用于分離包括乳鐵蛋白的堿性乳蛋白的膨脹床吸附方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開內(nèi)容涉及改良的用于使用膨脹床吸附層析分離堿性乳蛋白(例如，具有高于7.0的等電點(PI)值的蛋白)或肽，例如乳鐵蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]嬰兒的營養(yǎng)組合物通常尋求模仿人母乳的組成和功能。乳鐵蛋白為鐵-結(jié)合糖蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的80-kDa成員，為人乳中的主要蛋白之一。乳鐵蛋白具有可逆地結(jié)合兩個鐵陽離子的能力，甚至在低pH時，并且可促進(jìn)人小腸中鐵攝入。功能上，乳鐵蛋白調(diào)節(jié)鐵吸收并且可結(jié)合基于鐵的自由基以及為免疫應(yīng)答貢獻(xiàn)鐵。此外，乳鐵蛋白顯示抗細(xì)菌活性。因此，在市售嬰兒配方中包含乳鐵蛋白將為有用的。
[0003]然而，乳鐵蛋白在嬰兒配方中的使用被大規(guī)模商業(yè)可用源的缺乏限制。與人乳鐵蛋白具有約69%的序列同源性的牛乳鐵蛋白，可通過多種純化方法從牛乳獲得，但這樣的方法對于廣泛商業(yè)使用效率低下。其它非人乳鐵蛋白包括豬乳鐵蛋白、馬乳鐵蛋白、水牛乳鐵蛋白、山羊乳鐵蛋白、鼠乳鐵蛋白和駱駝乳鐵蛋白，但存在相似的生產(chǎn)效率低下。
[0004]牛乳清中乳鐵蛋白的濃度，例如，通常僅約10-100 mg/升。穩(wěn)定的流化床吸附，也稱為膨脹床吸附(EBA)為用于從原料獲得蛋白的一種方法，例如從牛乳源獲得牛乳鐵蛋白。EBA使得能夠使用顆粒層析基質(zhì)直接從粗制原料分離生物分子，例如蛋白和質(zhì)粒，其中所述基質(zhì)在原料上樣期間和任選洗脫期間保持流化。由于基質(zhì)在上樣期間為流化的，固體和不想要的物質(zhì)通過基質(zhì)，避免了弄臟層析材料。因此，EBA可，在某些情況下，將離心、過濾、濃縮和純化的效果組合入單一過程，從而節(jié)約時間和將預(yù)處理純化步驟減到最少。然而，當(dāng)前的EBA技術(shù)在從乳源分離乳鐵蛋白中具有一些缺點。特別是，當(dāng)前的EBA技術(shù)仍使用相對大體積的液體并且還在乳鐵蛋白的洗脫期間使用高濃度的氫氧化鈉(例如，200mM)，這由于使蛋白變性可能導(dǎo)致不可逆的結(jié)構(gòu)變化。
[0005]此外，非人哺乳動物乳源包含其它有用蛋白，包括乳過氧化物酶酶、α -乳清蛋白、 乳球蛋白、免疫球蛋白、糖肽、糖大分子肽、乳清蛋白分離物和溶菌酶。這些蛋白和混合物也可用作食物成分或營養(yǎng)補充劑。因此，存在對改良的用于以商業(yè)規(guī)模從乳源分離和純化乳鐵蛋白和其它蛋白以用于營養(yǎng)產(chǎn)品例如嬰兒配方的方法的需求。
[0006]發(fā)明公開內(nèi)容
應(yīng)理解的是前述一般性說明和下文的詳述二者均呈現(xiàn)本公開內(nèi)容的實施方案并且意在提供用于理解如所要求的本公開內(nèi)容的性質(zhì)和特征的概述或框架。說明書用于解釋所要求主題的原理和操作。在閱讀下列公開內(nèi)容時，本公開內(nèi)容其它和進(jìn)一步的特征和優(yōu)點對本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地顯而易見。
[0007]本公開內(nèi)容提供改良的用于從乳源分離蛋白的ΕΒΑ方法。在具體實施方案中，本公開內(nèi)容提供用于從乳源分離乳蛋白，例如乳鐵蛋白的方法，包括建立包含顆粒基質(zhì)的膨脹床吸附柱、將乳源施用于基質(zhì)和用包含約0.3-約2.0 Μ氯化鈉的洗脫緩沖液從基質(zhì)洗脫乳鐵蛋白。本方法中可使用任何哺乳動物乳源，盡管在具體實施方案中，所述乳源為牛乳源。乳源包括，在一些實施方案中，全乳、減脂乳、脫脂乳、乳清、酪蛋白或其混合物。
[0008]用于實施本發(fā)明的最佳模式
此處將詳細(xì)參考本公開內(nèi)容的實施方案、一個或多個本文下面闡述的實施例。各實施例以舉例說明本公開內(nèi)容的營養(yǎng)組合物的方式提供并且不為限制。事實上，對本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，可對本公開內(nèi)容的教導(dǎo)作出多種修飾和變更而不脫離本公開內(nèi)容的范圍或精神。例如，作為一個實施方案的一部分說明或描述的特征可與另一個實施方案一起使用以產(chǎn)生又進(jìn)一步的實施方案。
[0009]因此，本公開內(nèi)容意欲涵蓋在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的這樣的修飾和變更及其相等物。本公開內(nèi)容的其它目標(biāo)、特征和方面在下列詳述中公開或從下列詳述顯而易見。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是本討論僅為示例性實施方案的描述并且不意在限制本公開內(nèi)容更廣的方面。
[0010]對本公開內(nèi)容的單數(shù)特征或限制的全部提及應(yīng)包括相應(yīng)的復(fù)數(shù)特征或限制，反之亦然，除非另外指明或由所提及的上下文清楚暗示含義相反。
[0011]如本文所使用的方法或過程步驟的所有組合可以以任何順序?qū)嵤?，除非另外指明或由進(jìn)行提及組合的上下文清楚暗示含義相反。
[0012]本公開內(nèi)容的方法，包括其組分，可包括本文所述實施方案的基本元件和限度以及任何額外或任選的步驟、由本文所述實施方案的基本元件和限度以及任何額外或任選的步驟組成或基本由其組成。
[0013]如本文所使用的，術(shù)語“約”應(yīng)解釋為指在任何范圍中指定的兩個數(shù)字。任何對范圍的提及應(yīng)考慮為提供對該范圍內(nèi)任何子集的支持。
[0014]本公開內(nèi)容涉及改良的用于使用EBA從原料，例如哺乳動物乳源，純化蛋白的方法。在某些實施方案中，所述乳源可為全乳、脫脂乳、減脂乳或乳衍生制品，例如乳清或酪蛋白。盡管乳源可為任何哺乳動物乳源，在具體實施方案中，其為牛乳源或更特別是牛乳清。在具體實施方案中，靶蛋白為乳鐵蛋白，盡管也可分離其它乳蛋白，例如乳過氧化物酶酶或乳清蛋白。EBA特別適于處理大體積的粗原料，因此可用于生產(chǎn)商業(yè)可用量的純化乳蛋白。在一些實施方案中，所述方法包括建立包含顆?；|(zhì)的膨脹床吸附柱、將乳源施用于基質(zhì)和用約0.3-約2.0 Μ氯化鈉從基質(zhì)洗脫乳鐵蛋白的步驟。在其它實施方案中，乳鐵蛋白用約0.5-約1.0 Μ氯化鈉洗脫，而在進(jìn)一步的實施方案中，乳鐵蛋白用約0.7-約0.9 Μ氯化鈉洗脫。
[0015]膨脹床吸附柱可為本領(lǐng)域所已知的任何一種，例如美國專利號7,812，138、6，620，326和6，977，046中所描述的那些。在一些實施方案中，所述柱裝備有至少一個入口和至少一個出口，并且可以以膨脹模式和填充模式二者操作。更特別地，在某些實施方案中，將乳源以膨脹模式施用于柱，洗脫以膨脹或填充模式進(jìn)行。在具體實施方案中，洗脫以膨脹模式進(jìn)行。例如，膨脹模式的膨脹比率可為約1-約3，或約1.3-約1.7。ΕΒΑ技術(shù)在國際出版申請?zhí)朤O 92/00799、TO 02/18237、TO 97/17132中進(jìn)一步描述，所述申請通過引用以其整體結(jié)合到本文中。
[0016]EBA柱含有包含大密度的小顆粒的吸附顆粒基質(zhì)材料，從而允許在膨脹模式下高流速。吸附顆?；|(zhì)材料可為適合EBA的任何基質(zhì)。顆粒的密度和大小影響系統(tǒng)的流速和膨脹比率。例如，在一些實施方案中，顆粒密度為1.3 g/mL或更大，例如至少1.5 g/mL、至少1.8 g/mL、至少2.0 g/mL或至少2.3 g/mL。在具體實施方案中，顆粒大小在約1.5-約3.5 mg/mL或約2.5-3.5 mg/mL的范圍內(nèi)。如本文所使用的吸附顆粒的密度是指完全溶劑化狀態(tài)的顆粒的密度，而不是干吸附顆粒的密度。
[0017]此外，在一些實施方案中，基質(zhì)的顆粒大小分布范圍為約10 μπι-約1000 μπι。例如，在某些實施方案中，顆粒大小分布范圍為約25 μπι-約1000 μπι，或約50 μπι-約800μm，或約80 μm-約600 μπι大小。在其它實施方案中，基質(zhì)的顆粒大小小于約300 μπι、小于約150 μπι，或小于約120 μπι。在具體實施方案中，顆粒大小范圍為約40-約150 μπκ約 40-約 120 μm、約 40-約 100 μπι 或約 40-約 70 μπι。
[0018]乳鐵蛋白的等電點為約8.9?，F(xiàn)有分離乳鐵蛋白的ΕΒΑ方法使用200 mM氫氧化鈉作為洗脫緩沖液。因此，系統(tǒng)的pH上升到12以上，乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和生物活性可因不可逆的結(jié)構(gòu)變化而受累(comprised)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)氯化鈉溶液可用作從EBA基質(zhì)分離乳鐵蛋白的洗脫緩沖液。在某些實施方案中，氯化鈉具有約0.3 M-約2.0 Μ的濃度。在其它實施方案中，乳鐵蛋白洗脫緩沖液具有約0.3 Μ-約1.5 Μ或約0.5 Μ-約1.0 Μ的氯化鈉濃度。
[0019]在某些實施方案中，乳鐵蛋白洗脫緩沖液可再循環(huán)一次或多次，從而減少總洗脫體積。例如，洗脫緩沖液可再循環(huán)2、3或更多次。在一些實施方案中，洗脫緩沖液可再循環(huán)約1-約10次或約1-約5次。提高的洗脫緩沖液溫度也可，在某些實施方案中，改善乳鐵蛋白的洗脫效率。氯化鈉洗脫緩沖液的溫度可為，在某些實施方案中，約30-約50°C。
[0020]在某些實施方案中，所述乳源包含乳過氧化物酶。乳過氧化物酶以比乳鐵蛋白低的親和性結(jié)合EBA，因此可在洗脫乳鐵蛋白前