一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)動物模型飼料技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種用于制備酒精性肝病動物模型的鼠飼料。該鼠飼料由酪蛋白、L?胱氨酸、DL?蛋氨酸、麥芽糊精、膳食纖維素、黃原膠、重酒石酸膽堿、礦物質(zhì)預(yù)混料、維生素預(yù)混料、膽固醇、膽酸鈉、魚油、酒精和水配制而成。將該鼠飼料用于制備動物酒精性肝病模型，可逐步造成小鼠酒精性脂肪肝、肝炎和肝纖維化，此模型與人類患病特征相似，病變有一定的發(fā)展過程，造模方法簡便易行，成功率高、死亡率低、重復(fù)性好，應(yīng)用前景廣闊。
【專利說明】
一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)動物模型飼料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備酒精性肝病動物 模型的飼料。
【背景技術(shù)】
[0002] 酒精性肝病是長期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病，其初期表現(xiàn)為酒精性脂肪肝，進(jìn)而 發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化甚至是肝癌，最終無法治愈。酒精性肝病在西方國家是最常見 的肝病，在我國隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展其發(fā)病率有增多的趨勢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并給家 庭和社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，現(xiàn)有治療酒精性肝病的 藥物很少。研究一種有效治療酒精性肝病的藥物迫在眉睫，篩選藥物依賴于動物模型。但 是建立穩(wěn)定的、形成時(shí)間短、形成率高的酒精性肝纖維化動物模型仍是臨床研究和實(shí)驗(yàn)研 究的難點(diǎn)。
[0003] 目前臨床上和實(shí)驗(yàn)上研究酒精性肝病使用的動物模型多采用Lieber-DeCarli酒 精液體飼料模型、Tsukaoto-French模型和Tipoe-Nanji酒精液體飼料模型（酒精性肝病 動物模型的研究進(jìn)展.安徽醫(yī)藥.2010, 14 (7) : 745-748)。這三種模型雖然很經(jīng)典但是仍有 一些不足。
[0004] 首先是Lieber-DeCarli酒精液體飼料模型一般只能造成酒精性脂肪肝，而無法 形成更為嚴(yán)重的肝炎和纖維化。Tsukaoto-French模型是通過在動物胃內(nèi)置入塑料導(dǎo)管，管 周荷包縫合，導(dǎo)管經(jīng)皮下隧道引至頸后，破皮引出，縫合固定導(dǎo)管（Mouse model ofchronic and binge ethanol feeding(the NIAAA model). Nature Protocols. 2013, 8(3):627-37)〇 雖然可以成功地建造酒精性肝炎和肝纖維化的模型，但是不符合臨床酒精性肝病病人的飲 酒方式，而且造模時(shí)間長，造模手術(shù)復(fù)雜，手術(shù)成功率低，動物死亡率高。Tipoe-Nanji酒精 液體飼料以魚油為主要脂肪，小鼠自由飲食，建立的雌性動物模型不僅有脂肪肝，還會伴有 炎癥和壞死甚至是輕度的肝纖維化，但是在雄性動物模型中無法形成纖維化。而研究酒精 性肝病最好用雄性動物，因?yàn)槟行孕锞普咭h(yuǎn)多于女性，男性酒精性肝病患者要遠(yuǎn)多于女 性，所以雄性動物更能模擬現(xiàn)實(shí)情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有動物模型中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備酒精性肝 病動物模型的飼料。
[0006] 本發(fā)明將酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、麥芽糊精、膳食纖維素、黃原膠、重酒石 酸膽堿、礦物質(zhì)混合物、維生素混合物、膽固醇、膽酸鈉、魚油和酒精配制形成一種液體飼 料，動物自由飲食此種鼠飼料加上5-7天一次的大劑量酒精灌胃，成功制備了酒精性肝病 模型，包括脂肪化、肝炎和肝纖維化模型。本發(fā)明將滿足臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究酒精性肝病的 需要，預(yù)計(jì)會有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
[0007] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，為淺黃色液體，由酪蛋白、L-胱氨酸、 DL-蛋氨酸、膳食纖維素、黃原膠、重酒石酸膽堿、礦物質(zhì)預(yù)混料、維生素預(yù)混料、膽固醇、膽 酸鈉、麥芽糊精、魚油、酒精和水組成。
[0009] 進(jìn)一步，一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，每1L所述飼料組成如下：
[0010] 酪蛋白41.4克；
[0011] L-胱氨酸0.5克；
[0012] DL-蛋氨酸 0.3 克；
[0013] 膳食纖維素10克；
[0014] 黃原膠3.0克；
[0015] 重酒石酸膽堿0· 53克；
[0016] 礦物質(zhì)預(yù)混料8. 75克；
[0017] 維生素預(yù)混料2. 5克；
[0018] 膽固醇2.0克；
[0019] 膽酸鈉0.2克；
[0020] 麥芽糊精 12. 8-25. 6 克；
[0021] 魚油 30-40 克；
[0022] 酒精25-50克（酒精以乙醇計(jì)量，酒精的具體形式為白酒）；
[0023] 余量為水。
[0024] 更進(jìn)一步，一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，每1L所述飼料組成如下：
[0025] 酪蛋白41.4克；
[0026] L-胱氨酸0· 5克；
[0027] DL-蛋氨酸 0· 3 克；
[0028] 膳食纖維素10克；
[0029] 黃原膠3. 0克；
[0030] 重酒石酸膽堿0· 53克；
[0031] 礦物質(zhì)預(yù)混料8. 75克；
[0032] 維生素預(yù)混料2. 5克；
[0033] 膽固醇2.0克；
[0034] 膽酸鈉0· 2克；
[0035] 麥芽糊精25. 6克；
[0036] 魚油36克；
[0037] 酒精50克（酒精以乙醇計(jì)量，酒精的具體形式為白酒）；
[0038] 余量為水。
[0039] 上述各配方的用于制備酒精性肝病動物模型的飼料的制備方法，步驟如下：
[0040] 1)將酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、膳食纖維素、黃原膠、重酒石酸膽堿、礦物質(zhì) 預(yù)混料、維生素預(yù)混料、膽固醇和膽酸鈉加入容器中，然后加入水，攪拌均勻，得混合物A ;
[0041] 2)再將麥芽糊精加入另一容器中，然后加入水，攪拌均勻后加入到混合物A中，攪 拌均勻，瓶裝后密封，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0042] 3)將魚油和酒精加入到步驟2)的瓶中，攪拌均勻得用于制備酒精性肝病動物模 型的飼料，其外觀為淺黃色液體。
[0043] 本發(fā)明的用于制備酒精性肝病動物模型的飼料優(yōu)選作為鼠飼料，用于制備酒精性 肝病模型鼠。
[0044] 本發(fā)明還提供了一種制備酒精性肝病動物模型的方法，包括以下步驟：
[0045] 1)模型制備過程中，動物每天自由飲食所述飼料；2)喂養(yǎng)第二周開始每5-7天灌 胃酒精一次，起始灌胃劑量為4g/kg，以后每1-2周逐級增加為5g/kg、6g/kg、7g/kg、8g/kg， 最后灌胃劑量穩(wěn)定在8g/kg。
[0046] 其中，酒精的灌胃劑量都是以乙醇來計(jì)量。
[0047] 在模型制備中，H&E染色發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)第五周小鼠肝組織脂質(zhì)空泡較多，脂質(zhì)蓄積嚴(yán) 重，并且隨著周數(shù)增加肝組織脂質(zhì)蓄積越嚴(yán)重；Masson染色發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)第八周小鼠肝組織 開始出現(xiàn)肝炎和纖維化現(xiàn)象。因此，本發(fā)明的飼料所制備的酒精性肝病動物模型符合臨床 上的酒精性肝病病人的飲酒方式，與其癥狀和發(fā)展過程相似程度很高。
[0048] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0049] 1、運(yùn)用了雄性小鼠成功建造酒精性肝病模型，且可使酒精性肝病有一定的發(fā)展過 程，使動物模型的臨床癥狀和病理學(xué)改變更接近真實(shí)的酒精性肝病。
[0050] 2、所述鼠飼料的制備方法操作簡單，便于推廣應(yīng)用。
[0051] 3、利用所述飼料制備酒精性肝病動物模型，簡單易行，安全，穩(wěn)定性好，造模成功 率高，建模時(shí)間短，對動物傷害很小，且癥狀高度符合臨床酒精性肝病的癥狀；
[0052] 4、通過本發(fā)明的鼠飼料建立的酒精性肝病動物模型，可以用來研究酒精性肝病的 發(fā)病過程和機(jī)制，篩選治療酒精性肝病的藥物，探索藥物的作用機(jī)理，具有十分重要的意 義。
【附圖說明】
[0053] 圖1為經(jīng)H&E染色發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織病理學(xué)上的變化圖。
[0054] 圖2為經(jīng)Masson染色發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟組織病理學(xué)上的變化圖。
[0055] H&E染色結(jié)果
[0056] HE染色20x，圖中標(biāo)尺的長度為100 μ m。A、B、C、D和E分別表示配對喂養(yǎng)組、模 型組第4、7、8、13次灌胃后肝臟組織切片染色圖。酒精模型組肝臟可見肝細(xì)胞脂肪化（▲， 脂肪空泡）、肝細(xì)胞壞死（，細(xì)胞核溶解）和炎癥病灶（C:> ) ?
[0057] Masson染色結(jié)果
[0058] Masson染色20x，圖中標(biāo)尺的長度為100μπι。A、B、C、D和E分別表示配對喂養(yǎng)組、 模型組第4、7、8、13次灌胃后肝臟組織切片染色圖。酒精模型組肝臟可見纖維化（一，纖維 化）。
【具體實(shí)施方式】
[0059] 下面
【申請人】將結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)理 解，以下內(nèi)容不應(yīng)以任何方式解釋為對本發(fā)明權(quán)利要求書請求保護(hù)范圍的限制。以下實(shí)施 例中所用原料均可以從市場上購得。
[0060] 實(shí)施例1
[0061] 一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，以制備1L所述飼料為例，其制備方法 如下：
[0062] 1)將酪蛋白41. 4克、L-胱氨酸0. 5克、DL-蛋氨酸0. 3克、膳食纖維素10克、黃原 膠3. 0克、重酒石酸膽堿0. 53克、礦物質(zhì)預(yù)混料8. 75克、維生素預(yù)混料2. 5克、膽固醇2. 0 克和膽酸鈉0. 2克加入容器中，然后加入適量的水，攪拌均勻，得混合物A ;
[0063] 2)再將麥芽糊精12. 8-25. 6克加入另一容器中，然后加入適量的水，攪拌均勻后 加入到混合物A中，攪拌均勻，瓶裝后密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0064] 3)將30-40克魚油和25-50克酒精（酒精以乙醇計(jì)量，酒精的具體形式為白酒） 加入到步驟2)的瓶中，攪拌均勻得1L用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，其外觀為淺黃 色液體。
[0065] 實(shí)施例2
[0066] 一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，以制備1L所述飼料為例，其制備方法 如下：
[0067] 1)將酪蛋白41. 4克、L-胱氨酸0· 5克、DL-蛋氨酸0· 3克、膳食纖維素（羅蓋特 水溶性膳食纖維，法國羅蓋特）10克、黃原膠3. 0克、重酒石酸膽堿0. 53克、礦物質(zhì)預(yù)混 料（Dyets. Inc#210011) 8. 75 克、維生素預(yù)混料（Dyets. Inc#310011) (http: //dyets. com/ vitamin-mixes/) 2. 5克、膽固醇2. 0克和膽酸鈉0. 2克加入容器中，然后加入適量的水，攪 拌均勻，得混合物A ;
[0068] 2)再將麥芽糊精25. 6克加入另一容器中，然后加入適量的水，攪拌均勻后加入到 混合物A中，攪拌均勻，瓶裝后密封，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0069] 3)將 36g 魚油（DSM#MEG-3,含 12% -13% DHA 和 18% -20% EPA) ;113· 2ml 56。 紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司）加入到上述飼料中，攪拌均勻即得，其外觀為淺黃色 液體，體積為1L。
[0070] 本實(shí)施例中所用25. 6克麥芽糊精和50克酒精熱量等量于115. 2克麥芽糊精；黃 原膠作為飼料中的增稠劑、懸浮劑和乳化劑。
[0071] 實(shí)施例3制備酒精性肝病動物模型
[0072] 雄性昆明小鼠，分為2組：模型組15只昆明小鼠和其配對喂養(yǎng)組6只昆明小鼠。 每只小鼠單籠飼養(yǎng)，每天自由飲食實(shí)施例2制備的飼料。配對喂養(yǎng)組鼠飼料為麥芽糊精代 替上述飼料中的酒精配制而成。喂養(yǎng)第二周開始，模型組每5-7天灌胃酒精一次（56°紅 星二鍋頭，北京紅星股份有限公司監(jiān)制），起始灌胃劑量為4g/kg，以后每次逐級增加為5g/ kg、6g/kg、6g/kg。第四次灌胃后，選取一只動物取肝臟，經(jīng)過10%福爾馬林固定，H&E染色 和Masson染色后，進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀察。
[0073] 其中，酒精的灌胃劑量都是以乙醇來計(jì)量，以下實(shí)施例同。
[0074] 模型組小鼠肝臟病理組織形態(tài)學(xué)可見大量肝細(xì)胞壞死（細(xì)胞核溶解）和脂肪化 (脂肪空泡）（結(jié)果見圖1B、2B)，但尚未形成纖維化。
[0075] 實(shí)施例4制備酒精性脂肪肝病動物模型
[0076] 在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，雄性昆明小鼠，分為2組：模型組14只動物和 其配對喂養(yǎng)組6只昆明小鼠。每只小鼠單籠飼養(yǎng)，每天自由飲食實(shí)施例2制備的鼠飼料。配 對喂養(yǎng)組鼠飼料為麥芽糊精代替上述飼料中的酒精配制而成。喂養(yǎng)第二周開始，模型組每 5-7天灌胃酒精一次（56 °紅星二鍋頭，北京紅星股份有限公司監(jiān)制），起始灌胃劑量為4g/ kg，以后每次逐級增加為5g/kg、6g/kg、6g/kg、7g/kg、7g/kg、8g/kg。第七次灌胃后，選取一 只動物取肝臟，經(jīng)過10%福爾馬林固定，H&E染色和Masson染色后，進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀 察。
[0077] 模型組小鼠在第七次灌胃后肝臟病理組織形態(tài)學(xué)可見大量肝細(xì)胞壞死（細(xì)胞核 溶解）和脂肪化（脂肪空泡）（圖1C)，程度比實(shí)施例3中的嚴(yán)重。Masson染色可見纖維化 病灶（圖2C)。
[0078] 實(shí)施例5制備酒精性纖維化肝病動物模型
[0079] 在實(shí)施例4的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，雄性昆明小鼠，分為2組：模型組13只昆明小 鼠和其配對喂養(yǎng)組6只昆明小鼠。每只小鼠單籠飼養(yǎng)，每天自由飲食實(shí)施例2制備的鼠飼 料。配對喂養(yǎng)組鼠飼料為麥芽糊精代替上述飼料中的酒精配制而成。喂養(yǎng)第二周開始，模 型組每5-7天灌胃酒精一次（56°紅星二鍋頭，北京紅星股份有限公司監(jiān)制），起始灌胃劑 量為4g/kg，以后每次逐級增加為5〖/1^、6〖/1^、6〖/1^、7〖/1^、7〖/1^、8〖/1^，最后灌胃劑量 穩(wěn)定在8g/kg。第八次灌胃后，選取兩只動物取肝臟，經(jīng)過10%福爾馬林固定，H&E染色和 Masson染色后，進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀察。
[0080] 模型組小鼠在第八次灌胃后肝臟病理組織形態(tài)學(xué)可見大量肝細(xì)胞壞死（細(xì)胞核 溶解）和脂肪化（脂肪空泡）（圖1D)，其程度比實(shí)施例3中的嚴(yán)重，和實(shí)施例4相當(dāng)。Masson 染色可見纖維化病灶（圖2D)，其程度和實(shí)施例4相當(dāng)。
[0081] 實(shí)施例6制備酒精性纖維化肝病動物模型：
[0082] 在實(shí)施例5的基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)，雄性昆明小鼠，分為2組：模型組8只昆明小 鼠和其配對喂養(yǎng)組6只昆明小鼠。每只小鼠單籠飼養(yǎng)，每天自由飲食實(shí)施例2制備的鼠飼 料。配對喂養(yǎng)組鼠飼料為麥芽糊精代替上述飼料中的酒精配制而成。喂養(yǎng)第二周開始，模 型組每5-7天灌胃酒精一次（56°紅星二鍋頭，北京紅星股份有限公司監(jiān)制），起始灌胃劑 量為4g/kg，以后每次逐級增加為5〖/1^、6〖/1^、6〖/1^、7〖/1^、7〖/1^、8〖/1^，最后灌胃劑量 穩(wěn)定在8g/kg。第十三次灌胃后，處死所有動物取肝臟，經(jīng)過10%福爾馬林固定，H&E染色 和Masson染色后，進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)觀察。
[0083] 配對喂養(yǎng)組小鼠肝臟正常，沒有出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和脂肪空泡現(xiàn)象（圖1A)，也無纖 維化和炎癥病灶（圖1A)，模型組小鼠在第十三次灌胃后，肝臟可見大量肝細(xì)胞壞死（細(xì)胞 核溶解）和脂肪化（脂肪空泡）以及炎癥病灶（圖1E)。Masson染色可見纖維化病灶（圖 2E)。模型組動物8只動物中有7只出現(xiàn)纖維化，發(fā)生率為87. 5%。如果從實(shí)施例4開始 統(tǒng)計(jì)，14只動物中有12只出現(xiàn)纖維化，發(fā)生率為85. 7%。此數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明中的飼料成 功地使雄性小鼠形成了纖維化模型，成模時(shí)間短，最早可在液體飼料飼養(yǎng)8周，即灌胃酒精 7次后成模，成模率高，總成模率為85. 7%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，其特征在于：由酪蛋白、L-胱氨酸、 DL-蛋氨酸、膳食纖維素、黃原膠、重酒石酸膽堿、礦物質(zhì)預(yù)混料、維生素預(yù)混料、膽固醇、膽 酸鈉、麥芽糊精、魚油、酒精和水組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，其特征在于，每1升所 述飼料組成如下： 酪蛋白41. 4克； L-胱氨酸0. 5克； DL-蛋氨酸0. 3克； 膳食纖維素10克； 黃原膠3. 0克； 重酒石酸膽堿〇. 53克； 礦物質(zhì)預(yù)混料8. 75克； 維生素預(yù)混料2. 5克； 膽固醇2. 0克； 膽酸鈉0. 2克； 麥芽糊精12. 8-25. 6克； 魚油30-40克； 酒精25-50克； 余量為水。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，其特征在于：所述酒 精以乙醇計(jì)量，酒精的具體形式為白酒。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于制備酒精性肝病動物模型的飼料，其特征在于，每1升所 述飼料組成如下： 酪蛋白41. 4克； L-胱氨酸0. 5克； DL-蛋氨酸0. 3克； 膳食纖維素10克； 黃原膠3. 0克； 重酒石酸膽堿〇. 53克； 礦物質(zhì)預(yù)混料8. 75克； 維生素預(yù)混料2. 5克； 膽固醇2. 0克； 膽酸鈉0. 2克； 麥芽糊精25. 6克； 魚油36克； 酒精50克； 余量為水。5. -種權(quán)利要求1-4中任一所述用于制備酒精性肝病動物模型的飼料的制備方法，其 步驟如下： 1) 將酪蛋白、L-胱氨酸、DL-蛋氨酸、膳食纖維素、黃原膠、重酒石酸膽堿、礦物質(zhì)預(yù)混 料、維生素預(yù)混料、膽固醇和膽酸鈉加入容器中，然后加入水，攪拌均勻，得混合物A ; 2) 再將麥芽糊精加入另一容器中，然后加入水，攪拌均勻后加入到混合物A中，攪拌均 勻，瓶裝后密封，4 °C保存?zhèn)溆茫? 3) 將魚油和酒精加入到步驟2)的瓶中，攪拌均勻得用于制備酒精性肝病動物模型的飼 料，其外觀為淺黃色液體。
【文檔編號】A01K67/02GK105901380SQ201510632614
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2015年9月29日
【發(fā)明人】李小軍, 穆云妹, 唐和斌, 李玉桑, 曾紫璇, 鄧明華
【申請人】中南民族大學(xué)