糖二脂?；视王?、gluculonosyl二脂酰基甘油或諸如此類物質(zhì)可用作酸性甘油糖脂。
組成本發(fā)明中使用的甘油脂和甘油糖脂的脂肪酸的實例有飽和和/或不飽和脂肪酸例如十四烷酸(肉豆蔻酸，C140)、十六烷酸(棕櫚酸，C160)、十四碳烯酸(肉豆蔻腦酸，C141)、十六碳烯酸(棕櫚油酸，C161)、十八碳烯酸(油酸，C181)、順-9，順-12-十八碳二烯酸(亞油酸，C182)和9，12，15-十八碳三烯酸(亞麻酸，C183)，而組成性的糖的實例有巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、甘露醇和肌醇。另外，甘油糖脂包括甘油脂與糖和/或蛋白質(zhì)等等的復(fù)合物。
通過其中包括一個用有機溶劑例如含水的親水性有機溶劑(例如，乙醇水溶液)提取步驟的方法，可以很容易地生產(chǎn)出本發(fā)明中使用的有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂。但對于該甘油脂和/或甘油糖脂的生產(chǎn)方法并無特殊限制。這樣，不但可以使用僅僅用水的提取法，還可以使用可用于純化該甘油脂和/或甘油糖脂的已知的方法。對含有源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂的物質(zhì)進行化學(xué)、物理或酶處理，然后純化目標(biāo)甘油脂和/或甘油糖脂也是可能的。對于純化，甘油脂和/或甘油糖脂的物理化學(xué)特性或生理學(xué)活性(編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用等等)可用作純化的指標(biāo)。
在本發(fā)明中，源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂經(jīng)有機溶劑例如己烷、氯仿、乙酸乙酯、親水性有機溶劑(例如，丙酮、丙醇、乙醇和甲醇)提取，產(chǎn)物與水的混合物或混合溶劑和含有甘油脂和/或甘油糖脂的可食性物質(zhì)可通過包括一個，例如，用乙醇水溶液提取步驟的生產(chǎn)方法很容易地生產(chǎn)。當(dāng)被用作食物或飲料時，提取優(yōu)選在以下條件下進行，其中一種有機溶劑，特別是親水性有機溶劑例如10-95％或優(yōu)選20-80％乙醇水溶液通常在10～70℃或優(yōu)選在20～60℃使用幾分鐘到幾天，或優(yōu)選幾十分鐘到幾十小時，這樣可有效地提取是編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂。在用有機溶劑或尤其用親水性有機溶劑提取前用酸或堿處理源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂，可能更有效地提取是編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂。
關(guān)于本發(fā)明中使用的收集純凈甘油脂和/或甘油糖脂的方法，可使用有些已知的方法例如Bligh-Dyer法和Folch分配法(參看“新生化實驗教科書”(New textbook on Experiments of Biochemistry)，卷4，脂質(zhì)III，104-109頁，1990，日本生物化學(xué)協(xié)會(Japan Biochemical Society)編輯，Tokyo Kagaku Dojin出版)以及與目的相適合的它們中的任何方法以提取本發(fā)明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂。
在本發(fā)明使用的甘油脂和/或甘油糖脂的純化中，使用疏水性載體、反相載體、正相(normal phase)載體等等對上面提到的提取物進行層析，由此能進行更有效地分離。
對于疏水性載體無特殊限制，任意一種已知載體均有可能被用到。這樣的載體的實例有其中引入丁基、辛基或苯基的Sephacryl型、Sepharose型、Toyopearl型樹脂等等以及Amberlite吸附樹脂XAD-1、-2、-4、-200、-7或-8。對于反相載體無特殊限制，可使用已知載體的任意一種，并且這樣的載體的一個實例為其中有共價連接烷基鏈的硅膠。對于正相載體無特殊限制，可使用已知載體的任意一種并且該載體的一個實例為硅膠。在進行純化中，可使用甘油脂和/或甘油糖脂的物理和化學(xué)特性或生理學(xué)活性例如編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用作為指標(biāo)。
本發(fā)明中使用的源自植物、微生物或動物的甘油脂和/或甘油糖脂，可以例如，通過傳統(tǒng)離子交換處理、疏水性層析處理、凝膠過濾處理等的方法從可食性植物、可食性微生物、可食性動物等等的乙醇水溶液提取物中純化出來。
通常，在很多情形中植物、微生物或動物中的甘油脂和/或甘油糖脂以與膜附近的糖或蛋白質(zhì)結(jié)合的高分子物質(zhì)的形式存在，并且例如一經(jīng)用熱水提取，能夠得到其中甘油脂和/或甘油糖脂與糖和/或蛋白質(zhì)結(jié)合的含甘油脂和/或甘油糖脂的物質(zhì)。另外，術(shù)語糖意為一種存在于植物、微生物或動物中的糖，它包括單糖、寡聚糖、多聚糖和糖偶聯(lián)物。
在本發(fā)明中，可使用所制備的這樣的含甘油脂和/或甘油糖脂的高分子物質(zhì)，因為盡管這是根據(jù)使用目的，經(jīng)酶、化學(xué)和或物理處理糖和/或蛋白質(zhì)以純化和收集甘油脂和/或甘油糖脂，由此得到更加純化狀態(tài)的甘油脂和/或甘油糖脂還是可能的。
通過上述方法得到的并在本發(fā)明中使用的甘油脂和/或甘油糖脂是來自天然的高度安全的物質(zhì)，并且作為食物和/或飲料特別有用。
當(dāng)所得到的甘油脂和/或甘油糖脂與識別靶細胞的配體例如單克隆抗體結(jié)合時，可在任何靶細胞中特異地引起編程性細胞死亡。再者，當(dāng)本發(fā)明的化合物與載體例如白蛋白質(zhì)結(jié)合時，能提供有更高吸收特性的物質(zhì)。
本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑可通過將例如源自植物、微生物或動物的是有效組分的那些甘油脂和/或甘油糖脂與已知的藥學(xué)載體結(jié)合而被制成藥學(xué)制劑。一般地，本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物例如甘油脂和/或甘油糖脂與藥學(xué)上可接受的液體或固體載體形成化合物，如果需要，之后加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖液、穩(wěn)定劑、賦形劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑等等，由此能制備固體制劑例如片劑、粒劑、稀釋粉劑、粉末制劑和膠囊以及液體制劑例如標(biāo)準(zhǔn)液體制劑、懸浮液和乳濁液?；蛘?，化合物可被制成干燥制劑，在實際使用前加入合適的載體將其轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w。
本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑可通過任何口服試劑和非腸道試劑例如注射和滴注試劑的方式來給予。
可以根據(jù)上述劑量形式和制劑形式選擇藥學(xué)載體。在口服試劑的情況下，可以使用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等等。在制備口服試劑中，結(jié)合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、促流動劑、矯味劑、著色劑、香料等等可以與其形成化合物。
另一方面在非腸道試劑的情況下，將源自例如植物、微生物或動物是本發(fā)明中有效組分有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的甘油脂和/或甘油糖脂溶于或懸浮在稀釋劑中，例如用于注射的蒸餾水、生理鹽水溶液、葡萄糖水溶液、用于注射的植物油、蓖麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇和如果需要，再向其中加入殺菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、麻醉劑等等。
可以根據(jù)制劑形式通過合適給藥途徑給予本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑。對于給藥方法也無特殊限制，并且可以應(yīng)用任何內(nèi)部和外部給藥和注射。注射制劑例如可以通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等等給予。外部制劑包括栓劑以及諸如此類的制劑。
雖然根據(jù)制劑形式、給藥方法和給藥目的以及給予誘導(dǎo)劑的病人之年齡、體重和癥狀，可以合適地確定本發(fā)明編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑的劑量，但此劑量并未確定，盡管通常情況下制劑中含有的有效組分的量對于成人來說為每天0.1-200mg/kg。不言而喻，根據(jù)不同條件劑量也不同，并且因此在一些情況下，少于上面范圍的劑量可能就足夠了，而在另一些情況下，可能需要多于上面范圍的劑量。本發(fā)明的藥學(xué)試劑不僅通過口服給予，還可通過將其加入到任何食物或飲料中每天攝食。
在研究生物防御的機制、免疫功能或與疾病例如癌癥的關(guān)系以及在開發(fā)編程性細胞死亡誘導(dǎo)的抑制劑中，由本發(fā)明編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑提供的編程性細胞死亡誘導(dǎo)方法是有用的。特別是，從作為食物有很長歷史的植物、微生物或動物中制備的是編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂在口服給藥時高度安全。另外，其中含有、向其中加入和/或在其中稀釋有例如源自植物、微生物或動物的本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂的那種或那些食物或飲料，具有天然的高度安全性，并且因為其編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用可作為健康食品。
對于本發(fā)明的食物或飲料無特殊限制，其實例有加工過的農(nóng)業(yè)/林業(yè)產(chǎn)品、加工過的家畜產(chǎn)品、加工過的漁業(yè)產(chǎn)品等等，包括加工過的谷物產(chǎn)品例如加工過的麥產(chǎn)品、加工過的淀粉產(chǎn)品、加工過的預(yù)混合產(chǎn)品、面條、通心面、面包、豆腐、日本蕎麥面條(soba)、日本麥麩面包(fu)、中國豆膠凍棒(bifun)、日本豆膠凍棒(harusame)、和壓縮米糕；加工過的脂肪/油產(chǎn)品例如成形脂肪/油、用于深炸食物的油、色拉油、蛋黃醬和調(diào)味品；加工過的大豆產(chǎn)品例如豆腐、發(fā)酵的豆腐(miso)和發(fā)酵的大豆(natto)；加工過的肉產(chǎn)品例如火腿、腌肉、壓縮火腿(press ham)和香腸；漁業(yè)產(chǎn)品例如冷凍底棲魚類魚肉(surimi)、熟魚醬(kamaboko)、燒成竹樣形狀的熟魚醬(chikuwa)、輕魚餅(hampen)、炸魚丸(satsumaage)、有一些組分的熟魚醬(tsumire)、魚產(chǎn)品(suji)、魚肉火腿、香腸、炸狐鰹(katsuobushi)、加工過的魚卵產(chǎn)品、罐頭魚產(chǎn)品和在大豆沙司中煮濃的貯藏魚產(chǎn)品(tsukudani)；奶產(chǎn)品例如牛奶、奶油、酸奶、黃油、奶酪、濃縮牛奶、干奶粉和冰淇淋；加工過的蔬菜/水果產(chǎn)品例如糊狀物、果醬、泡菜、水果飲料、蔬菜飲料和混合飲料；甜食例如巧克力、餅干、小面包、蛋糕、米球蛋糕和米餅；酒精飲料例如日本米酒(sake)、中國葡萄酒、葡萄酒、威士忌、日本蒸餾酒(shochu)、伏特加酒、白蘭地、杜松子酒、ram、啤酒、軟酒精飲料、果酒和烈性酒；餐桌奢侈品例如綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、軟飲料和乳酸飲料；調(diào)味品例如大豆醬、Worcester醬、醋和mirin；香料例如大蒜的提取物、胡椒、紅胡椒、肉豆蔻、姜、八角茴香、草藥和羅勒；罐裝、瓶裝或袋裝食物例如配有調(diào)味牛肉的熟米、裝在小壺樣容器內(nèi)的熟米(kamameshi)、和紅豆一起煮的米(sekihan)、咖喱和米飯以及其它已加工的食物；半炸或濃縮食物例如肝醬和其它涂抹食品的醬、soba和udon的湯(兩者都是日本面條)和濃縮湯；脫水食物例如速食面、速食咖喱、速溶咖啡、粉狀果汁、粉狀湯、速食miso湯、干餾食物、干餾飲料和干餾湯；冷凍食物例如sukiyaki、chawan-mushi(在鍋中煮的雜燴)、烤鰻魚(unagikabayaki)、漢堡牛排、燒賣(中國蒸餃)、餃子(塞滿碎豬肉等的煎餃)、各種烈酒和水果雞尾酒；固體食物；液體食品例如湯以及香料。
對于生產(chǎn)本發(fā)明的食物或飲料的方法無特殊限制，并且其實例有烹調(diào)、加工和通常使用的生產(chǎn)食物或飲料的方法，可以使用任何方法以生產(chǎn)含有是編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的源自例如植物、微生物和動物的那些甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料。
關(guān)于烹調(diào)和加工，在上述的烹調(diào)或加工后的產(chǎn)品會含有具備編程性細胞死亡誘導(dǎo)特性的甘油脂和/或甘油糖脂。
這樣，可在烹調(diào)或加工前、加工期間或加工后加入有編程性細胞死亡誘導(dǎo)特性的甘油脂和/或甘油糖脂?；蛘撸虼丝蓪⑴胝{(diào)或加工的產(chǎn)品或原材料加入含有甘油脂和/或甘油糖脂的物質(zhì)中使該甘油脂和/或甘油糖脂被稀釋。
在食物或飲料的生產(chǎn)中，可在任何步驟加入有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的甘油脂和/或甘油糖脂。關(guān)于加入方法，可加入甘油脂和/或甘油糖脂或因此可將食物、飲料或材料加入該甘油脂和/或甘油糖脂中使甘油脂和/或甘油糖脂被稀釋?？梢赃M行或者一次或者幾次加入。相應(yīng)地，能很容易地生產(chǎn)有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的食物或飲料。當(dāng)應(yīng)用任意一個那些步驟時，含有具備編程性細胞死亡誘導(dǎo)特性的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料，或者往其中加入或在其中稀釋有本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料被定義為本發(fā)明的食物或飲料。
對于在食物中有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或動物的是本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂)的量無特殊限制，但此量可依器官感覺和生理學(xué)活性合適地選擇。例如，上述甘油脂和/或甘油糖脂的量不少于10-9份每100份食物，并且就作為食物產(chǎn)生的器官感覺和生理學(xué)作用而言，優(yōu)選從10-8份到5份，更優(yōu)選從10-7份到2份。
對于在飲料中本發(fā)明的有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或動物的是本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂)的量無特殊限制，但此量可依器官感覺和生理學(xué)活性合適地選擇。例如，上述甘油脂和/或甘油糖脂的量不少于10-9份每100份飲料，并且就作為飲料產(chǎn)生的器官感覺和生理學(xué)作用而言，優(yōu)選從10-8份到5份，更優(yōu)選從10-7份到2份。另外，在本說明書中，術(shù)語“份”代表按照重量的份。
對于其中含有、往其中加入和/或在其中稀釋有具備編程性細胞死亡誘導(dǎo)特性的本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂之本發(fā)明的食物或飲料的形狀無特殊限制，但可包括能被口服，例如片劑、粒劑、膠囊、凝膠和溶膠的任何形狀。
本發(fā)明的食物或飲料含有大量的有生理學(xué)活性的、是本發(fā)明的編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂，并且因為該甘油脂和/或甘油糖脂編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用，其尤其是對維持胃和腸道良好健康有用的健康食物或飲料。
是本發(fā)明編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂源自植物、微生物或動物，特別是源自可食性植物、微生物或動物到食物或飲料的此甘油脂和/或甘油糖脂的使用是相當(dāng)安全的，此種情況該編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物在實現(xiàn)生理學(xué)功能的濃度下對動物無毒。
可食性植物、微生物或動物中本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂作為食物有很長的歷史，并且由此根據(jù)本發(fā)明制備的含有甘油脂和/或甘油糖脂的物質(zhì)在口服給予時有相當(dāng)高的安全性。相應(yīng)地，很自然地，其中含有、往其中加入和/或在其中稀釋有本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料具有高度安全性。
如上所述，現(xiàn)在已澄清根據(jù)本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂是在活體內(nèi)可獲得的脂類，具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
在本發(fā)明中應(yīng)用的是編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂在植物、微生物或動物的膜部分大量存在，并且特別地，它們/它能以低成本和簡便的方法從可食的植物或微生物中生產(chǎn)。另外，作為編程性細胞死亡誘導(dǎo)目的之化合物的甘油脂和/或甘油糖脂，可以根據(jù)其疏水程度選擇一種合適的溶劑而選擇性地純化。
本發(fā)明中應(yīng)用的是編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂(例如源自植物、微生物或動物的)能夠容易地將其編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用傳遞給食物或飲料，并且具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)特性的本發(fā)明的甘油脂和/或甘油糖脂作為食物或飲料的填加劑也是相當(dāng)有用的。
實施例在此將更為特別地以下面的實施例對本發(fā)明加以說明，然而本發(fā)明并不受這些實施例的限制。另外，這些實施例中的符號％意為重量百分比。
(1)將Kjellmaniella crassifolia充分干燥并將20kg干燥產(chǎn)物在自由式磨碎機(free grinder)(由Nara Kikai Seisakusho制造)中磨碎；二水氯化鈣(由Nippon Soda生產(chǎn))(7.3kg)溶于900ml自來水，然后與20kg磨碎的Kjellmaniella crassifolia混合，向該液體中吹入蒸汽40分鐘使溫度從12℃升高到90℃，并保持在90-95℃攪拌1小時，降溫得到1,100升冷卻產(chǎn)物。
之后對冷卻的溶液使用固-液分離器(型號CNA；由WestfalierSeparator生產(chǎn))進行固-液分離，在固-液分離后約有900升上清液制備出來。
固-液分離后的上清液(360升)用FE10-FC-FUS 0382(分離分子量30,000)(由Daicel生產(chǎn))濃縮至20升。之后將20升自來水加于其中，再使混合物濃縮至20升，重復(fù)此步驟5次以除鹽，籍此從Kjellmaniellacrassifolia中得到25升提取物。
冷凍干燥一升上述溶液得到13g干燥產(chǎn)物。
(2)在實施例1-(1)中提到的提取物(1.4升)用含0.2M CaCl2的20mM醋酸緩沖液(pH6)透析，獲得經(jīng)過透析的內(nèi)部液體。DEAE-Sepharose Fast Flow柱(14cm直徑×45.5cm高)用同樣的緩沖液平衡，將透析后的內(nèi)部液體上柱，用同一緩沖液沖洗并用上述的包含2M NaCl的緩沖液以濃度梯度的方式洗脫?？偺橇亢吞侨┧崃坑帽椒恿蛩岱椒ê瓦沁?硫酸方法檢測，并依洗脫順序得出級分A、B和C。這些級分用蒸餾水透析并冷凍干燥，得到760mg級分B。
級分B顯示出編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
圖1顯示了提取物從DEAE-Sepharose Fast Flow柱中洗脫的模式。這樣，圖1是顯示了源自海藻的提取物從DEAE-Sepharose Fast Flow柱(直徑14cm×高45.5cm)中洗脫的模式圖，其中縱坐標(biāo)顯示了咔唑硫酸法在530nm的和苯酚硫酸法在480nm的吸收以及電導(dǎo)率(mS/cm)，而橫坐標(biāo)顯示了級分序號。在圖中，空圈是苯酚硫酸法在480nm的吸收，黑點是咔唑硫酸法在530nm的吸收，實線是電導(dǎo)率。另外，對于一個級分來說液體的量是1,000ml。
(3)將通過上面的方法得到的級分B(8.6g)上樣到用1M NaCl平衡(其中NaCl的終濃度調(diào)節(jié)到1M)的苯基-Sepharose 6 Fast Flow柱。用1M NaCl沖洗該柱，并通過對水的濃度梯度法洗脫得到級分。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀法將其濃縮，并且用蒸餾水透析得到約6.5ml純凈級分。凍干此純凈級分得到60mg純凈產(chǎn)物。此純凈產(chǎn)物顯示出編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
(4)純凈產(chǎn)物編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的測定以如下方法測定上述級分B和實施例1-(3)中提及的純凈產(chǎn)物的編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。這樣，將級分B或上述純凈產(chǎn)物的0.5ml水溶液加到在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的2.5×105細胞/4.5mlHL-60(ATCC CL-240)中，并在37℃孵育48小時。同時，加入蒸餾水和已知有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的放線菌素D溶液制備對照樣品。在顯微鏡下肉眼觀察編程性細胞死亡體的形成、細胞的皺縮和核的聚集，由此對活細胞計數(shù)。觀察到這樣的現(xiàn)象并確認(rèn)活細胞數(shù)減少時，可確定編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性為陽性。
在加入級分B、純化產(chǎn)物或放線菌素D的情況下證實編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。圖2中給出了結(jié)果。這樣，圖2顯示了當(dāng)以終濃度分別為2mg/ml或0.9mg/ml的限度將級分B或純凈產(chǎn)物加入到上述HL-60細胞培養(yǎng)基中時，孵育時間和培養(yǎng)基中活細胞數(shù)之間關(guān)系圖。橫坐標(biāo)是孵育時間(小時)，而縱坐標(biāo)是培養(yǎng)基中活細胞數(shù)(×105/5ml)。圖中空方形是加水的對照，空菱形是加級分B的情況，空圈是加純凈產(chǎn)物的情況。
(5)有編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用的純凈產(chǎn)物的物理和化學(xué)特性測定上面實施例1-(3)中提及的純凈產(chǎn)物的物理和化學(xué)特性。
(i)NMR分析使用JNM-A500核磁共振設(shè)備(Nippon Denshi生產(chǎn))測定1H-NMR。
圖3表示的1H-NMR圖譜顯示了結(jié)果。圖3中，縱坐標(biāo)顯示了信號強度，橫坐標(biāo)顯示了化學(xué)位移值(ppm)。另外，1H-NMR中的化學(xué)位移值以定義HOD的化學(xué)位移值為4.65ppm來表達。
1H-NMR(D2O)δ0.7(脂肪酸末端甲基的H)，1.1(脂肪酸的亞甲基和巖藻糖C-5位甲基的H)，3.1-5.6(源自糖的H)(ii)GC-MS分析將HCl的5％甲醇溶液(1ml)加到實施例1-(3)提及的純凈產(chǎn)物2mg中，并且將得到的混合物封在試管中，在85℃加熱3小時。冷卻后，用1ml正己烷將其提取三次，并在氮蒸氣下將正己烷提取得到的提取物濃縮到約500μl，得到樣品A。
通過向殘余的甲醇層中加入碳酸銀將其中和并過濾，向濾液吹氮蒸氣以將其蒸發(fā)至干燥，再用真空泵干燥殘渣4小時。干燥后，將5滴TMS試劑(按如下制備即，將2.6ml六甲基二硅氮烷加到2.0ml干燥吡啶中，然后在其中加入1.6ml三甲基氯硅烷，通過離心除去得到的渾濁物質(zhì)，將由此得到的上清液用作試劑)加到殘渣中，并在室溫將得到的混合物靜置30分鐘。之后在50℃加熱該混合物10分鐘，冷卻并加1ml氯仿后攪拌，再用1ml水沖洗氯仿層三次。得到的氯仿溶液用作樣品B。
使用DX-302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi生產(chǎn))在以下面的條件對上述制備的樣品A和B進行GC-MS分析。柱TC-1(G.L. Science)，30m×0.25mm內(nèi)直徑溫度以每分鐘4℃的速度從130℃升到250℃，并在250℃保持5分鐘流動速率每分鐘1.2ml氦氣質(zhì)譜測定的質(zhì)量范圍m/z 50-500質(zhì)譜測定的重復(fù)時間3秒柱TC-1(G.L. Science)，30m×0.25mm內(nèi)直徑溫度以每分鐘4℃的速度從130℃升到300℃，并在300℃保持5分鐘流動速率每分鐘1.2ml氦氣質(zhì)譜測定的質(zhì)量范圍m/z 50-800質(zhì)譜測定的重復(fù)時間3秒結(jié)果是樣品A和B分別呈現(xiàn)出如圖4和圖5中顯示的完全離子色譜圖。每個圖中縱坐標(biāo)是相對強度(％)，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
通過對質(zhì)譜圖每個峰的分析來證實色譜圖中得自樣品A和B的峰。
十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲基酯(峰2)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲基酯(峰3)和十四碳烯酸的甲基酯(峰1)被證實為得自樣品A的主要組分。
從樣品B中證實了源自甘油的峰(峰1)、源自巖藻糖的峰(峰2、3和4)、源自木糖的峰(峰5和6)、源自甘露糖的峰(峰7)、源自半乳糖的峰(峰8、9和10)以及源自葡糖醛酸的峰(峰11)。
相應(yīng)地，發(fā)現(xiàn)上述純凈產(chǎn)物含有甘油脂和/或甘油糖脂。
用2.9升苯基纖維素精細柱(Phenylcellulofine柱)(Seikagaku Kogyo生產(chǎn))處理提取物并用6升1M氯化鈉、6升水和8升乙醇依次洗脫。
通過實施例1-(4)中提到的方法測定每個洗脫級分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用，在乙醇洗脫下來的級分中注意到編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用。
濃縮乙醇洗脫的級分并將其蒸發(fā)至干燥，將殘渣溶解在乙醇中以得到175ml溶液，其中的58ml用預(yù)先經(jīng)乙醇平衡的1,130ml SepharoseLH-60柱(Pharmacia生產(chǎn))處理，用乙醇洗脫該柱并以每60ml為一份收集洗脫液。
圖6給出了洗脫模式。這樣，圖6顯示了Sepharose LH-60柱層析結(jié)果圖，其中縱坐標(biāo)是在230nm的吸光度，橫坐標(biāo)是級分序號。
通過實施例1-(4)中提及的方法測定洗脫級分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性，于是發(fā)現(xiàn)級分序號為8-15和27-49的級分無活性，而級分號為16-21和22-26的級分顯示了編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用。
在顯示有活性的那些級分中，通過實施例1中提及的方法對三個級分(級分號20、21和23)進行成分分析。
圖7、8、9、10、11和12顯示了級分號20、21和23中的每一個的脂質(zhì)組分或糖組分的完全離子色譜圖。這樣，圖7、8和9顯示了級分號20、21和23中的每一個的脂質(zhì)組分的完全離子色譜，而圖10、11和12是顯示了級分號20、21和23中的每一個的糖組分的完全離子色譜。在每個圖中，縱坐標(biāo)是相對強度(％)，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖7和10中顯示了十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖7中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖7中峰3)、十六碳烯酸的甲酯峰(圖7中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖7中峰4)，從級分號為20的級分中檢測出源自甘油的峰(圖10中峰1)和源自半乳糖的峰(圖10中峰2、3和4)。圖8和11中顯示了十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖8中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖8中峰3)、十六碳烯酸的甲酯峰(圖8中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖8中峰4)，從級分號為21的級分中檢測出源自甘油的峰(圖11中峰1)和源自半乳糖的峰(圖11中峰2、3和4)。
圖9和12中顯示了十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖9中峰1)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖9中峰2)，從級分號為23的級分中檢測出源自甘油的峰(圖12中峰1)和源自半乳糖的峰(圖12中峰2、3和4)。
這樣，證實了上述級分含有甘油脂和/或甘油糖脂，并且闡明了甘油脂和/或甘油糖脂有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
(2)收集從如實施例2-(1)中提到的Sepharose LH-60柱洗脫下來的級分號為16-26的級分，濃縮并蒸發(fā)至干燥，干燥殘渣在氯仿中溶解，溶液上樣至用200ml Iatrobeads 6RS-8060(Iatron生產(chǎn))填充的預(yù)先經(jīng)氯仿平衡的柱，用氯仿洗脫，然后相繼用以80∶20、60∶40、40∶60和20∶80的比例混合的氯仿丙酮混合液連續(xù)洗脫。結(jié)果確定，用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的級分表現(xiàn)出強編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
確定了編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的級分以實施例1中提到的方法進行組分分析。
圖13、14、15和16顯示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的每一級分的脂質(zhì)和糖組分的完全離子色譜。這樣，圖13和14顯示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的每一級分的脂質(zhì)組分的完全離子色譜，圖15和16顯示用氯仿和用以80∶20比例混合的氯仿丙酮混合液洗脫的每一級分的糖組分的完全離子色譜。在每個圖中，縱坐標(biāo)是相對強度(％)，橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖13和15中顯示從用氯仿洗脫的級分中檢測出了一個十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖13中峰1)和一個源自甘油的峰(圖15中峰1)，而在圖14和16中顯示，從用80∶20的氯仿丙酮的混合液洗脫的級分中檢測出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖14中峰1)和十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖14中峰2)和一個源自甘油的峰(圖16中峰1)。
如此，確證了上述這些級分包含甘油脂，并且證實了甘油脂具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
結(jié)果，強編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性在用氯仿洗脫的級分和用40∶60氯仿和丙酮混合液洗脫的級分中得到確證。
(2)用氯仿洗脫的級分點樣于硅膠板60F254(Merck生產(chǎn))上并用9∶1的己烷和乙醚作展開劑進行薄層層析，由此在Rf值為約0.25處檢測出一個具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的單一點。
對該點以實施例1中提到的方法進行不同組分的分析。
圖17和18顯示Rf值為約0.25的該點的脂質(zhì)組分或糖組分的完全離子色譜。這樣，圖17顯示Rf值為約0.25的點的脂質(zhì)組分的完全離子色譜，而圖18顯示Rf值為約0.25的點的糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標(biāo)是相對強度，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別表示保留時間(分鐘)和掃描序號。
從圖17和18中顯示，從Rf值為約0.25的點檢測出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖17中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖17中峰2)和十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖17中峰3)和一個源自甘油的峰(圖18中峰1)。
(3)用40∶60氯仿和丙酮混合液洗脫的級分用95∶12的氯仿和甲醇作展開劑進行薄層層析，由此在Rf值為約0.33處檢測出一個具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的點。
對該點以實施例1中提到的方法進行不同組分的分析。
圖19和20顯示Rf值為約0.33的該點的脂質(zhì)組分或糖組分的完全離子色譜。這樣，圖19顯示Rf值為約0.33的點的脂質(zhì)組分的完全離子色譜，而圖20顯示Rf值為約0.33的點的糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標(biāo)是相對強度，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別表示保留時間(分鐘)和掃描序號。
從圖19和20中顯示，從Rf值為約0.33的點檢測出十四烷酸(肉豆蔻酸)的甲酯峰(圖19中峰1)、十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖19中峰2)和源自半乳糖的峰(圖20中峰2、峰3和峰4)以及一個源自甘油的峰(圖20中峰1)。
由此，確證上面給出的實施例3-(2)和實施例3-(3)中提到的點包含甘油脂和甘油糖脂，并且證實此甘油脂和甘油糖脂具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
將下層溶液濃縮并蒸發(fā)至干燥，從中制備出來一種氯仿溶解物質(zhì)，將其上樣至預(yù)先經(jīng)氯仿平衡的200ml Iatrobeads 6RS-8060柱(Iatron生產(chǎn))，并用氯仿、之后用氯仿和丙酮(40∶60)混合液、丙酮和甲醇混合液相繼洗脫該柱。
每個洗脫級分經(jīng)濃縮后，點樣于硅膠板60F254，并對每個確證有甘油脂的級分用櫻草靈試劑和苔黑酚試劑進行甘油脂的檢測。結(jié)果是用低極性的溶劑洗脫的級分含更高量脂質(zhì)，并就編程性細胞死亡誘導(dǎo)作用而言表現(xiàn)出更強的活性。
A.沉淀物中加入25ml75％乙醇水溶液，在60℃進行提取兩小時，離心后的上清液經(jīng)濃縮并蒸發(fā)至干燥，殘渣溶于1ml的75％乙醇水溶液。
B.10ml上清液中加入30ml乙醇，接著攪拌，離心后的上清液在真空中經(jīng)濃縮并蒸發(fā)至干燥，殘渣溶于0.4ml的75％乙醇水溶液中。
C.上清液在真空中蒸發(fā)至干燥，殘渣溶于1ml的75％乙醇水溶液中。
由此制備的提取產(chǎn)物用75％乙醇水溶液稀釋，在96孔微量滴定板的每個孔中加入5μl并風(fēng)干，向其中加入100μl的包含10％胎牛血清和5,000個HL-60細胞的RPMI1640培養(yǎng)基，用將在下面實施例7中描述的MTT法檢測抑制癌細胞生長的活性。
得到如表1所示結(jié)果。這樣，表1顯示提取方法和抑制癌細胞生長的活性之間的關(guān)系，表中的數(shù)據(jù)顯示具有抑制癌細胞生長的活性的稀釋溶液的稀釋率。在用75％乙醇水溶液提取前，粉末化的海帶用酸(①A)或堿(③A、④A、⑤A)溶液為初級提取劑進行處理，由此提取出與未處理的情況(⑦C)相比較具有兩倍強度的抑制癌細胞生長的活性的物質(zhì)。另外，那些級分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性用將在下面實施例8中描述的一種方法進行檢測，以確定具有抑制癌細胞生長活性的級分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
表1初級提取劑ABC①8＜2②44③8-④84⑤82⑥ 8⑦ 4⑧ 2⑨ ＜2
在每0.5g上面制備的磨碎產(chǎn)物中加入75％的乙醇水溶液(25ml)，室溫下提取兩小時。離心獲得提取物后，將其濃縮并在真空中蒸發(fā)至干燥獲得干燥產(chǎn)物。再將干燥產(chǎn)物溶于1ml水制備乙醇提取物。
(2)上述實施例6-(1)中提到的乙醇提取物的抑制癌細胞生長活性的測定。
用GD/X PES過濾器(Whatman生產(chǎn))過濾滅菌每種乙醇提取物，并用滅菌過的水制備稀釋系列。在96-孔的微量滴定板的每孔中各放置10μl稀釋液，向其中加入含有10％胎牛血清和5000HL-60細胞的RPMI1640培養(yǎng)基100μl，于37℃在5％二氧化碳氣的條件下孵育48小時。在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形狀，加入10μl含有5mg/ml 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-聯(lián)苯酚-溴化四唑(MTT；Sigma生產(chǎn))的磷酸緩沖鹽水溶液，再孵育四小時后在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。同時，加入含0.04NHCL的2-丙醇100μl充分?jǐn)嚢?，?90nm測定吸光度以衡量細胞生長程度。
對于那些蘑菇乙醇提取物的抑制癌細胞生長的活性，在30倍的Lyophyllum ulmarium稀釋液和10倍的荷葉離褶傘稀釋液中發(fā)現(xiàn)癌細胞被殺死，由此注意到其強大的抑制癌細胞生長的活性，并且發(fā)現(xiàn)編程性細胞死亡體(apoptic body)。在3倍的Grifola frondosa、Flammulinavelutipes、香茹和光帽磷傘稀釋液中細胞被殺死，在10倍稀釋液中發(fā)現(xiàn)編程性細胞死亡體。由此可見那些蘑菇的每種乙醇提取物均顯示強的抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
(3)對于Lyophyllum ulmarium的乙醇提取物，可通過實施例1中提到的方法對其組分進行分析。
圖21和22顯示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中脂質(zhì)組分或糖組分的完全離子色譜。這樣，圖21顯示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中脂質(zhì)組分的完全離子色譜，圖22顯示Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標(biāo)為相對強度(％)，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別表示保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖21和22顯示在Lyophyllum ulmarium乙醇提取物中十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖21的峰1)和順-9，順-12-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖21的峰2)。來自葡萄糖的峰(圖22的峰2，3和4)，來自甘露醇的峰(圖22的峰5)和來自甘油的峰(圖22的峰1)均可被檢測出來。
已證明其它蘑菇乙醇提取物中亦存在甘油脂和/或甘油糖脂。
用75％的乙醇水溶液制備每種級分在75％乙醇水溶液中的重溶溶液稀釋系列。在96-孔微量滴定板的每一孔中各加入5μl稀釋液并干燥，加入含有10％胎牛血清和5000HL-60細胞(ATCC CCL-240)的RPMI 1640培養(yǎng)基100μl，于37℃孵育48小時。在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形狀后加入10μl含有5mg/ml MTT的緩沖鹽水溶液，再孵育四小時后在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。同時，加入含0.04N HCL的2-丙醇100μl，充分?jǐn)嚢?，?90nm測定吸光度以衡量細胞生長程度(一種MTT方法)。
結(jié)果由20-倍下層中的上述級分殺死細胞，由此注意到其強大的抑制癌細胞生長的活性并證實編程性細胞死亡體存在。這樣，這種Lyophyllumulmarium的濃縮提取物由氯仿以同樣的方式分餾，取得的級分重新溶解到流動相用于硅膠柱層析，從而取代了溶解于75％乙醇水溶液再用于硅膠柱層析的方法。硅膠柱層析在兩種流動相條件下獨立進行，分別為氯仿∶甲醇∶水＝65∶25∶4(條件1)和氯仿∶甲醇＝65∶25(條件2)。每種硅膠柱層析的級分均濃縮并蒸發(fā)干燥，殘留物重新溶解在相當(dāng)于初始液體體積1/20的75％乙醇水溶液中，通過同上的MTT方法測定它的抑制癌細胞生長的活性，被證實具有活性的級分通過薄層層析的方法分析(氯仿∶甲醇∶水＝65∶25∶4)。結(jié)果在條件1下，級分A中有活性，表現(xiàn)為與櫻草靈試劑的斑點反應(yīng)(脂質(zhì))，與茚三酮試劑的斑點反應(yīng)(氨基)，與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)(糖)和與Dittmer試劑的斑點反應(yīng)(磷脂)，級分B的活性表現(xiàn)為與櫻草靈試劑的斑點反應(yīng)和與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)。在條件2下，在級分C中有活性，表現(xiàn)為與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)，級分D中的活性表現(xiàn)為與櫻草靈試劑的斑點反應(yīng)和苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)，級分E中的活性，表現(xiàn)為與櫻草靈試劑的斑點反應(yīng)，與茚三酮試劑的斑點反應(yīng)和與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)。進一步，在條件1下收集級分A，濃縮并蒸發(fā)干燥，溶解入流動相用于硅膠柱層析。將氯仿和甲醇95∶5比率的混合物用作流動相(條件3)。用與前面所述相同的MTT方法分析每種級分，被證實具有活性的級分通過薄層層析的方法分析(氯仿∶甲醇＝95∶5)。結(jié)果在條件3下，級分F中的活性表現(xiàn)為與櫻草靈試劑的斑點反應(yīng)，級分G中的活性表現(xiàn)為與櫻草靈試劑的斑點反應(yīng)和與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)，級分H中的活性表現(xiàn)為與苔黑酚磺酸鹽試劑的斑點反應(yīng)。編程性細胞死亡體的形成證實了那些抑制癌細胞生長的活性級分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
用75％或50％的乙醇水溶液稀釋每種濃縮的Lyophyllum ulmarium提取物。稀釋液按實施例7中提到的MTT方法分析。在用75％或50％的乙醇水溶液稀釋的10-倍提取物溶液中注意到細胞的死亡，證實了其抑制癌細胞生長的活性。這樣又證實了在用75％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液的提取條件下，具有抑制癌細胞生長的活性物質(zhì)可被提取出。進一步，可用那些濃縮的Lyophyllum ulmarium提取物測定編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。因此，用25μl每種上面提到的濃縮提取物為例，從中蒸發(fā)去乙醇，殘留物中加入在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中37℃孵育48小時的2.5×105HL-60細胞/4.5ml。同時，通過添加蒸餾水和已知具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的放線菌素D溶液(10μg/ml)制備對照樣品。在光學(xué)顯微鏡下目視觀察可見編程性細胞死亡體的形成、細胞的收縮和核的凝聚，并可對活細胞計數(shù)。當(dāng)觀察到這些現(xiàn)象并注意到活細胞數(shù)目減少時，可判定樣品具有編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果，75％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液的提取物含有編程性細胞死亡誘導(dǎo)的物質(zhì)。
(2)在40g實施例6中提到的Lyophyllum ulmarium中加入0(0％)、50(25％)、100(50％)或150ml(75％)乙醇和160、110、60或10ml水，混合物置混合器混勻30秒，室溫下振搖兩小時，過濾得到提取物。用75％乙醇水溶液稀釋提取物，并分別通過實施例7中提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定其抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果用0、25和50％乙醇水溶液的2倍稀釋提取物溶液和用75％乙醇水溶液5-倍稀釋的提取物溶液均可見兩種活性。
將上面提到的40g Lyophyllum ulmarium切成3-5mm的立方體，加入50(25％)、100(50％)或150ml(75％)乙醇和110、60或10ml水，混合物在室溫下振搖兩小時，過濾得到提取物。用75％乙醇水溶液稀釋提取物，并通過實施例7中提到的MTT方法測定其抑制癌細胞生長的活性，通過實施例8中提到的方法測定其編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果原始(未稀釋的)含25％乙醇的提取物溶液和用50％和75％乙醇2-倍稀釋提取物溶液均可見兩種活性。
(3)將買來的香茹(Cortinellius shiitake)凍干，磨碎，得到的粉末在表2所示的條件下提取兩小時。
表2香茹粉末乙醇濃度用于提取的液體量 用于提取的溫度①0.5g 25％ 20ml60℃②0.5g 75％ 10ml室溫③0.5g 50％ 10ml室溫④0.5g 75％ 25ml室溫提取后，不溶物質(zhì)經(jīng)離心后移去，濃縮上清液并在真空中蒸發(fā)干燥，用1ml與提取時相同濃度的乙醇水溶液溶解。用75％乙醇水溶液溶液稀釋該溶液，并通過實施例7提到的MTT方法測定其抑制癌細胞生長的活性，通過實施例8中提到的方法測定其編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。結(jié)果10-倍稀釋的液(1)、2-倍稀釋的液(2)、5-倍稀釋的液(3)和5-倍稀釋的液(4)中均可見兩種活性。
(4)分開買到的香茹的菌帽和菌柄。將每種分別凍干，磨碎。在0.5g得到的粉末中加入75％乙醇水溶液25ml，于37℃提取兩小時。濃縮經(jīng)離心后的上清液，并在真空中蒸發(fā)干燥，殘留物溶解于1ml 75％乙醇水溶液中，所得溶液用75％乙醇水溶液稀釋。每種稀釋液抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性分別通過實施例7提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定。結(jié)果在菌帽提取物的2-倍稀釋液和菌柄提取物的20-倍稀釋液中均可見兩種活性。高級的中國香茹干以及中等級別的中國香茹的菌帽和菌柄均用混合器磨碎，用同樣提取物和同樣用于編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的測定方法處理，所有高級提取物和中等級別的菌帽和菌柄的5-倍稀釋提取物溶液均顯示兩種活性。
將提取物稀釋成從1-倍到100-倍的系列。在96-孔的微量滴定板的每孔中各放置10μl稀釋液，加入含有10％胎牛血清和5000HL-60細胞的RPMI1640培養(yǎng)基100μl，孵育48小時，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。結(jié)果在用水和75％乙醇水溶液稀釋的提取物中，細胞均被殺死，即茶的水和乙醇溶液提取物均顯示很強的抑制癌細胞生長的活性。另外，由于編程性細胞死亡體的形成，證實了它們的編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
(2)應(yīng)用實施例1中提到的方法處理實施例10-(1)中提到的綠茶粉末乙醇提取物以分析不同的組分。
圖23和24顯示綠茶粉末乙醇提取物中脂質(zhì)組分或糖組分的完全離子色譜。即，圖23顯示綠茶粉末乙醇提取物中脂質(zhì)組分的完全離子色譜，而圖24顯示綠茶粉末乙醇提取物中糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標(biāo)為相對強度(％)，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖23和24顯示綠茶粉末乙醇提取物中十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖23的峰1)和9，12，15-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖23的峰2)，來自葡萄糖的峰(圖24的峰3，4)，和來自甘油的峰(圖24的峰1)均可被檢測出來，因此可證實甘油脂和/或甘油糖脂的存在。還可檢測出來自肌醇的峰(圖24的峰5)和來自奎寧酸的峰(圖24的峰2)。買施例11(1)取0.5g米糠，加水、75％乙醇水溶液或90％乙醇水溶液，在室溫振搖兩小時。離心提取物，濃縮上清液并在真空中蒸發(fā)干燥，殘留物溶解于1ml水中。在用90％乙醇水溶液獲得的提取物中，不溶于水的物質(zhì)溶解于乙醇。將樣品稀釋，它們抑制癌細胞生長的活性和編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性分別通過實施例7提到的MTT方法和實施例8中提到的方法測定。結(jié)果在水提取物的5-倍稀釋液、未稀釋的75％乙醇提取物溶液和90％乙醇提取物醇溶片段的10-倍稀釋液中均可見兩種活性，可見米糠乙醇提取物顯示很強的抑制癌細胞生長和編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性。
(2)應(yīng)用實施例1中提到的方法處理實施例11-(1)中提到的米糠75％乙醇提取物以分析不同的組分。
圖25和26顯示米糠75％乙醇提取物中脂質(zhì)組分或糖組分的完全離子色譜。即，圖25顯示米糠75％乙醇提取物中脂質(zhì)組分的完全離子色譜，而圖26顯示米糠75％乙醇提取物中糖組分的完全離子色譜。每個圖中，縱坐標(biāo)為相對強度(％)，而橫坐標(biāo)的上半部和下半部分別是保留時間(分鐘)和掃描序號。
圖25和26顯示米糠75％乙醇提取物中十六烷酸(棕櫚酸)的甲酯峰(圖25的峰1)、十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖25的峰3)和順-9，順-12-十八碳烯酸(油酸)的甲酯峰(圖25的峰2)。來自葡萄糖的峰(圖26的峰2，3)和來自甘油的峰(圖26的峰1)均可被檢測出來，因此可證實甘油脂和/或甘油糖脂的存在。
本發(fā)明的益處依據(jù)本發(fā)明，提供甘油脂和/或甘油糖脂(如來自植物微生物或動物的具有強編程性細胞死亡誘導(dǎo)活性的甘油脂和/或甘油糖脂)是有效組分的編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑。該甘油脂和/或甘油糖脂大量存在于植物、微生物或動物的膜組分中，可通過乙醇水溶液或類似物有效提取，由此可容易獲得本發(fā)明中的有效組分。在用溶劑提取前，可先用酸或堿處理以提高提取效率。進而，根據(jù)其疏水性選擇提取溶劑的極性、用于分離的色譜載體等，可選擇性的制得目的甘油脂和/或甘油糖脂。其中含有、向其中加入或在其中稀釋有本發(fā)明中作為編程性細胞死亡誘導(dǎo)化合物的甘油脂和/或甘油糖脂的食物或飲料，因其每日攝取可改善健康，可用于健康食品。其中的甘油脂和/或甘油糖脂是從可食用的植物、微生物或動物中提取和/或純化的。
權(quán)利要求
1.一種包含由甘油和脂肪酸組成的甘油脂和/或由甘油、脂肪酸和糖組成的甘油糖脂作為有效組分的制劑用于誘導(dǎo)編程性細胞死亡的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述甘油脂和/或甘油糖脂利用有機溶劑來源于茶、蘑菇、藻類或谷物殘留物。
3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述制劑為食品或飲料，其中含有、向其中加入和/或在其中摻混所述甘油脂和/或甘油糖脂。
4.一種含有由甘油和脂肪酸組成的甘油脂和/或由甘油、脂肪酸和糖組成的甘油糖脂作為有效組分的制劑用于制備誘導(dǎo)編程性細胞死亡的食品或飲料的用途。
全文摘要
一種編程性細胞死亡誘導(dǎo)劑,其特征在于包含甘油脂和/或甘油糖脂作為有效成分。
文檔編號A61K35/56GK1380077SQ01144009
公開日2002年11月20日 申請日期2001年12月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月8日
發(fā)明者酒井武, 于福功, 小山信人, 巽容子, 佐川裕章, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社