專利名稱：用作疫苗和藥劑的具有被改變的干擾素拮抗劑活性的減毒負鏈病毒的制作方法
反映在本申請中的工作部分得到國立衛(wèi)生研究院(the NationalInstitutes of Health)的支持，因此政府對本發(fā)明具有一定的權利。
本申請是申編號60/117,683,1999年1月29日提交；申編號60/108,832,1998年11月18日提交；及申請?zhí)?0/089,103,1998年6月12日提交的部分延續(xù)，這些申請中每一部的全部內(nèi)容均作為參考引入本申請中。
1．前言本發(fā)明涉及，總的說來，具有拮抗細胞干擾素(IFN)應答的活性減弱的減毒負鏈RNA病毒，以及這種減毒的病毒在疫苗和藥劑制劑中的作用。本發(fā)明也涉及開發(fā)和應用IFN-缺陷系統(tǒng)以挑選、鑒定和復制這種減毒病毒。
在一個特定的實施例中，本發(fā)明涉及對NS1基因具有修飾的減毒流感病毒，這些修飾減弱或消除NS1基因產(chǎn)物拮抗細胞IFN應答的能力。該突變病毒在體內(nèi)復制，但表現(xiàn)出減弱的病原性，因此十分適用于活病毒疫苗，及藥劑制劑。
2．發(fā)明背景2.1 流感病毒含有負向基因組的有包膜的單鏈RNA的病毒家族被分為兩組，具有非分段的基因組(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、棒狀病毒科(Rhabdoviridae)、線狀病毒科(Filoviridae)、博納病病毒科(BornaDisease Virus))或具有分段的基因組(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)和砂粒病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科，如以下所詳細描述的，在本說明書中被用于實施例中，包括A、B和C型流感病毒，以及索戈托(Thogoto)和Dhori病毒以及傳染性的鮭魚貧血病毒(salmon anemia virus)。
流感病毒顆粒包括一個含有單鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心(一種螺旋狀的核殼體)，和一層內(nèi)部襯有基質(zhì)蛋白(M1)的外層脂蛋白被膜。A型流感病毒的分段的基因組包括八種線性、負極性、單鏈的RNA分子(七種是C型流感病毒的)，它們編碼十種多肽，包括RNA依賴性的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核殼體的核蛋白(NP)；基質(zhì)膜蛋白(M1、M2)；兩種從含有脂質(zhì)的被膜伸出的表面糖蛋白血凝素(HA)和唾液酸苷酶(NA)；非結構蛋白(NS1)和核外運蛋白(nuclear export protein)(NEP)?；蚪M的轉錄和復制在核內(nèi)發(fā)生并通過從質(zhì)膜上出芽發(fā)生組裝。這些病毒在混合感染的時候可以將基因重排列。
流感病毒經(jīng)由HA吸附到細胞膜糖蛋白和糖脂的唾液?；途厶?siaiyloligosaccharides)。在病毒體的胞飲作用之后，HA分子在細胞的內(nèi)涵體內(nèi)發(fā)生構象變化，其有利于膜融合，因此誘導脫殼。核殼體遷移到核心處，病毒mRNA在此處被轉錄。病毒mRNA通過一種獨特的機制轉錄，其中病毒核酸內(nèi)切酶將帶帽的5末端從細胞異源mRNA上切下來，該5末端然后作為病毒RNA模板通過病毒轉錄酶轉錄的引物。轉錄在離它們模板末端的15至22個堿基處終止，寡聚(U)序列在該處作為多聚(A)簇加入的信號。在這樣產(chǎn)生的八種病毒RNA分子中，六種是單順反子信息，其直接轉錄成蛋白，表示為HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白、PB2、PB1和PA。其他兩種轉錄本被剪接，各得到兩種mRNA，其以不同的閱讀框翻譯，產(chǎn)生M1、M2、NS1和NEP。換言之，八種病毒RNA片段編碼十種蛋白九種結構的和一種非結構的。流感病毒的基因和它們的蛋白產(chǎn)物的概況如以下表Ⅰ中所示。
流感A病毒基因組包括八種負極性單鏈RNA片段，編碼一種非結構和九種結構蛋白。非結構蛋白NS1大量存在于在流感病毒感染的細胞內(nèi)，但在病毒體內(nèi)卻沒有檢測到。NS1是一種在感染早期的細胞核內(nèi)以及病毒周期晚期的細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種磷蛋白質(zhì)(King等，1975,病毒學64378)。對在NS基因上帶有損傷的溫度敏感(temperature-sensitive,ts)型流感突變體的研究顯示NS1蛋白是多種機制的轉錄和轉錄后調(diào)節(jié)子，通過這些機制病毒能夠阻止宿主細胞基因表達并刺激病毒蛋白合成。同許多其它調(diào)節(jié)轉錄后過程的蛋白一樣，NS1蛋白同特定的RNA序列和結構相互作用。NS1蛋白已經(jīng)被報道結合不同種類的RNA，包括vRNA、多聚-A、U6snRNA、病毒mRNA的5非翻譯區(qū)域以及dsRNA(Qiu等，1995,RNA 1:304；Qiu等，1994，病毒學雜志.68:2425；Hatada Fukuda 1992，遺傳病毒學雜志73:3325-9)。在被轉染的細胞內(nèi)NS1蛋白從eDNA的表達已經(jīng)同幾種影響相關阻止mRNA的核-質(zhì)運輸、阻止前-mRNA剪接、阻止宿主mRNA多聚腺苷酸化和刺激病毒mRNA的翻譯(Fortes，等，1994,EMBO J.13:704；Enami，等，1994,J.Virol.68:1432；de la Luna，等，1995，病毒學雜志69:2427；Lu，等，1994,Genes Dev.8:1817；Park，等，1995，生物化學雜志270,28433；Nemeroff等，1998，分子細胞1:1991；Chen，等，1994,EMBO J.18:2273-83)。
2.2 減毒的病毒失活的病毒疫苗是通過“殺滅”病毒病原體制備的，如，通過加熱或福爾馬林處理，以至其不能復制。失活的疫苗的應用具有局限性，因為它們不能提供持續(xù)長久的免疫性以及，因此，提供的是有限的保護。一種生產(chǎn)病毒疫苗可選的方法包括使用減毒的活病毒疫苗。減毒的病毒能夠復制但不具有病原性，以及，因此，提供了持續(xù)更長久的免疫性并提供更強的保護。然而，生產(chǎn)減毒病毒的傳統(tǒng)方法包括宿主范圍突變體的隨機分離，其中許多是溫度敏感型的；如，病毒通過非天然的宿主傳代，挑選具免疫原性，但不具有病原性的子代病毒。
分離和培養(yǎng)流感病毒以用于疫苗目的的傳統(tǒng)培養(yǎng)基為含胚家雞卵。流感病毒典型地是在37℃下、在10-11天齡的卵內(nèi)生長2-4天。雖然大多數(shù)人初級分離的流感A和B病毒在胚胎的羊膜囊內(nèi)生長得更好，但在2至3代以后，病毒變得適于在尿囊腔的細胞內(nèi)生長，其易受卵外部的影響(Murphy,B.R.，和R.G.Webster,1996.正粘病毒，第1397-1445頁.在Fields Virology.Lippincott-RavenP.A.)。
重組DNA技術和基因工程技術，在理論上，將提供一種更強的生產(chǎn)減毒病毒的方法，因為特定的突變能夠被特意地工程化到病毒基因組內(nèi)。然而，對于病毒減毒，在遺傳上的變化是未知的或無法預計的。通常，將重組DNA技術應用到工程化病毒疫苗上的嘗試主要是針對亞單位疫苗的生產(chǎn)，其僅包括涉及免疫應答、在重組病毒載體(如痘苗病毒或桿狀病毒)內(nèi)表達的蛋白亞基。新近，重組DNA技術已經(jīng)在嘗試生產(chǎn)皰疹病毒缺失突變體或脊髓灰質(zhì)炎病毒中被利用，它們是在天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的、或已知的宿主范圍突變體的模擬減毒病毒。直到1990年，沒有負鏈RNA病毒未曾經(jīng)受被位點特異性操作，因此其無法在基因工程化。
迄今為止，減毒的活流感病毒可能無法抑制它們在其中復制的宿主內(nèi)部的干擾素應答。因此，雖然這些病毒是有利的，因為它們具免疫原性且不具有病原性，但對于生產(chǎn)疫苗的目的，它們在傳統(tǒng)培養(yǎng)基內(nèi)復制是困難的。此外，減毒的病毒可能帶有毒性，這種毒性很輕，以至不會使宿主產(chǎn)生足以迎接后繼的攻擊的免疫應答。
3．發(fā)明概述本發(fā)明涉及拮抗細胞IFN應答的能力受損傷的減毒負鏈RNA病毒，以及這類病毒在疫苗和藥劑制劑中的應用。IFN干擾素活性損傷的突變病毒被減毒-它們具感染性、能夠在體內(nèi)復制以提供亞臨床感染水平、且不具有病原性。因此，它們是活病毒疫苗的理想候選者。而且，這些減毒能夠誘導強IFN應答，這在體內(nèi)具有其它生物結果，提供了抗后來感染疾病的防護和/或誘導抗腫瘤應答。因此，減毒的病毒可以被在治療上使用，用于防止或治療高危個體的其它感染疾病、癌癥、及/或IFN-可治療的疾病。
依據(jù)本發(fā)明使用的負鏈RNA病毒包括分段的及非分段的病毒；優(yōu)選的實施例包括但不局限于流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口炎病毒(VSV)和副流感病毒(PIV)。在本發(fā)明中使用的病毒的選取可以從天然產(chǎn)生的株系、變體或突變體；誘導突變的病毒(如，通過暴露在誘變劑中、反復傳代和/或在非許可性宿主內(nèi)傳代產(chǎn)生)；重排列(對于分段的病毒基因組)；和/或具有理想表型的(如，一種損傷的拮抗細胞IFN應答的能力)的遺傳工程化的病毒(如，使用“反向遺傳學”技術)?？梢曰谠贗FN缺陷系統(tǒng)和在IFN充足的系統(tǒng)內(nèi)生長之間的不同，選擇突變體或遺傳工程化的病毒。例如，可以選擇在一種IFN缺陷系統(tǒng)中生長、但不在一種IFN充足的系統(tǒng)中生長的病毒(或在一種IFN充足系統(tǒng)中生長較差的病毒)。
選擇減毒病毒使其自身可以在疫苗或藥劑制劑中用作活性成分?？蛇x地，減毒病毒可以被用作重組產(chǎn)生的疫苗的載體或“主鏈”。為此目的，可以采用“反向遺傳學”技術來工程化突變或?qū)⑼鈦淼目乖瓫Q定簇引入到減毒病毒中，其可以作為“親本”株系。這樣，可以工程化疫苗以免疫對抗株系變體，和可選地，對抗完全不同的感染因子或疾病抗原。例如，減毒病毒可以被工程化以表達其它預選株系的中和抗原決定簇。可選地，可以將負鏈RNA病毒之外的病毒的抗原決定簇構建到減毒的突變病毒內(nèi)(如，HIV的gp160、gp120、或gp41)?？蛇x地，可以將非病毒性感染的病原體(如，寄生蟲、細菌、真菌)的抗原決定簇工程化到病毒內(nèi)。在又另一個可選的情況下，可以制備癌癥疫苗，如通過將腫瘤抗原工程化到減毒的病毒主鏈上。
在一個涉及具分段基因組的RNA病毒的特定實施例中，重排列技術可以被用于將減毒的表現(xiàn)型從一種母本分段的RNA病毒株系(一種天然突變體、一種誘變病毒、或一種工程化的病毒)轉到一種不同的病毒株系(一種野生型病毒、天然突變體、一種誘變病毒、或一種遺傳工程化的病毒)中。
減毒的病毒，其在宿主內(nèi)誘導強IFN應答，可以被用于藥劑制劑中以預防或治療其它病毒感染、或可用IFN-治療的疾病，如癌癥中。在這點上，可以改變減毒病毒的趨性，以在體內(nèi)或來自體內(nèi)將病毒對準想要的靶器官、組織或細胞。使用該方法，IFN應答可以被就地誘導，在靶位點，因此避免或最小化系統(tǒng)IFN治療的副作用。為此，可以工程化減毒病毒以表達一種特異性針對靶器官、組織或細胞的受體的配基。
本發(fā)明部分基于申請者們的發(fā)現(xiàn)，即野生型流感病毒的NS1作為一種IFN拮抗劑發(fā)揮功能，在其中NS1阻止病毒感染的宿主細胞內(nèi)IFN調(diào)節(jié)的應答。缺乏NS1活性的病毒突變體被發(fā)現(xiàn)是細胞IFN應答的有效誘因，并在體內(nèi)被證明具有一種減毒的表現(xiàn)型；即，該突變病毒在體內(nèi)復制，但具有降低的病原性影響。不想將本發(fā)明如何起作用拘泥于任何理論或解釋，推測本發(fā)明中的病毒的減毒特性是由于它們誘導強的細胞IFN應答的能力，以及它們拮抗宿主IFN應答的能力受損傷。然而，本發(fā)明中的減毒病毒的有利特性不能僅僅歸于對細胞干擾素應答的影響。事實上，與NS1相關的其它活性上的改變可能促成想要的減毒表現(xiàn)型。
具有損傷的IFN拮抗活性的突變流感病毒被顯示在體內(nèi)復制，產(chǎn)生的滴度足以誘導免疫和細胞因子應答。例如，用減毒的流感病毒接種疫苗在動物體內(nèi)降低病毒滴度，其繼而被野生型流感病毒攻擊。減毒病毒也表現(xiàn)出抗病毒和抗腫瘤活性。用減毒的流感病毒預感染阻止了再度感染的野生型流感病毒的其它株系、和其它病毒(如仙臺病毒)在含胚卵內(nèi)的復制。將減毒的流感病毒接種到腫瘤細胞注射過的動物體內(nèi)降低了轉化灶形成的數(shù)目。因為已知流感病毒誘導一種CTL(細胞毒性T細胞)應答，因此減毒的病毒是癌癥疫苗的一種十分有吸引力的候選者。
降低但不消除病毒的IFN拮抗活性的突變對于疫苗制劑是優(yōu)選的-可以就其在傳統(tǒng)及非傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中的生長，及具有的中間毒性選擇這些病毒。特別地，本申請者們已經(jīng)證明一種NS1 C-末端-截短的突變體在IFN缺乏的培養(yǎng)基(如6和7天齡含胚家雞卵)中、以及在10天齡含胚家雞卵的尿囊膜內(nèi)(流感病毒的傳統(tǒng)培養(yǎng)基，其不允許流感病毒突變體(其中整個NS1基因被缺失，在本說明書中也稱為“敲除”突變體)的生長)復制到高滴度。然而，NS1-C-末端截短突變體在12天齡含胚卵中減少。該方法第一次允許，活減毒的負鏈RNA病毒(其具有改變的、但不是消除的、IFN拮抗活性，并且其能夠在適合疫苗藥劑的培養(yǎng)基中生長)的產(chǎn)生和鑒定。該方法也首次提供，流感或其它病毒(其含有提供改變的、但不是消除的干擾素拮抗活性的突變)的一種有效的選擇鑒定系統(tǒng)。
本發(fā)明也涉及使用IFN缺陷系統(tǒng)來增殖減毒的病毒，該病毒不能在普遍用于疫苗生產(chǎn)的傳統(tǒng)系統(tǒng)中生長。在本說明書中用到的術語“IFN-缺陷系統(tǒng)”是指系統(tǒng)，如，細胞、細胞系和動物，如小鼠、家雞、火雞、兔子、大鼠等，其不產(chǎn)生IFN或產(chǎn)生低水平的IFN，對IFN不應答或較低效率地應答，及/或缺乏由IFN誘導的抗病毒基因活性。為此，申請者們已經(jīng)鑒定或設計了許多可以被使用的IFN-缺陷系統(tǒng)，包括但不局限于初期的含胚卵、IFN缺陷型細胞系(如VERO細胞、或如STAT1敲除的遺傳工程化的細胞系)。可選地，可以用抑制IFN系統(tǒng)的化合物(包括藥物、抗體、反義核酸分子、核糖酶，等)預處理含胚卵或細胞系。又另一個實施例涉及IFN系統(tǒng)缺陷型的卵的應用，如，由STAT1陰性的鳥生的卵，尤其是家禽，包括但不局限于轉基因家雞、家鴨或火雞。
4．


圖1、DelNS1病毒抑制卵中野生型流感A病毒的復制。將標出的pfu的delNS1病毒接種十天齡含胚雞卵。八小時以后，用103pfu WSN病毒感染這些卵。在37℃孵育兩天之后，收集尿囊液并在MDBK細胞中通過噬斑分析確定WSN的滴度。結果是兩個卵的平均。
圖2、在含胚卵中由delNS1病毒誘導的抗病毒應答。將十天齡的含胚雞卵與PBS(未處理)或與2×104fpu delNS1病毒(delNS1處理過)一起孵育。八小時以后，立刻用10 pfu的流感A/WSN/33(H1N1)病毒、流感A/PR8/34(H+N1)病毒、流感A/X-31(H3N2)病毒、流感B/Lee/40病毒、或仙臺病毒感染雞卵。孵育兩天以后，收集尿囊液并通過血凝分析確定病毒滴度。結果是兩個卵的平均。
圖3、用表達與綠色熒光蛋白(GFP)融合的IRF-3的質(zhì)粒轉染CV1細胞。這使得可以通過熒光顯微鏡確定IRF-3在細胞內(nèi)的定位。在一些情況下，將一種表達NS1的質(zhì)粒以指定的比例同表達IRF-3的質(zhì)粒一起共轉染。轉染的24小時以后，用PR8(WT)或delNS1病毒如指定的高感染復數(shù)(moi)轉染感染這些細胞。感染的10小時以后，在熒光顯微鏡下分析細胞中IRF-3-GFP的定位。表現(xiàn)IRF-3僅在細胞質(zhì)定位(CYT)和在細胞質(zhì)及細胞核定位(Nuc+Cyt)的細胞的百分率被表示出來。
5．發(fā)明詳述本發(fā)明涉及拮抗細胞IFN應答的能力受損傷的減毒負鏈RNA病毒的產(chǎn)生、挑選和鑒定，以及這類病毒在疫苗和藥劑制劑中的應用。
這些病毒可以具有被分段的和沒有被分段的基因組，并且可以選自天然發(fā)生的株系、變體或突變體；誘變的病毒(如，通過暴露在紫外輻射、誘變劑、和/或傳代)；重排列(對于具有被分段的基因組的病毒)；和/或遺傳工程病毒。例如，突變體病毒的產(chǎn)生可以通過天然變異、暴露在紫外輻射、暴露在化學誘變劑、通過在非許可性宿主內(nèi)傳代、通過重排列(即，通過將一種減毒的被分段病毒與另一種具有想要的抗原的株系一起協(xié)同感染)、和/或通過遺傳工程(如，使用“反向遺傳學”)。選擇用于本發(fā)明的病毒具有缺損的IFN拮抗活性并且是減毒的；即，它們是具有感染力的并且能夠在體內(nèi)復制，但僅產(chǎn)生導致非病原性的亞臨床感染水平的低滴度。這些減毒的病毒是活疫苗的理想候選者。
在一個優(yōu)選的實施例中，挑選用于本發(fā)明的減毒病毒應該能夠在宿主內(nèi)誘導強的IFN應答--一種特性，當作為一種疫苗使用時，導致強免疫應答的產(chǎn)生，并且其具有其它的生物學后果，使這些病毒能夠作為一種制藥試劑用于本發(fā)明及/或治療其它病毒感染、或高?；颊唧w內(nèi)的腫瘤形成、或其它用IFN治療的疾病。
本發(fā)明部分，基于本發(fā)明者們在研究流感病毒突變體時的許多發(fā)現(xiàn)和觀察。然而，這些原理能夠被類似地應用和外推到其它被分段的和沒有被分段的負鏈RNA病毒中，包括，但不局限于副粘病毒(仙臺病毒、副流感病毒、腮腺炎、新城疫病毒)；麻疹病毒(麻疹病毒、犬瘟病毒和牛瘟病毒)；肺炎病毒(呼吸道合胞病毒和牛呼吸道病毒)；以及彈狀病毒(水泡性口炎病毒和狂犬病病毒)。
首先，IFN應答對于在體內(nèi)遏制病毒感染是重要的。本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)野生型流感病毒A/WSN/33在IFN缺陷型小鼠(STAT1-/-小鼠)內(nèi)的生長導致泛器官的感染；即，病毒感染與產(chǎn)生一種IFN應答的野生型小鼠中的情形不同，不局限于肺部(Garcia-Sastre，等，1998，病毒學雜志72:8550，其全部內(nèi)容作為參照結合于本說明書中)。第二，本發(fā)明者們證實流感病毒的NS1作為一種IFN拮抗劑發(fā)揮功能。本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)一種缺失了整個NS1基因的流感病毒突變體(即，一種NS1“敲除”)無法在IFN產(chǎn)生型的宿主細胞內(nèi)生長到高滴度，并且僅能夠在IFN-缺陷型的宿主體內(nèi)復制。NS1基因敲除小鼠證實了一種減毒表現(xiàn)型(即，其在IFN缺陷型STAT1-/-小鼠體內(nèi)是致死的，但在野生型小鼠體內(nèi)沒有)，并且被發(fā)現(xiàn)是宿主細胞內(nèi)IFN應答的一種強誘導子(Garcia-Sastre，等，1998，病毒學252:324-330，其全部內(nèi)容作為參照結合于本說明書中)。用NS1敲除突變病毒的預感染降低了在含胚卵內(nèi)再度感染的野生型流感和其它病毒(如，仙臺病毒)的滴度。在另一個實施例中，用NS1敲除突變流感病毒感染降低了接種過腫瘤細胞的動物體內(nèi)的轉化性形成。因此，NS1敲除流感病毒證明頗具吸引力的生物特性。然而，S1敲除流感病毒不能夠在用于疫苗產(chǎn)生的常規(guī)系統(tǒng)中復制。為了克服這一困難，本發(fā)明者們使用并開發(fā)了產(chǎn)生合理產(chǎn)量的減毒病毒IFN缺陷型系統(tǒng)。
另外，本發(fā)明者們設計了NS1的缺失突變體，其不缺失整個基因。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)這些NS1突變體呈現(xiàn)一種“過渡”表現(xiàn)型-病毒能夠在用于復制流感病毒的傳統(tǒng)宿主內(nèi)生長(雖然在IFN-缺陷型的系統(tǒng)內(nèi)生長較好，其獲得較高的滴度)。最重要的是，這些缺失突變體在體內(nèi)是減毒的，并誘導一種強的IFN應答。流感病毒NS1截短的突變體疫苗接種在動物體內(nèi)引起低滴度，并繼而被野生型病毒攻擊，提供抗病毒的防護。
本發(fā)明也涉及用于用作疫苗的病毒的分離、鑒定和生長的培養(yǎng)基。特別地，描述了用于有效生長流感病毒突變體的干擾素缺陷型培養(yǎng)基。依據(jù)本發(fā)明，一種干擾素缺陷型培養(yǎng)基是一種在其產(chǎn)生或應答干擾素的能力上存在缺陷的培養(yǎng)基。本發(fā)明中的培養(yǎng)基可以被用于任意數(shù)目的，可能需要干擾素缺陷型生長環(huán)境的病毒的生長。這些病毒可以包括，但不局限于仙臺病毒、副流感病毒、腮腺炎、新城疫病毒)；麻疹病毒(麻疹病毒、犬瘟病毒和牛瘟病毒)；肺炎病毒(呼吸道合胞病毒和牛呼吸道病毒)；彈狀病毒(水泡性口炎病毒和狂犬病病毒)。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明中的減毒病毒在用于人類或動物的疫苗和藥劑制劑中的使用。特別地，這些減毒病毒可以被用作疫苗以抵抗廣范圍的病毒和/或抗原，包括但不局限于株系變體、不同病毒或其它感染性病原體(如，細菌、寄生蟲、真菌)的抗原，或腫瘤特異性抗原。在另一個實施例中，這些減毒的病毒，其抑制病毒復制和腫瘤形成，可以被用于預防或治療感染(病毒性的或非病毒性的)或腫瘤形成或治療IFN在治療上有效的疾病?？梢圆捎枚喾N方法將活減毒病毒制劑引入到某人類或動物患者體內(nèi)，以誘導一種免疫或適當?shù)募毎蜃討?。這些包括，但不局限于，鼻內(nèi)、氣管內(nèi)(trachial)、口服、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)及皮下途徑。在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明中的減毒病毒的配制是用于鼻內(nèi)施用的。
5.1 具有改變的IFN拮抗活性的突變體的產(chǎn)生任何具有降低的IFN拮抗活性的突變病毒或株系均可以被選擇并依據(jù)本發(fā)明進行使用。在一個實施方案中，可以選擇天然發(fā)生的突變體或變體、或自發(fā)的突變體，它們拮抗細胞IFN應答的能力受損。在另一個實施方案中，突變體病毒的產(chǎn)生可以通過將病毒暴露在誘變劑(如紫外輻射或化學誘變劑)中、或者通過多次傳代及/或在非許可性宿主內(nèi)傳代。差示生長系統(tǒng)篩選可用于挑選具有損傷的IFN拮抗功能的突變體。對于基因組被分段的病毒，可以通過重排列將減毒的表現(xiàn)型轉移到另一種具有一種理想抗原的株系內(nèi)，(即，通過該減毒病毒與理想的株系的共轉染，并挑選兩種表現(xiàn)型均表現(xiàn)的重排列體)。
在另一個實施方案中，突變體可以被工程化到一種負鏈RNA病毒內(nèi)，如流感、RSV、NDV、VSV和PIV，使用“反向遺傳學”的方法。這樣，具有減毒表現(xiàn)型的天然的或其它突變體能夠被工程化到疫苗株系中。例如，可以工程化負責IFN拮抗活性的基因(如流感病毒的NS1)中編碼區(qū)域的缺失、插入或替換。也可以考慮負責IFN拮抗活性的基因中非編碼區(qū)域的缺失、替換或插入。為此，可以對擔負負責IFN拮抗活性的基因的轉錄、復制、多聚腺苷酸化和/或包裝的信號進行工程化。例如，在流感病毒中，這些修飾包括，但不局限于用一種流感B病毒基因中的非編碼區(qū)域替代一種流感A病毒基因中的非編碼區(qū)域Muster，等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5177),在一種流感病毒基因的非編碼區(qū)域上的堿基對交換(Fodor，等，1998，病毒學雜志72:6283)，在一種流感病毒基因的啟動子區(qū)域上的突變(Piccone，等，1993,Virus Res.28:99；Li，等，1992，病毒學雜志66:4331)，在一種流感病毒基因5’末端影響多聚腺苷酸化的尿嘧啶殘基鏈段的替換和缺失(Luo，等，1991，病毒學雜志65:2861；Li，等，病毒學雜志1994,68(2):1245-9)。這些突變體，如對啟動子，能夠減量調(diào)節(jié)負責IFN拮抗活性的基因的表達。在病毒基因上的突變，其可能調(diào)節(jié)負責IFN拮抗活性的基因表達，也在可以依據(jù)本發(fā)明進行使用的病毒范圍之內(nèi)。
本發(fā)明也涉及對NS1基因片段的突變，其可能不會導致IFN拮抗活性的改變或一種IFN-誘導表現(xiàn)型，而導致改變的病毒功能和一種減毒的表現(xiàn)型如，改變了的對于含多聚(A)的mRNA的核外運的抑制，改變了的對于前mRNA剪接的抑制，改變了的對于由dsRNA的隱蔽引起的PKR活化的抑制，改變了的對于病毒RNA翻譯的影響，以及改變了的對于宿主mRNA多聚腺苷酸化的抑制(如.，見Krug在流感教科書中，Nicholson等1998年編輯，82-92，及其中所引用的參考文獻)。
反向遺傳學技術包括制備合成的重組病毒RNA，其包括負鏈病毒RNA的非編碼區(qū)域，這對于病毒多聚酶的識別及對于在產(chǎn)生成熟病毒體中所必需的包裝信號是必要的。重組RNA從重組DNA模板中合成，并與純化的病毒聚合酶復合物在體外進行重構，以形成能夠被用于轉染細胞的重組的核糖核蛋白(RNPS)。在合成的RNA在體外或在體內(nèi)轉錄的過程中，如果存在病毒聚合酶蛋白，將達到更有效的轉染。這些合成的重組RNP能夠被獲救到感染性病毒顆粒內(nèi)。上述技術的描述在美國專利編號5,166,057,1992年11月24日提交；在美國專利編號5,854,037,1998年12月29日提交；在歐洲專利出版物EP0702085Al,1996年2月20日出版；在美國專利申請系列編號09/152,845；在國際專利出版物WO97/12032,1997年4月3日出版；WO96/34625,1996年11月7日出版；歐洲專利出版物P-A780475；WO99/02657,1999年1月21日出版；WO98/53078,1998年11月26日出版；WO98/02530,1998年1月22日出版；WO99/15672,1999年4月1日出版；WO98/13501,1998年4月2日出版；WO97/062701997年2月20日出版；以及EPO 780 47SAl,1997年6月25日出版，每篇的全文均作為參照結合于本說明書中。
通過反向遺傳學方法產(chǎn)生的減毒病毒能夠被用于本說明書中所描述的疫苗和藥劑制劑中。反向遺傳學技術也可以被用于工程化對于疫苗生產(chǎn)很重要的其它病毒基因另外的突變--即，有用的疫苗株系變體的抗原決定簇可以被工程化到減毒病毒中?？蛇x地，完整的異源抗原決定簇，包括來自其它病毒或非病毒病原體的抗原可以被工程化到減毒株系中。例如，可以將非相關病毒的抗原如HIV(gp160、gp120、gp4l)、寄生蟲抗原(如，瘧疾)、細菌或真菌抗原或腫瘤抗原工程化到減毒的株系中。可選地，在體內(nèi)改變病毒趨性的抗原決定簇可以被工程化到本發(fā)明的嵌合減毒病毒中。
在一個可選的實施方案中，反向遺傳學技術和重排列技術的組合可以被應用于工程化具有理想抗原決定簇的分段的RNA病毒減毒病毒。例如，可以將一種減毒的病毒(通過自然選擇、誘變或通過反向遺傳學技術產(chǎn)生)和一種帶有想要的疫苗抗原決定簇的株系(通過自然選擇、誘變或通過反向遺傳學技術產(chǎn)生)共轉染到允許被分段的基因組重排列的宿主內(nèi)。然后可以選擇表現(xiàn)減毒表現(xiàn)型及想要的抗原決定簇的重排列體。
在另一個實施方案中，被突變的病毒是一種DNA病毒(如，牛痘、腺病毒、桿狀病毒)或一種負鏈RNA病毒(如，脊髓灰質(zhì)炎病毒)。在這些情況下，可以采用在工藝上熟知的重組DNA技術(如，見美國專利編號4,769,330,Paoletti；美國專利編號4,215,051,Smith，各篇的全文均作為參照結合于本說明書中)。
任何病毒可以依據(jù)本發(fā)明被工程化，包括但不局限于以下表2中所列出的家族。
表2人類和動物病毒的科病毒特性 病毒科dsDNA有被膜的 痘病毒科Irididoviridae皰疹病毒科無被膜的 腺病毒科乳頭多瘤空泡病毒科嗜肝DNA病毒科ssDNA無被膜的 小DNA病毒科dsRNA無被膜的 呼腸孤病毒科BirnaviridaessRNA有被膜的有義基因組復制中無DNA步驟披蓋病毒科黃病毒科冠狀病毒科復制中有DNA步驟 反轉錄病毒科反義基因組非分段的基因組 副粘病毒科棒狀病毒科絲狀病毒科分段的基因組 正粘病毒科布尼亞病毒科砂粒病毒科無被膜的 細小核糖核酸病毒科杯狀病毒科使用的縮寫ds=雙鏈；ss=單鏈；有被膜的=具有來自宿主細胞膜的外部脂雙層；有義基因組=對于RNA病毒，基因組由直接在核糖體上翻譯的核苷酸序列組成，=對于DNA病毒，基因組由與mRNA相同的核苷酸序列組成；反義基因組=基因組由與有義鏈互補的核苷酸序列組成。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及被遺傳工程化的流感病毒，其含有NS1基因產(chǎn)物的缺失和/或截短。流感A和B的NS1突變體是尤其優(yōu)選的。在一種方法中，NS1基因產(chǎn)物的氨基末端區(qū)域的部分被保留，然而NS1基因產(chǎn)物的C-末端區(qū)域的部分被缺失?？梢酝ㄟ^在合適的密碼子上的核酸缺失、插入、或突變來工程化特定的理想突變體。特別地，截短的NS1蛋白具有野生型NS1基因產(chǎn)物的1-60個氨基酸、1-70個氨基酸、1-80個氨基酸、1-90個氨基酸(N-末端氨基酸是1)，優(yōu)選的是90個氨基酸；1-100個氨基酸，優(yōu)選的是99個氨基酸；或從1-130個氨基酸，優(yōu)選的是124個氨基酸。
本發(fā)明也涉及任何被遺傳操作的流感病毒，其中NS1基因產(chǎn)物已經(jīng)通過NS1蛋白的截短或修飾而被修飾，修飾的NS1蛋白賦予突變體病毒以下的表現(xiàn)型病毒在非常規(guī)的培養(yǎng)基(如6-7天齡的雞卵)中甚至到高滴度的能力，或病毒誘導宿主干擾素應答的能力。對于流感A病毒，這些包括，但不局限于具有一段NS1截短的病毒。
本發(fā)明包括天然發(fā)生、具有減毒表現(xiàn)型的突變流感病毒A或B的應用，以及被工程化以含有這些負責減毒表現(xiàn)型的突變的流感病毒株系的應用。對于流感A病毒，這些包括，但不局限于具有一段124個氨基酸的NS1的病毒(Norton等，1987，病毒學156:204-213，其全部作為參照結合于本說明書中)。對于流感B病毒，這些包括，但不局限于具有一種包括來自N-末端的127個氨基酸的NS1截短突變體病毒(B/201)(Norton等，1987，病毒學156:204-213，其全部作為參照結合于本說明書中)，以及有一種包括來自N-末端的90個氨基酸的NS1截短突變體病毒(B/AWBY-234)(Tobita等，1990，病毒學174:3201-213，其全部作為參照結合于本說明書中)。本發(fā)明包括與NS1/38、NS1/80、NS1/124類似的天然發(fā)生的突變體的應用(Egorov，等，1998，病毒學雜志72(8):6437-41)，以及天然發(fā)生的突變體A/Turkey/ORE/71、B/201或B/AWBY-234。
減毒的流感病毒可以進一步被工程化以表達其它疫苗株系的抗原(如，使用反向遺傳學或重排列)。可選地，減毒的流感病毒可以被工程化，采用遺傳操作過的病毒反向遺傳學或重排列，以表達完整的外來抗原決定簇，如，其它感染病原體的抗原、腫瘤抗原、或靶抗原。由于NS RNA片段是八種病毒RNA中最短的，因此有可能NS RNA將比其它病毒基因能夠容納更長的異源序列的插入。此外，NS RNA片段在被感染的細胞內(nèi)指導高水平蛋白的合成，暗示著它對于外來抗原的插入可能將是一種理想的片段。然而，依據(jù)本發(fā)明，感冒病毒的8個片段之任一個均可用于異源序列的插入，例如當需要表面抗原遞呈時，可以采用編碼結構蛋白的片段，如，HA或NA。
5.2 基于宿主-限制性的選擇系統(tǒng)本發(fā)明包括選擇具有理想表現(xiàn)型的病毒的方法，即，具有低的或無IFN拮抗活性的病毒，無論是來自天然的變體、自發(fā)的變體(即，在病毒復制過程中發(fā)展起來的變體)、誘變的天然變體、重排列體和/或遺傳操作的病毒。這些病毒最好以差示生長鑒定方式篩選，其是將在IFN-缺陷型同IFN-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中的生長進行比較。挑選表現(xiàn)出在IFN-缺陷型系統(tǒng)內(nèi)的生長比在IFN-產(chǎn)生型系統(tǒng)內(nèi)地生長好的病毒；優(yōu)選的，挑選在IFN-缺陷型系統(tǒng)內(nèi)生長比在IFN-產(chǎn)生型系統(tǒng)內(nèi)生長的滴度至少高一個對數(shù)的病毒。
可選地，可以采用IFN分析系統(tǒng)篩選病毒，如，基于轉錄的分析系統(tǒng)，其中報告基因的表達受一種IFN應答啟動子的控制?？梢詼y定報告基因在被感染/未感染的細胞內(nèi)的表達，以鑒定有效誘導IFN應答、但不能夠拮抗IFN應答的病毒。然而，在一個優(yōu)選的實施例中，采用差示生長分析來挑選具有理想表現(xiàn)型的病毒，因為所使用的宿主系統(tǒng)(IFN-產(chǎn)生型比IFN-缺陷型)施加了適當?shù)倪x擇壓力。
例如，可以在多種表達IFN及IFN應答元件的細胞、細胞系、或動物模型系統(tǒng)與IFN或IFN應答元件缺陷的細胞、細胞系、或動物模型系統(tǒng)之間比較病毒生長(通過滴度測定)。為此，可以比較病毒在細胞系內(nèi)的生長，如VERO細胞(其為IFN-缺陷型)/MDCK細胞(其為IFN-產(chǎn)生型)?？蛇x地，IFN-缺陷型細胞系可以來自或建立于動物繁殖的或遺傳操作以成為INF系統(tǒng)缺陷型(如，STAT1-/-突變小鼠)?？梢詼y定病毒在這些細胞系內(nèi)的生長/在IFN-產(chǎn)生型細胞衍生、例如，來自野生型動物(如，野生型小鼠))的細胞系內(nèi)的生長的比較。在又另一個實施例中，可以將IFN-產(chǎn)生型的及已知能夠支持野生型病毒的生長的細胞系工程化為IFN-缺陷型，(如，通過敲除STAT1、IRF3、PKR，等。)可以采用工藝上熟知的、用于病毒在細胞系內(nèi)復制的技術(見，例如，在下文中的工作實施例)?？梢员容^病毒在標準IFN產(chǎn)生型細胞系/IFN缺陷型遺傳操作過的細胞系內(nèi)的生長。
也可以采用動物系統(tǒng)。例如，對于流感病毒，在未成熟的、IFN-缺陷型含胚卵(如，大約6至8天齡)內(nèi)的生長，可以同在較老的、IFN-產(chǎn)生型卵(如，大約10至12天齡)內(nèi)的生長進行比較。為此可以采用工藝上熟知的、用于在卵內(nèi)感染和復制的技術(如，見在下文中的工作實施例)。可選地，可以將在IFN-缺陷型STAT1-/-小鼠內(nèi)的生長同在IFN-產(chǎn)生型野生型小鼠內(nèi)的生長進行比較。在又另一個實施例中，可以將在由，如，STAT1-/-轉基因家禽產(chǎn)生的IFN-缺陷型含胚卵內(nèi)的生長同在由野生型家禽產(chǎn)生的IFN-產(chǎn)生型卵內(nèi)的生長進行比較。
然而，為了篩選的目的，可以采用瞬時IFN-缺陷型系統(tǒng)以替代遺傳操作的系統(tǒng)。例如，宿主系統(tǒng)的處理可以用抑制IFN產(chǎn)生的化合物和/或IFN應答的組分(如，藥物、抗IFN的抗體、抗IFN-受體的抗體、PKR抑制物、反義分子和核糖酶，等)。可以比較病毒在IFN-產(chǎn)生型未經(jīng)處理的對照內(nèi)的生長和在IFN-缺陷型處理過的系統(tǒng)內(nèi)的生長。例如，在用待篩選的病毒感染之前，IFN-產(chǎn)生型的較老的卵可以用這些藥物預處理。將其生長與在未處理的相同天齡的對照卵內(nèi)的生長進行比較。
本發(fā)明的篩選方法提供了一種鑒定具有消除的IFN拮抗活性的突變體病毒的簡單且容易的方法，通過將這些突變體病毒無能力在IFN-應答環(huán)境中生長，同這些突變體病毒能夠在IFN-缺陷型環(huán)境中生長相比。本發(fā)明的篩選方法也可以被用于鑒定具有改變的、但不是消除的IFN拮抗活性的突變體病毒，通過測定這些突變體病毒在IFN-應答(如，10-天齡含胚卵或MCDK細胞)及IFN-缺陷(如，6-至7-天齡含胚卵或Vero細胞)環(huán)境中都能夠生長的能力。例如，在10-天齡卵內(nèi)的生長低于6-7天齡卵內(nèi)的生長至少一個對數(shù)的滴度的流感病毒將被認為它們抑制IFN應答的能力受損傷。在另一個實施例中，在12-天齡卵(其具有(mount)一種高IFN應答)內(nèi)的生長低于10天齡卵(其具有(mount)一種中等IFN應答)內(nèi)的生長至少一個對數(shù)的滴度的流感病毒將被認為它們拮抗IFN應答的能力受到部分損傷，并且被認為是具有吸引力的疫苗候選者。
本發(fā)明中的選擇方法也包括鑒定誘導IFN應答的突變體病毒。依據(jù)本發(fā)明的選擇方法，IFN應答的誘導的測定可以通過測定各種水平，包括IFN表達、或在突變體病毒感染之后或涉及IFN表達和/或IFN應答的轉催化劑的活化而由IFN誘導的靶基因表達、或報告基因表達。
在本發(fā)明選擇系統(tǒng)的又另一個實施例中，IFN應答的誘導的確定可以通過在待測試的突變體病毒(如，IRF-3，其響應雙鏈RNA被磷酸化)感染之后測定IFN途徑中的組分的磷酸化狀態(tài)。響應I型IFN、Jak1激酶和TyK2激酶，IFN受體的亞基，STAT1，和STAT2迅速被酪氨酸磷酸化。因此，為了確定突變體病毒是否誘導IFN應答，將細胞，如293細胞，用待測試的突變體病毒感染并在感染之后，裂解細胞。IFN途徑組分，如Jak1激酶或TyK2激酶，采用特定的多克隆血清或抗體，從被感染的細胞溶解產(chǎn)物中被免疫沉淀下來，激酶的酪氨酸磷酸化狀態(tài)的確定是通過用抗-磷酪氨酸抗體進行免疫印跡分析(如，見Krishnan等1997，歐洲生物化學雜志247:298-305)。在突變體病毒感染之后，IFN途徑中任何組分的磷酸化狀態(tài)的增強均表明突變體病毒誘導了IFN應答。
在又一個實施方案中，本發(fā)明的選擇系統(tǒng)包括測定響應病毒感染誘導的轉錄因子(如，IRF3、STAT1、STAT2，等)結合特定的DNA序列或轉運的能力。特別地，STAT1和STAT2是磷酸化的，并且響應I型IFN從細胞質(zhì)到細胞核被轉運。轉錄因子結合特定的DNA序列或轉運的能力可以通過本工藝熟練人員了解的技術進行測定，如，電遷移率變動分析、細胞染色，等。
在本發(fā)明選擇系統(tǒng)的又另一個實施例中，IFN應答的誘導的測定可以通過在待測病毒感染之后，測定IFN-依賴的轉錄活化。在該實施例中，已知由IFN誘導的基因的表達，如，Mx、PKR、2-5-寡聚腺苷酸合成酶、主要組織相容性復合物(MHC)I型，等，可以通過本工藝熟練人員了解的技術進行分析(如，RNA印跡、蛋白質(zhì)印跡、PCR，等)。可選地，在一種干擾素激活的應答元件(如IFN-激活的ISG-54K基因的啟動子)的控制下，將待測細胞(如人胚腎細胞或人骨肉瘤細胞)工程化成瞬時或組成型表達報告基因(如熒光素酶報告基因或氯霉素轉移酶(CAT)報告基因)(Bluyssen等，1994，歐洲生物化學雜志220:395-402)。用待測的突變體病毒感染細胞，并將報告基因的表達水與在未感染的細胞內(nèi)或在野生型病毒感染的細胞內(nèi)進行比較。在用待測的病毒感染之后，報告基因表達水平的提高將表明待測的突變體病毒誘導了IFN應答。
在由另一個實施例中，本發(fā)明的選擇方法包括測定IFN的誘導，通過確定待測的突變體病毒感染的細胞或卵的抽提物是否能夠提供抗病毒感染的保護性活性。更具體地，用待測的突變體病毒或野生型病毒感染10-天齡含胚雞卵的組群。感染約15至20小時以后，收集尿囊液并測定IFN活性，通過確定在組織培養(yǎng)細胞(如CEF細胞)內(nèi)抗VSV感染的保護性活性的最大稀釋度。
5.3 病毒在干擾素缺陷型生長培養(yǎng)基中的增殖本發(fā)明也包括用于具有改變的IFN拮抗活性的、天然發(fā)生的或工程化過的突變體病毒的生長或分離的，方法和IFN-缺陷型培養(yǎng)基?？梢员挥糜谥С譁p毒的突變體病毒生長的IFN-缺陷型培養(yǎng)基包括，但不局限于IFN缺陷型的天然發(fā)生的細胞、細胞系、動物或含胚卵，如，Vero細胞、未成熟的含胚卵；工程化為IFN缺陷型的重組細胞或細胞系，如，來自STAT1敲除小鼠或其它類似工程化的轉基因動物的IFN-缺陷型細胞系；來自IFN缺陷型鳥類的含胚卵，尤其是家禽(如，家雞、家鴨、火雞)，包括被培育成IFN-缺陷型的組群(flock)或轉基因鳥類(如，STAT1敲除)。可選地，宿主系統(tǒng)，細胞、細胞系、卵或動物可以被遺傳操作以表達編碼IFN系統(tǒng)的抑制物的轉基因，如，顯性陰性突變體，如缺乏DNA結合功能區(qū)的STAT1、反義RNA、核糖酶、IFN產(chǎn)生的抑制物、IFN信號傳遞的抑制物、和/或由IFN誘導的抗病毒基因的抑制物。應該了解的是被培育或遺傳操作以成為IFN缺陷型的動物將存在一定的無免疫應答的，應當保持在一種控制的、無疾病的環(huán)境下。因此，應當采取適當?shù)拇胧?包括食用抗生素的使用)以減少轉基因IFN缺陷型動物(如成群培育的母雞、家鴨、火雞，等)暴露在感染因子中的危險性?？蛇x的，宿主系統(tǒng)，如，細胞、細胞系、卵或動物可以用一種抑制IFN產(chǎn)生和/或IFN途徑的化合物進行處理，如，藥物、抗體、反義分子、靶向STAT1基因的核糖酶分子、和/或由IFN誘導的抗病毒基因。
依據(jù)本發(fā)明，未成熟的含胚雞卵包括的卵作為一種自然的過程最高可達、但不到10-天齡的卵，優(yōu)選的是6-至10-天齡，但不到10-天齡，作為生長條件的選擇的結果，如，在孵育溫度上的改變；藥物處理；或其它任何導致卵遲滯發(fā)育的改變，以至該卵的IFN系統(tǒng)相比于10-至12-天齡的卵是不完全發(fā)育的。
5.3.1 天然的IFN缺陷培養(yǎng)基在一個實施方案中，本發(fā)明涉及天然發(fā)生的和工程化突變的病毒在非傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中的生長，如還沒有發(fā)育一個IFN系統(tǒng)的未成熟的含胚卵。由于脆弱的狀態(tài)和較小的尿囊體積，未成熟的含胚卵通常不用于培養(yǎng)病毒。本發(fā)明包括在小于10天齡的含胚卵中生長突變體病毒；優(yōu)選的是在8-天齡的含胚卵中生長突變體病毒，最優(yōu)選是，在6至8-天齡的卵內(nèi)。
本發(fā)明也包括在細胞或細胞系中生長和分離具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒的方法，這些細胞或細胞系天然不具有一種IFN途徑或具有一種缺陷的IFN途徑或在IFN系統(tǒng)上具有一種缺陷，如，IFN的表達水平低于野生型細胞。在一個尤其優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及在Vero細胞中生長具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒的方法。
5.3.2 遺傳操作的IFN缺陷型培養(yǎng)基本發(fā)明涉及在一種遺傳操作的IFN缺陷型培養(yǎng)基中生長和分離具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒的方法。本發(fā)明包括轉基因鳥類，其中IFN系統(tǒng)的一種必需基因，如，STAT1被突變，其將產(chǎn)下IFN缺陷型的卵。本發(fā)明進一步包括轉基因以表達顯性陰性轉錄因子的鳥類，如，缺少DNA結合功能域的STAT1、核糖酶、反義RNA、IFN產(chǎn)生的抑制物、IFN信號傳遞的抑制物、以及響應IFN誘導的抗病毒基因的抑制物。采用來自一種IFN-缺陷型轉基因鳥類的卵的長處在于傳統(tǒng)的10天齡卵可以被用于生長病毒，因為其較大的尺寸，所有具有更高的穩(wěn)定性和更大的體積。在又另一個實施例中，可以將細胞系遺傳操作成為IFN缺陷型。本發(fā)明包括的細胞系，其中IFN合成、IFN途徑的必需基因和/或一種由IFN誘導的抗病毒基因被突變，如，STAT1。
本發(fā)明提供了重組細胞系或動物，尤其是鳥類，其中對于IFN途徑為必需的一種或多種基因，如，干擾素受體、STAT1等，已經(jīng)被破壞，即，為“敲除”；重組動物可以是任何動物，但在一個優(yōu)選的實施例中是鳥類，如，家雞、火雞、母雞、家鴨，等。(見，如，Sang,1994，生物技術趨勢12:415；Perry，等，1993,Transgenic Res.2:125；Stern,C.D.,1996,Curr Top Microbiol Immunol212:195-206；和Shuman,1991,Experientia 47:897，為了關于鳥類轉基因的產(chǎn)生的回顧，各篇的全部內(nèi)容均作為參照結合于本說明書中)。這種細胞系或動物可以通過任何技術上已知的破壞細胞或動物染色體上的一個基因方法產(chǎn)生。這些技術包括，但不局限于前核微注射(Hoppe & Wagner,1989，美國專利編號4,873,191)；逆轉錄病毒介導的基因轉移到種系中；(Van der Putten等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.，美國82:6148-6152)；基因靶向胚胎干細胞(Thompson等，1989，細胞56:313)；胚胎的電穿孔(Lo,1983，分子細胞生物學3:1803)；以及精子一介導的基因轉移(Lavitrano等，1989，細胞57:717)；等。為了這些的回顧，見Gordon,1989，轉基因動物，Intl.Rev.Cytol.115:171，其全文均作為參照結合于本說明書中。
特別地，一種STAT1敲除小鼠的產(chǎn)生可以通過啟動其染色體上的一種STAT1基因同一種已經(jīng)被生物失活(優(yōu)選的是通過插入一段異源序列，如，一種抗生素抗性基因)的外來STAT1基因之間的同源重組。同源重組以在小鼠基因組中破壞基因的方法已經(jīng)被描述，如，在Capecchi(1989，科學244:1288)和Mansour等(1988，自然336:348)。
簡要地，一種STAT1基因克隆的全部或部分是從相同種類的基因敲除細胞或動物的基因組DNA中分離出來的。該STAT1基因組克隆可以通過任何工藝上已知的分離基因組克隆的方法進行分離(如，通過用一種來自一段STAT1序列的探針來探察基因組文庫，如見Meraz等，1996，細胞84:431；Durbin等，1996，細胞84:443，和本說明書中所引用的參考文獻中所描述的序列)。一旦分離出基因組克隆，即將該克隆的全部或部分引入到一個重組載體內(nèi)。優(yōu)選地，引入到載體內(nèi)的該克隆的部分至少包括STAT基因一個外顯子的一部分，即，包括一種STAT1蛋白的編碼序列。然后將一段不與STAT1序列同源的序列，優(yōu)選的是一種陽性選擇性標記，如一種編碼一種抗生素抗性基因的基因，引入到STAT1基因外顯子內(nèi)。選擇性標記優(yōu)選的是與啟動子操作性連接，更優(yōu)選的是與一種組成型啟動子。該非同源序列被引入到STAT1編碼序列的任何將破壞STAT1活性的位置，如，在其中點突變或其它突變已經(jīng)被證明可以失活STAT1蛋白功能的位置。例如，但不是作為限制，非同源序列可以被插入到STAT1蛋白中含有所有或部分激酶功能域的片段的編碼序列上(如，編碼激酶功能域至少50、100、150、200或250個氨基酸的核苷酸序列)。
陽性選擇標記優(yōu)選的是一種新霉素抗性基因(neo基因)或一種潮霉素抗性基因(hygro基因)。啟動子可以是任何工藝上已知的啟動子；通過舉例的方式，啟動子的例子可以是磷酯酰甘油酸激酶(PGK)啟動子(Adra等，1987，基因60:65-74),polⅡ啟動子(Soriano等，1991，細胞64:693-701)，或MC1啟動子，其是一種工程化用于在胚胎衍生的干細胞內(nèi)表達的合成啟動子(Thomas&Capecchi,1987，細胞51:503-512)。一種選擇性標記(如抗生素抗性基因)的使用，使得可以挑選結合了靶載體的細胞(例如，neo基因產(chǎn)物的表達提供了對G418的抗性，hygro基因產(chǎn)物的表達提供了對潮霉素的抗性)。
在一個優(yōu)選的實施例中，一種用于同源的與非同源相反，載體的重組的反選擇步驟的陰性選擇性標記，被插入到STAT1基因組克隆插入物的外部。例如，這種陰性選擇標記是HSV胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)，其表達使細胞對更昔洛韋敏感。陰性選擇性標記優(yōu)選的是在一種啟動子例如，但不局限于PGK啟動子、PolⅡ啟動子或MC1啟動子的控制之下。
當發(fā)生同源重組時，載體中與STAT1基因同源、以及同插入到STAT1基因序列內(nèi)部的非同源的部分，被結合到染色體上的STAT1基因內(nèi)，載體的剩余部分丟失。因此，由于該陰性選擇標記是在與STAT1基因同源的區(qū)域的外部，發(fā)生同源重組的細胞(或它們的子代)，將不含有該陰性選擇標記。例如，如果該陰性選擇標記是HSV-tk基因，發(fā)生同源重組的細胞將不表達胸腺嘧啶激酶，并且將在暴露在更昔洛韋*中仍能生存。該過程允許了發(fā)生同源重組的細胞的選擇，同非同源重組相比，非同源重組中有可能該陰性選擇標記也同STAT1序列以及陽性選擇標記一起被結合到基因組上。因此，非同源重組在其中已經(jīng)發(fā)生的細胞將最有可能表達胸腺嘧啶激酶及對更昔洛韋*敏感。
一旦靶載體構建完成，即用一種限制性酶(靶載體中對于該酶有一單一性位點)使其線性化，并通過任何工藝上已知的方法(如通過電穿孔)將線性化的載體引入到胚胎衍生的干(ES)細胞內(nèi)(Gossler等，1986,Proc.Natl.Acad.Sci.美國83:9065-9069)。如果靶載體包括一個陽性選擇標記和一個陰性、反選擇標記，可以通過在選擇性培養(yǎng)基中的孵育來選擇同源重組在其中發(fā)生的ES細胞。例如，如果該選擇性標記是neo抗性基因和HSV-tk基因，則將細胞暴露于G41(如，大約300微克/毫升)和更昔洛韋(如，大約2μM)。
任何已知的基因分型的技術，例如但不局限于DNA印跡分析或聚合酶鏈式反應，均可以被采用以確定被破壞的STAT1序列已經(jīng)同源重組到ES細胞基因組的STAT1基因上。由于STAT1基因克隆的限制性圖譜是已知的，而且STAT1編碼序列的序列是已知的(見Meraz等，1996，細胞84:431；Durbin等，1996，細胞84:443450，所有本說明書中所引用的參考文獻)，因此可以確定來自被破壞的和沒有被破壞的等位基因中的DNA的特定限制性片段或PCR擴增產(chǎn)物的大小。因此，通過分析限制性片段或PCR產(chǎn)物(其大小在被破壞的和沒有被破壞的STAT1基因之間存在區(qū)別)，即可以確定同源重組是否發(fā)生以破壞STAT1基因。
然后可以將帶有破壞的STAT1位點的ES細胞通過微量注射引入到胚泡內(nèi)，然后可以采用常規(guī)的技術將胚泡移植到假孕小鼠的子宮內(nèi)。由移植的胚泡發(fā)育而來的動物是被破壞的等位基因的嵌合體。該嵌合雄鼠可以同雌鼠雜交，并且可以工程化該雜交使等位基因的生殖系傳遞與某一外表顏色的傳遞相連。等位基因的生殖系傳遞的確定，如以上所描述的，可以通過DNA印跡或PCR分析從組織樣品中分離出來的基因組DNA。
5.3.3 瞬時IFN缺陷型培養(yǎng)基細胞、細胞系、動物或卵可以用抑制IFN系統(tǒng)的化合物預處理。依據(jù)本發(fā)明，抑制IFN合成、或IFN系統(tǒng)組分的活性或表達的化合物具可以被用于預處理宿主，如，抑制IFN合成、IFN的活性、IFN受體、IFN信號傳導途徑中的其它靶物的化合物，或抑制由IFN誘導的抗病毒基因的活性的化合物?？梢砸罁?jù)本發(fā)明被使用的化合物的例子，包括，但不局限于，核酸分子、抗體、多肽、IFN受體的拮抗劑、STAT1途徑的抑制物、PKR的抑制物，等。依據(jù)本發(fā)明，核酸分子包括靶向編碼IFN系統(tǒng)必需組分(如，STAT1)的基因的反義分子、核糖酶和三股螺旋分子。核酸分子也包括編碼IFN系統(tǒng)組分的顯性陰性*突變體的核苷；如，在病毒突變體感染之前，可以用一種編碼IFN受體的截短的、無傳導信號能力的突變體的DNA轉染細胞。
可以依據(jù)本發(fā)明進行使用，以抑制IFN途徑的顯性-陰性*突變體包括Jak1、TyK2的激酶缺陷型或缺少DNA結合功能域STAT1、和STAT2的轉錄因子(見，如，Krishnan等，1997，歐洲生物化學雜志247:298-305)。
5.4 疫苗制劑本發(fā)明包括含有減毒的負鏈RNA病毒(其拮抗細胞IFN應答的能力受損)、和一種合適的賦形劑的疫苗制劑。用于疫苗制劑的病毒可以選自天然發(fā)生的突變體或變體、誘導突變的病毒或遺傳操作的病毒。被分段的RNA病毒的減毒的鏈也可以通過重排列結束產(chǎn)生，或者通過采用反向遺傳學方法和重排列的組合。天然發(fā)生的變體包括從天然分離的病毒、以及在病毒復制過程中自發(fā)產(chǎn)生的變體，具有受損的拮抗細胞IFN應答的能力。該減毒的病毒本身可以被用作疫苗制劑中的活性成分?？蛇x地，該減毒病毒可以被用作重組產(chǎn)生的疫苗的載體或“主鏈”。為此，可以采用重組技術，如反向遺傳學(或者，對于被分段的病毒，反向遺傳學和重排列技術的組合)來工程化突變或?qū)⑼鈦砜乖氲接糜谝呙缰苿┑臏p毒病毒內(nèi)。這樣，疫苗可以被工程化以對株系變體免疫，或者可選的，對完全不同的感染因子或疾病抗原免疫。
事實上，可以將任何異源基因序列構建到本發(fā)明的病毒內(nèi)以在疫苗中使用。優(yōu)選地，誘導對多種病原體中的任何一種的防護型免疫應答的抗原決定簇，或結合中和抗體的抗原可以被病毒表達作為病毒的部分被表達。例如，可以構建到本發(fā)明的病毒內(nèi)以在疫苗中使用的異源基因序列，包括但不局限于人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原決定簇如gp120；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；皰疹病毒糖蛋白(如，gD、gE)；脊髓灰質(zhì)炎病毒的VP1；非病毒病原體(如細菌和寄生蟲)的抗原決定簇，等等。在另一個實施例中，可以表達全部或部分免疫球蛋白基因。例如，模擬這些抗原決定簇的抗-獨特型免疫球蛋白的可變區(qū)域可以被構建到本發(fā)明的病毒內(nèi)。在由另一個實施例中，可以表達腫瘤相關的抗原。
可以配制活的重組病毒疫苗或失活的重組病毒疫苗?；畹囊呙缈赡苁莾?yōu)選的，因為在宿主內(nèi)的增殖導致與在自然感染中的發(fā)生類具有類似種類和量級的延長的刺激，因此，提供了重要的、長久的免疫。這種活重組病毒疫苗制劑的產(chǎn)生可以通過采用常規(guī)方法達到，包括病毒在細胞培養(yǎng)物內(nèi)或在雞胚的尿囊內(nèi)復制，接著進行純化。
疫苗制劑可以包括遺傳操作的負鏈RNA病毒，其在NS1基因或類似基因上存在突變，包括但不局限于在下文工作實施例中所描述的截短的NS1流感突變體。它們也可以采用天然的變體進行配制，如流感A的A/火雞/Ore/71天然變體、或流感B的B/201及B/AWBY-234天然變體。當作為一種活病毒疫苗配制時，應當采用每劑的范圍是從約104pfu至約5×106pfu。
可以采用多種方法以輸入以上所描述的疫苗制劑，這些包括但不局限于鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、口服、真皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、以及皮下途徑。可能優(yōu)選的是通過為此工程化疫苗的病原體的天然感染途徑、或通過母本減毒病毒的天然感染途徑輸入病毒疫苗制劑。當采用一種活流感病毒疫苗制劑時，可能優(yōu)選的是通過流感病毒感染的天然途徑輸入該制劑。流感病毒誘導充分分泌和細胞免疫應答的能力可以被有利地利用。例如，流感病毒的呼吸道感染可能誘導一種強的分泌免疫應答，例如在泌尿生殖系統(tǒng)中，一種特定疾病致病原的同時防護。
本發(fā)明這的一種疫苗，包括104-5×106pfu具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒，可以一次性施用。可選地，本發(fā)明中的一種疫苗，包括104-5×108pfu具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒，可以根據(jù)動物(優(yōu)選的是一種哺乳動物，更優(yōu)選的是人類)的需要經(jīng)常施用。
5.5 藥物組合物本發(fā)明包括含有具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒的藥物組合物，這些病毒可以用作一種抗病毒因子或抗腫瘤因子或用作抗IFN-敏感疾病的因子。該藥物組合物作為一種抗病毒預防藥具有實用性，也可以施用到處于已經(jīng)被感染或估計暴露于病毒的危險的患者體內(nèi)。例如，如果一個孩子在學校接觸了幾名患有流感的同學，他回家后其母親將施用本發(fā)明中的抗病毒藥物組合物給她自己、該小孩和其他家庭成員以預防病毒感染和后繼的疾病。旅行到世界部分地區(qū)，在該地區(qū)流行一種特定的傳染疾病(如，甲型肝炎病毒、瘧疾，等)，的人們也可以被治療。
可選地，這些藥物組合物可以被用于治療腫瘤或阻止腫瘤形成，如，在患有癌癥或存在發(fā)展腫瘤或癌癥的危險的患者中。例如，患有癌癥的患者可以被治療以預防進一步的腫瘤發(fā)生。可選地，能夠治療已經(jīng)或估計接觸過致癌物質(zhì)的患者；可以治療環(huán)境清理從業(yè)者，他們有可能接觸污染物(如，石棉)?？蛇x地，將接觸射線的患者可以在暴露之前或之后進行治療(如，暴露于高劑量射線的或必需服用致癌藥物的患者)。
本發(fā)明中的減毒病毒作為抗腫瘤劑的使用是以本申請人的發(fā)現(xiàn)為基礎的，即在其IFN-拮抗基因上含有一個缺失的減毒的流感病毒突變體，在小鼠中能夠降低腫瘤的形成。本發(fā)明的抗腫瘤特性可能至少部分與它們誘導IFN和IFN應答的能力相關?？蛇x地，本發(fā)明中的減毒病毒的抗腫瘤特性，可能與它們在腫瘤細胞內(nèi)的特異性生長并殺滅腫瘤細胞的能力相關，其中許多病毒已知在IFN系統(tǒng)中存在缺陷。不考慮擔負抗腫瘤特性的分子機制，本發(fā)明中的減毒病毒可以被用于治療腫瘤或用于預防腫瘤形成。
本發(fā)明進一步包括具有改變的IFN-拮抗劑表現(xiàn)型的突變體病毒，其在體內(nèi)靶向特定氣管、組織和/或細胞，目的是在局部誘導治療或預防效果。這種方法的一個優(yōu)點是本發(fā)明中的IFN-誘導病毒靶向特定的位點，如，在腫瘤的位置，以位點特異性的方式誘導IFN以得到治療效果，而不是系統(tǒng)性誘導IFN，這可能具有毒性作用。
本發(fā)明中的突變體IFN-誘導病毒可以用本說明書中所描述的方法進行工程化，以表達將使病毒靶向特定位點的蛋白或肽段。在一個優(yōu)選的實施例中，IFN-誘導病毒將被靶向腫瘤的位置。在該實施方案中，突變體病毒可以被工程化以表達一種識別腫瘤特定抗原的抗體的抗原結合位點，從而使該IFN-誘導病毒靶向腫瘤。在又另一個實施例中，其中被靶向的腫瘤表達一種激素受體，如乳腺或卵巢腫瘤表達的雌激素受體，IFN-誘導的病毒可以被工程化表達合適的激素。在又一個實施例中，其中被靶向的腫瘤表達一種生長因子(如，VEGF、EGF、或PDGF)的一種受體，IFN-誘導的病毒可以被工程化表達合適的生長因子或其部分。因此，依據(jù)本發(fā)明，IFN-誘導病毒可以被工程化表達任何靶基因產(chǎn)物，包括肽，蛋白，如酶、激素、生長因子、抗原或抗體，其將執(zhí)行使病毒靶向需要抗-病毒、抗細菌、抗-殺菌劑或抗-癌活性的位點的功能。
輸入的方法包括但不局限于真皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬腦膜外(epidural)、及口服途徑。本發(fā)明中的藥物組合物可以通過任何方便的途徑施用，例如通過灌輸或快速濃注、通過上皮或皮膚黏膜層(如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜，等)的吸收，也可以同其它生物活性因子結合施用。施用可以為系統(tǒng)性或局部性。另外，在一個優(yōu)選的實施例中，可能理想的是通過任何合適的途徑將本發(fā)明中的藥物組合物引入到肺內(nèi)。也可以采用肺部施用，如，通過施用一種吸入器或噴霧器，并用氣溶性因子配制。
在一個特定的實施例中，可能理想的是局部施用本發(fā)明中的藥物組合物到需要治療的部位；這可以通過，例如，但不是作為限制，外科手術的過程中局部融合，局部應用，如，手術之后結合傷口敷料，通過導液管的方式，通過栓劑的方式，或通過植入物的方式注射，上述植入物為多孔、無孔、或凝膠狀材料，包括膜，如sialastic*膜，或纖維。在一個實施例中，可以通過直接注射施用到惡性腫瘤或瘤或前瘤組織的位點(或前位點)。
在又一個實施例中，該藥物組合物可以控釋系統(tǒng)遞送。在一個實施例中，可以使用一種泵(見Langer,supra；Seften,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等，1980,Surgery 88:507；Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一個實施例中，可以采用聚合材料(見藥物施用的控制釋放，Smolen和Ball(編輯)，Wiley,New York(1984)；Ranger & Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也見Levy等，198S，科學228:190；During等，1989,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等，1989,J.Neurosurg.71:105)。在又一個實施例中，可以將一種控制釋放的系統(tǒng)放置在復合物靶位點(即，肺部)的附近，因此僅需要系統(tǒng)劑量的一部分(見，如，Goodson,1984，在藥物施用的控制釋放，上述，第2卷，第115-138頁)。其它控制釋放系統(tǒng)的討論在Langer的綜述中(1990，科學249:1527-1533)。
本發(fā)明中的藥物組合物包括一種治療上有效劑量的減毒病毒，及一種藥用載體，在一個特定實施例中，術語“藥用”表示經(jīng)聯(lián)邦或州政府的某一管理機構核準、或列于美國藥典或其它普遍公認用于動物(或更特別地是用于人類)的藥典中。術語“載體”表示一種藥物組合物與其一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以被用作液體載體，尤其是對于注射溶液。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸鹽、滑石粉、氯化鈉、干脫脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水乙醇等等。這些組合物可以采用的形式有溶液、懸液、乳劑、藥片、藥丸、膠囊、粉末、持續(xù)釋放的制劑等等。這些組合物可以配制成栓劑。口服制劑可以包括標準的載體，如制藥級的D-甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等。合適的藥劑載體的例子在E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”中被描述。這些組合物將包含治療上有效劑量的治療劑，優(yōu)選的是以純化的形式，同一種合適量的載體一起以提供適當?shù)厥┯玫交颊唧w內(nèi)的形式。其制劑應當適合施用的模式。
本發(fā)明中的藥物組合物的量，其將在治療一種特定的紊亂或癥狀中有效，將依賴于該紊亂或癥狀的本質(zhì)，并且可以通過標準的臨床技術確定。另外，可以選擇性地采取體外分析以幫助鑒定最優(yōu)的劑量范圍。在制劑中需要采用的精確劑量也將依賴于施用的途徑、及疾病或紊亂的嚴重程度，及其決定應當依據(jù)醫(yī)師的判斷及各患者的狀況。然而，施用的合適劑量范圍通常是大約104-5×106pfu并且可以一次性施用，或者如所需要的以多次間隔施用多次。本發(fā)明中包括104-5×106pfu具有改變的IFN拮抗活性的突變體病毒的藥物組合物，可以鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、肌肉或皮下施用。有效劑量可以從體外或動物模型測試系統(tǒng)得出的劑量應答曲線中推知。
6．實施例流感A病毒的
NS1截短突變體的產(chǎn)生和特性6.1 材料和方法流感A/PR/8/34病毒在37℃下、在10-天齡含胚雞卵中孵育。流感A病毒25A-1，一種含有來自耐低溫株系A/Leningrad/134/47/57的NS片段及PR8病毒的保留基因的重排列體(Egorov等，1994,Vopr.Virusol.39:201-205；Shaw等，1996，在流感病毒Ⅲ控制的選擇中,Brown,Hampson Webster編輯(Elsevier Science)第433-436頁)于34℃在Vero細胞中生長。25A-1病毒在哺乳動物細胞內(nèi)為溫度敏感型，并且被用作NS1/99轉染病毒獲救的一種輔助病毒。保存在含有1微克/毫升胰酶的最低必需培養(yǎng)基(minimal essentialmedium,MEM)中的Vero細胞和MDCK細胞(Difco Laboratories,Detroid,Michigan)被用于流感病毒的生長。Vero細胞也被用于NS1/99病毒的選擇、噬菌斑純化和滴定。MDCK細胞被保存在含有10％熱失活胎牛血清的DMEM(DuLbecco’s最低必需培養(yǎng)基)。Vero細胞在AIM-V培養(yǎng)基中生長(生命技術，Grand Island,NY)。
質(zhì)粒pT3NS1/99，包括NS1的99個氨基酸的C-末端截短形式，其構建如以下。首先，pPUC19-T3/NS PR8，含有PR8病毒的完整NS基因，其側翼為T3 RNA聚合酶啟動子和BpuAI限制性位點，采用適當?shù)囊锿ㄟ^反向PCR被擴增(Ochman等，1988，遺傳學120:621-623)。將由此得到的含有被截短的NS1基因的cDNA磷酸化，Klenow處理，自身連接并在大腸桿菌株系TG1中復制。純化之后得到的構建物命名為pT3NS1/99并通過測序鑒定。表達PR8病毒的NP、PB1、PB2、和PA蛋白的質(zhì)粒(pHMG-NP、pHMG-PB1、pHMG-PB2、和pHMG-PA)以前已被描述(Pleschka等，1996，病毒學雜志70:4188-4192)。pPOLI-NS-RB的產(chǎn)生是通過替換流感A/WSN/33(WSN)病毒NS基因的編碼區(qū)域的RT-PCR產(chǎn)物內(nèi)部的pPOLI-CAT-RT(Plesehka等，1996，病毒學雜志70:4188-4192)的CAT開讀框。該質(zhì)粒在一段被截短的人聚合酶I啟動子的控制下表達WSN病毒的NS-特異性病毒RNA片段。
NS1/99病毒的產(chǎn)生是通過核糖核蛋白酶(RNP)轉染(Luytjes等，1989，細胞59:1107-1113)。這些RNP的形成是通過T3 RNA聚合酶轉錄在BpuAⅠ位點被線性化的pT3NS1/99，存在純化的核蛋白和流感25A-1病毒的聚合酶的條件下(Enami，等，1991，病毒學雜志65:2711-2713)。RNP復合物被轉染到之前已經(jīng)被25A-1病毒轉染過的Vero細胞內(nèi)。將轉染后的細胞在37℃孵育18小時，上清在40℃下在Vero細胞內(nèi)傳代兩次，并在覆蓋有瓊脂鋪層培養(yǎng)基的Vero細胞內(nèi)將噬菌斑純化三次。通過RT-PCR，采用特定的引物分析所分離的NS1/99病毒。野生型轉染病毒的產(chǎn)生如下；如以上所描述的(Pleschka等，1996，病毒學雜志70:4188-4192)，在35-毫米培養(yǎng)皿中Vero細胞被質(zhì)粒pHMG-NP、pHMGPBI、pHMG-PB2、pHMG-PA和pPOLI-NS-RB轉染。轉染兩天以后，將細胞用5×104pfu的delNS1病毒轉染并在37℃再孵育兩天。細胞上清在MCDK細胞內(nèi)傳代一次并在雞胚卵內(nèi)傳代兩次。通過在卵內(nèi)進行有限稀釋以克隆轉染病毒。如以上所描述的，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化的NS1/99轉染體病毒的基因組RNA(Zheng等，1996，病毒學217:242-251)。NS1/99病毒表達被截短的NS1蛋白的鑒定是通過對標記的被感染細胞抽提物的進行免疫沉淀，采用了一種兔的抗NS1多克隆抗血清。
用大約103pfu的PRB、NS1/99、或delNS1(其中整個NS1基因被缺失)病毒接種含胚雞卵(6、10、和14天齡)的尿囊腔，在37℃孵育兩天，通過血細胞凝集(HA)分析以滴定存在于尿囊液中的病毒。
用5×106pfu、1.5×105pfu、或5×103pfu的野生型A/PR/8/34(PR8)或NS1/99病毒以鼻內(nèi)接種5只BALB/c小鼠(TaconicFarms)的組群。接種是在麻醉下進行的，采用50微升含有適當病毒的適當數(shù)目的噬菌斑形成單位的MEM。每天對動物進行監(jiān)視，在發(fā)現(xiàn)瀕死時將其處死。在一個后繼的實驗中，對所有存活的小鼠在四星期以后均施用100LD50劑量的野生型PR8病毒。在照料和使用實驗室動物上的所有操作均遵從NIH指導原則。
6.2 結果流感A病毒通過NS1缺失的減毒申請人先前已經(jīng)證明其中NS1基因被缺失的流感A病毒(delNS1病毒)，能夠在在I型干擾素(IFN)的產(chǎn)生上存在缺陷的細胞(如Vero細胞)內(nèi)生長到大約107pfu/ml滴度。然而，該病毒在其復制能力上存在損傷并在小鼠體內(nèi)引起疾病(Garcia-Sastre等，1998，病毒學252:324)。相反，delNS1病毒能夠在其中生長并殺死STAT1-/-小鼠。這些結果證明流感A病毒的NS1蛋白是一種毒性因子，其涉及由I型IFN調(diào)節(jié)的宿主抗病毒應答的抑制。以下實驗的構建是為了證明人們是否能夠通過缺失部分NS1基因，來產(chǎn)生毒性在野生型和delNS1病毒之間的流感病毒，以及這些病毒是否可能具有用作抗流感病毒的活減毒疫苗的最優(yōu)特性，即，穩(wěn)定性，和在減毒性、免疫原性以及在適合疫苗制備的培養(yǎng)基中生長之間的適當平衡，如含胚雞卵。
為了驗證該假說，構建一種流感A/PR/8/34(PR8)病毒，其中NS1基因已經(jīng)被修飾，目的是指導僅含有與野生型NS1蛋白的230個氨基酸共享的氨基末端99個氨基酸的、截短的NS1蛋白的表達。如以上所描述的(Garcia-Sastre等，1998，病毒學252:324)，該病毒(NS1-99)的獲得是通過使用25A-1輔助病毒，RNP轉染人工工程化的NS基因。對NS1在病毒感染的細胞內(nèi)表達的分析顯示了NS1-99病毒中NS1蛋白的被截短的本質(zhì)。
分析delNS1、NS1-99和野生型PR8病毒在不同天齡的含胚雞卵中的生長能力。本實驗的原理來自事實，即含胚卵在適當?shù)拇碳は潞铣珊蛻餓性IFN的能力是天齡依賴性的。事實上，IFN誘導力即應答均開始于大約10天齡，然后隨著天齡指數(shù)性提高(Sekellick等，1990,In Vitro Cell.Dev.Biol.26:997；Sekellick & Marcus,1985 J.Interferon Res.5:657)。因此，不同天齡的卵的采用代表了一個單獨的測定不同病毒抑制IFN應答的能力的系統(tǒng)。用大約103pfu的PR8、NS1-99或delNS1病毒接種6、10、和14天齡的卵，在37℃下孵育2天，通過紅血球凝集(HA)分析滴定存在于尿囊液中的病毒。如表3中所顯示的，其中野生型病毒在6、10、和14天齡的含胚卵內(nèi)生長到類似的HA滴度，delNS1僅在6-天齡的卵內(nèi)復制到可檢測的HA滴度。相反，NS1-99病毒表現(xiàn)出介于delNS1和野生型病毒之間的行為，能夠在10-天齡的卵內(nèi)，但不能在14-天齡的卵內(nèi)生長到類似于野生型病毒的HA滴度。
表3病毒在含胚雞卵內(nèi)的復制紅血球凝集滴度1病毒卵的天齡 6天 10天 14天WT PR822,048 4,0961,071NS1/99 N.D.32,048＜2delNS1 64＜2 ＜21滴度代表具有血凝活性的最高稀釋度2野生型流感A/PR/8/34病毒。3未確定NS1-99病毒的減毒特性接下來在小鼠中被證明。為了這一目的，用5×106pfu、1.5×105pfu、或1.5×103pfu的野生型PR8或NS1/99病毒鼻內(nèi)感染5只BALB/c小鼠的組群。然后在3周內(nèi)監(jiān)視小鼠的存活率。結果在表4中給出。NS1-99病毒的LD50至少高于野生型病毒的3個對數(shù)。表4．NS1-99病毒在小鼠內(nèi)的減毒性存活率病毒感染劑量(pfu):5×1061.5×1051.5×103WT PR811/51/5 1/5NS1-99 3/55/5 5/51野生型流感病毒A/PR/8/347．實施例流感B病毒NS1截短突變體的產(chǎn)生和特性7.1 材料和方法實驗細節(jié)同章節(jié)6.1.中的類似。兩種突變體流感B病毒，B/610B5B/201(B/201)和B/AWBY-234，全長(C-末端被截短的NS1蛋白)分別為127個氨基酸和90個氨基酸(Norton等，1987，病毒學156:204；Tobita等，1990病毒學174:314)，來自組織培養(yǎng)物中的在抗-A(H3N2)病毒抗體的存在下的，涉及B/Yamagata/1/73(B/Yam)和A/Aichi/2/68病毒共轉染實驗。將突變的流感病毒在不同天齡的含胚卵內(nèi)的生長同母本病毒B/Yam(其含有一種野生型281個氨基酸的NS1蛋白)的生長相比較。將6、10和14天齡的卵同大約103pfu的B/Yam、B/201或B/AWBY-234病毒一起孵育，在35℃孵育2天，并通過HA分析滴定存在于尿囊液中的病毒。
此外，確定了B/201和B/AWBY-234病毒在小鼠內(nèi)的減毒特性。用3×105pfu的野生型B/Yam或B/201和B/AWBY-234突變體病毒鼻內(nèi)感染三只BALB/小鼠的組群，并在感染后的第3天，通過測定病毒在肺部的滴度來確定這些病毒復制的能力，因為野生型B/Yam在小鼠中不能誘導疾病的明顯信號。
7.2 結果表5流感B病毒在含胚雞卵內(nèi)的復制紅血球凝集滴度病毒卵的天齡6天10天14天B/Yam 362256 ＜2B/201 32 ＜2 ＜2B/AWBY-2348 ＜2 ＜2從突變體和野生型流感B病毒在含胚雞卵內(nèi)的生長中獲得的結果，如表5中顯示，證明了，象在流感A病毒的情況下，流感B病毒NS1的羧基末端的截短在較老的含胚雞卵(其引起有效的IFN應答)內(nèi)導致了較低的復制產(chǎn)率。該發(fā)現(xiàn)暗示著流感B病毒的NS1涉及抑制宿主的IFN應答，并且在流感B病毒NS1基因上的缺失導致了一種減毒的表現(xiàn)型。
從在小鼠中的復制實驗得到的結果列于表6。B/201和B/AWBY-234病毒的滴度大約低于B/Yam滴度量級的三個對數(shù)，暗示著流感B病毒羧基末端功能域的截短導致了小鼠內(nèi)的一種減毒的表現(xiàn)型。
表6．流感B病毒在小鼠肺部內(nèi)的復制病毒轉染后第3天的肺部滴度(pfu/肺部)B/Yam 2×1041×1043×104B/201 30 ＜10 60B/AWBY-234 ＜10 40＜108．小鼠內(nèi)抗野生型流感病毒感染的防護，該小鼠被其NS1蛋白上含有缺失的流感A和B病毒免疫為了確定被含有截短的NS1蛋白的減毒流感A和B病毒免疫的小鼠是否被保護以抗它們各自野生型病毒的攻擊，進行了以下的實驗。用A/NS1-99病毒鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠，三周以后將它們用100 LD50的野生型流感A/PR/8/34病毒攻擊。保護被免疫的動物以防死亡，然而所有對照初次受試小鼠在感染之后均死亡(見表7)。在第二個實施例中，用流感B病毒B/201或B/AWBY-234(表達截短的NS1蛋白)鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠。三周以后，用3×105pfu的野生型流感B/Yam/1/73病毒感染小鼠。由于流感B病毒的這種株系在小鼠內(nèi)不誘導疾病癥狀，在攻擊后第3天通過測定病毒滴度來確定防護程度。然而初次受試對照動物的滴度大約為104pfu/肺部，但在被免疫動物的肺部沒有檢測到病毒(見表8)。這些發(fā)現(xiàn)表明含有被修飾的NS1基因的流感A以及流感B病毒能夠在小鼠中誘導一種免疫應答，其能夠完全防護后繼的野生型病毒的攻擊。
表7．被流感A/NS1-99病毒免疫過的小鼠在100 LD50野生型流感A/PR/8/34病毒入侵之后的存活率。
A/NS1-99病毒的免疫劑量存活的數(shù)目/總數(shù)5×106pfu 3/31.5×105pfu 4/4PBS0/5
表8．被流感B/201和B/AWBY-234病毒免疫過的小鼠在3×105pfu野生型流感B/Yamagata/73病毒入侵之后的肺部滴度。
免疫劑量肺部滴度(pfu/肺)3×105pfu B/201＜101,＜101,＜101,＜101,＜1013×105pfu B/AWBY-234 ＜101,＜101,＜101,＜101,＜101PBS 2.5×104,1×104,1.7×104,3×104,5×1049．實施例I型干擾素在被delNS1病毒感染之后的含胚卵內(nèi)的誘導delNS1病毒，一種缺乏NS1基因的流感A病毒，其在含胚雞卵內(nèi)誘導I型IFN的分泌能力如下檢測。為了這一目的，用5×103pfu的delNS1或野生型PR8病毒感染每組兩只10天齡的含胚雞卵的組群。在37℃孵育18小時以后，收集尿囊液并對酸性pH透析過夜，以失活感染病毒。在酸性pH處理之后，將樣品對PBS透析，通過確定在CEF細胞內(nèi)具有抗VSV感染(大約200 pfu)保護活性的最高稀釋度而測定IFN活性。如表9中所顯示的結果表明在NS1的缺乏下，流感A病毒是IFN的較高誘導者。
表9．IFN在卵內(nèi)的誘導病毒IFN(U/毫升)PR8 ＜16,＜16delNS1 400,400模擬＜16,＜1610．實施例delNS1病毒的抗病毒活性從流感A病毒中除去IFN拮抗(NS1)基因可以導致一種具有誘導高水平的IFN的能力的病毒的產(chǎn)生。如果情況是這樣的話，delNS1病毒將“干涉”IFN-敏感病毒的復制。為了測定這一可能性，申請人研究了在卵內(nèi)delNS1病毒抑制流感A/WSN/33(WSN)病毒(一種普遍使用的實驗室流感病毒株系)的復制的能力。如圖1中可以看出，僅用2pfu的delNS1病毒處理能夠誘導WSN病毒在尿囊液中的最終滴度降低一個對數(shù)。另外，用2×104pfu的delNS1病毒處理導致WSN在卵內(nèi)的復制幾乎完全被廢除。delNS1病毒也能夠干涉卵內(nèi)其它流感A病毒株系(H1N1和H3N2)、流感B病毒以及一種不同的病毒如仙臺病毒的復制(圖2)。
受到這些結果的鼓勵，本發(fā)明者們接著確定了delNS1病毒在小鼠體內(nèi)干涉野生型流感病毒復制的能力。雖然在組織培養(yǎng)物中用I型IFN處理在體外抑制了流感A病毒的復制，但在小鼠體內(nèi)用IFN處理不能夠抑制流感病毒的復制(Haller,1981,Current Top MicrobiolImmunol 92:25-52)。在對于大多數(shù)近交株系的小鼠是正確的，除了A2G小鼠。A2G小鼠，以及顯著比例的野生型小鼠(大約75％)，含有至少一個完整的M×1-/-等位基因，然而大多數(shù)實驗株系都是M×1-/-(Haller,1986,Current Top Microbiol Immunol 127:331-337)。M×1蛋白，人類M×A蛋白的一種同族蛋白(Aebi,1989,Mol.Cell.Biol.11:5062)，是流感病毒復制的一種有效抑制物(Haller,1980,自然283:660)。該蛋白不是組成型表達的，但其表達受I型IFN的轉錄誘導。因此，A2G小鼠可以被用于測定IFN-誘導物激活抗流感A病毒的抗病毒應答的能力(Haller,1981,Current Top MicrobiolImmunol 92:25-52)。
申請人用5×106pfu的高度病原性流感A/PR/8/34病毒隔離群鼻內(nèi)感染八只4-周齡的A2G小鼠(Haller,1981,Current TopMicrobiol Immunol 92:25-52)。一半的小鼠在PR8感染之前24小時接受了5×106pfu的delNS1的鼻內(nèi)處理。其它四只小鼠用PBS處理。檢測體重變化和存活率。這些結果證明delNS1處理能夠保護A2G小鼠抗流感病毒引發(fā)的死亡和體重減輕。同樣的處理在M×1-/-小鼠中是無效的，表明病毒防護基因是受M×1，即，IFN，介導的。
11．實施例delNS1病毒在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤特性假如I型IFN和/或I型IFN的誘導物已經(jīng)顯示出具有抗腫瘤活性(Belardelli和Gresser,1996今日免疫學17:369-372；Qin等，1998,Proc.Nati.Acad.Sci.95:14411-14416)，有可能用delNS1病毒處理腫瘤可以調(diào)節(jié)腫瘤的退化?？蛇x地，delNS1病毒可能具有瘤溶解特性，即，它有可能能夠特異性地在其中生長并殺滅腫瘤細胞，已知許多這些特性在IFN系統(tǒng)中是存在缺陷的。為了驗證delNS1病毒的抗腫瘤活性，采用肺部腫瘤轉移的小鼠腫瘤模型中的鼠科癌細胞系CT26.WT完成了以下實驗(Restifo等，1998，病毒學249:89-97)。靜脈內(nèi)注射5×105CT26.WT細胞到十二只6-周齡的BALB/c小鼠體內(nèi)。一半的小鼠在接種后的1、2和3天每隔24小時鼻內(nèi)處理106pfu的delNS1病毒。在腫瘤注射的十二天以后，殺死小鼠并計算肺部腫瘤轉移。如表10中所顯示的，delNS1處理介導了鼠科肺部腫瘤轉移顯著退化。
表10．delNS1病毒在注射過CT26.WT腫瘤細胞的BALB/c小鼠內(nèi)的抗腫瘤活性肺部腫瘤轉移的數(shù)目PBS-處理的delNS1-處理的小鼠1 ＞250 120小鼠2 ＞250 28小鼠3 ＞250 9小鼠4 ＞250 6小鼠5 ＞250 2小鼠6 ＞250 112．實施例NS1蛋白在流感病毒感染過程中抑制IRF-3的移位此處所描述的結果說明流感病毒的NS1蛋白是負責抑制抗病毒的I型IFN應答的，并且在該蛋白上的突變/缺失導產(chǎn)生了一種減毒病毒，因為在感染過程中IFN應答被增強。已知在病毒感染過程中I型IFN的合成可以被雙鏈RNA(dsRNA)攻擊。IRF-3是一種轉錄因子，發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物細胞的細胞質(zhì)內(nèi)常常以失活的形式存在。雙鏈RNA誘導轉錄因子IRF-3磷酸化(活化)，導致其移位到細胞核內(nèi)，它在該處誘導特定基因的轉錄，包括編碼I型IFN的基因(Weaver等，1998，分子細胞生物學18:1359)。為了確定流感病毒的NS1是否對IRF-3起作用，監(jiān)測IRF-3在被野生型PR8或delNS1感染的CV1細胞內(nèi)的定位。圖3顯示IRF-3的移位在PR8感染的細胞內(nèi)是最小的(小于細胞的10％)。相反，大約90％的delNS1-感染的細胞表現(xiàn)出IRF-3的核移位。引人注意的是，有可能通過從反式質(zhì)粒表達NS1來部分抑制IRF-3在delNS1-缺陷型細胞內(nèi)的移位。這些結果證明流感A病毒的NS1能夠在病毒-感染的細胞內(nèi)抑制IRF-3的移位。有可能流感病毒的NS1通過隱蔽病毒感染時產(chǎn)生的dsRNA來抑制dsRNA-介導的IRF-3活化，因此導致了IFN合成的抑制。
本發(fā)明不受所描述的特定實施例范圍的局限，它們僅作為本發(fā)明個別方面的單個說明，任何功能上等價的構造物或病毒均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，除了在本說明書中所表示和描述的以外，從以上的描述和附圖中，本發(fā)明中的各種變通對于本工藝的熟練人員將是很明顯的。這些變通落入附加的權利要求范圍之內(nèi)。
本說明書中引用了多種參考文獻，其中所公布的全部內(nèi)容均作為參考結合于本說明書中。
權利要求
1．疫苗制劑，包括具有干擾素拮抗表現(xiàn)型的減毒負鏈RNA病毒，其(a)負責減毒，及(b)在相同的條件下增殖，允許該減毒的病毒同在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)內(nèi)相比，在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)內(nèi)能夠生長到更高的滴度；以及藥用賦形劑。
2．如權利要求1中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒選自天然發(fā)生的病毒、誘導突變的病毒或重排列體。
3．如權利要求1中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒選擇遺傳操作的突變體。
4．如權利要求3中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒是表達外來病原體的抗原決定簇的嵌合體病毒。
5．如權利要求1、2、3或4中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒是流感病毒。
6．疫苗制劑，包括減毒的流感病毒，其在NS1基因上具有突變以負責減毒表現(xiàn)型，和藥用賦形劑。
7．如權利要求1、2、3或4中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒是一種呼吸道合胞病毒。
8．如權利要求1、2、3或4中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒是一種副流感病毒。
9．如權利要求1、2、3或4中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒是一種水泡性口炎病毒。
10．如權利要求1、2、3或4中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒是新城疫病毒。
11．如權利要求1中所述的疫苗制劑，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)為STAT1陰性，干擾素-產(chǎn)生型系統(tǒng)是STAT1陽性。
12．如權利要求5中所述的疫苗制劑，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
13．如權利要求8中所述的疫苗制劑，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
14．如權利要求9中所述的疫苗制劑，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
15．如權利要求10中所述的疫苗制劑，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
16．如權利要求1或11中所述的疫苗制劑，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
17．如權利要求12中所述的疫苗制劑，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
18．如權利要求13中所述的疫苗制劑，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
19．如權利要求14中所述的疫苗制劑，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
20．如權利要求15中所述的疫苗制劑，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
21．如權利要求5中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒的濃度為每劑大約104至大約5×106pfu。
22．如權利要求6中所述的疫苗制劑，其中減毒的病毒的濃度為每劑大約104至大約5×106pfu。
23．一種藥劑制劑，包括一種具有干擾素拮抗表現(xiàn)型的減毒負鏈RNA病毒，其(a)負責減毒，及(b)使得當在相同的條件下增殖時，同在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)內(nèi)相比，該減毒的病毒在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)內(nèi)能夠生長到更高的滴度；以及一種藥用賦形劑。
24．如權利要求23中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒選自天然發(fā)生的病毒、誘導突變的病毒或重排列體。
25．如權利要求23中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒選自遺傳工程化的突變體。
26．如權利要求25中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒是一種表達一種外來病原體的一種抗原決定簇的嵌合體病毒。
27．如權利要求23、24、25、或26中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒是一種流感病毒。
28．一種藥劑制劑，包括在NS1基因上具有一個突變以負責減毒表現(xiàn)型的減毒流感病毒，和藥用賦形劑。
29．如權利要求23、24、25、或26中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒是一種呼吸道合胞病毒。
30．如權利要求23、24、25、或26中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒是一種副流感病毒。
31．如權利要求23、24、25、或26中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒是一種水泡性口炎病毒。
32．如權利要求23、24、25、或26中所述的藥劑制劑，其中減毒的病毒是一種新城疫病毒。
33．如權利要求23中所述的藥物組合物，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)為STAT1陰性，干擾素-產(chǎn)生型系統(tǒng)是STAT1陽性。
34．如權利要求27中所述的藥物組合物，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
35．如權利要求30中所述的藥物組合物，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
36．如權利要求31中所述的藥物組合物，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
37．如權利要求32中所述的藥物組合物，其中干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)是一種大約6至大約8天齡的含胚雞卵，干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)是大約10至大約12天齡的含胚雞卵。
38．如權利要求23或33中所述的藥物組合物，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
39．如權利要求34中所述的藥物組合物，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
40．如權利要求35中所述的藥物組合物，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
41．如權利要求36中所述的藥物組合物，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
42．如權利要求37中所述的藥物組合物，其中在干擾素-缺陷型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度至少高于在干擾素-產(chǎn)生型宿主系統(tǒng)中復制的減毒病毒的滴度一個對數(shù)。
43．如權利要求27中所述的藥物組合物，其中減毒的病毒的濃度為每劑大約104至大約5×106pfu。
44．如權利要求28中所述的藥物組合物，其中減毒的病毒的濃度為每劑大約104至大約5×106pfu。
45．一種減毒的流感病毒，包括一種被修飾過的NS1基因和一種被改變的干擾素拮抗表現(xiàn)型。
46．如權利要求45中所述的減毒流感病毒，其中NS1基因在羧基末端被修飾或截短。
47．如權利要求45中所述的減毒流感病毒，其中NS1基因在氨基末端被修飾或截短。
48．如權利要求45中所述的減毒流感病毒，其是NS1/99。
49．一種接種某一患者的方法，包括將權利要求1或6中所述的疫苗制劑以引起免疫應答的有效劑量施用到該患者。
50．一種在某一患者體內(nèi)預防傳染性疾病的方法，包括將權利要求23或28中所述的藥物組合物以引起一種細胞干擾素應答的有效劑量施用到該患者。
51．一種在某一患者體內(nèi)治療或預防腫瘤的方法，包括將權利要求23或28中所述的藥物組合物以有效引起一種細胞干擾素應答或瘤溶解的劑量施用到該患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及,總的說來,具有拮抗細胞干擾素(IFN)應答的活性受損的減毒負鏈RNA病毒,以及這些減毒病毒在疫苗和藥劑制劑中的作用。本發(fā)明也涉及開發(fā)和應用IFN－缺陷系統(tǒng)以挑選這些減毒的病毒。特別地,本發(fā)明涉及對NS1基因具有修飾的減毒流感病毒,該修飾減弱或消除NS1基因產(chǎn)物拮抗細胞IFN應答的能力。該突變病毒在體內(nèi)復制,但表現(xiàn)出減弱的病原性,因此十分適用于活病毒疫苗,及藥劑制劑。
文檔編號C12N15/86GK1312725SQ99809582
公開日2001年9月12日 申請日期1999年6月11日 優(yōu)先權日1998年6月12日
發(fā)明者P·帕勒瑟, A·加西亞－薩斯特雷, T·穆斯特 申請人:紐約城市大學辛乃山醫(yī)科學校