專利名稱：通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶akt誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療性血管發(fā)生的方法和組合物。更具體的說，本發(fā)明致力于通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT誘導(dǎo)血管發(fā)生性蛋白質(zhì)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。本發(fā)明的組合物和方法優(yōu)選包含編碼AKT的核酸及其施用。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生血管發(fā)生是導(dǎo)致新血管發(fā)育的生物學(xué)過程。該過程包含多種細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)、和細(xì)胞-細(xì)胞因子相互作用(Melillo等人，1997，新血管研究(Cardiovascular Research)35480-489；Lewis等人，1997，新血管研究(Cardiovascular Research)35490-497)。新血管網(wǎng)絡(luò)的形成在成年生物體中通常是罕見的。但是，新血管結(jié)構(gòu)可于多種病理性狀況下發(fā)生，包括局部缺血、發(fā)炎、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、和慢性創(chuàng)傷。
治療性血管發(fā)生包括使用適當(dāng)?shù)难馨l(fā)生性生長因子精確的刺激新血管發(fā)育。因此，治療性血管發(fā)生可用于治療多種局部缺血狀況或刺激創(chuàng)傷愈合。局部缺血狀況可影響心臟、下肢、皮瓣、外周神經(jīng)、骨、或移植物。局部缺血狀況包括腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、四肢缺血、外周動(dòng)脈疾病、間歇性跛行、缺血性心肌病、和心肌缺血(WO97/14307)。
已證明，多種因子具有血管發(fā)生性活性。這些因子包括堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美國專利5,661,133)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Pu等人，1993，循環(huán)(Circulation)88208-2156)、促血管生成素(angiopoietin)、和VEGF(評(píng)論參閱Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。
還有人提出，血管發(fā)生對(duì)于實(shí)體瘤及其轉(zhuǎn)移的生長和維持而言是必需的(美國專利5,854,205)。為了刺激血管發(fā)生，腫瘤可上調(diào)多種血管發(fā)生性因子(包括VEGF)的生成。VEGF血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子是一類血管發(fā)生性多肽，也是血小板衍生的生長因子蛋白質(zhì)家族的成員。這些蛋白質(zhì)是糖基化陽離子二聚體，分子量約為46-48kDa。與其它血管發(fā)生性因子相比，VEGF的前面有天然信號(hào)序列，因而能夠由完整細(xì)胞分泌。VEGF的其它名稱包括血管通透因子(VPF)和c-fos誘導(dǎo)的生長因子(FIGF)。
已鑒定了VEGF的幾種形式，包括VEGF121(美國專利5,219,739)、VEGF165(美國專利5,332,672)、VEGF189(美國專利5,240,848)、VEGF206、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美國專利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。已顯示，VEGF的多種形式在缺血組織中促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，并增強(qiáng)側(cè)副血管的形成和血流。
過渡金屬離子(諸如CoCl2)顯示增強(qiáng)VEGF基因的表達(dá)并刺激血管形成(美國專利5,480,975)。AktAKT蛋白是在凋亡(程序化細(xì)胞死亡)中發(fā)揮作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。最近，已研究了細(xì)胞存活/死亡的調(diào)控所包括的兩種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。凋亡刺激激酶1(ASK1)的激活在多種細(xì)胞類型中導(dǎo)致凋亡(Ichijo等人，1997)，而包含磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和Akt的途徑導(dǎo)致細(xì)胞保護(hù)作用。已證明，ASK1活性是由腫瘤壞死因子-α(TNFα)治療或Fas連接誘導(dǎo)的(Ichijo等人，1997；和Chang等人，1998)。ASK1顯性失活突變體的過度表達(dá)抑制由TNFα或Fas連接誘導(dǎo)的凋亡，說明ASK1在TNFα或Fas連接誘導(dǎo)的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。ASK1誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制尚不清楚。已顯示，ASK1的異位表達(dá)導(dǎo)致多種應(yīng)激所激活信號(hào)途徑的激活，諸如可介導(dǎo)ASK1所誘導(dǎo)凋亡的MKK4/JNK和MKK6/p38途徑(Ichijo等人，1997)。
PI3K/Akt途徑對(duì)于調(diào)控細(xì)胞存活/死亡而言似乎也是重要的(Kulik等人，1997；Franke等人，1997；Kauffmann-Zeh等人，1997；Hemmings，1997；和Dudek等人，1997)。存活因子，諸如血小板衍生的生長因子(PDGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，在多種狀況下通過誘導(dǎo)PI3K活性而促進(jìn)細(xì)胞存活(Kulik等人，1997；和Hemmings，1997)。激活的PI3K導(dǎo)致磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PtdIns(3，4，5)-P3)的生成，繼而磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸結(jié)合含AH/PH結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt并誘導(dǎo)其活性(Franke等人，1995；Hemmings，1997b；Downward，1998；和ALessi等人，1996)。PI3K的特異抑制劑或Akt顯性失活突變體消除這些生長因子或細(xì)胞因子促進(jìn)存活的活性。另外，組成性的活性PI3K或Akt突變體的引入在細(xì)胞通常經(jīng)歷凋亡性細(xì)胞死亡的條件下促進(jìn)細(xì)胞存活(Kulik等人，1997；和Dudek等人，1997)。這些觀察結(jié)果證明，PI3K/Akt途徑在細(xì)胞存活/凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
文獻(xiàn)中已鑒定了人Akt蛋白激酶的兩種異構(gòu)體，Akt1和Akt2(Staal，1987)。美國臨時(shí)申請(qǐng)60/125,108中描述了人Akt的第三種形式，命名為Akt3。Nakatani等人(1999，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)257906-910)描述了Akt的另一種異構(gòu)體。還鑒定了大鼠Akt序列(Konishi等人，1995)。
已顯示，人Akt1的C末端第473位絲氨酸對(duì)于它的調(diào)控是必需的(Stokeo等人，1997；和Stephens等人，1998)。生長因子刺激后，PI3K激活。PI3K的產(chǎn)物PtdIns(3，4，5)-P結(jié)合Akt1，并引起Akt1由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜附近，在此第308位蘇氨酸和第473位絲氨酸發(fā)生磷酸化(Downward，1998)。這些殘基的磷酸化對(duì)于Akt1的激活是重要的。已顯示，最近鑒定的蛋白激酶PDK1負(fù)責(zé)第308位蘇氨酸的磷酸化，而磷酸化第473位絲氨酸的激酶尚未鑒定(Stokeo等人，1997；和Stephens等人，1998)?；虔煼ɑ虔煼òㄍㄟ^將遺傳信息引入患者(諸如引入患者受影響的細(xì)胞或器官)來校正缺陷或異常(突變、異常表達(dá)、等等)?？稍隗w外將這種遺傳信息引入細(xì)胞，然后再將經(jīng)修飾細(xì)胞重新引入身體；或者，直接在體內(nèi)引入適當(dāng)位點(diǎn)。在這方面，文獻(xiàn)中已描述了細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因轉(zhuǎn)移的不同技術(shù)(參閱Roemer和Friedman，1992，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)208211)，包括“裸露DNA”的轉(zhuǎn)染和包含DNA與DEAE-dextran(Pagano等人，1967，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)1891)、DNA與核蛋白(Kaneda等人，1989，科學(xué)(Science)243375)、DNA與脂質(zhì)(Felgner等人，1987，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(PNAS)847413)的復(fù)合物、使用脂質(zhì)體(Fraley等人，1980，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)25510431)、等等的多種技術(shù)。最近，使用病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體的應(yīng)用有希望代替物理轉(zhuǎn)染技術(shù)。在這方面，已測(cè)試了不同病毒感染某些細(xì)胞群體的能力，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒、和腺病毒。
已有人提出用于血管發(fā)生的基因療法，具體采用VEGF編碼序列(Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。在兔后肢局部缺血模型中，將含VEGF165cDNA的質(zhì)粒動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)施用增加了側(cè)副血流(Tsurumi等人，1996，循環(huán)(Circulation)943281-3290；Takeshita等人，1996，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)227628-635)。在這種模型中，含人VEGF121、VEGF165、和VEGF189cDNA的質(zhì)粒也顯示具有血管發(fā)生性活性(Takeshita等人，1996，實(shí)驗(yàn)室研究(Lab Invest.)75487-501；和WO97/14307)。相似的，含VEGF165編碼序列的復(fù)制缺陷型腺病毒在小鼠中可誘導(dǎo)新血管形成(Muhlhauser等人，1995，循環(huán)研究(Circ.Res.)771077-1086)。在人類患者中，含VEGF165序列的質(zhì)粒顯示在缺血的四肢(Isner等人，1996，柳葉刀(Lancet)348370-374)和心臟(參閱《時(shí)代》(Time)雜志，1999年1月11日，第68-73頁)中誘導(dǎo)血管發(fā)生。
本發(fā)明涉及用于刺激血管發(fā)生的另一種方法，其中并不是直接施用VEGF編碼序列。更具體的說，申請(qǐng)人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，VEGF生成是由Akt蛋白誘導(dǎo)的。因此，本發(fā)明致力于通過將Akt蛋白引入細(xì)胞來刺激細(xì)胞內(nèi)的VEGF表達(dá)。細(xì)胞優(yōu)選存在于患有局部缺血狀況的患者體內(nèi)，其結(jié)果是患者體內(nèi)有益的側(cè)副血管形成。
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發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于刺激細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)的方法和組合物。更具體的說，申請(qǐng)人出乎意料的發(fā)現(xiàn)，Akt蛋白能夠刺激VEGF表達(dá)。在最優(yōu)選的方面，細(xì)胞存在于患有局部缺血狀況的患者體內(nèi)，而且結(jié)果是患者體內(nèi)有益的側(cè)副血管形成。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)涉及通過對(duì)細(xì)胞施用Akt蛋白從而在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的方法。蛋白質(zhì)可以是任何Akt蛋白。Akt蛋白優(yōu)選人Akt蛋白。Akt蛋白更優(yōu)選人Akt1、Akt2、或Akt3。
施用Akt蛋白后生成的VEGF可以是能夠刺激血管發(fā)生的任何形式的VEGF。VEGF優(yōu)選VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
一方面，對(duì)細(xì)胞施用Akt蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞施用編碼Akt蛋白且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸。核酸可以是質(zhì)?；虿《镜囊徊糠?。優(yōu)選的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、和痘苗病毒。
可以單獨(dú)施用Akt蛋白或編碼Akt蛋白的核酸，或者與過渡金屬離子和/或血管舒張劑聯(lián)合施用。也可以與編碼第二種血管發(fā)生性因子且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸一起施用Akt蛋白或編碼Akt蛋白的核酸。優(yōu)選的血管發(fā)生性因子包括VEGF、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、或促血管生成素。另一方面，可以對(duì)細(xì)胞施用超過一種形式的Akt蛋白。
本發(fā)明還涉及通過對(duì)患有局部缺血狀況患者施用Akt蛋白從而在患者細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的方法。局部缺血狀況可以是腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特發(fā)性、或肥大性心肌病。蛋白質(zhì)可以是任何Akt蛋白。Akt蛋白優(yōu)選Akt1、Akt2、或Akt3。
施用Akt蛋白后生成的VEGF可以是能夠刺激血管發(fā)生的任何形式的VEGF。VEGF優(yōu)選VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
一方面，對(duì)患者施用Akt蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)患者施用編碼Akt蛋白且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸。核酸可以是質(zhì)?；虿《镜囊徊糠帧?yōu)選的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、和痘苗病毒。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過穿心外膜手術(shù)施用或通過使用導(dǎo)管的經(jīng)皮投遞將編碼Akt蛋白的核酸直接施用于心臟組織。
可以對(duì)患者單獨(dú)施用Akt蛋白或編碼Akt蛋白的核酸，或者與過渡金屬離子和/或血管舒張劑聯(lián)合施用。也可以與編碼第二種血管發(fā)生性因子且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸一起對(duì)患者施用Akt蛋白或編碼Akt蛋白的核酸。優(yōu)選的血管發(fā)生性因子包括VEGF、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、或促血管生成素。另一方面，可以對(duì)細(xì)胞施用超過一種形式的Akt蛋白。
本發(fā)明還涉及包含編碼Akt蛋白的核酸、過渡金屬離子和/或血管舒張劑、和制藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。核酸可以是質(zhì)?；虿《据d體的一部分。優(yōu)選的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、和痘苗病毒。
另一方面，本發(fā)明涉及通過在患有腫瘤的患者體內(nèi)抑制Akt活性水平由此抑制VEGF生成從而在患者體內(nèi)抑制血管發(fā)生的方法?？梢酝ㄟ^在反義核酸在胞內(nèi)條件下與Akt mRNA發(fā)生雜交的條件下將Akt反義核酸引入患者細(xì)胞從而降低Akt水平。還可以通過以足以結(jié)合并滅活A(yù)kt的水平將特異結(jié)合Akt的胞內(nèi)結(jié)合蛋白(諸如單鏈Fv抗體，scFv)引入患者細(xì)胞內(nèi)從而降低Akt水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過施用編碼Akt的顯性失活形式的核酸從而降低Akt活性。優(yōu)選直接對(duì)腫瘤細(xì)胞施用反義核酸、胞內(nèi)結(jié)合蛋白或其編碼核酸、或者顯性失活A(yù)kt突變體。
圖的簡述

圖1激活的Akt3突變體的構(gòu)建圖1A激活的Akt3的示意圖。在同一讀碼框內(nèi)，在人Akt3的全長編碼序列的N端融合來自人Src基因的肉豆蔻酸化信號(hào)(Myr)，在C端融合HA標(biāo)簽(HA)(見實(shí)施例)。
圖1B激活的Akt3在HEK293細(xì)胞內(nèi)的異位表達(dá)。用CMV6-MyrAkt3HA或僅用表達(dá)質(zhì)粒CMV6轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，制備細(xì)胞裂解物，并用抗HA抗體進(jìn)行免疫印漬。
圖1C激活的Akt3具有Akt活性。用激活的Akt3(MyrAkt3HA)的表達(dá)質(zhì)?；騼H用表達(dá)載體CMV6轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，制備細(xì)胞裂解物，并用抗HA抗體進(jìn)行免疫沉淀。以由GSK3衍生的肽作為底物，測(cè)量免疫沉淀物的Akt3激酶活性。Bkgd來自未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的背景水平；CMV6用CMV6轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；Akt3cak用組成性激活的Akt3的表達(dá)質(zhì)粒(CMV6-MyrAkt3HA)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。圖2在HeLa細(xì)胞中Akt增加VEGF165的分泌用激活的小鼠Akt1(Akt1)或激活的人Akt3(Akt3)的表達(dá)質(zhì)?；蛘邇H用CMV6載體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后1天，給細(xì)胞換成低有絲分裂原培養(yǎng)基(DMEM-0.5％FBS)。16小時(shí)后，收集培養(yǎng)基用于VEGF ELISA測(cè)定法。A道用0.4μg CMV6載體DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(6孔組織培養(yǎng)板)；Akt1道用0.4μg CMV6-mAkt1cak表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(6孔組織培養(yǎng)板)；Akt3道用激活人Akt3的表達(dá)質(zhì)粒(Akt3)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(6孔組織培養(yǎng)板)。圖3在人冠脈平滑肌細(xì)胞和人骨骼肌細(xì)胞中Akt增加VEGF165的表達(dá)圖3A以3×108VP/ml(VP病毒顆粒)的濃度，用綠色熒光蛋白(AV-GFP)、組成性有活性的小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)、或組成性有活性的人Akt3(AV-hAkt3cak)的重組腺病毒，感染人骨骼肌細(xì)胞(HSKMC)過夜。感染后1天，收集培養(yǎng)基，并通過ELISA測(cè)定法測(cè)量培養(yǎng)基中的VEGF水平。
圖3B以3×108VP/ml的濃度，用AV-GFP、AV-mAkt1cak、或AV-hAkt3cak，感染人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HCASMC)過夜。感染后1天，收集培養(yǎng)基，并通過針對(duì)人VEGF的ELISA測(cè)定法測(cè)量培養(yǎng)基中的VEGF水平。
圖3C以3×108VP/ml的濃度，用指定病毒感染HCASMC過夜。作為對(duì)照，將未感染細(xì)胞轉(zhuǎn)變成缺氧條件。1天后，由這些細(xì)胞分離總RNA，并通過Northern印漬分析檢測(cè)VEGF表達(dá)。圖4在大鼠心肌細(xì)胞中Akt增加VEGF表達(dá)以3×107VP/ml的濃度，用綠色熒光蛋白(AV-GFP)、組成性有活性的小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)、或組成性有活性的人Akt3(AV-hAkt3cak)的重組腺病毒，感染新生心肌細(xì)胞過夜。作為對(duì)照，對(duì)未感染細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)缺氧處理。感染后1天，分離總RNA，并通過Northern印漬分析檢測(cè)VEGF表達(dá)。
發(fā)明詳述本發(fā)明有利的提供了用于在細(xì)胞內(nèi)刺激VEGF表達(dá)的方法和組合物。因此，通過提供用于在缺血組織內(nèi)刺激側(cè)副血管形成的方法和設(shè)備，本發(fā)明能夠治療患者的局部缺血性疾病。更具體的說，本文顯示Akt蛋白能刺激血管發(fā)生性蛋白質(zhì)VEGF的表達(dá)。因此，本發(fā)明的第一個(gè)目標(biāo)涉及通過將Akt蛋白引入細(xì)胞從而在細(xì)胞內(nèi)刺激VEGF表達(dá)。在優(yōu)選的方面，對(duì)患者施用編碼Akt蛋白的核酸。
本發(fā)明還涉及通過對(duì)患有局部缺血狀況患者施用Akt蛋白來治療患者。優(yōu)選對(duì)患者施用編碼Akt蛋白的核酸，結(jié)果是患者缺血組織內(nèi)有益的側(cè)副血管形成。
下文各部分將更詳細(xì)的闡明本發(fā)明的各個(gè)方面。分成多個(gè)部分的這種組織形式意欲促進(jìn)對(duì)本發(fā)明的理解，而絕非意欲限制本發(fā)明。定義下文定義的術(shù)語用于整篇說明書，應(yīng)該有助于理解本發(fā)明的范圍和實(shí)踐。
在特定的實(shí)施方案中，術(shù)語“大約”或“大致”指指定數(shù)值或范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選10％以內(nèi)，更優(yōu)選5％以內(nèi)。
“核酸”指包含共價(jià)連接的亞單位核苷酸的聚合化合物。核酸包括多核糖核酸(RNA)和多脫氧核糖核酸(DNA)，二者可以是單鏈或者雙鏈。DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA、和半合成DNA。
“基因”指編碼多肽的核苷酸集群，包括cDNA和基因組DNA核酸。
重組DNA分子”指經(jīng)歷了分子生物學(xué)操作的DNA分子。
“載體”指用于將核酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)的任何方法。載體可以是復(fù)制子，它可附著另一種DNA片段從而使所附著片段得以復(fù)制?！皬?fù)制子”指作為體內(nèi)DNA自主復(fù)制單位使用即能夠在其自身控制下進(jìn)行復(fù)制的任何遺傳元件，如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、或病毒。術(shù)語“載體”包括用于在體外、離體、或體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒方法。病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺伴隨病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、和腺病毒載體，下文將更詳細(xì)的闡明。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物、和生物聚合物。除了核酸，載體還可以包含一種或多種調(diào)控區(qū)，和/或可用于選擇、測(cè)量、和監(jiān)測(cè)核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移至哪種組織、表達(dá)持續(xù)時(shí)間、等等)的可選擇標(biāo)記物。
“克隆載體”是復(fù)制子，諸如質(zhì)粒、噬菌體、或粘粒，它可附著另一種DNA片段從而使所附著片段得以復(fù)制?？寺≥d體可以是能在一種細(xì)胞類型中復(fù)制而在另一種細(xì)胞中表達(dá)(“穿梭載體”)。
“盒”指能夠插入載體特異限制位點(diǎn)的DNA片斷。DNA片斷編碼目的多肽，而盒及限制位點(diǎn)的設(shè)計(jì)要保證將盒插入正確轉(zhuǎn)錄和翻譯的讀碼框。
當(dāng)已將外源或異源DNA引入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，就說細(xì)胞已被所述DNA轉(zhuǎn)染。當(dāng)所轉(zhuǎn)染的DNA引起表型改變時(shí)，就說細(xì)胞已被外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化的DNA可整合(共價(jià)連接)到組成細(xì)胞基因組的染色體DNA中。
“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷、或胞苷；RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯和硫酯，可以是單鏈形式或雙鏈螺旋。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA、和RNA-RNA螺旋是可能的。術(shù)語“核酸分子”，特別是DNA或RNA分子，僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，而并未將其限制于任何特定三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括(但不限于)線性或環(huán)狀DNA分子(如限制片段)、質(zhì)粒、和染色體中的雙鏈DNA。在對(duì)特定雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)的討論中，本文可根據(jù)正常慣例描述序列，即只給出沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即序列與mRNA同源的鏈)的5’至3’方向的序列。“重組DNA分子”指經(jīng)歷了分子生物學(xué)操作的DNA分子。
當(dāng)單鏈形式的核酸分子在適當(dāng)?shù)臏囟群碗x子強(qiáng)度條件下能夠與其它核酸分子退火時(shí)，就說核酸分子與另一種核酸分子(諸如cDNA、基因組DNA、或RNA)是“可雜交的”(參閱Sambrook等人，同上)。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)性”。對(duì)于初步篩選同源核酸，可使用對(duì)應(yīng)Tm為55℃的低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件，如5x SSC/0.1％ SDS/0.25％奶/無甲酰胺；或30％甲酰胺/5x SSC/0.5％ SDS。中嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對(duì)應(yīng)較高Tm，如40％甲酰胺/5x或6x SCC。高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對(duì)應(yīng)最高Tm，如50％甲酰胺/5x或6x SCC。雜交要求兩種核酸包含互補(bǔ)序列，當(dāng)然，取決于雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，堿基之間的錯(cuò)配還是有可能的。對(duì)于核酸雜交而言，適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)性取決于核酸長度和互補(bǔ)程度，變數(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。兩種核苷酸序列之間的相似或同源程度越高，具有這兩種序列的核酸的雜交Tm值就越高。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)較高Tm)以如下順序降低RNARNA、DNARNA、DNADNA。對(duì)于長度超過100個(gè)核苷酸的雜合物，已經(jīng)推導(dǎo)了用于計(jì)算Tm的方程(參閱Sambrook等人，同上，9.50-0.51)。對(duì)于與較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯(cuò)配的位置變得更加重要，而寡核苷酸的長度決定了它的特異性(參閱Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。優(yōu)選的是，可雜交核酸的最小長度為至少大約10個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少大約15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少大約20個(gè)核苷酸。
在特定的實(shí)施方案中，術(shù)語“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”指Tm為55℃，并采用上文提出的條件。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tm為60℃；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tm為65℃。
用于此處時(shí)，術(shù)語“寡核苷酸”指通常至少18個(gè)核苷酸長且可與編碼Akt的基因組DNA分子、cDNA分子、或mRNA分子雜交的核酸?？蓸?biāo)記寡核苷酸，如用32P-核苷酸或已共價(jià)綴合標(biāo)記物(諸如生物素)的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記后的寡核苷酸可用作探針以檢測(cè)Akt編碼核酸的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸(可標(biāo)記其中之一或二者)可用作PCR引物，用于克隆Akt的全長或片段，或用于檢測(cè)Akt編碼核酸的存在。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸可與AktDNA分子形成三股螺旋。一般說來，可合成制備寡核苷酸，優(yōu)選使用核酸合成儀。因此，可用非天然存在的磷酸酯類似鍵(諸如硫酯鍵等)制備寡核苷酸。
DNA“騙碼序列”指當(dāng)置于適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制之下時(shí)，在體外或體內(nèi)細(xì)胞中將轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子決定了編碼序列的邊界。編碼序列可以包括(但不限于)原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核(如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、甚至合成DNA序列。若編碼序列意欲在真核細(xì)胞中表達(dá)，則多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列通常將位于編碼序列的3’端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)節(jié)序列，諸如提供編碼序列在宿主細(xì)胞的表達(dá)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、等等。在真核細(xì)胞中，多腺苷酸化信號(hào)也是控制序列。
“啟動(dòng)子序列”指能結(jié)合細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶并起始下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，啟動(dòng)子序列限定為在3’末端為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并向上游(5’方向)延伸，包括起始超過背景的可檢測(cè)水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目堿基或元件。在啟動(dòng)子序列中可找到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(可方便的確定，例如通過核酸酶S1作圖)，以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)。
當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA時(shí)，然后它被剪接(若編碼序列包含內(nèi)含子)，并翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質(zhì)，就說編碼序列在細(xì)胞中處于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制之下”。
用于此處時(shí)，術(shù)語“同源”指具有“共同進(jìn)化起源”的蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，包括來自超家族的蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白超家族)和來自不同物種的同源蛋白質(zhì)(如肌球蛋白輕鏈等)(Reeck等人，1987，細(xì)胞(Cell)50667)。這種蛋白質(zhì)(及其編碼基因)具有序列同源性，反映在它們的序列具有高度的相似性。
因此，術(shù)語“序列相似性”指具有或不具有共同進(jìn)化起源的蛋白質(zhì)的核酸或氨基酸序列之間的相同或一致程度(參閱Reeck等人，同上)。但是，在普通用法及本申請(qǐng)中，當(dāng)用諸如“高度的”之類副詞修飾時(shí)，術(shù)語“同源的”可以指序列相似性而非共同進(jìn)化來源。
在特定的實(shí)施方案中，當(dāng)兩種DNA序列確定長度的至少大約50％(優(yōu)選至少大約75％，最優(yōu)選至少大約90％或95％)核苷酸匹配時(shí)，就說這兩種DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。使用可由序列數(shù)據(jù)庫獲得的標(biāo)準(zhǔn)軟件比較序列，或者在例如為具體系統(tǒng)確定的嚴(yán)謹(jǐn)性條件下進(jìn)行Southern雜交實(shí)驗(yàn)，由此可以鑒定基本同源的序列。適當(dāng)雜交條件的確定屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。參閱例如Maniatis等人，同上；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第1和2卷，同上；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization)，同上。
“反義核酸”指與有義序列互補(bǔ)的核苷酸序列。反義核酸可用于下調(diào)或阻斷由有義鏈編碼的多肽的表達(dá)。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列指提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的DNA調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、等等。在真核細(xì)胞中，多腺苷酸化信號(hào)是另一類控制序列。
“信號(hào)序列”包含于表達(dá)在細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)編碼序列的開始。該序列編碼信號(hào)肽，位于成熟多肽的N端，指導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)多肽。術(shù)語“轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列”在本文中用于指這類信號(hào)序列?？烧业脚c多種真核和原核生物天然蛋白質(zhì)有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)序列，而且常常在兩類生物體中都發(fā)揮功能。
“調(diào)控區(qū)”指調(diào)控第二種核酸序列表達(dá)的核酸序列。調(diào)控區(qū)可包括天然負(fù)責(zé)特定核酸表達(dá)的序列(同源區(qū))，或者可包括來源不同卻負(fù)責(zé)不同蛋白質(zhì)或甚至合成蛋白質(zhì)表達(dá)的序列(異源區(qū))。特別的，序列可以是以特異或非特異方式、可誘導(dǎo)或非可誘導(dǎo)方式，刺激或抑制基因轉(zhuǎn)錄的真核或病毒基因的序列或衍生序列。調(diào)控區(qū)包括復(fù)制起點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、指導(dǎo)多肽進(jìn)入靶細(xì)胞分泌途徑的信號(hào)序列、和啟動(dòng)子。
來自“異源來源”的調(diào)控區(qū)指與表達(dá)的核酸非天然相連的調(diào)控區(qū)。異源調(diào)控區(qū)包括來自不同物種的調(diào)控區(qū)、來自不同基因的調(diào)控區(qū)、雜合調(diào)控序列、和非天然存在而由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員設(shè)計(jì)的調(diào)控序列。
“異源”DNA指非天然存在于細(xì)胞中或細(xì)胞染色體位點(diǎn)的DNA。異源DNA優(yōu)選包括對(duì)細(xì)胞而言是外源的基因。
“同源重組”指將外源DNA序列插入另一種DNA分子，如將載體插入染色體。載體優(yōu)選靶向用于同源重組的特異染色體位點(diǎn)。對(duì)于特異同源重組，載體將包含與染色體序列同源的足夠長區(qū)域，從而得以互補(bǔ)結(jié)合并將載體摻入染色體。較長的同源區(qū)和較高程度的序列相似性可增加同源重組的效率。
“多肽”指包含共價(jià)連接的氨基酸殘基的聚合混和物。氨基酸具有如下一般結(jié)構(gòu) 根據(jù)側(cè)鏈R，將氨基酸分成7組(1)脂肪族側(cè)鏈，(2)含羥基OH的側(cè)鏈，(3)含硫原子的側(cè)鏈，(4)含酸性基團(tuán)或酰胺基團(tuán)的側(cè)鏈，(5)含堿性基團(tuán)的側(cè)鏈，(6)含芳香環(huán)的側(cè)鏈，和(7)脯氨酸，在這種氨基酸中側(cè)鏈與氨基融合。本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包含至少大約14個(gè)氨基酸。
“蛋白質(zhì)”指在活細(xì)胞中發(fā)揮結(jié)構(gòu)性或功能性作用的多肽。
多肽或蛋白質(zhì)的“變體”指由多肽或蛋白質(zhì)衍生且保留該多肽或蛋白質(zhì)的至少一種生物學(xué)特性的任何類似物、片段、衍生物、或突變體。自然界中可能存在多肽或蛋白質(zhì)的不同變體。這些變體可以是特征為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因核苷酸序列中存在差異的等位基因變異，或者可以包括不同剪接或翻譯后修飾。熟練技術(shù)人員能夠產(chǎn)生具有一處或多處氨基酸替代、刪除、添加、或取代的變體。這些變體可包括，但不限于，(a)用保守或非保守氨基酸替代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的變體，(b)向多肽或蛋白質(zhì)添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的變體，(c)一個(gè)或多個(gè)氨基酸包含取代基的變體，和(d)多肽或蛋白質(zhì)融合了另一種多肽(諸如血清清蛋白)的變體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道用于獲得這些變體的技術(shù)，包括基因(遏制、刪除、突變、等等)、化學(xué)、和酶技術(shù)。
若這些等位基因變異、類似物、片段、衍生物、突變體、和修飾(包括其它mRNA剪接形式和其它翻譯后修飾形式)導(dǎo)致保留多肽任何生物學(xué)特性的多肽衍生物，則意欲將它們包括于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
“異源蛋白質(zhì)”指細(xì)胞中非天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
當(dāng)超過大約40％的氨基酸相同或超過大約60％的氨基酸相似(功能相同)時(shí)，就說這兩種氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。優(yōu)選通過使用例如GCG(Genetics Computer Group，GCG包程序手冊(cè)，第7版，麥迪遜，威斯康星)累積程序進(jìn)行比對(duì)來鑒定相似或同源序列。
術(shù)語“對(duì)應(yīng)”在本文中用于指相似或同源序列，無論測(cè)量相似性或同源性的分子的確切位置是否相同或相似。核酸或氨基酸序列比對(duì)可包含間隔物。因此，術(shù)語“對(duì)應(yīng)”指序列相似性，而非氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號(hào)。編碼Akt蛋白的基因本發(fā)明涵蓋Akt蛋白或多肽，或者編碼Akt蛋白或多肽的核酸在細(xì)胞中刺激VEGF表達(dá)的應(yīng)用。Akt優(yōu)選人Akt3蛋白或多肽，包括Akt的全長或天然存在形式或其能夠刺激VEGF表達(dá)的任何片段。用于此處時(shí)，“Akt”指Akt多肽，而“akt”指編碼Akt多肽的基因。
本領(lǐng)域知道多種小鼠和人Akt序列(參閱Coffer等人，1991，歐洲生化雜志(Eur.J.Biochem.)201475-481；Jones等人，1991，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)884171-4175；Bellacosa等人，1993，癌基因(Oncogene)8745-754；GenBank編號(hào)M63167、X61037、和X65687；和美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/125,108)。Akt優(yōu)選人Akt1(SEQ ID NO11)、Akt2(SEQ ID NO12)、或Akt3(SEQID NO2)。本發(fā)明的優(yōu)選Akt包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。本發(fā)明的優(yōu)選核酸編碼SEQ ID NO2、SEQ ID NO11、或SEQ ID NO12所示氨基酸序列。核酸更優(yōu)選包含SEQ ID NO1所示序列。Akt還可衍生自非人來源。
根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)的傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)、和重組DNA技術(shù)。文獻(xiàn)中充分解釋了這些技術(shù)。參閱例如Sambrook、Fritsch、和Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(本文“Sambrook等人，1989)；《DNA克隆實(shí)踐方法》(DNA CloningA Practical Approach)，第1和2卷，D.N.Glover編，1985；《寡核苷酸合成》(OligonucleotideSynthesis)，M.J.Gait編，1984；《核酸雜交》(Nucleic AcidHybridization)，B.D.Hames和S.J.Higgins編，1985；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription And Translation)，B.D.Hames和S.J.Higgins編，1984；《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture)，R.I.Freshney編，1986；《固定化細(xì)胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL出版社，1986；B.Perval，《分子克隆實(shí)踐指南》(A Practical GuideTo Molecular Cloning)，1984；F.M.Ausubel等人編，《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons公司，1994。
可以由任何來源(特別是人cDNA或基因組文庫)分離編碼Akt的基因(無論是基因組DNA還是cDNA)。如上文所述，本領(lǐng)域眾所周知用于獲得akt基因的常用方法(參閱Sambrook等人，1989，同上)。
因此，任何動(dòng)物細(xì)胞潛在的可作為核酸來源用于akt基因的分子克隆?？赏ㄟ^本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)流程由克隆的DNA(如DNA“文庫”)獲得所述DNA，優(yōu)選由高水平表達(dá)該蛋白質(zhì)的組織(如心、胰、和骨骼肌cDNA)制備的cDNA文庫；通過化學(xué)合成；通過cDNA克??；或者通過由預(yù)定細(xì)胞純化的基因組DNA或其片段的克隆獲得該DNA(參閱例如Sambrook等人，1989，同上；D.M.Glover編，1985，《DNA克隆實(shí)踐方法》(DNA CloningA Practical Approach)，第1和2卷，MRL出版有限公司，牛津，英國)。除了編碼區(qū)，由基因組DNA衍生的克隆可包含調(diào)控區(qū)和內(nèi)含子DNA區(qū)；由cDNA衍生的克隆將不包含內(nèi)含子序列。無論來源是什么，應(yīng)將基因分子克隆到合適載體中用于擴(kuò)增基因。
一旦制得該DNA片段，即可以大量方法實(shí)現(xiàn)對(duì)含預(yù)定akt基因的特定DNA片段的鑒定。例如，可通過與標(biāo)記探針的核酸雜交篩選DNA片段(Benton和Davis，1977，科學(xué)(Science)196180；Grunstein和Hogness，1975，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)723961)。這些與探針基本同源的DNA片段將發(fā)生雜交。如上文所述，同源程度越高，則可使用越嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件。在特定的實(shí)施方案中，使用Northern雜交條件鑒定akt基因的mRNA剪接變體。
可根據(jù)基因特性進(jìn)行進(jìn)一步的選擇，如基因是否編碼具有本文公開的Akt蛋白的等電性質(zhì)、電泳性質(zhì)、氨基酸組成、或部分氨基酸序列的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。因此，可通過基于其表達(dá)產(chǎn)物的物理學(xué)、化學(xué)或免疫學(xué)特性的測(cè)定法檢測(cè)該基因的存在與否。例如，可根據(jù)它們產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是否具有與Akt相似或相同的電泳遷移、等電聚焦或非平衡pH凝膠電泳行為、蛋白水解消化圖譜、或抗原特性來選擇cDNA克隆或雜交選擇正確mRNA的DNA克隆。在特定的實(shí)施方案中，針對(duì)人Akt特異表位產(chǎn)生的多克隆抗體識(shí)別表達(dá)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及編碼Akt能夠刺激VEGF表達(dá)的等位基因變體、剪接變體、類似物、和衍生物的基因(如cDNA)的應(yīng)用。Akt衍生物和類似物的生成和應(yīng)用屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。這些變體、類似物、衍生物、和同源物應(yīng)保留刺激VEGF表達(dá)的能力。
通過替代、添加、或刪除改變編碼核酸序列以提供功能相當(dāng)?shù)姆肿樱纱丝芍苽銩kt衍生物。優(yōu)選制備相對(duì)于天然Akt而言功能活性增強(qiáng)或升高的衍生物。
由于核苷酸編碼序列的簡并性，編碼與akt基因基本相同的氨基酸序列(包括含單個(gè)氨基酸變異的氨基酸序列)的其它DNA序列也可應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)踐。這些包括，但不限于，等位基因、來自其它物種的同源基因、和含全部或部分akt基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列通過用編碼原序列相同氨基酸殘基的不同密碼子替代而改變，由此產(chǎn)生沉默的變化。同樣的，本發(fā)明的akt衍生物包括，但不限于，從一級(jí)氨基酸序列上看含全部或部分Akt蛋白氨基酸序列的那些，它們包括用序列中導(dǎo)致保守氨基酸替代的殘基來替代功能相當(dāng)?shù)陌被釟埢桓淖兊男蛄小＠?，可用極性相似的另一氨基酸替代序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，它可用作功能同等物，產(chǎn)生沉默的改變。序列中氨基酸的替代物可選自該氨基酸所屬類型的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。含芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、和組氨酸。帶負(fù)電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預(yù)期這樣的改變不會(huì)影響聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的表觀分子量或等電點(diǎn)。
特別優(yōu)選的替代是-用賴氨酸取代精氨酸，反之亦然，從而保持正電荷；-用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，從而保持負(fù)電荷；-用絲氨酸取代蘇氨酸，從而保持游離羥基；和-用谷氨酰胺取代天冬酰胺，從而保持游離CONH2。
還可引入氨基酸替代，以便用具有特別優(yōu)選特性的氨基酸進(jìn)行替代。例如，可引入半胱氨酸以添加可能與其它半胱氨酸形成二硫鍵的位點(diǎn)?？梢虢M氨酸作為特別有催化活性的位點(diǎn)(即組氨酸可作為酸或堿，是生化催化中最常用的氨基酸)。也可引入脯氨酸，因?yàn)樗哂刑厥獾钠矫娼Y(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可誘導(dǎo)β-轉(zhuǎn)角。
可通過本領(lǐng)域知道的多種方法產(chǎn)生編碼本發(fā)明Akt衍生物和類似物的基因。導(dǎo)致它們產(chǎn)生的操作可于基因或蛋白質(zhì)水平進(jìn)行。例如，可通過本領(lǐng)域知道的許多策略中的任一種修飾克隆的Akt基因序列(Sambrook等，1989，同上)?？捎孟拗菩詢?nèi)切酶在適當(dāng)位點(diǎn)切割此序列，根據(jù)需要還可進(jìn)行其它酶促修飾、分離、和體外連接。產(chǎn)生編碼Akt衍生物或類似物的基因時(shí)，應(yīng)小心確保修飾后的基因保留在與Akt基因相同的翻譯讀碼框內(nèi)，而在編碼所需活性的基因區(qū)內(nèi)不被翻譯終止信號(hào)打斷。
另外，Akt編碼核酸序列可在體外或在體內(nèi)突變以產(chǎn)生和/或破壞翻譯、起始、和/或終止序列，或產(chǎn)生編碼區(qū)中的變異和/或形成新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或破壞原先存在的位點(diǎn)，從而便于進(jìn)一步的體外修飾。這些突變優(yōu)選增強(qiáng)突變Akt基因產(chǎn)物的功能活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域知道的任何誘變技術(shù)，包括，但不限于，體外定點(diǎn)誘變(C.Hutchinson等人，1978，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2536551；Zoller和Smith，1984，DNA 3479-488；Oliphant等人，1986，基因(Gene)44177；Hutchinson等人，1986，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83710)、TAB接頭(Pharmacia)的使用，等等。PCR技術(shù)優(yōu)選用于定位誘變(參閱Higuchi，1989，“用PCR加工DNA”，在《PCR技術(shù)DNA擴(kuò)增的原理和應(yīng)用》(PCR TechnologyPrinciples andApplicaiton for DNA Amplification)中，H.Erlich編，Stockton出版社，第6章，第61-70頁)。
然后可將鑒定和分離后的DNA序列插入合適的克隆載體?？墒褂帽绢I(lǐng)域知道的大量的載體-宿主系統(tǒng)?？捎玫妮d體包括，但不局限于，質(zhì)粒或修飾后的病毒，但是載體系統(tǒng)必須與所使用的宿主細(xì)胞相容。載體的實(shí)例包括，但不限于，大腸桿菌噬菌體，諸如λ衍生物，或質(zhì)粒，諸如pBR322衍生物或pUC質(zhì)粒衍生物，如pGEX載體、pmal-c、pFLAG、等等?？赏ㄟ^將DNA片段連接到具有互補(bǔ)粘端的克隆載體內(nèi)來實(shí)現(xiàn)克隆載體中的插入。但是，若克隆載體中不存在用于片段化DNA的互補(bǔ)限制性位點(diǎn)，則可酶促修飾DNA分子的末端?；蛘?，可通過將核苷酸序列(接頭)連接到DNA末端來產(chǎn)生任何預(yù)定位點(diǎn)；這些連接的接頭可包含編碼限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的特殊化學(xué)合成寡核苷酸?？山?jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔、等等將重組分子引入宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生基因序列的許多拷貝?？寺〉幕騼?yōu)選包含于穿梭載體質(zhì)粒中，以供在克隆細(xì)胞(如大腸桿菌)中擴(kuò)增，而且在需要時(shí)便于純化用于隨后插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)細(xì)胞系。例如，穿梭載體是能在超過一種類型的生物體中復(fù)制的載體，可通過連接來自大腸桿菌質(zhì)粒的序列與來自酵母2μ質(zhì)粒的序列制備既能在大腸桿菌中復(fù)制又能在釀酒酵母中復(fù)制的穿梭載體。Akt多肽的表達(dá)可將編碼Akt或其抗原性片段、衍生物、或類似物以及它的功能活性衍生物(包括嵌合蛋白質(zhì))的核苷酸序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，即包含轉(zhuǎn)錄和翻譯插入的蛋白質(zhì)編碼序列所必需的元件的載體。本文將這些元件稱為“啟動(dòng)子”。因此，本發(fā)明核酸在本發(fā)明表達(dá)載體中可操作連接啟動(dòng)子。cDNA和基因組序列都可克隆并在這些調(diào)控序列的控制下表達(dá)。表達(dá)載體還優(yōu)選包含復(fù)制起點(diǎn)。
可在重組表達(dá)載體上提供必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)，或者可由編碼Akt和/或其側(cè)翼區(qū)的天然基因提供。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用心臟特異啟動(dòng)子和/或特異趨向心臟細(xì)胞的載體將Akt的表達(dá)限制于心肌細(xì)胞。
潛在的宿主-載體系統(tǒng)包括，但不限于，感染了病毒(如痘苗病毒、腺病毒、等)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；感染了病毒(如桿狀病毒)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，諸如含酵母載體的酵母；或用噬菌體、DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。載體的表達(dá)元件在強(qiáng)度和特異性上都有所變化。取決于所用的宿主-載體系統(tǒng)，可使用大量合適的轉(zhuǎn)化和翻譯元件中的任一種。
在通過重組整合編碼序列后，可在染色體上表達(dá)重組Akt蛋白或其功能片段、衍生物、嵌合構(gòu)建物、或類似物。在這點(diǎn)上，可使用大量擴(kuò)增系統(tǒng)中的任一種來實(shí)現(xiàn)高水平的穩(wěn)定基因表達(dá)(參閱Sambrook等人，1989，同上)。
可在適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基中在供細(xì)胞表達(dá)Akt的條件下培養(yǎng)包含含Akt編碼核酸的重組載體的細(xì)胞。上述用于將DNA片段插入克隆載體的任何方法都可用于構(gòu)建包含具有適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)和蛋白質(zhì)編碼序列的基因的表達(dá)載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)，以及體內(nèi)重組(遺傳重組)。
可將編碼Akt多肽的核酸可操作連接任何調(diào)控區(qū)(即本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)并受其控制，但是這些調(diào)控元件必須在選擇用于表達(dá)的宿主靶腫瘤處是有功能的。調(diào)控區(qū)可包含用于在宿主細(xì)胞中功能轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)，以及位于目的基因3’端且提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸化位點(diǎn)的區(qū)域。所有這些元件構(gòu)成了表達(dá)盒。
可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子包括組成性啟動(dòng)子和可調(diào)控(可誘導(dǎo))啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有可能天然負(fù)責(zé)核酸的表達(dá)。它也可來自異源來源。具體而言，它可以是真核或病毒基因的啟動(dòng)子序列。例如，它可以是由預(yù)定感染的細(xì)胞基因組衍生的啟動(dòng)子序列。同樣的，它可以是由病毒基因組衍生的啟動(dòng)子序列，諸如腺病毒(E1A和MLP)、巨細(xì)胞病毒、或勞氏肉瘤病毒。另外，可通過添加激活或調(diào)控序列或者能夠發(fā)生組織特異或優(yōu)勢(shì)表達(dá)的序列來修飾啟動(dòng)子(烯醇化酶和GFAP啟動(dòng)子等等)。此外，當(dāng)核酸不包含啟動(dòng)子序列時(shí)，可以插入啟動(dòng)子序列。
可用于實(shí)踐本發(fā)明的啟動(dòng)子包括遍在啟動(dòng)子(如HPRT、波形蛋白、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白)、中間絲啟動(dòng)子(如橋粒蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、GFAP)、治療性基因啟動(dòng)子(如MDR型、CFTR、因子VIII)、組織特異啟動(dòng)子(如平滑肌細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、在分裂的細(xì)胞中優(yōu)先激活的啟動(dòng)子、應(yīng)答刺激的啟動(dòng)子(如類固醇激素受體、視黃酸受體)、四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物、巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、腺病毒Ela啟動(dòng)子、和腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLP)。WO96/01313、US5,168,062、和5,385,839(收入本文作為參考)中描述了四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物和CMV啟動(dòng)子。
更具體的說，可通過本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件控制Akt蛋白的表達(dá)，但是這些調(diào)控元件在選擇用于表達(dá)的宿主中必須是有功能的。可用于控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子包括，但不限于，SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、勞氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)片段中所含的啟動(dòng)子(Yamamoto等人，1980，細(xì)胞(Cell)22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等人，1981，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，1982，自然(Nature)29639-42)；原核表達(dá)載體，諸如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff等人，1978，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)753727-3731)或tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，1983，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8021-25)；也可參閱“來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”(1980，科技美國人(Scientific American)24274-94)；來自酵母或其它真菌的啟動(dòng)子元件，諸如Gal4啟動(dòng)子、ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子；和展示組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在胰腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)(Swift等人，1984，細(xì)胞(Cell)38639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港生物學(xué)季度討論會(huì)(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.)50399-409；MacDonald，1987，肝臟病學(xué)(Hepatology)7425-515)；在胰腺β-細(xì)胞內(nèi)有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan，1985，自然(Nature)315115-122)、在淋巴細(xì)胞內(nèi)有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等人，1984，細(xì)胞(Cell)38647-658；Adames等人，1985，自然(Nature)318533-538；Alexander等人，1987，細(xì)胞分子生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)71436-1444)、在睪丸、乳房、淋巴、和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等人，1986，細(xì)胞(Cell)45485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等人，1987，基因和發(fā)育(Gene andDevel.)1268-276)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等人，1985，細(xì)胞分子生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)51639-1648；Hammer等人，1987，科學(xué)(Science)23553-58)、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等人，1987，基因和發(fā)育(Gene and Devel.)1161-171)、在骨髓細(xì)胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等人，1985，自然(Nature)315338-340；Kollias等人，1986，細(xì)胞(Cell)4689-94)、在腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等人，1987，細(xì)胞(Cell)48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)(Sani，1985，自然(Nature)314283-286)、和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等人，1986，科學(xué)(Science)2341372-1378)。
優(yōu)選的是，或使用心臟特異啟動(dòng)子或使用特異趨向心臟細(xì)胞的載體，將Akt的表達(dá)限制于心肌細(xì)胞。
可通過5種常用方法鑒定包含Akt蛋白編碼核酸的表達(dá)載體(a)目的質(zhì)粒DNA或特異mRNA的PCR擴(kuò)增，(b)核酸雜交，(c)選擇標(biāo)記基因功能的存在或缺失，(d)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行分析，和(e)插入序列的表達(dá)。在第一種方法中，可通過PCR擴(kuò)增核酸以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在第二種方法中，可用探針通過核酸雜交檢測(cè)插入表達(dá)載體的外源基因的存在，所用探針含與插入的標(biāo)記基因同源的序列。在第三種方法中，可以外源基因插入載體而引起的某些“選擇標(biāo)記”基因功能(如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、對(duì)抗生素的抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中包涵體的形成，等等)的存在或丟失為基礎(chǔ)鑒定并選擇重組載體/宿主系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，若編碼Akt的核酸插入載體的“選擇標(biāo)記”基因序列中，則通過選擇標(biāo)記基因功能的缺失可鑒定含Akt插入片段的重組體。在第四種方法中，通過適當(dāng)?shù)南拗泼赶b定重組表達(dá)載體。在第五種方法中，假如表達(dá)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)功能活性構(gòu)象，那么可通過測(cè)定重組體所表達(dá)的基因產(chǎn)物的活性、生化或免疫學(xué)特征來鑒定重組表達(dá)載體。
多種宿主/表達(dá)載體組合可用于表達(dá)Akt DNA序列。例如，有用的表達(dá)載體可包括染色體、非染色體、和合成的DNA序列片段。合適的載體包括SV40衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒colE1、pCR1、pBR322、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith等人，1988，基因(Gene)6731-40)、pMB9及其衍生物，諸如RP4等質(zhì)粒；噬菌體DNA，如噬菌體1的大量衍生物，如NM989，和其它噬菌體DNA，如M13和絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA；諸如2μm質(zhì)粒等酵母質(zhì)?；蚱溲苌铮豢捎糜谡婧思?xì)胞的載體，諸如可用于昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體；由質(zhì)粒與噬菌體DNA聯(lián)合衍生的載體，諸如經(jīng)修飾而應(yīng)用噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒；等等。
例如，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，既可使用非融合型轉(zhuǎn)移載體，諸如，但不限于，pVL941(BamHI克隆位點(diǎn)；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII、和PstI克隆位點(diǎn)；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、和BamHI克隆位點(diǎn)；Summers和Invitrogen)、和pBlueBacIII(BamHI、BglII、PstI、NcoI、和HindIII克隆位點(diǎn)，可用藍(lán)/白重組體篩選；Invitrogen)；又可使用融合型轉(zhuǎn)移載體，諸如，但不限于，pAc700(BamHI和KpnI克隆位點(diǎn)，其中BamHI識(shí)別位點(diǎn)開始于起始密碼子；Summers)、pAc701和pAc702(與pAc700相同，具有不同的閱讀框架)、pAc360(多角體蛋白起始密碼子下游36bp處有BamHI克隆位點(diǎn)；Invitrogen(195))、和pBlueBacHisA、B、C(三種不同的閱讀框架，具有BamHI、BglII、PstI、NcoI、和HindIII克隆位點(diǎn)，用于ProBond純化的N-末端肽和藍(lán)/白斑重組體篩選；Invitrogen(220))。
本發(fā)明試圖使用的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括，含可誘導(dǎo)啟動(dòng)子諸如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動(dòng)子的載體，如包含DHFR表達(dá)載體的任何表達(dá)載體，或DHFR/氨甲喋呤共擴(kuò)增載體，諸如pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI、和EcoRI克隆位點(diǎn)，該載體既表達(dá)克隆基因又表達(dá)DHFR，參閱Kaufman，1991，分子生物學(xué)現(xiàn)行方案(Current Protocols inMolecular Biology)16.12)?；蛘?，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺基肟共擴(kuò)增載體，諸如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、和BclI克隆位點(diǎn)，其中載體表達(dá)谷氨酰胺合成酶和克隆基因；Celltech)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下指導(dǎo)游離體基因表達(dá)的載體，諸如pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、和KpnI克隆位點(diǎn)，組成性勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)片段(RSV-LTR)啟動(dòng)子、潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、和KpnI克隆位點(diǎn)，組成性人巨細(xì)胞病毒(hCMV)立即早期基因、潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、和BamHI克隆位點(diǎn)，可誘導(dǎo)的金屬硫蛋白IIa基因啟動(dòng)子、潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI、和KpnI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子、組氨醇選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、和BamHI克隆位點(diǎn)，RSV-LTR啟動(dòng)子、G418選擇標(biāo)記；Invitrogen)、和pEBVHis(RSV-LTR啟動(dòng)子、潮霉素選擇標(biāo)記、可通過ProBond樹脂純化并用腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本發(fā)明的可選擇哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、和ApaI克隆位點(diǎn)，G418選擇；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、和XbaI克隆位點(diǎn)，G418選擇；Invitrogen)、等等。本發(fā)明使用的牛痘病毒哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(參閱Kaufman，1991，同上)包括，但不限于，pSC11(SmaI克隆位點(diǎn)，TK-和β-gal篩選)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、和HindIII克隆位點(diǎn)；TK-和β-gal篩選)、和pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindIII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位點(diǎn)，TK或XPRT選擇)。
本發(fā)明也可使用酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)Akt蛋白。例如，非融合型pYES2載體(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHI、SacI、KpnI、和HindIII克隆位點(diǎn)；Invitrogen)或融合型pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、和HindIII克隆位點(diǎn)，用ProBond樹脂純化并用腸激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)，只提及這兩種可用于本發(fā)明的載體。
一旦鑒定并分離了特定的重組DNA分子，可使用本領(lǐng)域已知的幾種方法進(jìn)行擴(kuò)增。一旦建立了合適的宿主系統(tǒng)和生長條件，就可增殖和制備一定量的重組表達(dá)載體。如上所述，可用的表達(dá)載體包括，但不限于，下列載體或其衍生物人或動(dòng)物病毒，諸如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒，諸如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如λ)，以及質(zhì)粒和粘粒DNA載體，這里只提到其中一些。
另外，可選擇能夠調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以預(yù)期的特異方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。不同的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后加工及修飾具有其特征性及特異性機(jī)制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以保證所表達(dá)外源蛋白質(zhì)的預(yù)期修飾和加工。酵母中的表達(dá)可產(chǎn)生生物學(xué)活性產(chǎn)物。真核細(xì)胞中的表達(dá)可提高“自然”折疊的可能性。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)可為重建或建立Akt活性提供工具。而且，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可不同程度影響加工反應(yīng)，諸如蛋白水解切割。
通過本領(lǐng)域已知方法，將載體引入預(yù)期宿主細(xì)胞中，如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、基因槍、或DNA載體轉(zhuǎn)移器(參閱如Wu等人，1992，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26314621-14624；Hartmut等人，加拿大專利申請(qǐng)2,012,311，1990年3月15日提交)。
如上所述，通過收集培養(yǎng)液或溶解包涵體，如用去污劑處理，若需要還可以用超聲波法或其它機(jī)械方法，可獲得可溶形式的蛋白質(zhì)。使用多種技術(shù)可分離溶解的或可溶的蛋白質(zhì)，諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、等電聚焦、雙向凝膠電泳、層析法(如離子交換、親和、免疫親和、和大小排阻柱層析)、離心、差異溶解度、免疫沉淀、或用于蛋白質(zhì)純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?；虔煼ê娃D(zhuǎn)基因載體如上所述，本發(fā)明涉及Akt蛋白刺激VEGF表達(dá)的能力，VEGF是一種誘導(dǎo)血管發(fā)生的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明包括通過對(duì)患有局部缺血狀況患者施用編碼Akt蛋白的核酸而進(jìn)行的基因療法。局部缺血狀況可包括腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、四肢缺血、外周動(dòng)脈疾病、間歇性跛行、心肌缺血、或者缺血性、特發(fā)性、或肥大性心肌病。
適當(dāng)摻入載體中的Akt編碼核酸，以及包含它們的藥物組合物，可用于治療缺血組織。它們可用于在體內(nèi)在任何類型的缺血組織中轉(zhuǎn)移并表達(dá)基因，尤其是心臟。此外，依照待治療的病理學(xué)，可進(jìn)行靶向治療(具體而言，就是，可通過選擇的載體確定趨向特定組織的轉(zhuǎn)移，并通過選擇的特定啟動(dòng)子確定表達(dá))。本發(fā)明的核酸或載體可有利的用于在人或動(dòng)物中，在體內(nèi)或在細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生能夠刺激VEGF蛋白表達(dá)的Akt蛋白。本發(fā)明由此有可能特異的、局部的、且有效的治療局部缺血。
可單獨(dú)施用編碼Akt蛋白的核酸，或者與編碼血管發(fā)生性因子的核酸聯(lián)合。已知的血管發(fā)生性因子包括堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美國專利5,661,133)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Pu等人，1993，循環(huán)(Circulation)88208-2156)、促血管生成素、和VEGF(評(píng)論參閱Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。已鑒定了VEGF的幾種形式，包括VEGF121(美國專利5,219,739)、VEGF165(美國專利5,332,672)、VEGF189(美國專利5,240,848)、VEGF206、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美國專利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。編碼Akt蛋白的核酸還可與過渡金屬離子聯(lián)合施用，諸如CoCl2，它顯示可增強(qiáng)VEGF基因的表達(dá)并刺激血管形成(美國專利5,480,975)。
如上所述，“載體”是用于將本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的任何工具。優(yōu)選的載體是病毒載體，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、和腺伴隨病毒。由此，用病毒載體或通過直接引入DNA，體內(nèi)、離體或體外引入編碼Akt蛋白或多肽的基因。通過將轉(zhuǎn)基因載體靶向特異細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)靶組織中的表達(dá)，諸如用病毒載體或受體配基，或用組織特異的啟動(dòng)子，或二者結(jié)合使用。
通常用于體內(nèi)靶向和治療流程的病毒載體是基于DNA的載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本領(lǐng)域已知用于構(gòu)建和使用病毒載體的方法(參閱Miller和Rosman，1992，生物技術(shù)(BioTechniques)7980-990)。優(yōu)選的病毒載體是復(fù)制缺陷型的，即它們?cè)诎屑?xì)胞中不能自主復(fù)制。一般而言，本發(fā)明范圍內(nèi)使用的復(fù)制缺陷型病毒載體基因組缺少至少一個(gè)病毒在感染細(xì)胞中復(fù)制所必需的區(qū)域。這些區(qū)域可用本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的任何技術(shù)或刪除(全部或部分)或使其無功能。這些技術(shù)包括完全去除、替代(用其它序列，特別是插入的核酸)、部分刪除、或向必需(對(duì)復(fù)制而言)區(qū)添加一個(gè)或多個(gè)堿基。使用遺傳操作技術(shù)或通過誘變劑處理，可在體外(在分離DNA上)或原位進(jìn)行這些技術(shù)。優(yōu)選復(fù)制缺陷型病毒保留包裝病毒顆粒所必需的基因組序列。
DNA病毒載體包括減毒的或缺陷型DNA病毒，諸如，但不限于，單純皰疹病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、牛痘病毒、等等。優(yōu)選完全或幾乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入細(xì)胞后無復(fù)制能力，因而不會(huì)導(dǎo)致可能產(chǎn)生的病毒感染。使用缺陷型病毒載體得以施用于特異、局部區(qū)域的細(xì)胞，而不用擔(dān)心該載體會(huì)感染其它細(xì)胞。因此可特異靶向特殊組織。具體載體的例子包括，但不限于，缺陷型皰疹病毒1(HSV1)載體(Kaplitt等人，1991，分子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)(Molec.Cell.Neurosci.)2320-330)、缺失糖蛋白L基因的缺陷型皰疹病毒載體(專利發(fā)表物RD371005A)、或其它缺陷型皰疹病毒載體(國際專利發(fā)表物WO94/21807，發(fā)表于1994年9月29日；國際專利發(fā)表物WO92/05263，發(fā)表于1994年4月2日)；減毒型腺病毒載體，諸如Stratford-Perricaudet等人描述的載體(1992，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)90626-630；也可參閱La Salle等人，1993，科學(xué)(Science)259988-990)；以及缺陷型腺伴隨病毒載體(Samulski等人，1987，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)613096-3101；Samulski等人，1989，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)633822-3828；Lebkowski等人，1988，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)83988-3996)。
體內(nèi)施用時(shí)，優(yōu)選將適當(dāng)?shù)拿庖咭种浦委熍c病毒載體(如腺病毒載體)結(jié)合使用，以避免病毒載體和感染細(xì)胞的免疫失活。例如，可施用諸如白介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、或抗CD4抗體等免疫抑制細(xì)胞因子來阻斷對(duì)病毒載體的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答(參閱如Wilson，1995，自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine))。另外，采用經(jīng)改造表達(dá)最小數(shù)量抗原的病毒載體是有利的。
自然的，本發(fā)明涵蓋載體的投遞，它將表達(dá)治療有效量的Akt用于基因療法。用于本文的術(shù)語“治療有效量”指足以改善宿主的臨床顯著局部缺血狀況的量。腺病毒載體在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體是腺病毒載體。腺病毒是真核DNA病毒，經(jīng)修飾后可將本發(fā)明的核酸有效投遞至多種細(xì)胞類型中。存在多種血清型的腺病毒。在本發(fā)明范圍內(nèi)，優(yōu)選使用這些血清型中的2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或動(dòng)物來源的腺病毒(參閱WO94/26914)。可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的那些動(dòng)物來源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如May1，Beard等人，1990，病毒學(xué)(Virology)7581)、羊、豬、禽、和猿(例如SAV)來源的腺病毒。優(yōu)選的動(dòng)物來源腺病毒是犬腺病毒，更優(yōu)選CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
優(yōu)選的本發(fā)明復(fù)制缺陷型腺病毒載體包含ITR、衣殼化序列、和目的核酸。更優(yōu)選的是，至少腺病毒的E1區(qū)是非功能性的。E1區(qū)中的刪除優(yōu)選為Ad5腺病毒序列的第455-3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。也可修飾其它區(qū)域，特別是E3區(qū)(WO95/02697)、E2區(qū)(WO94/28938)、E4區(qū)(WO94/28152、WO94/12649、和WO95/02697)、或晚期基因L1-L5中的任一個(gè)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)有刪除(Ad1.0)。EP185,573中公開了E1-刪除的腺病毒的例子，該專利全文引入本文作為參考。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1和E4區(qū)有刪除(Ad3.0)。WO95/02697和WO96/22378(收入本文作為參考)公開了E1/E4-刪除的腺病毒的例子。在還有一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體在E1區(qū)有刪除，并在其中插入了E4區(qū)和核酸序列(參閱FR94 13355，收入本文作為參考)。
通過本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員已知的任何技術(shù)，可制備本發(fā)明復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Levero等人，1991，基因(Gene)101195；EP185 573；Graham，1984，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)32917)。具體而言，可通過腺病毒與其中攜帶目的DNA序列的質(zhì)粒之間的同源重組進(jìn)行制備。在腺病毒與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)入適當(dāng)細(xì)胞系后進(jìn)行同源重組。采用的細(xì)胞系應(yīng)優(yōu)選(i)是所述元件可轉(zhuǎn)化的，且(ii)包含能與復(fù)制缺陷型腺病毒部分基因組互補(bǔ)的序列，它優(yōu)選以整合形式存在于細(xì)胞系中，從而避免發(fā)生重組的風(fēng)險(xiǎn)。如專利申請(qǐng)WO94/26914和WO95/02697所述，可用的細(xì)胞系例子是人胚胎腎細(xì)胞系293(Graham等人，1997，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)3659)，它包含整合在其基因組中的Ad5腺病毒左手部分基因組(12％)，和能彌補(bǔ)E1和E4功能的細(xì)胞系。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)回收并純化重組腺病毒。腺伴隨病毒載體腺伴隨病毒(AAV)是相對(duì)較小的DNA病毒，它們能以穩(wěn)定的定位方式整合到感染細(xì)胞的基因組中。它們能感染廣譜的細(xì)胞而不影響細(xì)胞生長、形態(tài)、或分化，且它們看上去不涉及人的病理學(xué)。AAV基因組已被克隆、測(cè)序、并表征。它包含大約4700個(gè)堿基，且兩末端含有約145個(gè)堿基的反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)，作為病毒的復(fù)制起點(diǎn)?；蚪M的剩余部分分成兩個(gè)具衣殼化功能的基本區(qū)基因組的左手部分，含涉及病毒復(fù)制和病毒基因表達(dá)的rep基因；基因組的右手部分，含編碼病毒衣殼蛋白的cap基因。
已描述了來自AAV的載體用于在體外和在體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因的應(yīng)用(參閱WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368、US5,139,941、EP488 528)。這些發(fā)表物描述了多種AAV衍生的構(gòu)建物，其中rep和/或cap基因被刪除并由目的基因取代，和這些構(gòu)建物在體外(進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞)或在體內(nèi)(直接進(jìn)入生物體)用于轉(zhuǎn)移所述目的基因的應(yīng)用。通過將含目的核酸序列且該序列側(cè)翼有兩AAV反向末端重復(fù)(ITR)區(qū)的質(zhì)粒與攜帶AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到感染了人輔助病毒(例如腺病毒)的細(xì)胞系中，可制備本發(fā)明復(fù)制缺陷型重組AAV。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化產(chǎn)生的AAV重組體。
因此，本發(fā)明還涉及AAV衍生的重組病毒，其基因組包含編碼Akt3且側(cè)翼為AAV ITR的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含編碼Akt3且側(cè)翼為兩AAV ITR的核酸序列的質(zhì)粒。這些質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)移核酸序列，在適當(dāng)?shù)那闆r中，可將質(zhì)粒摻入脂質(zhì)體載體(假病毒)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將基因引入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，例如參閱Anderson等人，美國專利5,399,346；Mann等人，1983，細(xì)胞(Cell)33153；Temin等人，美國專利4,650,764；Temin等人，美國專利4,980,289；Markowitz等人，1988，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)621120；Temin等人，美國專利5,124,263；EP453242，EP178220；Bernstein等人，1985，遺傳工程學(xué)(Genet.Eng.)7235；McCormick，1985，生物技術(shù)(BioTechnlogy)3689；國際專利發(fā)表物WO95/07358，Dougherty等人于1995年3月16日發(fā)表；和Kuo等人，1993，血液學(xué)(Blood)82845。逆轉(zhuǎn)錄病毒是感染分裂細(xì)胞的整合病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含兩個(gè)LTR、一個(gè)衣殼化序列、和三個(gè)編碼區(qū)(gag、pol、和env)。在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gag、pol、和env基因通常全部或部分刪除，并以異源目的核酸序列取代。可由不同類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建這些載體，諸如HIV、MoMuLV(“鼠莫羅尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫羅尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)、SNV(”脾臟壞死病毒”)、RSV(“勞氏肉瘤病毒”)、和弗蘭德病毒(Friendvirus)。WO95/02697公開了缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
一般而言，為了構(gòu)建含核酸序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，首先構(gòu)建含LTR、衣殼化序列、和編碼序列的質(zhì)粒。將此構(gòu)建物用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系能反式提供質(zhì)粒中缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒功能。通常，包裝細(xì)胞系由此能表達(dá)gag、pol、和env基因。這樣的包裝細(xì)胞系在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，特別是細(xì)胞系PA317(US4,861,719)；PsiCRIP細(xì)胞系(WO90/02806)、和GP+envAm-12細(xì)胞系(WO89/07150)。另外，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在LTR中包含修飾以抑制轉(zhuǎn)錄活性，還可含其中可包含部分gag基因的衣殼化序列(Bender等人，1987，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)611639)。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，純化重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
可構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為感染顆?；蛴糜趩屋嗈D(zhuǎn)染。在前一種情況中，修飾病毒以保留其中除負(fù)責(zé)致癌轉(zhuǎn)化特性的基因之外的所有其它基因，并表達(dá)異源基因。制備非感染性病毒載體以破壞病毒包裝信號(hào)，但保留包裝共引入病毒所需的結(jié)構(gòu)基因，所述病毒經(jīng)改造包含異源基因和包裝信號(hào)。因此，產(chǎn)生的病毒顆粒不能生產(chǎn)另外的病毒。
發(fā)表于1995年10月的國際專利發(fā)表物WO95/28494描述了靶向基因投遞。非病毒載體或者，通過脂轉(zhuǎn)染可在體內(nèi)引入載體。在過去十年中，越來越多將脂質(zhì)體用于核酸的體外包裝和轉(zhuǎn)染。為解決脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染中所遇困難和危險(xiǎn)而設(shè)計(jì)的合成陽離子脂質(zhì)，可用于制備脂質(zhì)體，用于在體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記物的基因(Felgner等人，1987，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)847413-7417；參閱Mackey等人，1988，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)858027-8031；Ulmer等人，1993，科學(xué)(Science)2591745-1748)。使用陽離子脂質(zhì)可促進(jìn)帶負(fù)電荷核酸的包裝，還促進(jìn)它與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜之間的融合(Felgner和Ringold，1989，科學(xué)(Science)337387-388)。國際專利發(fā)表物WO95/18863和WO96/17823以及美國專利5,459,127描述了用于轉(zhuǎn)移核酸的特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。在體內(nèi)應(yīng)用脂轉(zhuǎn)染將外源基因引入特異器官具有某些實(shí)際的好處。脂質(zhì)體的分子靶向特異細(xì)胞是優(yōu)勢(shì)之一。已清楚在具細(xì)胞異質(zhì)性的組織中定向轉(zhuǎn)染特殊細(xì)胞類型是特別有利的，諸如胰、肝、腎、和腦。為了靶向目的，脂質(zhì)可化學(xué)偶聯(lián)其它分子(參閱Mackey等人，同上)。靶向肽(如激素或神經(jīng)遞質(zhì))和蛋白質(zhì)(諸如抗體)或非肽分子都可化學(xué)偶聯(lián)到脂質(zhì)體上。
其它分子也可用于促進(jìn)核酸的體內(nèi)轉(zhuǎn)染，諸如陽離子寡聚肽(如國際專利發(fā)表物WO95/21931)、由DNA結(jié)合蛋白衍生的肽(如國際專利發(fā)表物WO96/25508)、或陽離子聚合物(如國際專利發(fā)表物WO95/21931)。
還可以以裸露DNA質(zhì)粒的形式將載體引入體內(nèi)(參閱美國專利5,693,622、5,589,466、和5,580,859)。通過本領(lǐng)域已知方法，可將用于基因療法的裸露DNA載體引入預(yù)期宿主細(xì)胞中，如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、基因槍、或DNA載體轉(zhuǎn)移器(參閱如Wu等人，1992，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26314621-14624；Hartmut等，加拿大專利申請(qǐng)2,012,311，1990年3月15日提交；Williams等人，1991，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)882726-2730)。也可使用受體介導(dǎo)的DNA投遞方法(Curiel等人，1992，人類基因療法(Hum.GeneTher.)3147-154；Wu和Wu，1987，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2624429-4432)。優(yōu)選的裸露DNA載體包括具有條件性復(fù)制起點(diǎn)的pCOS質(zhì)粒(參閱WO97/10343)和缺乏復(fù)制起點(diǎn)和標(biāo)記基因的小環(huán)質(zhì)粒(參閱WO96/26270)。藥物組合物和投遞本發(fā)明還涉及藥物組合物。這些組合物可包含上文定義的Akt蛋白或多肽或者編碼Akt蛋白或多肽的核酸，以及制藥學(xué)可接受的載體或工具。本發(fā)明組合物特別適用于配制用于基因療法的生物學(xué)物質(zhì)。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含編碼人Akt蛋白或多肽的核酸。
組合物可包含Akt蛋白或編碼Akt蛋白的核酸。組合物還可包含編碼血管發(fā)生性因子的核酸。已知的血管發(fā)生性因子包括堿性和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美國專利5,661,133)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Pu等人，1993，循環(huán)(Circulation)88208-2156)、促血管生成素、和VEGF(評(píng)論參閱Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。已鑒定了VEGF的幾種形式的編碼核酸，包括VEGF121(美國專利5,219,739)、VEGF165(美國專利5,332,672)、VEGF189(美國專利5,240,848)、VEGF206、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美國專利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。組合物還可包含過渡金屬離子，諸如CoCl2，其顯示可增強(qiáng)VEGF基因的表達(dá)并刺激血管形成(美國專利5,480,975)。Akt蛋白或編碼Akt蛋白的核酸還可與血管舒張劑聯(lián)合施用。血管舒張劑的范例包括硝基血管舒張劑(如硝普鹽、緩釋硝酸甘油)、非特異血管舒張劑(如肼苯噠嗪、罌粟堿)、腺苷受體激動(dòng)劑、鈣通道阻斷劑、α阻斷劑(如哌唑嗪)、內(nèi)源血管舒張劑肽或相關(guān)肽類似物(如物質(zhì)P、CGRP)、K通道激活劑、ACE抑制劑或血管緊張肽受體阻斷劑、內(nèi)皮縮血管肽受體阻斷劑或ECE抑制劑、和血管舒張劑前列腺素。
本發(fā)明的任何載體，不管是病毒或非病毒型的，都優(yōu)選在制藥學(xué)可接受的載體或工具中引入體內(nèi)。術(shù)語“制藥學(xué)可接受的”指分子實(shí)體和組合物在施用于人體時(shí)是生理上可忍受的，且通常不引起過敏或類似的不適反應(yīng)，諸如胃部不適、頭暈、等等。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“制藥學(xué)可接受的”優(yōu)選指聯(lián)邦或州政府主管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或列于美國藥典或其它通常認(rèn)可用于動(dòng)物(特別是人)的藥典中的。術(shù)語“載體”指稀釋劑、佐劑、賦形劑、或與化合物一起施用的工具。這些制藥學(xué)載體可以是無菌液體，諸如水或油，包括石油、動(dòng)物、植物、或合成來源的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、等等。優(yōu)選采用水或鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作為載體，對(duì)于可注射溶液尤其如此?！独酌黝D藥物科學(xué)》(Remington’s PharmacerticalSciences，E.W.Martin)描述了合適的制藥學(xué)載體。
本發(fā)明藥物組合物可配制用于局部、口服、非腸胃、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、等等施用。
藥物組合物優(yōu)選包含用于可注射配方的制藥學(xué)可接受載體，具體而言，可以是無菌、等張鹽水溶液(NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、等等，或這些鹽類的混和物)，或是干的(特別是凍干的)組合物，在適當(dāng)情況中，加入無菌水或生理鹽水后能夠形成可注射溶液。
具體而言，組合物可以是等張、無菌鹽水溶液(NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、等等，或這些鹽類的混和物)，或是干的(尤其是凍干的)組合物，根據(jù)情況，加入無菌水或生理鹽水后能夠形成可注射溶液。
優(yōu)選的無菌可注射制劑可以是在無毒腸胃外可接受溶劑或稀釋劑中配制而成的溶液或懸浮液。制藥學(xué)可接受載體或工具的范例是鹽水、緩沖鹽水、等張鹽水(如NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、等等，或這些鹽類的混和物)、Ringer氏溶液、葡萄糖、水、無菌水、甘油、乙醇、及其聯(lián)合。傳統(tǒng)采用1，3-丁二醇和無菌不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)?？刹捎萌魏螠睾偷牟粨]發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。脂肪酸(諸如油酸)也在可注射制劑中應(yīng)用。
根據(jù)不同參數(shù)，特別是根據(jù)施用模式、所述病理學(xué)、待表達(dá)的基因、或預(yù)期療程，可調(diào)整用于施用的本發(fā)明核酸的劑量，不管是單獨(dú)施用還是摻入載體。一般而言，在本發(fā)明重組病毒的情況中，以104-1014pfu的劑量形式配制并施用，優(yōu)選106-1010pfu。術(shù)語“pfu”(噬斑形成單位)對(duì)應(yīng)于病毒溶液的感染能力，通過感染合適的細(xì)胞培養(yǎng)物并測(cè)量(通常在48小時(shí)后)感染細(xì)胞形成的噬斑數(shù)目來測(cè)定pfu。文獻(xiàn)中很好的記錄了測(cè)定病毒溶液pfu滴度的技術(shù)。
本發(fā)明組合物可以非腸胃或穿粘膜途徑引入，如口服、鼻吸、直腸、或穿皮給予。施用優(yōu)選非腸胃途徑，如靜脈內(nèi)注射，還包括，但不限于，小動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、和顱內(nèi)施用?？赏ㄟ^直接注射到待治療位點(diǎn)(特別是心臟)來引入組合物。
指向心臟的優(yōu)選施用途徑是直接注射到心臟內(nèi)(美國專利5,693,622和5,661,133)。使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)可使心臟成像，諸如磁共振成像或計(jì)算機(jī)輔助斷層照相，并通過立體定位注射至例如心肌缺血區(qū)域來施用治療性組合物。
優(yōu)選使用心臟特異啟動(dòng)子和/或特異趨向心臟細(xì)胞的載體將Akt的表達(dá)限制于心肌細(xì)胞。
還可通過導(dǎo)管的使用進(jìn)行指向心臟的施用。美國專利5,851,521、5,652,225、5,328,470、5,698,531、5,707,969、5,830,879、和5,674,192描述了多種有孔氣囊、雙層氣囊、和水凝膠導(dǎo)管。
在還有一個(gè)實(shí)施方案中，可在受控釋放系統(tǒng)中投遞包含Akt多肽或多肽編碼核酸的組合物。例如，可使用靜脈內(nèi)輸液、可植入滲透泵、穿皮貼劑、脂質(zhì)體、或其它施用模式來施用核酸或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用泵(參閱Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等人，1980，外科學(xué)(Surgery)88507；Saudek等人，1989，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl.J.Med.)321574)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用聚合材料(參閱《受控釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》(Medical Applications of Controlled Release)，Langer和Wise編，CRC出版社，伯克萊屯，佛羅里達(dá)，1974；《受控藥物生物利用度，藥物產(chǎn)品的設(shè)計(jì)和性能》(Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Desing and Performance)，Smolen和Ball編，Wiley出版社，紐約，1984；Ranger和Peppas，1983，高分子化學(xué)高分子科學(xué)評(píng)論雜志(J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.)2361；還可參閱Levy等人，1985，科學(xué)(Science)228190；During等人，神經(jīng)學(xué)年鑒(Ann.Neurol.)25351，1989；Howard等人，1989，神經(jīng)外科學(xué)雜志(J.Neurosurg.)71105)。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，受控釋放系統(tǒng)可置于治療靶(即心臟)附近，由此只需要全身性劑量的一部分(參閱如Goodson，1984，《受控釋放的醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，同上，第2卷，第115-138頁)。Langer(1990，科學(xué)(Science)2491527-1533)的綜述中討論了其它受控釋放系統(tǒng)。
因此，可通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、或皮下施用途徑投遞本發(fā)明組合物?；蛘撸赏ㄟ^鼻腔或口腔施用適當(dāng)配制的組合物。通過以必需間隔(如每天、每12小時(shí)、等)提供治療有效劑量(即足以在施用對(duì)象體內(nèi)誘導(dǎo)代謝變化的劑量)，可確保持續(xù)供應(yīng)生物學(xué)物質(zhì)。這些參數(shù)將取決于待治療疾病狀況的嚴(yán)重程度、執(zhí)行的其它行為(諸如更改食譜)、治療對(duì)象的體重、年齡、和性別、以及本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員參照標(biāo)準(zhǔn)的良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐可容易測(cè)定的其它標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明還涉及通過抑制患有腫瘤患者體內(nèi)Akt水平由此抑制VEGF生成從而抑制患者體內(nèi)血管發(fā)生的方法。可以通過在反義核酸在胞內(nèi)條件下與Akt mRNA發(fā)生雜交的條件下將Akt反義核酸引入患者細(xì)胞從而降低Akt水平。還可以通過以足以結(jié)合并滅活A(yù)kt的水平將特異結(jié)合Akt的胞內(nèi)結(jié)合蛋白(諸如單鏈Fv抗體，scFv)引入患者細(xì)胞內(nèi)從而降低Akt水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過施用編碼顯性失活形式Akt的核酸從而降低Akt活性。優(yōu)選直接對(duì)腫瘤細(xì)胞施用反義核酸、胞內(nèi)結(jié)合蛋白或其編碼核酸、或者顯性失活A(yù)kt突變體。
本發(fā)明反義序列與編碼Akt蛋白的序列互補(bǔ)，并下調(diào)或阻斷Akt蛋白的表達(dá)。優(yōu)選實(shí)施方案包含反義多核苷酸分子。WO92/15680(將全部內(nèi)容收入本文作為參考)公開了反義多核苷酸(編碼反義RNA分子的DNA)的制備和應(yīng)用，以及寡聚和遺傳反義的應(yīng)用。
本發(fā)明反義核酸優(yōu)選能夠與編碼Akt蛋白的DNA序列的全部或部分或相應(yīng)信使RNA特異雜交的RNA。本發(fā)明反義序列可衍生自DNA序列，它在細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生與人Akt mRNA的全部或一部分互補(bǔ)的RNA?？赏ㄟ^反向表達(dá)編碼Akt蛋白的所有或部分序列來制備這些反義序列(EP140308)。任何長度的反義序列都適用于實(shí)踐本發(fā)明，只要它能夠下調(diào)或阻斷Akt的表達(dá)即可。優(yōu)選反義序列長度為至少20個(gè)核苷酸。
在這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的另一方面，核酸編碼反義RAN分子。在這個(gè)實(shí)施方案中，核酸可操作連接能夠表達(dá)核酸序列的信號(hào)，并利用(優(yōu)選)重組載體構(gòu)建物引入細(xì)胞中，一旦將載體導(dǎo)入細(xì)胞，該細(xì)胞將表達(dá)反義核酸。合適載體的范例包括質(zhì)粒、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、和皰疹病毒。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案是通過抑制Akt活性來特異抑制血管發(fā)生的方法，包括能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與Akt選擇性相互作用的胞內(nèi)結(jié)合蛋白的編碼核酸序列。WO94/29446和WO94/02610(將全部內(nèi)容收入本文作為參考)公開了胞內(nèi)結(jié)合蛋白編碼基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。胞內(nèi)結(jié)合蛋白包括能夠在其表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)選擇性結(jié)合Akt或與其相互作用，并中和所結(jié)合的Akt蛋白的功能的任何蛋白質(zhì)。胞內(nèi)結(jié)合蛋白優(yōu)選抗體或抗體片段。
WO94/02610公開了抗體的制備和編碼特殊抗體的核酸的鑒定。參照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的技術(shù)，使用Akt蛋白或其片段，制備對(duì)該蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體。隨后制備包含胞內(nèi)結(jié)合蛋白或其片段的編碼核酸且能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體以用于本發(fā)明的方法。用于向含Akt細(xì)胞投遞胞內(nèi)結(jié)合蛋白編碼核酸的合適載體和方法包括上文所述的。編碼Akt胞內(nèi)結(jié)合蛋白的核酸序列還可包含用于將胞內(nèi)結(jié)合蛋白靶向Akt細(xì)胞定位的定位信號(hào)編碼序列和/或能夠?qū)麅?nèi)結(jié)合蛋白插入細(xì)胞質(zhì)膜的序列的編碼序列。可以將定位信號(hào)或插入序列置于胞內(nèi)結(jié)合蛋白上的任何部位，只要它不干擾與Akt蛋白的結(jié)合即可。WO94/02610公開了定位信號(hào)的范例。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過施用編碼顯性失活形式Akt的核酸來降低Akt活性。Fujio等人(1990，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)274(23)16349-16354)、Wang等人(1999，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)19(6)4008-4018)、Jiang等人(1999，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96(5)2077-2081)、和Gerber等人(1998，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)273(46)30336-30343)描述了顯性失活形式Akt的范例。
施用本發(fā)明范圍內(nèi)的生物學(xué)物質(zhì)的生物體優(yōu)選人，但可以是任何動(dòng)物。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易的領(lǐng)會(huì)，本發(fā)明的方法和藥物組合物特別適合施用于任何動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，包括，但不限于，家畜(諸如貓或狗)、農(nóng)畜(諸如，但不限于，牛、馬、山羊、綿羊、和豬)、野生動(dòng)物(或是在野地里或是在動(dòng)物園里)、研究用動(dòng)物(諸如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、狗、貓、等)、鳥類(諸如雞、火雞、鳴禽、等)即用于獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
實(shí)施例通過參照作為本發(fā)明示范而提供的下列非限制性實(shí)施例，可更好的理解本發(fā)明。常用分子生物學(xué)技術(shù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知分子生物學(xué)的傳統(tǒng)方法，諸如質(zhì)粒DNA的制備性提取、質(zhì)粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、DNA片段的電洗脫純化、酚或酚/氯仿的蛋白質(zhì)抽提、鹽介質(zhì)中DNA的乙醇或異丙醇沉淀、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、等等，且文獻(xiàn)中有詳盡描述(Maniatis等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1982；第2版，1989；F.M.Ausubel等人編，《分子生物學(xué)現(xiàn)行方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons公司，紐約，1987)。
傳統(tǒng)的克隆載體包括pBR322和pUC類質(zhì)粒，以及M13系列的噬菌體。這些都可購買獲得(Bethesda Research Laboratories)。
為了進(jìn)行連接，可通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)大小分離DNA片段，用酚或酚/氯仿混和液抽提，用乙醇沉淀，然后在存在噬菌體T4 DNA連接酶(Biolabs)時(shí)參照供應(yīng)商的推薦溫育。
可用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)參照供應(yīng)商的說明書進(jìn)行5’突出末端的補(bǔ)平。在存在噬菌體T4DNA聚合酶(Biolabs)時(shí)參照制造商的推薦進(jìn)行3’突出末端的破壞。通過S1核酸酶的受控處理進(jìn)行5’突出末端的破壞。
可參照Taylor等人(1985，核酸研究(Nucl.Acids Res.)138749-8764)開發(fā)的方法，使用Amersham銷售的試劑盒，進(jìn)行由合成寡脫氧核苷酸指導(dǎo)的體外誘變。
可使用“DNA熱循環(huán)儀”(Perkin Elmer Cetus)，參照制造商的說明書，進(jìn)行PCR(聚合酶催化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，R.K.Saiki等人，1985，科學(xué)(Science)2301350-1354；K.B.Mullis和F.A.Faloona，1987，酶學(xué)方法(Meth.Enzym.)155335-350)技術(shù)，即DNA片段的酶促擴(kuò)增。
可參照Sanger等人(1977，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)745463-5467)開發(fā)的方法，使用Amersham銷售的試劑盒，進(jìn)行核苷酸序列的證實(shí)。
可使用Qiagen質(zhì)粒純化系統(tǒng)，參照制造商的指示，純化質(zhì)粒DNA。實(shí)施例1人Akt3的克隆此實(shí)施例描述了編碼Akt3蛋白的核酸的克隆。實(shí)施例1.1對(duì)cDNA文庫篩選Akt3數(shù)據(jù)庫搜尋揭示，1個(gè)人cDNA克隆包含與人Akt1和Akt2同源但又不同的一段人cDNA序列。為了分離這種先前未知人Akt異構(gòu)體(本文稱為人Akt3)的全長編碼序列，用對(duì)應(yīng)于人Akt3的5’-UTR和N端編碼區(qū)的cDNA探針篩選人心臟cDNA文庫。
由Genome System購買了一個(gè)人cDNA克隆(ID#479072)。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用如下引物對(duì)AKT3-5’UTR-F3(5’TCC AAA CCC TAA AGC TGA TAT CAC 3’；SEQ ID NO3)和AKT3-C-R1(5’CCT GGA TAG CTT CTG TCC ATT C 3’；SEQ ID NO4).
由此cDNA擴(kuò)增覆蓋人Akt3部分5’-UTR(非翻譯區(qū))和部分5’-編碼序列的片段。使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boerhinger Mannheim)，參照制造商的指示，用α-32P-dCTP標(biāo)記cDNA探針。使用Bio-Rad層析旋轉(zhuǎn)柱，參照制造商的指示，純化探針。
最初將超過1百萬個(gè)噬菌體克隆用于cDNA噬菌體文庫篩選(Clonetech，目錄#HL5027t)。在添加20mg/ml四環(huán)素、0.2％麥芽糖、和10mM MgCl2的LB中接種宿主細(xì)胞XL1-B，并于37℃溫育過夜。如Maniatis(1989)所述，進(jìn)行噬菌體感染和轉(zhuǎn)膜。將濾膜變性，復(fù)性并烘烤，然后用雜交液于65℃預(yù)雜交4小時(shí)。向?yàn)V膜中加入變性形式(加熱變性10分鐘)的32P標(biāo)記探針，并雜交過夜。雜交后，連續(xù)用2x SSC/0.1％ SDS、1x SSC/0.1％ SDS、和0.5x SSC/0.1％ SDS于65℃清洗濾膜。將濾膜空氣干燥，并使Kodak X射線膠片曝光。此初次篩選后，選擇陽性克隆用于二次和三次篩選。純化獲得的陽性噬菌體，并使用BM25.8-25宿主細(xì)胞，參照制造商(Boerhinger Mannheim)的指示，將噬菌體DNA轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒DNA。
選擇兩個(gè)陽性克隆用于完整測(cè)序和進(jìn)一步的表征。這兩個(gè)克隆之一(9號(hào)克隆)包含人Akt3的部分5’-UTR和N端編碼序列(第1-127位氨基酸)。另一個(gè)克隆(1號(hào)克隆)包含大部人Akt3序列(第15位氨基酸-C末端)和3’-UTR。通過融合這兩種部分序列形成了全長cDNA序列。SEQ ID NO1顯示了編碼人Akt3的完整序列。SEQ ID NO2顯示了對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。Akt3比Akt1和Akt2短，而且Akt3與Akt1或Akt2在C端序列上沒有顯著同源性。特別是，人Akt3 C端部分的最后14個(gè)氨基酸與人Akt1和Akt2中存在的不同。實(shí)施例2Akt3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建此實(shí)施例描述了含激活A(yù)kt3的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。融合最初兩種部分cDNA克隆(上文所述1號(hào)和9號(hào)克隆)以獲得全長AKT3編碼序列。將含人Src肉豆蔻酸化序列的DNA融合在全長Akt3序列的N末端。將HA標(biāo)簽序列融合在全長Akt3序列的C末端(用于檢測(cè)表達(dá))。將此嵌合MyrAkt3HA的序列置于CMV啟動(dòng)子的控制之下。完整構(gòu)建物稱為CMV6-MyrAkt3HA(圖1A)。實(shí)施例2.1CMV6-MyrAktHA此實(shí)施例描述了能夠表達(dá)Akt3和組成性有活性形式的人Akt3的質(zhì)粒的構(gòu)建。通過1號(hào)克隆的PCR擴(kuò)增，使用如下引物對(duì)hAKT3c19-PCR5(F)(5’-ATG AGC GAT GTT ACC ATT GTG AAA GAA GGT TGG GTT CAG AAGAGG GGA GAA TAT ATA AAA AAC TGG AGG CCA AG-3’；SEQ ID NO5)，該引物包含Akt3最初24個(gè)氨基酸的編碼序列；和hAKT3 c11-PCR3(5’-TTA TTT TTT CCA GGT ACC CAG CAT GCC-3’；SEQ ID NO6).獲得全長Akt3編碼序列。
為了生成組成性有活性形式的Akt3，使用如下引物對(duì)MyrAKT3Ha-F1(5’GCG CGC GAA TTC CCACCATGG GTA GCA ACA AGA GCA AGC CCA AGG ATG CCA GCC AGC GGC GCC GCAGCA GCG ATG TTA CCA TTG TGA AAG-3’；SEQ ID NO7)，該引物包含Kozak序列(CCACC)、來自人src的肉豆蔻酸化序列(下劃線)、和人Akt3的最初8個(gè)氨基酸(粗體)；和MyrAKT3Ha-R(5’-GCG CGC GGG CCC TTA GGC GTAGTC GGG GAC GTC GTA CGG GTA TTT TTT CCA GTT ACC CAG CAT GCC-3’；SEQ IDNO8)，該引物包含HA標(biāo)簽的編碼序列(粗體)，通過PCR擴(kuò)增全長Akt3的編碼序列。用EcoRI/ApaI消化PCR產(chǎn)物，并亞克隆到pCDNA3.1的EcoRI/ApaI位點(diǎn)中，產(chǎn)生pCDNA3-Myr-Akt-HA。通過PCR擴(kuò)增MyrAktHA的編碼序列，并亞克隆到載體CMV6的KpnI/EcoRI位點(diǎn)中。用于PCR反應(yīng)的引物對(duì)是CMV6-AKT3cat-F(5’-CGG GGT ACC ACC ATG GGT AGC AAC AAG AGC AAG CCC AAGGAT GCC AGC CAG-3’；SEQ ID NO9)，和CMV6-AKT3cat-R(5’-CCG GAA TTC TTA GGC GTA GTC GGG GAC GTC-3’；SEQ IDNO10).通過測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒。實(shí)施例2.2人AKT3的表達(dá)此實(shí)施例描述了人AKT3在組織培養(yǎng)物中的表達(dá)。在添加10％胎牛血清(FBS)的DME培養(yǎng)基中于37℃、5％ CO2的恒溫箱中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和COS-7細(xì)胞。
將質(zhì)粒CMV6-[MyrAkt3HA]瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。作為對(duì)照，用CMV6載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在這兩種轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞分成0.2×106細(xì)胞/cm2的密度。使用脂轉(zhuǎn)染胺試劑(LipofectAmine，Gibco BRL)，參照制造商的指示，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡而言之，在不含血清和抗生素的DME培養(yǎng)基中混和DNA。加入脂轉(zhuǎn)染胺試劑(DNA∶脂轉(zhuǎn)染胺試劑＝1mg∶4ml)。簡單混和后，將DNA/脂轉(zhuǎn)染胺試劑混和物于室溫保持30分鐘。用1xPBS清洗細(xì)胞，并暴露于DNA/脂轉(zhuǎn)染胺試劑混和物3小時(shí)。轉(zhuǎn)染后，用1xPBS清洗細(xì)胞2次，并換成DMEM-10％ FBS培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，裂解細(xì)胞。用抗HA抗體免疫沉淀裂解物，并使用衍生自Akt1下游靶GSK-3的肽測(cè)定免疫沉淀物的激酶活性(Cross等人，1995)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，參照Cross等人(1995)的方法，進(jìn)行Akt的體外激酶測(cè)定法。用1xPBS清洗細(xì)胞2次，并在裂解緩沖液(50mMTris/HCl(pH7.4)、1mM EDTA、1mM EGTA、0.5mM Na3VO4、0.1％ β-巰基乙醇、1％屈立通X-100、50mM NaF、5mM焦磷酸鈉、10mM磷酸甘油鈉、0.5mM PMSF、2μg/ml抑酶肽、2mg/ml亮抑酶肽、和1mM微囊藻素)中裂解。于4℃離心15分鐘，除去不溶物。將細(xì)胞裂解物與多克隆抗HA抗體(BABCO)一起于4℃在旋轉(zhuǎn)搖床上保溫1小時(shí)。向裂解物中加入蛋白A-瓊脂糖珠1小時(shí)。免疫沉淀后，將沉淀物用清洗液A(添加0.5M NaCl的裂解緩沖液)清洗3次，用清洗液B(50mM Tris/HCl(pH7.4)、0.03％ Brij35、0.1mM EGTA、和0.1％ β-巰基乙醇)清洗3次，再用激酶緩沖液(20mM MOPS(pH7.2)、25mM β-磷酸甘油鈉(pH7.0)、1mM Na3VO4、1mM DTT)清洗3次。清洗后，將沉淀物重懸于40μl激酶反應(yīng)混和物(100mM ATP、0.1mg/ml Crosstide底物肽(UBI)、20mM MgCl2、10mM蛋白激酶A抑制劑/PKI(UBI)、和10mCig-32P-ATP)。于30℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完全后，將混和物簡單離心，并將30μl上清液上樣至p81硝酸纖維素紙環(huán)(Gibco BRL)上。將硝酸纖維素紙用180mM磷酸清洗10分鐘3次，再用丙酮清洗2分鐘2次。使用閃爍計(jì)數(shù)儀監(jiān)測(cè)紙的放射性。CMV6[MyrAkt3HA]轉(zhuǎn)染樣品的激酶活性比對(duì)照載體CMV6轉(zhuǎn)染細(xì)胞高20倍，而后者與該測(cè)定法的背景水平相似(圖1B)。
為了測(cè)試轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的MyrAkt3HA表達(dá)，將由轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備的裂解物進(jìn)行抗HA抗體免疫印漬。如上所述，制備細(xì)胞裂解物，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用封閉液(1xPBS、0.2％吐溫20、5％脫脂奶粉)于4℃處理過夜。將濾膜與小鼠單克隆抗HA抗體(在封閉液中1∶500稀釋)一起于室溫保溫3小時(shí)。用封閉液清洗15分鐘3次后，將濾膜與綴合HRP的兔抗小鼠IgG抗體(在封閉液中1∶1000稀釋)一起于室溫保溫1小時(shí)。用封閉液清洗10分鐘3次，并用1xPBS/0.2％吐溫20清洗3次后，將濾膜在ECL(PIERCE)中參照制造商的指示顯影，并使Kodak X射線膠片曝光。如圖1C所示，在CMV6-[MyrAkt3HA]轉(zhuǎn)染樣品中存在大約60kDa的亮帶(與MyrAkt1HA大小相似，資料未顯示)，而在CMV6轉(zhuǎn)染樣品(陰性對(duì)照)中沒有。綜合起來看，這些資料證明CMV6-[MyrAkt3HA]的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致功能性Akt活性。實(shí)施例3對(duì)VEGF表達(dá)的刺激使用肌細(xì)胞分離系統(tǒng)(Worthington Biochemical公司)分離新生大鼠心肌細(xì)胞。簡而言之，將由1-3日齡大鼠收集的心臟絞碎，用胰蛋白酶(終濃度50μg/ml)于4℃消化過夜，隨后用膠原酶于37℃消化45分鐘。研磨后，將混和物濾過細(xì)胞濾器。簡單離心后，將細(xì)胞以0.3×106細(xì)胞/ml的密度重懸于涂板培養(yǎng)基(DMEM∶M199＝4∶1，10％熱滅活的馬血清、5％胎牛血清、1x胰島素-運(yùn)鐵蛋白-硒添加物(GibcoBRL)、和1x慶大霉素、100μg/ml BrdU)。24小時(shí)后，將細(xì)胞換成低有絲分裂原培養(yǎng)基(DMEM∶M199＝4∶1，1x慶大霉素)。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)(上文所述)和Kenneth Walsh博士(Boston，MA)提供的方法制備包含組成性有活性的小鼠akt1的重組腺病毒(AV-mAkt1cak)。
在感染病毒前，在組織培養(yǎng)基中將病毒稀釋至3×107/m1。向6孔組織培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入1ml含病毒培養(yǎng)基，而向每個(gè)100mm培養(yǎng)皿中加入8ml含病毒培養(yǎng)基。感染過夜后，用1xPBS洗去培養(yǎng)基中的過量病毒，并將細(xì)胞換成標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。實(shí)施例3.4ELISA測(cè)定法使用VEGF165ELISA檢測(cè)試劑盒(R％D System公司，目錄號(hào)DVE00)進(jìn)行人VEGF ELISA測(cè)定法。收集培養(yǎng)基并通過簡單離心澄清。加入測(cè)定稀釋劑RD1W后，將樣品加到每個(gè)適當(dāng)孔中。然后將平板于室溫保溫2小時(shí)。用清洗緩沖液清洗每個(gè)孔3次。隨后，用提供的綴合抗VEGF抗體處理每個(gè)孔于室溫2小時(shí)。重復(fù)上述清洗步驟。加入底物并于室溫保溫20分鐘。使用設(shè)定為450nm的微量讀數(shù)儀測(cè)定光密度，而波長校正設(shè)為540nm。實(shí)施例3.5RNA分離和Northern雜交使用Ultraspec RNA分離試劑(Biotecx)分離總RNA。簡而言之，向100mm組織培養(yǎng)板中的細(xì)胞加入1ml Ultraspec溶液。由平板上刮下細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至不含RNA酶的離心管中。加入200μl氯仿后，將混和物漩渦震蕩并于4℃離心。收集水溶液(上層)并用等體積的異丙醇沉淀RNA。用70％乙醇清洗并干燥后，將RNA溶于經(jīng)DEPC處理的水中。在1％瓊脂糖凝膠上分離20μg總RNA。電泳并轉(zhuǎn)膜后，將印漬進(jìn)行UV交聯(lián)。
用使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim)產(chǎn)生的32P標(biāo)記DNA探針進(jìn)行雜交。于65℃雜交后，相繼用2xSSC-0.1％ SDS和0.1xSSC-0.1％ SDS清洗印漬，并使Kodak X射線膠片曝光過夜。實(shí)施例3.6Akt增加轉(zhuǎn)染細(xì)胞的VEGF表達(dá)用激活的小鼠Akt1(CMV6-mAkt1cak)、激活的人Akt3(CMV6-HAkt3)的表達(dá)質(zhì)粒、或CMV6載體(作為對(duì)照)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，給細(xì)胞換成低有絲分裂原培養(yǎng)基(添加0.5％胎牛血清的DMEM)。16小時(shí)后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基并進(jìn)行人VEGF165的ELISA。如圖2所示，Akt1或Akt3轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基中的VEGF水平顯著高于載體CMV6轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基(作為對(duì)照)。這些資料證明，組成性有活性的Akt1或Akt3在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)VEGF165表達(dá)。實(shí)施例3.7AV-mAkt1cak和AV-hAkt3cak在人骨骼肌細(xì)胞和人平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo)VEGF表達(dá)用表達(dá)有活性小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)或組成性有活性人Akt3(AV-hAKT3cak)的重組腺病毒感染人骨骼肌細(xì)胞(HSKMC)和人冠脈平滑肌細(xì)胞(HCASMC)。作為對(duì)照，用驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)的AV-GFP感染細(xì)胞。感染后1天，收集培養(yǎng)基并通過ELISA測(cè)量培養(yǎng)基中的VEGF水平。如圖3A所示，AV-mAKT1cak和AV-hAKT3cak都在HSKMC中顯著增加VEGF165表達(dá)，而AV-GFP感染具有少許影響或無影響。此外，如圖3B所示，AV-mAkt1(cak)和AV-hAkt3cak在人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HCASMC)中誘導(dǎo)VEGF165。
為了評(píng)價(jià)Akt對(duì)VEGF信使RNA的影響，用表達(dá)mAkt1cak、hAkt3cak、或GFP的腺病毒感染HCASMC。作為陽性對(duì)照，將細(xì)胞換成缺氧條件24小時(shí)。分離總RNA并進(jìn)行VEGF的Northern印漬分析。如圖3C所示，缺氧處理顯著誘導(dǎo)VEGF表達(dá)。另外，AV-mAkt1cak和AV-hAkt3cak而非AV-GFP顯著增加VEGF的mRNA水平。這些資料指出，Akt通過增加mRNA水平而增加VEGF表達(dá)。實(shí)施例3.8AV-mAkt1cak和AV-hAkt3cak在心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)VEGF表達(dá)用編碼mAkt1cak(AV-mAkt1cak)、小鼠野生型Akt1(AV-mAkt1wt)、hAkt3cak(AV-mAkt3cak)的腺病毒、或AV-GFP(作為對(duì)照)感染新生大鼠心肌細(xì)胞。作為陽性對(duì)照，在缺氧條件下培養(yǎng)未感染細(xì)胞24小時(shí)。感染后1天，由這些細(xì)胞分離RNA并通過Norhtern印漬分析檢測(cè)VEGF表達(dá)。如圖3所示，AV-mAkt1cak或AV-hAkt3cak在心肌細(xì)胞中顯著增加VEGF表達(dá)，而AV-GFP或AV-mAkt1wt對(duì)VEGF165表達(dá)具有少許影響或無影響。
本發(fā)明不限于本文所述具體實(shí)施方案的范圍。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述描述和附圖將領(lǐng)會(huì)除本文所述外對(duì)本發(fā)明的多種更改。這些更改意欲屬于所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
還應(yīng)理解，為核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小和所有分子量都是大約的，且提供用于描述。
本文引用了很多出版物，其公開內(nèi)容均全文引入本文作為參考。
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362Thr Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp65 70 75act act gtt ata gag aga aca ttt cat gta gat act cca gag gaa agg 410Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg80 85 90 95gaa gaa tgg aca gaa gct atc cag gct gta gca gac aga ctg cag agg 458Glu Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg100 105 110caa gaa gag gag aga atg aat tgt agt cca act tca caa att gat aat 506Gln Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn115 120 125ata gga gag gaa gag atg gat gcc tct aca acc cat cat aaa aga aag 554Ile Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys130 135 140aca atg aat gat ttt gac tat ttg aaa cta cta ggt aaa ggc act ttt 602Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe145 150 155ggg aaa gtt att ttg gtt cga gag aag gca agt gga aaa tac tat gct 650Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala160 165 170 175atg aag att ctg aag aaa gaa gtc att att gca aag gat gaa gtg gca 698Met Lys 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1.誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)的方法，該方法包括對(duì)細(xì)胞施用Akt蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中Akt蛋白選自Akt1、Akt2、和Akt3。
3.權(quán)利要求2的方法，其中Akt蛋白是Akt3。
4.權(quán)利要求1的方法，其中VEGF選自VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述施用包括將編碼Akt蛋白且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸引入細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述核酸是質(zhì)粒或病毒載體的一部分。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述核酸是質(zhì)粒的一部分。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、和痘苗病毒。
9.權(quán)利要求5的方法，其中Akt在細(xì)胞內(nèi)組成性表達(dá)。
10.權(quán)利要求1的方法，還包括施用過渡金屬離子和/或血管舒張劑。
11.權(quán)利要求5的方法，還包括施用編碼第二種血管發(fā)生性因子且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸。
12.權(quán)利要求11的方法，其中第二種血管發(fā)生性因子選自VEGF、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、和促血管生成素。
13.權(quán)利要求12的方法，其中VEGF選自VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
14.權(quán)利要求12的方法，其中第二種血管發(fā)生性因子是內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。
15.權(quán)利要求2的方法，其中對(duì)細(xì)胞施用至少兩種形式的Akt蛋白。
16.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞位于患有局部缺血狀況患者的體內(nèi)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中局部缺血狀況是腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特發(fā)性、或肥大性心肌病。
18.誘導(dǎo)患有局部缺血狀況患者的細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)的方法，該方法包括對(duì)患者施用Akt蛋白。
19.權(quán)利要求18的方法，其中Akt蛋白選自Akt1、Akt2、和Akt3。
20.權(quán)利要求19的方法，其中Akt蛋白是Akt3。
21.權(quán)利要求18的方法，其中VEGF選自VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
22.權(quán)利要求18的方法，其中對(duì)患者施用編碼Akt蛋白且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述核酸是質(zhì)?；虿《据d體的一部分。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述核酸是質(zhì)粒的一部分。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、和痘苗病毒。
26.權(quán)利要求22的方法，其中Akt在細(xì)胞內(nèi)組成性表達(dá)。
27.權(quán)利要求18的方法，還包括對(duì)患者施用過渡金屬離子和/或血管舒張劑。
28.權(quán)利要求18的方法，其中局部缺血狀況是腦血管缺血、腎缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特發(fā)性、或肥大性心肌病。
29.權(quán)利要求22的方法，還包括施用編碼第二種血管發(fā)生性因子且可操作連接表達(dá)控制序列的核酸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中第二種血管發(fā)生性因子選自VEGF、酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、和促血管生成素。
31.權(quán)利要求30的方法，其中VEGF選自VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
32.權(quán)利要求30的方法，其中第二種血管發(fā)生性因子是內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。
33.權(quán)利要求16的方法，其中對(duì)患者施用至少兩種形式的Akt蛋白。
34.包含編碼Akt蛋白的核酸、過渡金屬和/或血管舒張劑、和制藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述核酸是質(zhì)?；虿《据d體的一部分。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述核酸是質(zhì)粒的一部分。
37.權(quán)利要求35的組合物，其中所述病毒載體選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、和痘苗病毒。
38.在患有腫瘤患者體內(nèi)抑制血管發(fā)生的方法，包括抑制患者體內(nèi)Akt活性水平，由此抑制VEGF的生成。
39.權(quán)利要求38的方法，包括在反義核酸在胞內(nèi)條件下與AktmRNA發(fā)生雜交的條件下，將Akt反義核酸引入患者細(xì)胞內(nèi)。
40.權(quán)利要求38的方法，包括以足以結(jié)合并滅活A(yù)kt的水平將可特異結(jié)合Akt的胞內(nèi)結(jié)合蛋白引入患者細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的方法，其中胞內(nèi)結(jié)合蛋白是單鏈Fv抗體(scFv)。
42.權(quán)利要求38的方法，包括引入編碼Akt的顯性失活形式的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療性血管發(fā)生的方法和組合物。更具體的說,本發(fā)明致力于通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。本發(fā)明的組合物和方法優(yōu)選包含編碼AKT的核酸及其施用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1360629SQ00810249
公開日2002年7月24日 申請(qǐng)日期2000年6月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月11日
發(fā)明者K·郭, Y·伊瓦施切克, K·克拉克 申請(qǐng)人:阿溫蒂斯藥物制品公司