專利名稱：免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
本申請是中國專利申請94109522.3的分案申請。
本發(fā)明者對此加有組胺的γ-球蛋白繼續(xù)進(jìn)行深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了免疫調(diào)節(jié)作用及抑制嗜酸性粒細(xì)胞增多作用的新藥理作用，從而完成了本發(fā)明。
作為本發(fā)明醫(yī)藥組合物有效成分的加有組胺的γ-球蛋白是組胺和γ-球蛋白的組合物，可通過將γ-球蛋白成分和組胺成分適宜混合后制造。
本發(fā)明中所使用的γ-球蛋白可用通常的方法從血清或胎盤血漿中得到，作為組胺成分可以利用游離的組胺及其鹽酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽等藥學(xué)上允許的鹽。制造本發(fā)明醫(yī)藥組合物時(shí)，可將例如1至200mg、優(yōu)選的是5-50mg的γ-球蛋白和0.01至2μg、優(yōu)選是0.05至0.5μg的組胺成分適宜混合后來制造。
由于本發(fā)明組合物主要是以注射劑形式使用，所以可以使用注射用蒸餾水或生理食鹽水作為等滲溶液作成制劑。另外，在制造時(shí)，除了γ-球蛋白成分和組胺成分之外，還可以適當(dāng)?shù)丶尤肴芙獯龠M(jìn)劑、等滲化劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、保存劑等添加劑，例如，檸檬酸、苯甲酸鈉、甘氨酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、磷酸鹽、抗壞血酸鈉、氯經(jīng)鈉、碳酸氫鈉等。
另外，本發(fā)明醫(yī)藥組合物也可以作成一種在使用時(shí)才溶解的注射劑，將其各成分在干燥狀態(tài)下混合、或者是把混合溶液充入小玻璃瓶等中冷凍后干燥而得到。在制造注射用干燥制劑時(shí)，除了加入上述添加劑外，必要時(shí)還可以加入葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等賦形劑。作為注射用干燥制劑的例子，可舉出臨床上使用的加入組胺的免疫球蛋白制劑。
以下，舉出加有組胺的γ-球蛋白的配制方法的一個(gè)例子。再者，由于以下的藥理試驗(yàn)是以白鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所以使用白鼠γ-球蛋白。即，將白鼠γ-球蛋白及組胺二鹽酸鹽按下列比例溶解在蒸餾水中，在室溫下攪拌2小時(shí)后，冷凍干燥，使用時(shí)，加入生理食鹽水、溶解后即可使用。本發(fā)明化合物白鼠γ-球蛋白量 組胺二鹽酸鹽量HG505.3mg 0.10μgHG7512.0mg 0.15μgHG9028.8mg 0.30μg制作出的HG50、HG75及HG90在以下的任何一個(gè)藥理試驗(yàn)中都顯示有效的作用，作為代表例表示了用HG75得到的結(jié)果。
1.免疫調(diào)節(jié)作用免疫調(diào)節(jié)作用是以產(chǎn)生三硝基苯(TNP)特異性抗體及TNP特異性的延遲型過敏(DTH)反應(yīng)作為指標(biāo)來進(jìn)行測定的。
(1)結(jié)合三硝基苯的羊紅細(xì)胞(TNP-SRBC)的配制。
將三硝基苯磺酸(TNBS)溶解在磷酸緩沖化生理鹽水中(40mg/7.0ml、pH7.2)，在一邊攪拌下向其中滴加1ml的羊紅血球顆粒。在避光狀態(tài)下攪拌數(shù)次后，室溫下放置20分鐘后，用生理鹽水洗滌3次。以3000rpm離心分離5分鐘后，用生理鹽水配制S×109/ml。
(2)TNP特異性抗體的產(chǎn)生向6-8周齡的雌性BALB/C白鼠的腹腔內(nèi)投與109個(gè)的TNP-SRBC，使用二硝基苯-牛血清白蛋白(DNP-BSA)的酶免疫測定法(ELISA)測定血清中的抗TNP抗體。其結(jié)果，從第4-6天的峰值，可確認(rèn)產(chǎn)生了抗TNP-1gM及抗TNP-1gG的強(qiáng)抗體。而對于缺少胞腺的BALB/C裸鼠，幾乎沒有看到這兩種抗體的產(chǎn)生。
(3)TNP特異性的DTH反應(yīng)與上述(2)相同，用TNP-SRBC致敏后，在第14天，將4.7mg/ml的TNBS0.025ml注以后肢右足掌中，誘導(dǎo)TNP特異的DTH反應(yīng)。誘導(dǎo)后的第24小時(shí)及48小時(shí)，用千分表測定兩足掌的厚度。以左右的腫脹的差來表示DTH反應(yīng)的強(qiáng)度。其結(jié)果，在誘導(dǎo)24小時(shí)后可明確地觀察到DTH反應(yīng)，但對于BALB/C裸鼠完全沒有觀察到DTH反應(yīng)。另外，在此DTH反應(yīng)測定系中可以繼續(xù)使用與上述(2)的抗體產(chǎn)生系中同一個(gè)白鼠進(jìn)行試驗(yàn)。
(4)被驗(yàn)藥劑作用的確定利用上述試驗(yàn)系，將本發(fā)明化合物的加有組胺的白鼠γ-球蛋白(150mg/kg/day)、環(huán)孢菌素A(10mg/kg/day)、環(huán)磷酰胺(100mg/kg/day)強(qiáng)的松龍(0.5mg/kg/day)及左旋咪唑(5mg/kg/day)在TNP-SRBC致敏日后的4天內(nèi)經(jīng)皮下給藥，調(diào)查對于抗TNP抗體產(chǎn)生及對TNP特異性DTH反應(yīng)的作用。
抗TNP抗體產(chǎn)生系列的結(jié)果表示在

圖1、TNP特異性DTH反應(yīng)系列的結(jié)果表示在表1中。
此外，在以下本試驗(yàn)結(jié)果中，使用Student’st檢驗(yàn)求出與對照平均值的明顯差值，并加以*標(biāo)記?！?p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001〕表1
II.嗜酸性粒細(xì)胞增多抑制作用(1)豚草花粉抗原誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞增多模型將用生理鹽水稀釋到1000倍的豚草花粉浸汁，在開始日及第1天以0.1ml、進(jìn)而在第6、8、14天以0.2ml；皮下注射到6-8周齡的雌性BALB/C白鼠身上，使之產(chǎn)生致敏作用。第20天，將稀釋為1000倍的豚草抗原注射到白鼠腹腔內(nèi)，誘導(dǎo)反應(yīng)。誘導(dǎo)后的第24小時(shí)，回收腹腔浸出細(xì)胞，用吉姆薩染色后計(jì)算總細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果。嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)在誘導(dǎo)后的第24小時(shí)達(dá)到峰值。而對于T細(xì)胞缺乏的BALB/C裸鼠完全沒有看到嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞對腹腔內(nèi)的浸潤。
(2)測定被檢藥劑的作用使用上述嗜酸性粒細(xì)胞增多模型，將本發(fā)明化合物加有組胺的γ-球蛋白(3mg/mouse/day)在誘導(dǎo)日前，以每周2次進(jìn)行皮下給藥3周，調(diào)查對于嗜酸性粒細(xì)胞增多的作用。另外對于構(gòu)成加有組胺的白鼠γ-球蛋白成分的組胺(二鹽酸鹽)及白鼠γ-球蛋白也分別地單獨(dú)的投入相當(dāng)量進(jìn)行試驗(yàn)。進(jìn)而在誘導(dǎo)日前2天到當(dāng)天的3天內(nèi)皮下給藥公知的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(100mg/kg/day)進(jìn)行比較。
結(jié)果表示在表2中表2被檢藥 腹腔內(nèi)浸出嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(×105個(gè))非致敏 0.4±0.1***對照3.7±0.4本發(fā)明化合物0.5±0.1***組胺3.4±0.6γ-球蛋白 3.2±0.5環(huán)孢菌素A 0.4±0.2***(3)使用血小板活性化因子(PAT)誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞增多模型的被檢藥劑作用的測定對于6-8周齡的雌性BALB/C白鼠，從腹腔內(nèi)注射PAF(5μg/200μl)，誘導(dǎo)反應(yīng)。誘導(dǎo)后24小時(shí)，回收腹腔浸出細(xì)胞，計(jì)測嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)等。使用此嗜酸性粒細(xì)胞增多模型，與上述同樣，調(diào)查本發(fā)明化合物的加有組胺的白鼠γ-球蛋白對嗜酸性白因球增多的抑制作用。
表3中表示了結(jié)果的一個(gè)例子表3被檢藥腹腔內(nèi)浸出嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(×105個(gè))非致敏0.3±0.1**對照 2.3±0.5本發(fā)明化合物 0.8±0.1*組胺 2.2±0.8γ-球蛋白 1.5±0.2從圖1結(jié)果明顯地看出，本發(fā)明化合物加有組胺的γ-球蛋白，對于IgG、IGM產(chǎn)生抗體顯示顯著的增強(qiáng)作用。可是作為免疫抑制劑的環(huán)孢菌素A和環(huán)磷酰胺卻顯著地抑制了上述2種抗體的產(chǎn)生。另一方面，作為腎上腺皮質(zhì)激素劑的強(qiáng)的松龍和具有免疫調(diào)節(jié)作用的左旋咪唑，按此次給藥量，對于抗體的產(chǎn)生沒有明顯的影響。
與此相反，如表1所示，對于延遲型過敏(DTH)反應(yīng)，本發(fā)明化合物加有組胺的γ-球蛋白表示了顯著的抑制作用，同樣環(huán)孢菌素A和環(huán)磷酰胺也看到明確的抑制作用。另外，強(qiáng)的松龍也看到弱的抑制作用，但是對于左旋咪唑沒有看到顯著影響。
由以上可看出，作為以往的免疫抑制劑的環(huán)孢菌素A和環(huán)磷酰胺可顯著地同時(shí)抑制IgG、IgM抗體產(chǎn)生及DTH反應(yīng)的兩種免疫反應(yīng)，但是本發(fā)明化合物加有組胺的γ-球蛋白對抗體產(chǎn)生顯示了增強(qiáng)作用，對DTH反應(yīng)顯示抑制作用。因此，加有組按的γ-球蛋白與以往的免疫抑制劑具有明顯不同的免疫調(diào)節(jié)作用。
進(jìn)而，如表2所示，本發(fā)明加有組胺的γ-球蛋白在豚草花粉抗原誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞增多模型中，對于向腹腔內(nèi)的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤有著顯明的抑制作用。由表3的結(jié)果可明顯地看了，對于不是抗原誘導(dǎo)，而是通過PAF給藥而誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞增多，加有組胺的γ-球蛋白與免疫抑制劑環(huán)孢菌素A同樣顯示了明顯的抑制作用。此嗜酸性粒細(xì)胞增多抑制作用，對于作為加有組胺的γ-球蛋白的構(gòu)成成分的組胺及γ-球蛋白來說，在將它們單獨(dú)地使用時(shí)就未觀察到抑制效果，所以本發(fā)明化合物的特異性作用是很明顯的。另外，即使與環(huán)孢菌素A同樣的給藥期間(從誘導(dǎo)2日前至當(dāng)日的三天內(nèi))，在上述抗原誘導(dǎo)及PAF誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞增多模型中也看到了顯著的抑制作用。
由以上的藥理試驗(yàn)結(jié)果可明顯地看出，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物具有與以往的免疫抑制劑顯著不同的特異性免疫調(diào)節(jié)作用，所以對于免疫系統(tǒng)異常缺陷的疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑、多發(fā)性硬化癥等自身免疫疾病和各種免疫缺陷癥來說作為治療藥劑是有效的。另外，由于對嗜酸性粒細(xì)胞增多有抑制作用，所以作為感染癥、寄生蟲病、呼吸器官疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等并發(fā)的嗜酸性粒細(xì)胞增多癥的治療劑也是有效的。
嗜酸性粒細(xì)胞集中在構(gòu)成炎癥原因的受到刺激的部位上，作為引起炎癥癥狀的效應(yīng)細(xì)胞已被公知。因此，抑制嗜酸性粒細(xì)胞增多的藥劑可以作為抑制炎癥的藥劑來使用。以加有組胺的γ-球蛋白作為有效成分的本發(fā)明醫(yī)藥組合物由于除了具有上述嗜權(quán)性粒細(xì)胞增多抑制作用之外，還兼有抑制DTH反應(yīng)中的腫脹作用，所以作為優(yōu)良的抗炎癥劑也是非常有用的。
圖中符號如下□對照(生理鹽水) ■本發(fā)明化合物△環(huán)孢菌素A ▲環(huán)磷酰胺○左旋咪唑●強(qiáng)的松龍
權(quán)利要求
1.免疫調(diào)節(jié)劑，其中含有以加有組胺的γ-球蛋白作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的治療劑，是自身免疫疾病的治療劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的治療劑，是多發(fā)性硬化癥的治療劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2記載的治療劑，是全身性紅斑的治療劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2記載的治療劑，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求2記載的治療劑，是免疫缺陷綜合癥的治療劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了加有組胺的γ－球蛋白作為有效成分的新的醫(yī)藥組合物，它可用作免疫調(diào)節(jié)劑等。它與以往的免疫抑制劑有著明顯不同的免疫調(diào)節(jié)作用，所以對于免疫系統(tǒng)異常缺陷的疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫疾病和名種免疫缺陷病的治療藥劑是有效的。
文檔編號A61P7/00GK1471975SQ0112447
公開日2004年2月4日 申請日期2001年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月9日
發(fā)明者吉井春夫, 深田有里子, 里子 申請人:日本臟器制藥株式會社