專利名稱：一種n端特異的人ywhae多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品，具體是一種N端特 異的YWHAE多肽及其抗體制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
YWHAE (tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein)蛋白屬于14-3-3家族，通過(guò)結(jié)合phosphoserine-containing proteins介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這一高度保守的蛋白家族已被證實(shí)存在于植物和哺乳 動(dòng)物。YWHAE可以和CDC25， RAF1以及IRS1蛋白相互作用，提示其可能 具有多種生物學(xué)功能，并已證明與胰島素代謝相關(guān)，與小細(xì)胞肺癌相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決通過(guò)免疫實(shí)驗(yàn)特異性檢測(cè)YWHAE的表達(dá)與天然存在， 并建立相應(yīng)體外免疫分析所需基本生物制品的問(wèn)題，而提供的一種能特異性 針對(duì)YWHAE的N端的合成多肽、相應(yīng)抗體及其制備方法。本發(fā)明還可同時(shí) 解決目前使用的類似抗體價(jià)格高，親和力低，抗體結(jié)合蛋白的位置不特異且抗原性較差等問(wèn)題。本發(fā)明所述的抗YWHAE合成多肽、相應(yīng)抗體，按照以 下步驟制備
抗原表位分析與拮抗位置確定利用多種表位預(yù)測(cè)軟件，如DNAstar， OMIGA， UWGCG等進(jìn)行綜合分析，主要考量指標(biāo)包括親水性結(jié)構(gòu)、抗原 指數(shù)、表面可及性等，再結(jié)合我們已有實(shí)際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終確定 第13到第26位為該抗體的靶標(biāo)，其氨基酸序列為L(zhǎng)AEQAERYDEMVES。
多肽的合成靶標(biāo)多肽采用全自動(dòng)多通道多肽合成儀合成，柱層析純化， 然后通過(guò)HPLC，用每分鐘1%的標(biāo)準(zhǔn)乙晴梯度來(lái)檢測(cè)純度。
多肽與載體蛋白交聯(lián)由于本合成多肽分子量太小，在動(dòng)物體內(nèi)不能誘 導(dǎo)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此將多肽與載體蛋白交聯(lián)后才能進(jìn)行免疫，選擇鑰孔嘁 血藍(lán)素進(jìn)行交聯(lián)，能顯著增加抗原的大小和免疫原性，從而制備出人工免疫原。
免疫動(dòng)物所述的制備方法，其抗原肽-交聯(lián)載體蛋白做為免疫原，免疫 家兔制備抗體。選取適齡免疫用新西蘭兔，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行多點(diǎn)注射 免疫。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)停止免疫。
抗體純化達(dá)到要求的免疫動(dòng)物放血，標(biāo)準(zhǔn)方法收集抗血清，依次使用 辛酸-硫酸銨方法和親和層析過(guò)柱純化方法，進(jìn)行抗血清純化，通過(guò)
SDS-PAGE和HPLC驗(yàn)證純度，得到目標(biāo)抗體。
本發(fā)明制備的高質(zhì)量多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)，可與天然YWHAE分 子發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。用多肽制備抗體的成本較常規(guī)的重組抗原制備抗體方法低，抗體特異性好，經(jīng)親和層析純化后可以用于各種酶免檢測(cè)和WB試 驗(yàn)要求，可用于建立體外免疫分析。該合成肽抗體的制備，為YWHAE分子 的研究及其相關(guān)疾病的研究(如診斷策略的制定，流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防和控 制)提供了一個(gè)重要的工具，以及在生物醫(yī)學(xué)研究中對(duì)相應(yīng)靶蛋白的特性、 含量的測(cè)定、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都具有重要作用。


圖1是液相色譜鑒定合成多肽純度結(jié)果圖。
圖2是質(zhì)譜鑒定合成多肽分子量結(jié)果圖。
圖3是通過(guò)間接ELISA方法鑒定純化抗體相對(duì)親和常數(shù)結(jié)果圖。
圖1表明經(jīng)過(guò)HPLC對(duì)合成的多肽進(jìn)行純化后，液相色譜鑒定純度為 90.9%。
圖2表明多肽分子量理論值為1771.9，質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值M+H+為 1773.59。
圖3中ELISA檢測(cè)制備的多抗和多肽抗原親和常數(shù)為106-107L/mol。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1: YWHAE抗原肽的合成。
用DNAstar， OMIGA， UWGCG等蛋白分析軟件，對(duì)YWHAE氨基酸 序列進(jìn)行親水性結(jié)構(gòu)(hydrophilicity)、抗原指數(shù)(antigenicity)、表面可及性 (surface probability)以及同源性(homology)等分析，再結(jié)合我們已有實(shí) 際制備抗體的驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)，最終確定第13到第26位為靶標(biāo)，其氨基酸序列為 LAEQAERYDEMVES。在全自動(dòng)多肽合成儀上由固定羧基向氨基端遞減合 成后獲得粗品。經(jīng)30%乙睛溶解后，進(jìn)行高壓液相色譜(HPLC)分析，計(jì) 算主峰面積并收集，經(jīng)冷凍真空抽干后純化合成肽，質(zhì)譜鑒定。
實(shí)施例2:合成多肽與載體的偶聯(lián)。
載體蛋白選擇KLH (Keyhole limpet hemocyanin)，用雙功能試劑 順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進(jìn)行偶聯(lián) 取KLH5mg (O."Mmol，含賴氨酸2.2jjmol)，溶于0.75mL偶聯(lián)緩沖液 1 (50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5) ; 3mg MBS (11|jmo)溶于75|jL 二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉(zhuǎn)混勻，室溫下 作用30分鐘。迅速離心后，將反應(yīng)混合物(約0.8mL)加入預(yù)先用偶聯(lián)緩 沖液2 (0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/LNaCL， 0.01mol/LNa2EDTA， pH7.0) 平衡的PD-10柱。用偶聯(lián)緩沖液2洗脫，收集洗脫液(即MBS-KLH溶液)。 溶解1.5mg合成多肽于0.15mL偶聯(lián)緩沖液2，加入MBS-KLH緩沖液0.56， 室溫下旋轉(zhuǎn)混合，作用2小時(shí)后置4 。C過(guò)夜，將反應(yīng)混合物(約0.7mL) 加入預(yù)先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將 KLH、 MBS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-KLH和偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-PAGE (聚丙 烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯(lián)效率。實(shí)施例3:抗多肽抗體的制備。
取偶聯(lián)的KLH-多肽50(Hjg，溶于500|jL磷酸緩沖液，加等體積完全福 氏佐劑。免疫選取適齡免疫用新西蘭兔(體重標(biāo)準(zhǔn)為2-2.5公斤)，經(jīng)過(guò)適 應(yīng)性飼養(yǎng)后，背部皮內(nèi)不少于15點(diǎn)注射。2周后抗原量減半(250jjg)，加 等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強(qiáng)免疫。2周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫， 方法同前。再2周后耳緣靜脈少量采血，用合成多肽(1pg/mL)包被酶標(biāo) 板，間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)。反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血測(cè)抗體效價(jià)達(dá) 到1: 16萬(wàn)時(shí)停止免疫，采用頸動(dòng)脈放血收集抗體。
實(shí)施例4:親和層析純化抗多肽抗體。
① YWHAE合成多肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化 Sepharose4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯(lián)緩沖液洗 2次，迅速與溶于5mL偶聯(lián)緩沖液的合成多肽500ijg混合，室溫下旋轉(zhuǎn)混 合2小時(shí)。加入0.2mol/L甘氨酸4mL終止反應(yīng)，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)。 用偶聯(lián)緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50mL磷酸鹽緩沖液 洗凝膠，按終止?jié)舛?.02%加疊氮鈉(NaN3)，置4。C保存。
② 親和層析純化抗多肽抗體:將20mL兔抗多肽血清與1.6mL多肽偶聯(lián) 的Sepharose 4B共同加入50mL離心管，4°C旋轉(zhuǎn)混合6小時(shí)。將凝膠加 入層析柱，棄去流出液，用15mL磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加0.8mL pH2.9， 0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別加入8支預(yù)先加 入80jjL 2mol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5) ， 20mL磷酸鹽緩沖液洗凝膠。上述全部操作過(guò)程在4°C下完成。每管取洗脫液2pL，稀釋50倍后測(cè)280nm 的OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量并繪制洗脫曲線。
實(shí)施例5:抗體的鑒定，使用間接ELISA方法檢測(cè)抗體相對(duì)親和常數(shù)。
用合成肽交聯(lián)BSA，分別以5 ug/mL和10 yg/mL的濃度，在4度下 包被ELISA檢測(cè)板過(guò)夜，10%的山羊血清室溫封閉2小時(shí)后加入倍比稀釋的 已知蛋白濃度的純化后的抗體，再加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗0.1mL，
TMB顯色測(cè)定A45C。以抗體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以曲線達(dá)到水平時(shí)的A450
值為100%，以其他相對(duì)于該濃度的百分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，求出A5Q即50% A 值對(duì)應(yīng)的抗體濃度。按照Kaff-(n-1)/2(n[Ab' ] t-2[Ab] t)算出抗體相對(duì)親和 常數(shù)，其中[Ab' ]t 、 [Ab]t指的是A5o時(shí)即包被抗原分別為5ug/mL和10 wg/mL時(shí)抗體半飽和時(shí)抗體的摩爾濃度，[Ag]t、 [Ag' ]t指的是包被的抗 原濃度本實(shí)驗(yàn)中即指10yg和5ug， n=[Ag]t/[Ag， ] t，本實(shí)驗(yàn)中n=2。
試驗(yàn)效果
1. YWHAE合成多肽:HPLC純化后，使用液相色譜鑒定純度為90.9%。 多肽分子量理論值為1771.9,質(zhì)譜鑒定實(shí)測(cè)值M+H+為1773.59。
2. 多肽與載體的偶聯(lián)效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)效率與樣品回收 率大致相符，大于80%。
3. 抗體效價(jià)多只家兔得到的抗血清效價(jià)均在1:10萬(wàn)以上。4. 抗體親和力相對(duì)親和常數(shù)為106-107L/mol。
5. 抗體的應(yīng)用以上技術(shù)指標(biāo)的實(shí)現(xiàn)保證該抗體完全可以應(yīng)用于蛋白 印跡和各種酶免實(shí)驗(yàn)，以及建立相應(yīng)體外免疫分析試劑。序列表
<110>北京意宏安生物科技有限公司
<120> —種N端特異的人YWHAE多肽及其抗體制備方法 <160> 2
<210> 1 <211> 255 <212> PRT <213>人
<400> 1
MDDREDLVYQAKLAEQAERYDEMVESMKKVAGMDVELTVEERNLLS VAYKNVIGARRASWRIISSIEQKEENKGGEDKLKMIREYRQMVETELKLICC DILDVLDKHLIPAANTGESKVFYYKMKGDYHRYLAEFATGNDRKEAAENSL VAYKAASDIAMTELPPTHPIRLGLALNFSVFYYEILNSPDRACRLAKAAFDD AIAELDTLSEESYKDSTLIWIQLLRDNLTLWTSDWIQGDGEEQNKEALQDVE DENQ
<210> 2 <211> 14 <212> PRT <213>人<formula>formula see original document page 11</formula>
權(quán)利要求
1.一種N端特異的人YWHAE多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)AEQAERYDEMVES。
2. —種特異的抗人YWHAEN端合成多肽抗體，其特征在于該抗體效價(jià)在l: 100000以上， 特異性強(qiáng)，親和力高達(dá)106 — 107L/mol。
3. —種特異的抗人YWHAE N端合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以YWHAE氨基酸 序列中第13到第26位的LAEQAERYDEMVES肽段序列作為抗原肽合成人YWHAE抗 原肽；純化的抗原肽與蛋白載體偶聯(lián)，經(jīng)柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動(dòng)物， 制備多肽抗體，并經(jīng)親和層析純化而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔嘁血藍(lán)素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯(lián)的KLH—多肽加福氏佐劑免疫后收集 抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，免疫家 兔制備兔抗人YWHAE合成多肽抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯(lián)Sepharose4B，制備親和層析 柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種N端特異的人YWHAE多肽及其抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外試驗(yàn)用的生物制品。N端特異的人YWHAE多肽的氨基酸序列為L(zhǎng)AEQAERYDEMVES?？谷薡WHAE多肽抗體按以下方法制備(1)人YWHAE抗原表位的分析；(2)人YWHAE N端多肽的合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人YWHAE多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人YWHAE多肽抗體。本發(fā)明制備的N端特異的抗人YWHAE合成多肽抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好，可與天然人YWHAE發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)；制備成本低；純化后的抗體可完全用于免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為研究人YWHAE的生物學(xué)作用及其與各種疾病的關(guān)系提供了有用的工具。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101319004SQ200710100209
公開(kāi)日2008年12月10日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者杜宏武, 王德仙, 陳光宇, 陳吾奇 申請(qǐng)人:北京意宏安生物科技有限公司