專利名稱：含有迷迭香提取物的卷煙過濾嘴以及通過使用所述過濾嘴減少由煙霧中有害物質(zhì)引起的 ...的制作方法
含有迷迭香提取物的巻煙過濾嘴以及通過使用所述過濾嘴減少
由煙霧中有害物質(zhì)引起的DNA損傷的方法
1. 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及含有迷迭香提取物的巻煙過濾嘴以及減少由煙霧中各 種有害物質(zhì)引起的DNA損傷的方法。更具體地，本發(fā)明涉及使用所述 過濾嘴通過減少人肺部苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG ( BPDE-dG )加合物 來減少人細胞中由苯并[a]芘引起的DNA損傷。
2. 背景
人肺部苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG ( BPDE-dG )加合物集中于支氣 管細胞中。目前認為該加合物是由苯并[a]芘引起的腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵 事件。煙霧是BPDE-dG形成的重要誘因。
煙草使用是到目前為止暴露于已知致癌物和由癌癥引起的死亡之 間最普遍的關(guān)聯(lián)，并且因此是了解癌癥誘導(dǎo)機理的模型。苯并[a]芘 (BP )是存在于排出廢氣、碳烤食品中的高致癌性多環(huán)芳香烴(PAH )， 煙霧中少量存在，通常低于10ng/煙。BP是肺癌病原學(xué)中所涉及的煙 霧中60多種致癌物質(zhì)之一。它通過代謝活化成苯并[a]芘-7，8-二醇 -9，10-環(huán)氧化物(BPDE)，其主要在鳥嘌呤的W-位置與DNA反應(yīng)，主 要產(chǎn)生N2-鳥噤呤損傷，例如，苯并[a]芘-7，8-二醇-9,10-環(huán)氧化物 -W-脫氧鳥苷(BPDE-dG)加合物。已經(jīng)最后確定了人組織中BPDE-DNA 加合物的存在，并且BPDE-dG加合物專門集中在支氣管細胞，并因此 參與人肺癌的開始。
由于其理想的香味和高抗氧化活性，迷迭香(i os邁sr//7^ o/77c//7a7/s Labiatae)草和油、迷迭香提取物、鼠尾草酸和鼠尾草 酚通常用作食品加工中的香料和調(diào)味劑。
然而，在本發(fā)明之前，沒有認識到在巻煙過濾嘴中使用迷迭香提取物將會減少人細胞中由苯并[a]芘引起的DM損傷，具體地，苯并[a] 芘是人肺部的苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG ( BPDE-dG )加合物，目前認 為該加合物是由苯并[a]芘引起的腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵事件。
3.發(fā)明概述
認為BP是涉及吸煙者中肺癌誘導(dǎo)的重要致癌物質(zhì)并且，如在該研 究中所表明，活性氧種類實質(zhì)性地促進了關(guān)鍵的肺部致瘤加合物的形 成。盡管這對于防止對煙上癮以及提高戒煙和減少吸煙計劃的效率都 是關(guān)鍵的，但這些方法幾乎沒有效果。防止BPDE-dG加合物的形成是 一種可使減少成癮吸煙者的肺癌風(fēng)險降低的方法。
本發(fā)明涉及含有迷迭香提取物的巻煙過濾嘴，以及減少由煙霧中 的有害物質(zhì)引起的DNA損傷的方法。更具體地，本發(fā)明提供了使用所 述過濾嘴通過減少人肺部苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG ( BPDE-dG )加合 物來減少人細胞中由苯并[a]芘引起的DM損傷。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(-)-反-BPDE-dG加合物的量在(+)-BP-7，8 二醇的存在 下隨著煙霧的濃度線性增加。過氧化氫酶和超氧化物岐化酶抑制其超 過80°/。的形成。當(dāng)用(+)-BP-7， 8 二醇將MCF-7細胞處理2小時時，煙 霧劑量依賴性地增加(-)-反-BPDE-dG的形成，并減少(+)-順-BPDE的 CYP依賴性形成。
用苯并[a]芘將細胞處理長達一天，然后將其暴露于煙霧2小時。 在這2小時期間，發(fā)現(xiàn)了由于CYP的活性，與未處理細胞中的水平相 比較，用煙霧處理過的細胞中加合物形成增加兩倍。因此，發(fā)現(xiàn)了煙 霧通過其含有的活性氧種類激活了導(dǎo)致BPDE-dG加合物形成的苯并[a] 芘代謝途徑的第二個步驟。
因此，煙霧可以這種方式引起關(guān)鍵的肺部致瘤加合物的形成。
最后，發(fā)現(xiàn)了含有迷迭香提取物的改良巻煙過濾嘴使MCF-7細胞 中由煙霧引起的BPDE-dG加合物水平降低超過70%。相信這是降低成 癮吸煙者中肺癌風(fēng)險的重大進展。4.附圖、方案和表格的簡述


圖1.致癌物質(zhì)苯并[a]芘的主要代謝途徑和DNA結(jié)合。苯并[a] 芘是可以在體內(nèi)通過酶或通過氧活性種類轉(zhuǎn)化產(chǎn)生DNA-反應(yīng)性二氫 二醇環(huán)氧化物的煙草致癌物質(zhì)。通過細胞色素p450-依賴性單加氧酶 (P450 )或活性氧種類的催化從(-)-BP-7, 8-二氫二醇立體選擇性地產(chǎn) 生致突變的(+) -r-7， t-8- 二羥基-1-9， 10-氧-7， 8， 9， 10-四氫 -BP [ (+)-反-BPDE]。隨后該親電子的中間產(chǎn)物與基因組DNA的反應(yīng)在 二氫二醇和鳥苷的環(huán)外氨基之間產(chǎn)生了穩(wěn)定的加合物。這種DNA損傷
可以轉(zhuǎn)化成以下復(fù)制循環(huán)內(nèi)的突變，除非產(chǎn)生這種加合物的修復(fù)。
圖2.使用無細胞系統(tǒng)伴隨DNA加合作用獲得的結(jié)果將2ml水 中的6mg小牛胸腺DNA加入5ml具有不同稀釋度的CSS中，并在室溫 與(+)-BP-7，8-二醇反應(yīng)2小時(終濃度為3. 6pM)。如材料和方法 中概述的，將DNA水解并測量所釋方文的BP-四醇I。
圖3. (a) BP-7，8-二醇通過過氧化氫自由基和細胞色素P450環(huán) 氧化成可以結(jié)合DM的活性種類(反-BPDE和順-BPDE)的立體化學(xué)， 和(b)該研究中測量的DNA至BP-四醇的酸水解。(-)-反-BPDE-dG 和(-)-順-BPDE的水解導(dǎo)致BP-四醇1-2和BP-四醇II-1的形成，然 而，其是不穩(wěn)定的并轉(zhuǎn)化成BP-四醇I-l和BP-四醇11-2。
圖4.使用MFC-7細胞獲得的結(jié)果。用單獨的(+)-BP-7，8-二醇 (0. 2 m M )或在不同稀釋度的CSS存在下用(+) -bp-7， 8-二醇(0. 2 u M) 處理20ml總體積中10x 1(r細胞/l50cm'燒瓶2小時。如材料和方法 中概述的，分離DNA,水解并測量釋放的BP-四醇和測定結(jié)合水平。在 對應(yīng)于分別源自(-)-反-BPDE-dG和(+)-順-BPDE-dG的BP-四醇I和 BP-四醇II的色鐠圖上觀察到兩個截然不同的峰(參考文獻32-34 )。 數(shù)值表示兩個使用3-4次HPLC運行的獨立實驗的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差。圖 4a，上圖，隨著CSS稀釋，(-)-反-BPDE-dG加合物的增加；圖4b，下 圖，隨著CSS的稀釋，1/ (+)-順-BPDE-dG的增加。
圖5.暴露于BP 2. 5 u M或BP 2. 5 n M+CS溶液(稀釋20倍)所 示時間后，MCF-7細胞中的BPDE-dG結(jié)合。在暴露于BP期間的最后2小時加入煙霧溶液(方案1)。如材料和方法中所述的進行BPDE-dG 的分析。數(shù)值表示兩個使用4-6次HPLC運行的獨立實驗的平均值加標(biāo) 準(zhǔn)差。孵育12小時后，BPDE-dG值是11.7士0. 5 (平均值土s.d. ) pg 加合物/mg DM, 18小時和24小時后，分別為17. 6 ± 0. 4， 26. 1 ± 0. 9。 在分別為12、 18和24小時的參照時間后兩小時，CYP自發(fā)代謝將這 些數(shù)值提高至17. 2 ± 0. 5、 27. 8 ± 0. 8和42. 2 ± 1. 0。煙霧溶液(CSS ) 的加入誘導(dǎo)了相同兩小時的過程中更加劇烈的變化，導(dǎo)致在12、 18 和24小時后，各自為36. 9±1.2、 56. 7 ± 0. 9和80. 2 ±1.2 (平均值 ± s. d. ) jug加合物/mg的終BPDE-dG值。
圖6.從標(biāo)準(zhǔn)過濾嘴和含有迷迭香的過濾嘴獲得的暴露于BP 2.5 pM或BP 2. 5 uM+CS溶液后，MCF-7細胞中的BPDE-dG結(jié)合。在暴露 于BP所示時間期間的最后2小時，加入煙霧溶液(方案l)。如材料 和方法中所述的進行BPDE-dG的分析。HPLC運行顯示出在對應(yīng)于源自 (+)-反-BPDE-dG的BP-四醇I的色譜圖上只存在一個峰。數(shù)值表示使 用4-6次HPLC運行的兩個獨立實驗的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差。
方案1.用BP將MCF-7細胞處理12小時和18小時，接著用煙霧 和BP—起再處理2小時(各自為實驗A和B)。該實驗的目的是在不 同時間激活BP以產(chǎn)生BP-7, 8-二醇，此后用煙霧處理細胞并在最后2 小時期間觀察其效果。對照表示只用BP處理過的細胞。
表l.清除劑對無細胞系統(tǒng)中由煙霧引起的BPDE-dG水平的影響
處理相對于標(biāo)準(zhǔn)CS的。/。BPDE-dG
標(biāo)準(zhǔn)CSS100
十超氧化物岐化酶SOD ( 20 in g )16
+過氧化氫酶(4pg)12
十滅活的過氧化氫酶(4 iag)100
迷迭香過濾的CSS替代標(biāo)準(zhǔn)CSS42
標(biāo)準(zhǔn)CSS系統(tǒng)包括2ml小牛胸腺DNA( 3mg/ml )、 600 ja 1 30|aM (+) BP-7， 8-二醇和5ml用pH 7. 4的PBS稀釋(1:19)的CSS，并且在室 溫孵育2小時。每個數(shù)值是從重復(fù)兩次進行的三個單獨的實驗獲得的。在每個重復(fù)兩次的實驗中，平均誤差為約12%。標(biāo)準(zhǔn)的BPDE-dG值是 56 ± 6. 3 (平均值± s. d.)加合物/mg DNA。
5.詳述
煙霧有原因地與很多人癌癥相關(guān)。吸煙是到目前為止暴露于已知 致癌物和由癌癥引起的死亡之間最廣泛的關(guān)聯(lián)，并且因此是了解癌癥 誘導(dǎo)機理的模型。
苯并[a]芘(BP)是存在于排出廢氣、碳烤食品中的高致癌多環(huán)芳 香徑(PAH)，煙霧中少量存在，通常低于10ng/煙。BP是肺癌病原學(xué) 中所涉及的煙霧中60多種致癌物質(zhì)之一。它通過代謝活化成苯并[a] 芘-7,8-二醇-9, 10-環(huán)氧化物(BPDE),其主要在鳥噪呤的N2-位置與 DNA反應(yīng)，主要產(chǎn)生N2-鳥嘌呤損傷，例如，苯并[a]芘-7， 8-二醇-9， 10-環(huán)氧化物-N2-脫氧鳥苷(BPDE-dG)加合物。
已經(jīng)最后確定了人組織中BPDE-DNA加合物的存在，并且BPDE-dG 加合物專門集中在支氣管細胞，并因此參與人肺癌的開始。
這種致癌物質(zhì)通過I期酶代謝成多種代謝產(chǎn)物，包括苯酚、芳烴 氧化物、醌、二氫二醇和二醇環(huán)氧化物。圖1中呈現(xiàn)了導(dǎo)致(+)-反 -BPDE-dG加合物形成的BP代謝途徑的概述。
更詳細地，通過兩輪細胞色素P450介導(dǎo)的氧化，從BP形成了最 終的致癌物質(zhì)(+)-反-BPDE。該氧化的第一個步驟優(yōu)先產(chǎn)生(-)-7， 8-二氫-7， 8-二氫苯并[a]芘[(-)BP-7， 8-二醇]。該二醇進一步主要氧化 成高致突變的(+)-r-7， t-8-二羥基-t-9， IO-氧-7， 8， 9， IO-四氫 -BP [ (+)-反-BPDE]。各種研究已經(jīng)清楚地鑒定出[(+)-反-BPDE]為BP 的主要致癌代謝產(chǎn)物，在體外和體內(nèi)呈現(xiàn)出增強的致突變活性。之前 大多數(shù)關(guān)于肺部致癌物質(zhì)代謝中遺傳變異的研究集中于通過各種細胞 色素P450的代謝激活，盡管這些酶在肺部的表達通常是低的。BP-7，8-二醇通過肺上皮細胞的激活不僅僅是由傳統(tǒng)的CYP/GST依賴性生物轉(zhuǎn) 化過程引起的，而且還涉及CYP以外的幾種代謝途徑。這些包括，月旨 加氧酶、脂質(zhì)-過氧化產(chǎn)物和過氧化物酶依賴性途徑，即C0X-1和C0X-2。
曰益增加的證據(jù)表明煙草自由基在吸煙者肺癌誘導(dǎo)中的病因意 義。每個煙圏形成煙中存在的超過10兆的自由基，這可能引起腫瘤開 始以及促進各種由R0S對細胞大分子的反復(fù)攻擊所致的各種形式的人 癌癥。推斷主要的自由基種類是半醌、氫醌和醌的平衡混合物。表明 這種自由基復(fù)合物引起氧化還原循環(huán)，從分子氧產(chǎn)生超氧化物陰離子 并導(dǎo)致過氧化氫和羥基的形成。這些活性種類造成培養(yǎng)的嚙齒動物和 人細胞的DNA切口和DNA單鏈斷裂。醌相關(guān)的氧化還原循環(huán)也參與這 些作用；認為氫醌和兒茶酚起著主要作用。
發(fā)現(xiàn)了煙霧通過其氧產(chǎn)生的自由基可以激活導(dǎo)致BPDE-dG加合物 形成的BP代謝途徑的第二個步驟，推測是因細胞中形成的 (-)-BP-7， 8-二醇代謝成(+)-r-7, t-8-二羥基-1-9， 10-氧-7， 8， 9， 10-四氫-BP[(+)-反-BPDB](圖1)。
還發(fā)現(xiàn)了這種激活比用CYP方法獲得的至少高兩倍。
此外，發(fā)現(xiàn)了來自煙霧的R0S可能是引起增加的BPDE-dG加合物 形成的部分原因。
還發(fā)現(xiàn)了含有配制的迷迭香粉末的過濾嘴可以顯著降低由于CS 氧產(chǎn)生的自由基引起的BPDE-dG水平，并且該發(fā)現(xiàn)可以用于巻煙過濾 嘴中，其減少支氣管上皮細胞中致癌的BPDE-dG加合物的形成。
本發(fā)明提供了 (i)確定與細胞色素P450相比較煙霧中的R0S對 BP-7， 8-二醇激活的相對作用的手段；(ii )確立煙霧的R0S是否通過 有助于導(dǎo)致關(guān)鍵的肺部BPDE-dG形成增加的BP-7， 8-二醇代謝而促進 致癌過程的手段；(iii )含有能顯著減少BPDE-dG形成的煙自由基清 除劑的過濾嘴；和(iv)所述過濾嘴顯著減少BPDE-dG加合物形成的 用途。
7.實施例
化學(xué)藥品。蛋白酶K ( EC 3. 4. 21. 64 ， 來自白色念球菌 (7W〃racA/脂/to/))購自Sigma (St. Louis， M0) ， RNA酶Tl(EC 3. 1. 21. 3，來自米曲霉(h; e/^2'"i^ or/zae))和RNA酶(無 DNA酶，來自牛胰腺的核糖核酸酶的異源混合物)獲自Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany)。 用于分光鏡檢查的來自E. Merck, Darmstadt, Germany的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS )含有3. OmMKCl、 1. 5mM KH2HP04、 140mMNaCl、 8. 0 mM Na2HP04 ( pH7. 4 ) 、 HPLC-級7K、 MeOH、 醚和乙醇。如果沒有另外指出，其他化學(xué)藥品購自Sigma (L， Isled， Abeau Chesnes， France) 、 Boehringer Ingelheim ( Heidelberg， Germany)和Boehringer Mannheim (Mannheim, Germany)。 所有BP 代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品獲自National Cancer Institute(國家癌癥研究所)， Chemical Carcinogen Rreference Standard Repository Midwest Research Institute (化學(xué)致癌物參照標(biāo)準(zhǔn)品庫中西部研究所) (Kansas City, MO)。
裝置。使用裝備有連接Hewlett-Packard集成器的Shimadzu RF-10AXL熒光檢測儀的Hewlett-Packard高壓等度(isocratic)和 梯度系統(tǒng)(Waldborn， Germany)來進行高性能液相色i脊(HPLC )。
煙霧/PBS溶液(CSS)的制備。根據(jù)Pryor等進行吸煙，沒有使 用Cambridge過濾嘴。使用早前由Nakayama等所述的基本上相同的煙 收集方法。在水泵產(chǎn)生的恒定真空的幫助下，將3. 8分鐘過程中從燃 燒8cm—支煙(Marlboro)產(chǎn)生的煙通過10ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 溶液起泡，該溶液同時捕獲氣相和煙焦油化學(xué)物質(zhì)。因為洗瓶壁上不 存在水不溶性焦油化合物，來自單支香煙煙霧的大部分水溶性化合物 包含于10ml PBS溶液中。在苯并[a]芘或其近似的代謝產(chǎn)物 (+)-BP-7，8-二醇的存在下，將稱為煙霧溶液(CSS)的這種水溶液立 即與外源DNA反應(yīng)或加入培養(yǎng)中的MCF-7細胞中。使用不同稀釋度的 CSS (參見下文)。
將迷迭香粉末狀提取物摻入巻煙過濾嘴中。取下常規(guī)巻煙的過濾 嘴，并將40mg迷迭香粉末狀提取物放置在過濾嘴接近巻煙自身的空位 置中。如此操作之后，將過濾嘴重新裝上。通過質(zhì)譜分析評價該過濾 嘴的作用。簡而言之，將煙霧在含有3，3，5，5-四甲基-l-吡咯啉-N-氧化物(TMP0)的有機溶液中起泡，TMPO是一種自旋捕獲加合物。然后 使用液相色語、質(zhì)諳分析定量羥基自由基加合物的含量。在所用的吸 煙條件下，觀察到羥基自由基減少30%。
在稀釋的煙霧溶液(CSS)存在下，外源DM與(+)-BP-7,8-二醇 的反應(yīng)。將2ml小牛胸腺DNA( 3mg/ml )加入5ml稀釋20倍的CSS中， 并根據(jù)以下的反應(yīng)在室溫與(+)-BP-7，8-二醇(終濃度3.6jnM)反應(yīng)2 小時
DNA+ [ (+) -BP-7, 8-二醇]+CSS —(-)-反-BPDE-N2-dG
測量所得到的(-)-反-BPDE-dG加合物的水平(參見下文)。作為 對照，進行了沒用CSS的實驗。
細胞培養(yǎng)條件和處理。將人乳癌細胞系MCF-7生長于150cm卩細胞 培養(yǎng)燒瓶中的總體積20ml最小必需培養(yǎng)基E-MEM中，該培養(yǎng)基補充了 10%FCS、 15mMHepes緩沖液和抗生素(200單位/ml青霉素、200jug/ml 鏈霉素和25 m g/ml氨千青霉素)。在37。c下在5% 0)2/95%空氣氣氛 中維持和處理細胞。
MCF-7細胞覆蓋燒瓶90。/。的表面積后，(匯合培養(yǎng)物分裂后2-3 天)，用20ml含有10%血清的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。24小時后，用 單獨的DMSO或使用溶解于DMSO中的致癌物質(zhì)(參見下文)和煙霧/PBS (CSS,參見上文)處理接近匯合的細胞，例如，超過90°/。的G0/G1期 細胞。DMSO的終濃度不超過總孵育體積的0. 1%。用單獨的DMSO處理 每個孵育組中包含的對照樣品。
a) ^ r^-"/7-7，《-二辱和肅#^理^^。用單獨的 (+)-BP-7， 8-二醇(0.2 MM)或在不同稀釋度的CSS存在下用 (+)-BP-7， 8-二醇(0. 2 jaM)將細胞處理2小時。通過從CS和細胞CYP， s產(chǎn)生的ROO。激活(+)-BaP-7，8-二醇，分別形成(-)-反-BPDE-dG和 (+)-順-BPDE-dG。通過BP-四醇1-1和BP-四醇II-2的形成測量它們 的水平(參見下文和圖3)。
b )炎y^ W J^j:^驗。為了表征對BP的時間/劑量暴
露和BPDE-dG水平，用含有終濃度為1.25、 2. 5和5. OiaM的培養(yǎng)基將
10細胞(10x 1()6細胞/i50cm2燒瓶，總體積20ml )分別處理6、 12、 18 和24小時(兩個燒瓶/劑量/時間點)。細胞中形成的BPDE-dG加合物 以劑量和時間依賴性方式線性增加，如其他(30)也顯示了?；谒?獲得的結(jié)果，選擇了 2. 5uM作為BP的工作濃度。
c) ^^和屑霧^理脫F-7敘敏。為了觀察CS濃度的作用，使用 不同的CSS稀釋度(1: 79; 1:39; 1:19; 1: 9 vol/vol)進行方案N°l 的實驗A。基于從該實驗I獲得的結(jié)果，選擇了 1: 19 (vol/vol )稀釋 度作為工作CS濃度。因此，根據(jù)方案1 (參見圖6-方案1)，用BP
(2. 5 ju M)和CSS (稀釋度1: 19 vol/vol )處理細胞(參見上文的"細 胞培養(yǎng)和處理，，)。
所有孵育組使用一式兩份的樣品重復(fù)2-3次。在處理結(jié)束時，通 過顯微鏡檢查細胞的形態(tài)學(xué)變化，然后使用0. 05。/。胰蛋白酶-EDTA
(0. 05%胰蛋白酶、0. 14MNaCl、 3mMKCl、 0. lMNa2HP04、 1.5mMK2HP04、 0. 5mM EDTA)通過胰蛋白酶作用來收集。加入等體積的含有10°/。FCS 的培養(yǎng)基后，將細胞在1000g離心，用PBS洗滌三次，然后將細胞沉 淀冷凍儲存在-20X:。在收集時通過錐蟲藍排除測定法測定了用BP和 煙霧或(+)-BP-7，8-二醇和煙霧處理的細胞的存活力大概為90%。所用 的劑量沒有顯示出任何細胞毒性，如通過乳酸脫氫酶活性測定法所測 量的(ELISA試劑盒,Boehringer， Mannheim)。
DNA制備和水解。用RNA酶、蛋白酶K、鹽化程序(31 )和氯仿處 理進行MCF-7細胞沉淀的DNA分離。簡而言之，將細胞沉淀重懸浮于 EDTA-十二烷基硫酸鈉(SDS )緩沖液中[lOmMTris緩沖液、lmM Na2EDTA、 1%SDS (w/v) ， pH8]，在37。C用RNA酶Tl ( 2000 U/ml )和RM酶A
(無DM酶；100nig/ml )在搖床上(100rpm)孵育1小時。然后加入 蛋白酶K( 300jug/ml )，并在37。C繼續(xù)孵育過夜。消化后，將6MNaCl 加入至1M的終濃度，接著在10000g離心。用2體積的乙醇將上清液 中的DM沉淀，用70%、 100%的乙醇、醚洗滌，千燥并溶解于10mMTris 緩沖液中。再次，加入RNA酶A (100jLtg/ml)和RNA酶Tl( 2000 U/ml )， 將溶液在37。C孵育1小時，接著加入蛋白酶K (100jjg/ml)，在37'C再孵育2小時。用氯仿將溶液提取一次，離心，并用1MNaCl制得 溶液。用2體積的冷乙醇將DM沉淀。
用100%乙醇沖洗待水解的DNA部分，以除去未結(jié)合的BP-四醇。 將無未結(jié)合BP-四醇的DNA溶解于水中，并通過A26。一測定DNA濃度。 通過Aw。/A環(huán)和a26。/A，的比例來確定純度。將用于分析的一定含量的 DM水解，如之前所述的，在終濃度0.1N HC1中在90。C孵育4小時。 這從BPDE-DNA加合物中釋放出四醇(圖3)，具有>90°/。的回收率。用 于注射的水解產(chǎn)物的體積為700 jj 1,含有5-10ug DNA。
BPDE-N2-dG加合物水平的測定。按照之前所述的[32, 33]通過 HPLC-FD測定加合物水平，使用r-7， c-9， t-8， t-10-四羥基-7， 8， 9， IO-四氫苯并[a]芘(BP-四醇II-l)作為內(nèi)標(biāo)[34]。將水解產(chǎn)物裝載于 Latex頂柱模塊(HD-Germany)上，該模塊含有5 |a m用10% MeOH平 衡的Cu反相材料(Nucleosil 100)，并用12ml 10% MeOH洗滌20 分鐘。隨后，通過Valco Instruments開關(guān)閥將頂柱打開，以流過4. 6mm x 25cm 5jimC8反相材料(Nucleosil 100)分析柱(Alltech GmbH, Unterhaching， Germany)。用以下Me0H/H20梯度洗脫由水解獲得的 產(chǎn)物50%， 0-17分鐘;50至60%, 17-32分鐘；60%， 32-42分鐘； 60至100%， 42-57分鐘。BP四醇的停留時間為BP四醇I-l(反-反 -BP四醇)(35. 2分鐘)；BP-四醇II-l (反-順-BP-四醇)，內(nèi)標(biāo)(36.9 分鐘)；BP四醇II-2 (順-順-BP-四醇)(42.3分鐘)。在344nra 的激發(fā)波長和398nm的發(fā)射波長測定熒光。因為在分開的MCF-7樣品 分析中沒有檢測到BP四醇II-2的形成，因此使用其作為內(nèi)標(biāo)(每個 HPLC運行加入2pg)，用于確定相對停留時間。檢測極限是O. 5pgBP 四醇1-1和BP-四醇II-l。通過從就在分析MCF-7樣品之前分析的可 信BP-四醇標(biāo)準(zhǔn)品的焚光峰面積產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定每種BP-四醇 的水平。(+)-反-BPDE-DNA加合物水解后，產(chǎn)生BP-四醇-I-l。(-)-反-BPDE-dG的水解導(dǎo)致BP-四醇1-2的形成，然而，這是不穩(wěn)定的， 并且轉(zhuǎn)變成BP-四醇I-1 (圖3) (38)。因此，通過HPLC運行中發(fā) 現(xiàn)的BP-四醇1-1定量來測量所形成的(-)-反-BPDE-dG的水平?；贐PDE與DNA反應(yīng)主要產(chǎn)生BPDE-N2-dG的發(fā)現(xiàn)(7 )，推定BP-四醇-I-l 水平對應(yīng)于BPDE-N2-dG的水平。 一式兩份地定量結(jié)合MCF-7 DNA的 BPDE水平。從等式lpmol/mg DNA/3. 125=1加合物/106核苷酸計算加 合物水平。HPLC運行是定量可再現(xiàn)的，并且兩個測試之間的可變性低 于5%。
通過BP誘變的機理已經(jīng)得到了充分確定，并用作"分子標(biāo)記"來 建立腫瘤發(fā)展中特定遺傳事件和致癌物質(zhì)暴露之間的因果性("確鑿 證據(jù)")。"BP分子標(biāo)記"對于確定煙霧是人肺癌的誘因，以及對于 確立最小化煙霧的特定策略或引入預(yù)防性方法具有顯著意義。癌癥化 療中所用的特定藥劑似乎是通過抑制致癌物質(zhì)對DNA的損傷、突變發(fā) 生、胂瘤助長和/或腫瘤進展來起作用的。
已經(jīng)研究了 CS對BP-7，8-二醇生物轉(zhuǎn)化成能夠在人細胞中形成穩(wěn) 定DM加合物的相對作用。各種研究已經(jīng)證明了穩(wěn)定的PAH-DNA加合 物可以通過核苷酸的錯誤結(jié)合或刪除導(dǎo)致突變。CS是同時含有有機和 無機化合物的復(fù)雜化學(xué)混合物的氣霧劑，迄今為止已經(jīng)鑒定了其中有 4800種化合物。已知煙霧的汽相和顆粒相都具有自由基。而氣相自由 基通常是短壽的，顆粒相中的自由基相對穩(wěn)定的，并且由氫醌、半醌、 醌復(fù)合物組成，該復(fù)合物是活性氧化還原體系，能夠?qū)⒎肿友踹€原產(chǎn) 生過氧化物，最終形成過氧化氫和羥基。此外，至少60種不同的CS 致癌物質(zhì)參與腫瘤開始和助長；CS中所含的最有效力的致癌物質(zhì)是BP 和NNK (4-(甲基硝基氨)-1-(3-吡啶)-1-丁酮)。
煙霧對(+)-反-BPDE-dG的作用，使用伴隨DNA加合的無細胞系統(tǒng)。 為了說明BPDE-dG形成的機理依賴于煙霧所產(chǎn)生的活性氧，在伴隨DN A 加合的體外無細胞體統(tǒng)中尋找這種加合物。在(+) -BP-7，8-二醇的存在 下，將含有氣相和煙霧焦油的CSS溶液與DNA立即反應(yīng)(參見以上的 方案)。從該實驗的結(jié)果表明CS可以將(+)-BP-7，8-二醇氧化成(-)-反-BPDE ，其隨后形成(-)-反-BPDE-dG加合物。(-)-反-BPDE-dG的含 量線性增加，并且是劑量依賴性的(參見圖2)。
之前發(fā)現(xiàn)了將煙霧捕獲在PBS中后，從煙霧產(chǎn)生了大量活性氧，
13如&02和0「。這種從煙霧產(chǎn)生的活性氧可能引起了所觀察到的(-)-反 -BPDE-dG的形成。為了證實這一點，檢查了過氧化氬酶和超氧化物岐 化酶(S0D)對所產(chǎn)生的(-)-反-BPDE-dG的作用，并發(fā)現(xiàn)了兩種酶都 抑制加合物的形成。失活的過氧化氫酶顯示出沒有作用(表1)。從 這些結(jié)果推斷出煙霧可以氧化(+)-BP-7，8 二醇，因此形成(-)-反 -BPDE-dG，并且大體上可以通過從煙霧產(chǎn)生的氧的作用來解釋這種活 性。
煙霧對用(+)-BP-7，8-二醇處理的MCF-7細胞中形成的(-)-反 -BPDE-dG加合物的作用。已經(jīng)表明有兩條獨立的途徑參與BP-7，8-二 醇代謝成BPDE(圖3)。 (+)-對映異構(gòu)體的細胞色素P450依賴性代謝 優(yōu)先形成(+)-順-BPDE,而涉及含血紅素蛋白的途徑連同過氧化物(例 如，脂質(zhì)過氧化物)優(yōu)先形成(-)-反-BPDE。另一方面，(-)-BP-7，8-二醇可以通過這兩條途徑代謝，并導(dǎo)致(+)-反-BPDE和(-)-順-BPDE 的形成，(+)-反-BPDE是BP的最終形式?？梢酝ㄟ^HPLC分析區(qū)分不 同的途徑，因為在本發(fā)明的條件下，能清楚地分開分別從反-和順-BPDE 產(chǎn)生的四醇。
為了研究導(dǎo)致(-)-反-BPDE形成的(+)-BP-7，8-二醇的煙霧依賴 性環(huán)氧化的更多作用，使用了人乳房細胞系MCF-7,(-)-反BPDE與DNA 形成(-)-反-BPDE-dG加合物。使用MCF-7細胞來觀察煙霧ROS對 (+)-BP-7， 8 二醇激活的作用的原因是這些細胞具有很低的過氧化物 酶活性。用(+)-BP-7，8-二醇處理細胞，(+)-BP-7，8-二醇是可以區(qū)分 由ROS和CYP依賴性途徑形成的加合物的立體化學(xué)探針(圖3)。在 對應(yīng)于分別源自(-)-反-BPDE-dG和(+)-順-BPDE-dG的BP-四醇I和 BP-四醇II的色鐠圖上觀察到截然不同的峰(參考文獻32-34 )。煙 霧線性和劑量依賴性地增加了 (-)-反-BPDE-dG的ROS依賴性形成(圖 4a)并減少了 (+)-順-BPDE-dG加合物的CYP依賴性形成，通過BP-四 醇II的形成來測量。這種減少也是劑量依賴性的，并且DNA加合物的 倒數(shù)隨著煙霧濃度線性增加(4b ) 。 CS對(+)-順-BPDE-dG的CYP依賴 性形成的抑制作用和增加的(-)-反-BPDE-dG加合物形成進一步證實從煙霧產(chǎn)生的氧在(-)-反-BPDE-dG加合物形成中的作用。
其他研究表明所誘導(dǎo)的CYP活性受到氧化攻擊的削弱。作為這種 現(xiàn)象的基礎(chǔ)的機理是細胞色素P4501A1基因的下調(diào)。幾乎沒有過氧化 物酶活性可能致使處于"應(yīng)激"條件下的MCF細胞具有提高的DNA損 傷和降低的修復(fù)能力。因此，這可能引起與BP-7,8-二醇激活無關(guān)的 BPDE-DNA加合物的增加。
煙霧對用BP處理的細胞中形成的BPDE-dG加合物的作用。之前使 用MCF-7細胞培養(yǎng)物的研究揭示這些細胞具有可誘導(dǎo)的P4501B1和 P4501A1活性。P450催化的BP代謝回轉(zhuǎn)的存在和MCF-7細胞中可檢測 過氧化物酶活性的不存在，使得可以評價煙霧氧自由基對人細胞培養(yǎng) 物中的BP激活的作用。MCF-7細胞具有高CYP1A1酶活性，用于BP的 代謝激活，導(dǎo)致(-)-BP-7，8-二醇的形成，隨后導(dǎo)致(+)-反BPDE-dG 的形成(圖1 ) 。 6小時時，加合物形成的水平顯著低于暴露12小時 和24小時后觀察到的。用2. 5 pMBP處理6小時后，大約形成2000pg 加合物/mg DNA，而在12小時和24小時后，分別存在超過11000pg 和超過20000pg力口合物/mgDNA (Wilcoxon Rank Sum Test,獲得 p-0. 0022 )。
用BP將細胞處理12和18小時，以i秀導(dǎo)(-)-BP-7，8二醇的形成， 這是ROS的底物。對(-)-BP-7，8-二醇的優(yōu)先形成的間接確認是HPLC 運行時不存在源自順-BPDE的BP-四醇II，其前體物質(zhì)是(+)-BP-7,8-二醇(圖3)。然后將細胞暴露于煙霧的CSS和BP下2小時。HPLC 運行顯示對應(yīng)于源自(+)-反-BPDE-dG的色謙圖上只存在一個峰。圖5 中呈現(xiàn)了用CSS處理的細胞和那些未處理的(對照)之間的差異。如 上所述，該研究所用的細胞系在由CS引起的氧化攻擊后維持降低 CYP1A1表達的能力。細胞色素P450的抑制可能減少了 BP活化成 (-)-BP-7，8二醇和(+)-反-BPDE。因此，由CS引起的提高的差異是由 于從CS產(chǎn)生的ROS引起的提高的(-)-BaP-7，8-二醇代謝所引起的。對 于用CS與對照處理14小時和20小時，Wilcoxon Rank Sum Test分 別獲得p-0. 0022。最近，由DNA的BP引起的劇烈損傷發(fā)生在形成BPDE-dG加合物的人支氣管上皮細胞中，認為該加合物對于人支氣管 上皮細胞肺癌的開始是"關(guān)鍵的"。因此，煙霧中產(chǎn)生的活性氧物質(zhì) 在支氣管細胞中的這種"關(guān)鍵"加合物的形成中起著重要作用(圖1)。 含有迷迭香提取物的過濾嘴對BPDE-dG加合物形成的作用。由于 其理想的香味和高抗氧化活性，迷迭香(^^邁aW/2i/s o/Y7c/i3a//s "6/a"e)草和油通常用作食品加工中的香料和調(diào)味劑。迷迭香提取 物、鼠尾草酚或熊果酸對小鼠皮膚的局部應(yīng)用抑制了苯并[a]芘與上皮 DNA的共價結(jié)合、由7，12-二甲基苯并蒽(DMBA)引起的腫瘤開始、TPA
誘導(dǎo)的腫瘤助長、鳥氨酸脫羧酶活性和炎癥。迷迭香提取物、鼠尾草 酸和鼠尾草酚強烈抑制I期酶、CYP450活性并誘導(dǎo)II期酶、谷胱甘
肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和醌還原酶活性的表達。鼠尾草酚抑制激活的巨
噬細胞中一氧化氮(N0)產(chǎn)生。已經(jīng)將抗氧化特性稱為保護性作用的
機械論基礎(chǔ)。
為了除去煙霧中的自由基和活性氧種類，將少量迷迭香粉末摻入 標(biāo)準(zhǔn)過濾嘴中(參見材料)。通過摻入迷迭香提取物的過濾嘴誘導(dǎo)的 濃縮物中自由基的減少通過CSS的羥基含量的定量來估算由摻入迷迭 香提取物的過濾嘴所誘導(dǎo)的濃縮物中自由基的減少，使用旋轉(zhuǎn)捕獲 (TMP0)，使用LC-ESI-MS/MS。在所用的吸煙條件下，觀察到羥基30% 的減少。由于這種過濾嘴降低煙霧中自由基水平的效率，如與相當(dāng)?shù)?不含添加劑的標(biāo)準(zhǔn)Marlboro過濾嘴相比，使用MCF-7細胞比較了通過 這種過濾嘴與標(biāo)準(zhǔn)過濾嘴的CS對BPDE-dG形成的作用。
用BP處理MCF-7細胞時，獲得了圖6中呈現(xiàn)的結(jié)果。進行了兩組 實驗(A和B)。用BP將細胞分別處理12和18小時，接著用來自兩 種過濾嘴的CSS和BP —起再處理2小時(方案1 )。為了評價這最后 2小時過程中，加合物的CYP依賴性增加，每組進行了兩個對照A 組為12和14小時，B組為18和20小時。來自標(biāo)準(zhǔn)過濾嘴的CSS使 14和20小時時獲得的結(jié)合水平加倍。
然而，迷迭香過濾嘴強烈地阻止由標(biāo)準(zhǔn)過濾嘴獲得的增加，在這 兩個組中超過70% (圖6)。改良的過濾嘴清除了 ROS并隨后減少了(-)-BP-7，8-二醇的活化(圖3)。除了自由基的減少，迷迭香粉還具 有減少BPDE-dG形成的其他機理。
使用完整的迷迭香提取物(6jag.mr1)與1.5|aM BP共同孵育6 小時后，還將人支氣管上皮細胞中的CYP1A1活性和DNA加合物形成抑 制了 80%(BEAS-2B)。因此，使用減少自由基的量以減少關(guān)鍵致癌加 合物的形成的過濾嘴對于成癮的吸煙者是重要的益處。
因此，本發(fā)明的迷迭香巻煙過濾嘴對于目的在于減少支氣管上皮 細胞中的BPDE-dG的化學(xué)預(yù)防性計劃是一種具有前景的候選物。
應(yīng)理解本發(fā)明的以上描述易于受到各種改進、改變和變化，并且 這些意欲包括在所附權(quán)利要求的等價含義和范圍之內(nèi)。例如，最明顯 的改進是使用各種凝膠材料作為物質(zhì)的電響應(yīng)組合物。
因此，將看到能有效達到以上所列的從之前的描述變得清楚的目 的，因為可以在實施上述方法(過程)中進行某些改變，而不脫離本 發(fā)明的精神和范圍，以上描述中所含的所有物質(zhì)都將被解釋為說明性 的，而非是限制意義的。
還應(yīng)理解以下的權(quán)利要求旨在涵蓋在此所述的本發(fā)明的所有一般 的和特定的特征和按照表述可被認為落入其間的本發(fā)明范圍的所有陳 述。
權(quán)利要求
1.通過抽吸帶有過濾嘴的卷煙來減少人肺部的來自所產(chǎn)生的煙霧的苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG(BPDE-dG)加合物的方法，所述方法包括使煙霧通過過濾嘴的步驟，其中所述過濾嘴用唇形科(Labiatae)植物的提取物浸漬過，其中所述提取物包括多酚化合物或其衍生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述植物是迷迭香。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過用醇溶劑或水醇溶劑提取來 產(chǎn)生提取物。
4. 通過抽吸帶有過濾嘴的巻煙來減少人肺部的來自所產(chǎn)生的煙霧 的苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG (BPDE-dG)加合物的方法，所述方法包 括使煙霧通過過濾嘴的步驟，其中所述過濾嘴用含有至少 一種多酚化合 物或其衍生物的混合物浸漬過。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述混合物包含至少一種選自鼠 尾草酚、迷迭香酚、迷迭香酸和鼠尾草酸的多酚化合物或其衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述混合物包含鼠尾草酚、鼠尾 草酸、迷迭香酸和迷迭香酚。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述混合物包含鼠尾草酸或鼠尾 草酚。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述過濾嘴包含0. 5g至0. lmg的 至少一種多酚化合物或其衍生物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述過濾嘴包含0. Olg的至少一 種多酚化合物或其衍生物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中將所述至少一種多酚或其衍生物 與聚合載體偶聯(lián)或置于微膠嚢基質(zhì)中或加入到過濾嘴的纖維中。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有迷迭香提取物的卷煙過濾嘴和減少由煙霧中的各種有害物質(zhì)引起的DNA損傷。更具體地，本發(fā)明涉及使用所述過濾嘴通過減少人肺部苯并[a]芘二醇環(huán)氧化物-dG(BPDE-dG)加合物來減少人細胞中由苯并[a]芘引起的DNA損傷。
文檔編號A24D3/06GK101641023SQ200680056513
公開日2010年2月3日 申請日期2006年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月17日
發(fā)明者I·埃瑪米 申請人:生物合成技術(shù)公司