專利名稱：用于生物樣品的高特異性同型半胱氨酸分析法的制作方法
本申請涉及生物液體，如尿、全血和血漿中的同型半胱氨酸的分析法。更具體地說，本發(fā)明涉及包含一種或多種同型半胱氨酸酶的酶制劑的用途和包含這些酶的診斷試劑盒。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)例中，同型半胱氨酸的濃度通過測定從中產(chǎn)生的硫化氫來確定。
K.S.McCully等(美國病理學(xué)雜志，56，pp.111-128，1969)首先報道了血漿同型半胱氨酸水平與心血管疾病危險的關(guān)系。McCully等確定了升高的血漿同型半胱氨酸濃度與動脈硬化疾病之間的相互關(guān)系。最近的研究證實(shí)甚至中等升高的血漿同型半胱氨酸水平是顯著增加的患冠心病疾病、腦血管疾病和外周血管疾病的危險的指標(biāo)。參見例如J.Selhub等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，32，pp.286-291，1995，和S.Kang等，營養(yǎng)年鑒，12，pp.279-298，1992。
在分析患心血管疾病的危險方面，有許多證據(jù)表明升高的同型半胱氨酸水平比升高的膽固醇水平可能是更好的危險指標(biāo)。例如，在一個研究中，高于正常值高限僅12％的血漿同型半胱氨酸濃度與增加3.4倍的心肌梗死危險相關(guān)(M.Stampfer等，美國醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志，268，pp.877-881，1992)。在診斷出心血管疾病之前抽血的另一研究中，一組271名男性(后來患有心肌梗死)顯示比后來未患有心肌梗死的對照病人明顯更高水平的同型半胱氨酸(參見P.Ueland等，心血管疾病，止血和內(nèi)皮功能，1992，p.183-236，MarcelDekker，紐約)。
O.Nygard等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，337(4)，pp.230-236(1997)報道總的血漿同型半胱氨酸是患有證實(shí)的冠狀動脈疾病的病人的死亡率的有力的指標(biāo)。
仍未獲得對其中同型半胱氨酸參與心血管疾病過程的分子機(jī)理的進(jìn)一步的認(rèn)識。提出同型半胱氨酸參與導(dǎo)致例如氧游離基的過度產(chǎn)生、彈性蛋白酶活化和鈣沉積(即斑的形成)的反應(yīng)。對于目前理論的綜述，參見K.McCully，天然藥物，2(4)，pp.386-389(1996)和K.S.McCully，臨床和實(shí)驗室科學(xué)手冊，23(6)，pp.477-493(1993)。循環(huán)的升高的同型半胱氨酸水平還可直接影響凝固過程(參見上面的O.Nygard等和該文引用的參考文獻(xiàn))。
因此，需要開發(fā)準(zhǔn)確的確定病人的同型半胱氨酸水平的方法，以及使得該分析方法成為標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)踐認(rèn)同的部分。如下所描述的，還非常需要能獲得對涉及異常同型半胱氨酸代謝的嬰兒疾病的廣泛的篩選，如高胱氨酸尿。
A.Araki等，色譜學(xué)雜志，422，pp.43-52(1987)描述了利用與硫醇特異性熒光劑反應(yīng)，接著用高壓液相色譜(HPLC)檢測以分離其它硫醇種類的用于血漿中游離和與蛋白質(zhì)結(jié)合的同型半胱氨酸的檢測方法。還參見N.P.B.Dudman等，臨床化學(xué)，42(12)，pp.2028-2032(1996)。用于臨床應(yīng)用的這些方法的缺點(diǎn)可能包括可被HPLC處理的樣品數(shù)的固有的限制，以及HPLC的使用可能不允許高生產(chǎn)率的篩選和在臨床實(shí)驗室可能不存在適宜的HPLC儀器。
Shipchandler等(參見臨床化學(xué)，41(7)，pp.991-994，1995)最近描述了用于同型半胱氨酸和同型胱氨酸(同型半胱氨酸的二硫鍵二聚體)的熒光極化免疫分析法。該分析法被報道證實(shí)了與半胱氨酸和甲硫氨酸的極小的交叉反應(yīng)。該分析法包括將同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為S-腺苷同型半胱氨酸，并且檢測是基于使用識別S-腺苷同型半胱氨酸的單克隆抗體，以及還有其熒光素類似物。然而，該檢測方法的可能的缺點(diǎn)可包括與單克隆抗體生產(chǎn)相關(guān)的成本和抗體的“非特異性”，即例如與S-腺苷甲硫氨酸的交叉反應(yīng)。此外，表明該方法僅可用僅可從一個來源獲得的特定的專利僅器來進(jìn)行。
K-W.Thong等(實(shí)驗寄生蟲學(xué)，63，pp.143-151，1987)描述了將同型半胱氨酸酶促轉(zhuǎn)化為α-丁酮酸、硫化氫和氨，接著用乙酸鉛測定硫化氫(還參見K-W.Thong等IRCS醫(yī)藥科學(xué)，13，pp.493-494，和pp.495-496，1985)。然而，沒有提議使用用于臨床診斷的所涉及的酶(例如來自寄生蟲陰道毛滴蟲)。此外，在臨床角度上，公開的方法未將同型半胱氨酸與半胱氨酸區(qū)分，它未計算在生物樣品中被二硫鍵鍵合或與蛋白結(jié)合的同型半胱氨酸部分。
包括使用來自細(xì)菌卵狀假單胞菌的微生物酶的另一種檢測同型半胱氨酸的方法公開在Yamaguchi等，Sapporo公共健康城市協(xié)會年報，No.20，pp.67-74，1993。由于同型半胱氨酸被認(rèn)為不穩(wěn)定，例如易于與蛋白形成二硫鍵，因此作者集中在檢測氨基酸甲硫氨酸作為測定同型半胱氨酸水平(如對于高胱氨酸尿)的一個間接的方法。
作為對同型半胱氨酸的一種間接的測定，該方法可能是不甚準(zhǔn)確的，并且由于生物樣品中的高本底水平的氨，代替產(chǎn)物硫化氫測定產(chǎn)物氨可能不甚敏感。還注意到氨分析法受污染的脫氨酶存在的不利影響，這可能是一個普遍存在的問題。類似地，由于生物樣品中的高本底水平，預(yù)期產(chǎn)物α-丁酮酸的分析是不甚有效的(對于分析方法，參見Y.Tan等，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，9，pp.233-245，1997)。
相對于本發(fā)明實(shí)例的另一個參考文獻(xiàn)是1997年5月20日提出的Sundrehagen的美國專利5,631,127。
隨著增加的心血管疾病中的同型半胱氨酸的作用的了解以及篩選病人患有心血管疾病的危險的公共健康目標(biāo)，非常需要可被用于準(zhǔn)確測定病人的同型半胱氨酸水平的新的分析方法。期望這些方法在升高的同型半胱氨酸濃度是特定疾病狀態(tài)的原因的那些情況和升高的同型半胱氨酸濃度是出現(xiàn)的疾病狀態(tài)的可檢測的副產(chǎn)物的情況中提供顯著的醫(yī)療益處。
這些分析方法還通過在可通過其它方法檢測其發(fā)生之前預(yù)測病人對心血管疾病的敏感性來提供很大的益處。在這方面，通過使該個方法適宜于一般人群，尤其是所有嬰幼兒的廣泛篩選實(shí)現(xiàn)很大的益處。
在這些改進(jìn)的分析方法的設(shè)計方面，開發(fā)可用于一步/酶分析中測定同型半胱氨酸的，但基本上對生物樣品中普遍存在的干擾濃度的半胱氨酸和甲硫氨酸是無活性的酶是很有價值的。如上所述，本發(fā)明提供具有該特異性的同型半胱氨酸酶。
本發(fā)明提供新的測定生物樣品中的同型半胱氨酸濃度的方法。在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方案中，生物樣品為尿、組織液、血液、血清或來自病人的血漿樣品，本發(fā)明的方法還可用于分析心血管疾病的危險。具體地說，本發(fā)明提供新的測定生物液體中的同型半胱氨酸濃度，同時避免測定相關(guān)的但為干擾性物質(zhì)，最具體地為半胱氨酸和甲硫氨酸的方法。
因此，提供測定存在于包含例如同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物樣品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括將實(shí)施樣品與能從同型半胱氨酸和半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫的酶制劑接觸，通過測定從同型半胱氨酸產(chǎn)生的硫化氫的量來確定所述樣品中同型半胱氨酸的量。在最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，酶制劑僅由一種相對于半胱氨酸，其對同型半胱氨酸的活性足以使得從半胱氨酸產(chǎn)生的硫化氫可被忽略的酶組成。
所述酶制劑包含一種被稱為同型半胱氨酸酶的并如下所述可能被稱為其它名稱的酶。此外，除非另有說明，術(shù)語“酶制劑”還應(yīng)被理解包括一個或多個等份試樣，即在分析方法的過程中可加入一種或多種酶的單劑量或多劑量，并且在患有過程中，術(shù)語的使用不局限于如何，多少次，等份試樣和步驟被用來加入所有必需的酶。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，認(rèn)識到存在于生物樣品，例如體液中的同型半胱氨酸的總濃度包括不以游離形式存在，而代之以與其它分子共價結(jié)合的同型半胱氨酸分子。本發(fā)明的方法提供其它用于在測定同型半胱氨酸來源的硫化氫之前釋放這些同型半胱氨酸的步驟。
然而，應(yīng)注意由于本發(fā)明的方法提供不存在來自相關(guān)物質(zhì)的干擾(例如半胱氨酸)的準(zhǔn)確的對游離同型半胱氨酸水平的測定，盡管僅檢測游離同型半胱氨酸，但對臨床醫(yī)生提供有價值的信息。在許多用途中，期望這些信息作為快速初級診斷工具極為有用，例如在所有新生嬰兒的檢測中。
本發(fā)明另外的具體實(shí)施方案包括區(qū)分同型半胱氨酸與在所述生物樣品中可能存在的任何半胱氨酸的方法。這些方法的代表為(I)一種方法，其中從同型半胱氨酸所的硫化氫區(qū)別于從半胱氨酸產(chǎn)生的硫化氫，所述方法包括如下的另外的起始步驟(a)將所述生物樣品與保護(hù)同型半胱氨酸免于所述酶制劑作用的試劑接觸；(b)讓所述酶制劑從存在于所述樣品中的半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫；(c)除去所述硫化氫；和(d)脫保護(hù)所述同型半胱氨酸，并加入另外量的酶制劑以從中產(chǎn)生硫化氫；和(II)一種方法，包括另外的起始步驟(a)將存在于所述生物樣品中的同型半胱氨酸與能將其轉(zhuǎn)化為可被分離的化合物的其它酶制劑接觸；(b)分離所述化合物；(c)在所述化合物被轉(zhuǎn)回為同型半胱氨酸的條件下，將所述化合物與酶制劑或其它試劑接觸；和(d)將如此產(chǎn)生的同型半胱氨酸與能從中產(chǎn)生硫化氫的所述酶制劑接觸
(III)一種方法，其中所述生物樣品被用使得半胱氨酸對所述酶制劑為非活性的試劑預(yù)處理；和(IV)一種方法，其中從中產(chǎn)生的硫化氫區(qū)別于從半胱氨酸產(chǎn)生的硫化氫，包括步驟(a)讓酶制劑從存在于所述樣品中的同型半胱氨酸和半胱氨酸產(chǎn)生分硫化氫，其中所述酶還從半胱氨酸以等于從中產(chǎn)生的硫化氫的量產(chǎn)生丙酮酸；(b)測定如此產(chǎn)生的丙酮酸的量，和(c)計算硫化氫的量從中產(chǎn)生的同型半胱氨酸的量，其中所述樣品被或任選不被分成第一部分和第二部分以進(jìn)行所述分析。
在很容易適宜于來自大量病人樣本的樣品的快速檢測的本發(fā)明尤其優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，提供一種測定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物樣品中的同型半胱氨酸的量的方法，包括步驟(a)將所述樣品分成2份，份1或1份2；(b)將份1與能將同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為不為同型半胱氨酸底物的底物的第一種酶制劑接觸，其中所述第一種酶制劑不將半胱氨酸認(rèn)作底物；(c)獨(dú)立地將份1和份2與包含能從同型半胱氨酸和半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫的同型半胱氨酸酶的第二種酶制劑接觸；(d)測定份1和份2產(chǎn)生的硫化氫的量；和(e)通過從份2的硫化氫的測定量減去份1的硫化氫的測定量計算所述生物樣品中的同型半胱氨酸的量，并將結(jié)果乘以2。
對于本發(fā)明的臨床實(shí)踐，提供了用于測定生物樣品中的同型半胱氨酸的量的診斷試劑盒，并且其中同型半胱氨酸包括從幾種來源的一種獲得的那些。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，診斷試劑盒包含(a)來自陰道毛滴蟲或假單胞菌屬(例如卵狀假單胞菌或惡臭假單胞菌)的同型半胱氨酸酶，和(b)至少一種能被用來測定在同型半胱氨酸酶反應(yīng)中形成的硫化氫的量的試劑。
在本發(fā)明的另一個方面，提供來自多于一個基因或其它多核苷酸的編碼同型半胱氨酸酶的嵌合核苷酸序列(無論DNA或RNA)，其中該序列的表達(dá)導(dǎo)致嵌合同型半胱氨酸酶的產(chǎn)生。對于本發(fā)明的實(shí)踐，該同型半胱氨酸酶具有有價值的特性，并且其優(yōu)選的實(shí)例包括包含來自陰道毛滴蟲或惡臭假單胞菌同型半胱氨酸酶的的氨基酸序列的嵌合酶。
因此，本發(fā)明提供兩種設(shè)計用于同型半胱氨酸的臨床分析的基本方法(1)使用新的分析方法以檢測同型半胱氨酸酶的反應(yīng)產(chǎn)物的增強(qiáng)生物樣品中的同型半胱氨酸的檢測，和(2)通過設(shè)計與其它含硫氨基酸相比具有顯著增加的對同型半胱氨酸的活性的同型半胱氨酸酶進(jìn)一步增強(qiáng)該分析方法的敏感性。
對于上面方法(2)，由SEQ ID NQ10編碼的蛋白質(zhì)的使用是具有代表性的。該同型半胱氨酸酶對半胱氨酸或甲硫氨酸為非活性的足以使例如在個體組織液、尿、血液、血清或血漿中存在的同型半胱氨酸的濃度可在一個分析步驟中測定，其中測定了兩種實(shí)施同型半胱氨酸酶對所述樣品中的同型半胱氨酸的反應(yīng)的一種或多種產(chǎn)物的量，并且其中所述測定基本上不受其中的半胱氨酸或甲硫氨酸的濃度的影響。
在一個優(yōu)選的方面，該同型半胱氨酸酶被模仿來自下面的同型半胱氨酸酶假單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬或毛滴蟲屬，在其一個實(shí)例中，該酶的一個或多個肽序列對應(yīng)地被SEQIDNO10的一個或多個同源肽序列取代，例如選自下面的那些(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(參見SEQIDNO10的殘基43-51)；(b)包含Leu的(a)的子集；(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(參見SEQIDNO10的殘基168-176)；(d)包含Glu的(c)的子集；(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(參見SEQIDNO10的殘基304-312)；(f)包含Tyr的(e)的子集。
在一個優(yōu)選的方面，該同型半胱氨酸酶為SEQIDNO10的置換變異體，插入變異體、缺失變異體或衍生物，其中所述變異體或衍生物具有一種或兩種下面的特性(a)在適宜的分析中，SEQIDNO10對同型半胱氨酸活性的至少約10％；和/或
(b)在適宜的分析中，不超過SEQIDNO10對同型半胱氨酸活性的約1000％。
本發(fā)明的其它方面包括(1)包含編碼具有該特異性的同型半胱氨酸酶的核苷酸序列的純化和分離的DNA分子，以及其中所述編碼序列可操作性地與能指導(dǎo)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的控制序列相連；和(2)適宜轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案為用于測定存在于包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的生物樣品中的同型半胱氨酸的量的方法，該方法包括測定從在由同型半胱氨酸酶催化的反應(yīng)中的同型半胱氨酸產(chǎn)生的產(chǎn)物的濃度，其中該產(chǎn)物也可通過所述同型半胱氨酸酶對所述樣品中的半胱氨酸反應(yīng)而產(chǎn)生，并且其中所述樣品包含其它干擾濃度的半胱氨酸，所述方法包括步驟(a)在存在允許半胱氨酸轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰半胱氨酸時，將所述樣品與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶一起保溫；(b)將從步驟(a)產(chǎn)生的混合物與同型半胱氨酸酶一起保溫，和(c)測定能從由同型半胱氨酸酶催化的反應(yīng)中的同型半胱氨酸和半胱氨酸產(chǎn)生的產(chǎn)物的濃度，并且其中優(yōu)選(1)使用作為同型半胱氨酸酶的對應(yīng)于SEQIDNO10的陰道毛滴蟲酶，或其殘基Met1至Leu396，和(2)使用大腸桿菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。還提供了診斷試劑盒，其為基于使用半胱氨酸t(yī)RNA合成酶的類似方法。
本發(fā)明的其它重要的特征包括用于個體生物樣品中的同型半胱氨酸的單個酶分析中的診斷試劑盒，所述試劑盒包含(a)同型半胱氨酸酶；和(b)至少一種能被用來測定由同型半胱氨酸酶對同型半胱氨酸反應(yīng)形成的產(chǎn)物硫化氫的量的試劑；其中所述同型半胱氨酸酶對半胱氨酸為非活性的足以使由所述同型半胱氨酸酶對半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)生的任何硫化氫基本上不干擾評價心血管疾病危險的所述試劑盒的使用。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，一般性的提供一種診斷試劑盒，其中包括的同型半胱氨酸酶具有這一特性，即當(dāng)例如在所述液體中同型半胱氨酸和半胱氨酸的濃度分別為約20umol和約300umol時，至少90％的在對同型半胱氨酸的分析中在接觸生物樣品時通過所述同型半胱氨酸酶作用產(chǎn)生的硫化氫是由所述同型半胱氨酸產(chǎn)生的。優(yōu)選地，包括的同型半胱氨酸酶具有這一特性，即至少約99％的在接觸所述生物液體時通過所述同型半胱氨酸酶作用產(chǎn)生的硫化氫來自同型半胱氨酸。例如可使用這些診斷試劑盒來準(zhǔn)確地測定生物液體中范圍為約1-500umol，或如需要更高的同型半胱氨酸濃度，其中在一個典型實(shí)例中，所述液體還包含0-約1000umol半胱氨酸。
對于這些試劑盒的使用以及本發(fā)明的其它分析方法，通常優(yōu)選包括使用二硫化物還原劑，如二硫蘇糖醇(“DTT”)，這樣還可檢測生物樣品中的與其它分子(如游離半胱氨酸，其它同型半胱氨酸分子或蛋白質(zhì)SH)經(jīng)二硫鍵結(jié)合的同型半胱氨酸分子。
根據(jù)緊接的對本發(fā)明的詳細(xì)描述描述了本發(fā)明其它代表性的實(shí)例和另外的方面。還應(yīng)認(rèn)識到不應(yīng)將本發(fā)明的實(shí)例看作依賴于或受任何涉及同型半胱氨酸在病理學(xué)過程中的作用的具體理論的限制。


圖1(A和B面)提供由mgl1基因編碼的陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶的氨基酸序列與由陰道毛滴蟲pAC2-1克隆編碼的氨基酸序列的比較。
圖2顯示對應(yīng)于半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸的pAC2-1克隆的同型半胱氨酸酶的比較性比活(單位/mg粗大腸桿菌提取物)。
圖3顯示對半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸(pAC2-1克隆，使用DEAE--Fast Flow方法純化)的同型半胱氨酸酶的比較性比活。
圖4顯示對半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸(pAC2-1克隆，使用鎳陽離子親合試劑純化)的同型半胱氨酸酶的比較性比活。
圖5顯示測定的對半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸(pAC2-1克隆)的Kcat值。
升高的血漿同型半胱氨酸水平被認(rèn)為是血管疾病的一個危險因素。同型半胱氨酸的動脈硬化特性被首先注意與極小組的總稱為高胱氨酸尿的遺傳疾病相關(guān)。該疾病狀態(tài)的特征在于通常比正常血液高10倍(或更高)的循環(huán)同型半胱氨酸水平。在這些情況下，在尿中還檢測到同型半胱氨酸。早期血管疾病與這種情況極為相關(guān)。例如，如果高胱氨酸尿未經(jīng)處理地被留下，約50％的病人患有血栓栓塞疾病，30歲年齡的死亡率為約20％(參見例如S.H.Mudd等，美國人類遺傳學(xué)雜志，37，pp.1-31，1985)。
由于多于75個流行病學(xué)或臨床研究目前已顯示總的同型半胱氨酸水平與冠狀動脈和外周動脈疾病、中風(fēng)和靜脈血栓形成之間的相互關(guān)系，醫(yī)學(xué)上顯著需要可準(zhǔn)確測定例如血漿中的同型半胱氨酸水平的診斷方法。如果該方法可適宜于大量病人或常規(guī)人群或新生嬰兒的大規(guī)模篩選，它還將是高等有利的。該分析方法的開發(fā)原則上受兩個相互關(guān)聯(lián)的困難的制約(1)同型半胱氨酸的化學(xué)和生化特性與其它包含巰基的生物分子的那些密切相關(guān)，包括氨基酸甲硫氨酸和半胱氨酸，因此改進(jìn)的用于同型半胱氨酸的分析方法必須是對同型半胱氨酸獨(dú)特反應(yīng)的。
(2)同型半胱氨酸是高活性的，并且在生理條件下除開同型半胱氨酸外還以許多形式存在，例如為二硫鍵連接的二聚體，與游離半胱氨酸經(jīng)二硫鍵連接的異源二聚體，為與血漿蛋白的半胱氨酸殘基經(jīng)二硫鍵連接的結(jié)合物和與其它蛋白質(zhì)氨基酸的R基團(tuán)(例如與蛋白質(zhì)賴氨酸的ε氨基)結(jié)合(通常作為N-?；苌?。這些結(jié)合形式極顯著地導(dǎo)致可能參與病理學(xué)過程的同型半胱氨酸的總量。還在僅在正常范圍之外的較少增加的條件下，在血漿中的同型半胱氨酸的濃度導(dǎo)致統(tǒng)計顯著的疾病危險(參見O.Nygard等，上文)，臨床分析提供檢測生物液體的總的同型半胱氨酸含量的能力是非常有用的。這說明游離同型半胱氨酸(或其中發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸的任何其它形式)可重復(fù)的檢測，但不存在來自其它物質(zhì)，如甲硫氨酸和半胱氨酸的干擾也為臨床醫(yī)生提供有價值的信息。
因此，本發(fā)明針對克服在對病人樣品的大規(guī)模篩選的條件下的上面的復(fù)雜性的同型半胱氨酸分析方法開發(fā)以及為此的試劑的選擇。
可用于本發(fā)明實(shí)踐中的同型半胱氨酸酶根據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐，用下文稱為“同型半胱氨酸酶”的酶酶促測定生物樣品中的同型半胱氨酸濃度，其被定義為能催化從同型半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫的反應(yīng)的酶。在通常的情況下，還產(chǎn)生氨和α-丁酮酸。如本文所描述的，優(yōu)選檢測稱為硫化氫，雖然產(chǎn)品氨和/或α-丁酮酸或其它產(chǎn)品也可被檢測。如本文所定義的同型半胱氨酸酶可催化涉及其它巰基化合物的反應(yīng)，并在文獻(xiàn)中獲得多個名稱；然而，如果它們擁有從同型半胱氨酸催化產(chǎn)生硫化氫的特性，則它們通常可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。
本發(fā)明實(shí)踐優(yōu)選的第一個同型半胱氨酸酶是來自細(xì)菌來源，惡臭假單胞菌的L-甲硫氨酸-α-脫氨-γ-巰基甲烷裂解酶(甲硫氨酸裂解酶)。該酶已由S.Ito等純化，生物化學(xué)雜志，79，pp.1263-1272(1976)，并被測定具有約170kDa的分子量。在S.Ito研究的內(nèi)容中，酶對甲硫氨酸進(jìn)行α-γ消除為α丁酮酸、甲硫醇和氨。如果同型半胱氨酸為底物，那么α丁酮酸、硫化氫和氨將是產(chǎn)生的產(chǎn)物。類似的酶已從卵狀假單胞菌分離，H.Tanaka等，生物化學(xué)雜志，16，pp.100-106(1977)。還開發(fā)了重組產(chǎn)生該假單胞菌屬酶的方法(參見Y.Tan等，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，9，pp.233-245，1997)，并且，在診斷試劑盒的成本和分析的可重復(fù)性方面，期望重組酶在本發(fā)明臨床實(shí)踐中的應(yīng)用提供優(yōu)勢。Tan等的參考文獻(xiàn)描述了包含單拷貝的酶編碼序列的稱為pAC1-1的克隆的構(gòu)建。稱為pAC1-11的串聯(lián)包含兩個拷貝的編碼序列另一個克隆已被構(gòu)建。使用PAC1-1結(jié)構(gòu)，pT7-7質(zhì)粒被用來構(gòu)建pAC1-11。在BamHI位點(diǎn)兩個編碼序列被連接在一起，第一個基因?qū)deI位點(diǎn)與BamHI位點(diǎn)連接，第二個基因?qū)amHI位點(diǎn)與另一個BamHI位點(diǎn)連接。
還測定了惡臭假單胞菌酶的底物特異性。例如，N.Esaki等，酶學(xué)方法，143，pp.459-465(1987)報道在相對活性大小上，針對甲硫氨酸的活性被指定為100，半胱氨酸為10和同型半胱氨酸為180。酶對于所有三種含硫氨基酸為活性的強(qiáng)調(diào)需要定義可恰當(dāng)測定硫化氫來源的臨床分析。應(yīng)注意到酶對于同型半胱氨酸比對于半胱氨酸的表觀10倍的優(yōu)選不能解釋為生物樣品中的半胱氨酸的濃度可能高-實(shí)際上大大高于同型半胱氨酸的濃度。使用現(xiàn)有技術(shù)已知的常規(guī)的篩選方法和分析法，適宜純化活性的同型半胱氨酸酶可來自其它假單胞菌屬的種或來自其它細(xì)菌。
另一組為可用于本發(fā)明實(shí)踐中的同型半胱氨酸酶的來源的微生物為毛滴蟲屬的種的寄生蟲和相關(guān)的原生動物。毛滴蟲屬是重要的尿道寄生蟲并為耐氧(但絕非厭氧)的具鞭毛原生動物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐優(yōu)選使用來自陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶。
為了抵銷宿主組織中氧的毒性，認(rèn)為毛滴蟲屬的種使用其硫醇代謝的能力，參見K-W Thong等，實(shí)驗寄生蟲學(xué).63，pp.143-151(1987)和本文引用的文獻(xiàn)。雖然在毛滴蟲屬的種之間發(fā)現(xiàn)了在同型半胱氨酸酶活性的相當(dāng)大的變化(本文稱為同型半胱氨酸脫硫酶活性)，通常篩選可獲得種類的可接受水平的酶活性。通常來講，在用于下述分析法中，優(yōu)選同型半胱氨酸酶應(yīng)具有至少約1單位/mg純化蛋白的比活，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知設(shè)計使用更多或更少量的具有不同酶活性的酶或酶制劑的這些分析法的改變的相關(guān)技術(shù)。注意到高度純化和活性惡臭假單胞菌酶具有約20單位/mg的比活(一個單位的酶活性可被描述為在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化的1mmol底物)(參見Y.Tan等，上文)。
上面的K-W.Thong等(1987)報道的“同型半胱氨酸脫硫酶活性”看來來自負(fù)責(zé)毛滴蟲屬中的甲硫氨酸純化分解活性的相同的酶，B.C.Lockwood和G.H.Coombs(生物化學(xué)雜志，279，pp.675-682，1991)后來提到甲硫氨酸-γ-裂解酶，其中還描述了該酶的純化。如上所述，來自陰道毛滴蟲的甲硫氨酸-γ-裂解酶(同型半胱氨酸)的使用優(yōu)選用于本發(fā)明的實(shí)踐中。
還優(yōu)選陰道毛滴蟲酶的重組形式的使用。一個可能的克隆方法遵循A.Marcos等的觀察結(jié)果，F(xiàn)EMS微生物通訊，135，pp.259-264(1996)，即陰道毛滴蟲基因可能具有很少的內(nèi)含子。因此，構(gòu)建基因組文庫(參見D.E.Riley等分子和生物化學(xué)寄生蟲學(xué)，51，pp.161-164，1992)，并用被預(yù)期反映一些部分保守序列的對應(yīng)于惡臭假單胞菌酶的DNA片段篩選。
Lockwood等還列舉了包括假單胞桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和氣單胞菌屬的種的其它具有甲硫氨酸-γ-裂解酶活性的細(xì)菌。
期望這些種類是可用于本發(fā)明實(shí)踐中的同型半胱氨酸酶活性的來源。期望提供有用的同型半胱氨酸酶的另外的生物為一些海藻(參見例如D.A.Gage等，自然，387，pp.981-897，(1997)，描述了具有廣泛甲硫氨酸相關(guān)代謝的種類)；硫細(xì)菌；和土壤或其它生活在極端環(huán)境條件下的微生物(參見例如R.A.Kerr，科學(xué)，276，pp.703-704，1997和E.Pennist，科學(xué)，276，pp.705-706，1997)?？蔀橥桶腚装彼崦割愋偷拿傅挠欣麃碓吹钠渌⑸锏膶?shí)例包括涉及牙周疾病的細(xì)菌，如能從半胱氨酸形成揮發(fā)性硫的那些。在這方面，參見S.Persson等，口腔微生物和免疫學(xué)，5(4)，pp.195-201，1990。
最后，對于可用于本發(fā)明實(shí)踐中的“同型半胱氨酸酶”的定義，在本文不應(yīng)局限的理解為硫化氫必須是該酶的產(chǎn)物。廣義上講，本發(fā)明提供高生產(chǎn)率的診斷方法，其允許對非常大量的包含同型半胱氨酸的樣品的進(jìn)行成本有效的分析，同時避免檢測干擾物。
因此，如果在可避免來自類似于同型半胱氨酸的物質(zhì)的干擾的條件下，該方法檢測這些代謝物，則期望分解同型半胱氨酸的其它酶可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。下面的實(shí)施例描述了準(zhǔn)確測定同型半胱氨酸，同時避免檢測干擾物的方法的大的圖譜。因此，理解下面公開的方法可被本領(lǐng)域技術(shù)人員修改用于使用許多其它對同型半胱氨酸作用的酶的檢測方法中。
嵌合同型半胱氨酸酶如上所述，在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，提供編碼嵌合同型半胱氨酸酶的來自多于一個基因(或其它多核苷酸，如cDNA或其它內(nèi)含子較少的序列)的嵌合核苷酸序列(DNA或RNA)。
這些同型半胱氨酸酶具有對于本發(fā)明極為有用的特性，其一個優(yōu)選的實(shí)例包括包含對應(yīng)于陰道毛滴蟲和惡臭假單胞菌同型半胱氨酸酶的氨基酸序列的嵌合酶。
認(rèn)為在各種條件下，惡臭假單胞菌同型半胱氨酸酶比陰道毛滴蟲酶更穩(wěn)定。作為其一個適宜的共有序列，參見B.Lockwood等，生物化學(xué)雜志，279，pp.675-682(1991)，純化中陰道毛滴蟲酶的回收非常低(參見p.679表2，稱為“甲硫氨酸γ裂解酶”)。因此，在本發(fā)明的實(shí)踐中，為了發(fā)揮其增強(qiáng)的穩(wěn)定性，在嵌合酶中優(yōu)選包括惡臭假單胞菌序列。
如上所討論的，不同的同型半胱氨酸酶對其各種含硫底物，例如半胱氨酸、甲硫氨酸和同型半胱氨酸具有各自不同的活性。雖然在特定的環(huán)境中具體反映條件的選擇可能影響表觀活性，但證據(jù)表明針對作為底物的同型半胱氨酸陰道毛滴蟲酶比惡臭假單胞菌酶具有更高的活性，而惡臭假單胞菌對作為底物的半胱氨酸或甲硫氨酸顯示更大的活性。在這方面，Lockwod等，1991，在其表4中報道的結(jié)果值得注意，因為陰道毛滴蟲酶的相對活性數(shù)據(jù)證實(shí)了非常顯著的“優(yōu)先權(quán)”將同型半胱氨酸作為底物(還參見其p.678報道的Km數(shù)據(jù))。這與N.Esaki等報道的上面對于惡臭假單胞菌酶的數(shù)據(jù)相反。
因此，用于本發(fā)明臨床診斷應(yīng)用中的同型半胱氨酸酶的特性可通過提供由于來自其兩個組成部分的種類的嵌合蛋白而產(chǎn)生的功能性特性的為嵌合分子的酶而得以改進(jìn)。尤其是，優(yōu)選選擇在本發(fā)明的嵌合同型半胱氨酸酶中包含本質(zhì)上導(dǎo)致其穩(wěn)定性的惡臭假單胞菌酶的區(qū)，同時還包含優(yōu)選增強(qiáng)對作為底物的同型半胱氨酸的活性的陰道毛滴蟲酶的區(qū)。
在該酶的設(shè)計方面，最近報道的陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶確實(shí)代表來自兩個基因的兩種蛋白質(zhì)種類是引人注意的(參見J.C.Mottram，序列直接送遞至Gene Bank，1997，7，17提交，陰道毛滴蟲mgl1基因，登記號AJ000486，NIDg2330884，和陰道毛滴蟲mgl2基因，登記號AJ000487，NIDg2330886)，如直接提出的，其全部序列被全部被本文引作參考。還參見1998，2，26公開的國際專利申請WO98/07872和A.McKie等，生物分析雜志，278，pp.5549-5556，1998。
由此，本發(fā)明提供包含編碼惡臭假單胞菌同型半胱氨酸酶的氨基酸序列和陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶的氨基酸序列(來自mgl1或mgl2或兩者)的從中可表達(dá)具有同型半胱氨酸酶活性的功能性蛋白的嵌合核苷酸序列的純化和分離DNA分子。在一個優(yōu)選的方面，核苷酸構(gòu)建物(或?qū)?yīng)于氨基酸構(gòu)建物)主要對應(yīng)于惡臭假單胞菌的核苷酸序列，因此提供包含惡臭假單胞菌同型半胱氨酸酶的編碼核苷酸序列的DNA分子，其中它的編碼所述酶的一個或多個氨基酸的一個或多個亞序列對應(yīng)地被一個或多個編碼陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶的對應(yīng)的氨基酸的亞序列取代。在本發(fā)明的一個實(shí)例中，mgl1基因編碼的陰道毛滴蟲酶在下文被稱為T1蛋白，mgl2基因編碼的陰道毛滴蟲酶在下文被稱為T2蛋白。
在嵌合多肽和編碼多核苷酸的選擇方面，下面的考慮值得注意。T1和T2蛋白由明顯類似的DNA序列所編碼。因此，通常希望是這樣的情況，將mgl1編碼亞序列置換入惡臭假單胞菌骨架中本質(zhì)上具有相同的效果，并產(chǎn)生本質(zhì)上類似于從等同的mgl2亞序列置換產(chǎn)生的那些的改進(jìn)。
然而，注意到存在有限數(shù)目的亞區(qū)，其中T1和T2序列基本不同，而同時T1序列(T2序列不甚如此)顯示與公開的惡臭假單胞菌序列本質(zhì)的同源性。的確，公開的惡臭假單胞菌序列顯示與T1序列顯著的同源性。
因此，本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方面，存在確定的陰道毛滴蟲酶的編碼序列區(qū)，其中T2序列和對應(yīng)的T1序列相互極為不同，然而T1序列本質(zhì)上與惡臭假單胞菌序列類似。不被理論所限制，認(rèn)為T2的這些編碼亞區(qū)提供唯一的插入至惡臭假單胞菌編碼提供針對同型半胱氨酸的嵌合種類的增強(qiáng)的活性的氨基酸序列區(qū)的多核苷酸中的機(jī)會，從而便于本發(fā)明的診斷方法。
由此，本發(fā)明提供包含惡臭假單胞菌同型半胱氨酸編碼序列的DNA分子，其中其各自編碼所述酶的一個或多個氨基酸的一個或多個亞序列對應(yīng)地被一個或多個各自編碼陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶的一個或多個對應(yīng)的氨基酸的核苷酸亞序列取代，并且其中所述產(chǎn)生的氨基酸取代選自(a)來自陰道毛滴蟲(T2)的Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO1)或其任何子集取代來自惡臭假單胞菌的Val-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu(SEQ ID NO2)或其任何子集；(b)來自陰道毛滴蟲(T2)的Asp-Val-Asp(SEQ ID NO3)或其任何子集取代來自惡臭假單胞菌的Glu-Leu-Lys(SEQ IS NO4)或其任何子集；(c)來自陰道毛滴蟲(T2)的Cys-His-Val-Val(SEQ ID NO5)或其任何子集取代來自惡臭假單胞菌的Ala-Leu-Gln-Leu(SEQ IS NO6)或其任何子集(d)來自陰道毛滴蟲(T2)的Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO7)或其任何子集取代來自惡臭假單胞菌的Gly--Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(SEQ IS NO8)或其任何子集；和(e)包含一種、兩種、三種或四種由上面(a)、(b)、(c)和(d)組提供的取代的所有組合。
對于上面列出的陰道毛滴蟲mgl2(“T2”)的氨基酸序列，應(yīng)注意到它們大致對應(yīng)于下面的氨基酸序列的位置Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(SEQ ID NO1)，大約226-237；Asp-Val-Asp(SEQ ID NO3)，大約318-320；Cys-His-Val-VAl(SEQ ID NO5)，大約331-335；和Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(SEQ ID NO7)，大約381-390。
對于本發(fā)明這方面的實(shí)例，上面列出的陰道毛滴蟲亞序列可被另外修飾以接受保守的氨基酸置換。此外，陰道毛滴蟲亞序列不需對應(yīng)地取代上面列出的惡臭假單胞菌序列，這樣例如陰道毛滴蟲亞序列可在附近被插入(即從中高達(dá)約10個氨基酸位置的距離)，同時靶定的惡臭假單胞菌序列部分或全部原位保留。此外，陰道毛滴蟲插入物可包含在其上述序列的N末端或C末端側(cè)發(fā)現(xiàn)的其它氨基酸的轉(zhuǎn)移，只要針對同型半胱氨酸的增加的活性的好處不因為降低的酶穩(wěn)定性而受損害。
適宜的嵌合編碼多核苷酸的構(gòu)建對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然易見的，并可包括定點(diǎn)突變或環(huán)出誘病較少或使用PCR技術(shù)。用于這些編碼多核苷酸表達(dá)的適宜的宿主細(xì)胞描述在例如Y.Tan等，蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，9，pp.233-245，1997。
用于缺乏對半胱氨酸的活性的一步分析法的同型半胱氨酸酶根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，還提供新的基本上對半胱氨酸為非活性的同型半胱氨酸酶，即任何該活性足夠低致使組織液、尿液、血液、血清或血漿樣品或其它來自人類個體的生物液體或樣品中存在的同型半胱氨酸的量可在一個酶分析法中測定--不需要校正還存在于樣品中的半胱氨酸和/或甲硫氨酸的量。當(dāng)認(rèn)識到這些生物樣品中的半胱氨酸是/或甲硫氨酸的濃度通常比其中的同型半胱氨酸濃度高很多，并且在一些疾病狀態(tài)尤其如此時，由于對簡易和快速同型半胱氨酸分析的廣泛的公共健康需要，這些發(fā)現(xiàn)的重要性對臨床醫(yī)生馬上為顯然易見的。雖然這些酶可能與甲硫氨酸反應(yīng)，但由于不同的可檢測反應(yīng)產(chǎn)物(硫化氫)產(chǎn)生，這通常是不相關(guān)的。
在這方面，由SEQIDNO10代表的新的陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶的活性尤其引人注意(參見實(shí)施例8，和圖2至4，下文將進(jìn)一步討論)。與對半胱氨酸比較，該酶對同型半胱氨酸的相對活性容易允許同型半胱氨酸的測定，而不需要校正存在于生物檢測樣品中的任何半胱氨酸。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施例中，該新的酶被模仿在各種微生物中發(fā)現(xiàn)的同型半胱氨酸酶，包括假單胞桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬氣單胞菌屬或毛滴蟲屬，尤其優(yōu)選的同型半胱氨酸酶來自陰道毛滴蟲，包括從其mgl1基因(SEQ ID NO11)或mgl2基因表達(dá)的那些。
在圖1中(面A和B)描述了兩種陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶的氨基酸序列，第一個來自本發(fā)明的新的克隆(pAC2-1)，第二個酶來自已知的mgl1基因(還參見SEQIDNO10和12用于氨基酸的比較；SEQ ID NO9和11用于編碼DNA的比較)。與mgl1比較，將看到pAC2-1特征在于三個不同(突變)的存在在氨基酸位置47，Phe變?yōu)長eu，在氨基酸位置172Asp變?yōu)镚lu，和在氨基酸位置308，Ser變?yōu)門yr。
通過摻入包括一種或多種這些不同(突變)的氨基酸置換產(chǎn)生的修飾的同型半胱氨酸酶的氨基酸序列尤其可用于本發(fā)明實(shí)例中。因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)例包括提供同型半胱氨酸酶以包含一種或多種選自下面的SEQIDNO10的(亞)序列(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(參見SEQIDNO10的殘基43-51)(b)包含Leu的(a)的子集；(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(參見SEQIDNO10的殘基168-176)(d)包含Glu的(c)的子集；(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(參見SEQIDNO10的殘基304-312)；和(f)包含Tyr的(e)的子集。
還應(yīng)注意到SEQIDNO10，即本發(fā)明優(yōu)選的同型半胱氨酸酶由從陰道毛滴蟲基因組DNA分離的基因的DNA序列(pAC2-1，參見SEQIDNO9)表達(dá)而來。相反，報道的mgl1和mgl2的分離看來涉及cDNA步驟。pAC2-1可能因此代表新的同型半胱氨酸酶毛滴蟲屬基因。
在一個代表性實(shí)例中，同型半胱氨酸酶模仿來自假單胞桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬氣單胞菌屬或毛滴蟲屬的酶，其中其起始多肽序列的一個或多個肽亞序列對應(yīng)地被一個或多個選自下面的SEQIDNO10的同源肽序列取代(a)Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(參見SEQIDNO10的殘基43-51)(b)包含Leu的(a)的子集；(c)Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(參見SEQIDNO10的殘基168-176)(d)包含Glu的(c)的子集；(e)Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(參見SEQIDNO10的殘基304-312)；和(f)包含Tyr的(e)的子集。
在這方面，術(shù)語“同源”的使用不表明該同源性是準(zhǔn)確的，但使用公知的模型的對這些序列的比較表明即使目前顯著不同，但這些序列可能來自共同的祖先基因或其子集。類似地，如本文使用的術(shù)語“突變”應(yīng)廣泛地被理解包括由天然或?qū)嶒炐缘热魏畏绞疆a(chǎn)生的修飾。
因此，通常優(yōu)選的實(shí)例包括模仿第一種毛滴蟲同型半胱氨酸酶的嵌合同型半胱氨酸酶，其中其一個或多個對應(yīng)于第二個毛滴蟲同型半胱氨酸的Leu47、Glu172和Tyr308殘基(來自pAC2-1，如SEQIDNO10所描述)的氨基酸對應(yīng)地被一個或多個所述Leu47、Glu172和Tyr308取代。
本發(fā)明另一個實(shí)例通過為SEQIDNO10的置換變異體、插入變異體、缺失變異體或其它衍生物的同型半胱氨酸酶確定，其中所述變異體或衍生物具有一種或多種下面的特性(a)在適宜分析法中，SEQIDNO10對同型半胱氨酸活性的至少約10％，優(yōu)選約至少25％，較優(yōu)選約至少50％(如實(shí)施例8所描述)；和/或(b)在適宜分析法中，SEQIDNO10對半胱氨酸或甲硫氨酸活性的不超過約1000％，優(yōu)選小于500％，較優(yōu)選小于200％(如實(shí)施例8所描述)。
該特性的范圍通常被認(rèn)為與半胱氨酸或甲硫氨酸比較，保持酶對同型半胱氨酸的的足夠的增強(qiáng)的活性以致一步法仍然可行，雖然理解在各個臨床應(yīng)用中對這一相對敏感性的準(zhǔn)確的要求可容易地被確定。例如，至少對于非患病的病人半胱氨酸通常被期望在尿樣中為低濃度。對于提供如例如通過適宜重組方法產(chǎn)生的來自其它生物的突變同型半胱氨酸酶，上面相關(guān)的提示被期望是有用的。由于該同型半胱氨酸酶對同型半胱氨酸的比活性比對半胱氨酸和甲硫氨酸高至少約100倍，因此由SEQ ID NO10代表的酶是尤其有用的實(shí)例。
在一個其中同型半胱氨酸酶被修飾以提高其用于一步分析法中的有用性的代表性實(shí)例中，如下改變(當(dāng)然通常通過修飾適宜的編碼DNA)野生型陰道毛滴蟲的氨基酸序列(來自mgl1，參見SEQ ID NO11和12)缺失Phe47、Asp172和Ser308其中的一個或多個，或被根據(jù)下式取代(1)對于Phe47，用Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met和Trp取代；(2)對于Asp172，用Glu、Gln或Asn取代；(2)對于Ser308，用Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr或Asn取代，其中如現(xiàn)有技術(shù)所認(rèn)識的，提示了相對保守的氨基酸置換，以及其在這方面的功效可通過常規(guī)實(shí)驗確定。
如下進(jìn)一步描述的(參見實(shí)施例7)，鎳-NTA親和純化方法(可從Qiagen公司購得，德國)可被用來易化同型半胱氨酸酶從大腸桿菌或其它被適宜同型半胱氨酸酶編碼DAN序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中的純化。這些方法利用了蛋白咪唑基選擇性地與固定在NTA樹脂介質(zhì)中的鎳陽離子的結(jié)合。在本發(fā)明這方面的一個優(yōu)選的實(shí)例中，通過修飾適宜的編碼DNA(參見SEQ ID NO9和10)，包含例如6個組成型組氨酸殘基的氨基末端的標(biāo)記被導(dǎo)入同型半胱氨酸酶中，從而便于其從宿主細(xì)胞物質(zhì)中的純化。
同型半胱氨酸酶SEQ ID NO10(還參見圖1AB)是包含一個或多個位于所述蛋白的天然Met1的N末端側(cè)的組氨酸的修飾的同型半胱氨酸酶的代表，其中所述修飾的酶對半胱氨酸或甲硫氨酸無活性，足以使存在于個體組織液、尿液、血液、血清或血漿中的同型半胱氨酸的濃度可通過在一步分析法中使用該酶來測定。在該分析法中，測定從所述修飾的同型半胱氨酸酶對同型半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)生的一種或多種產(chǎn)物的量，并且這些測定基本上不受樣品中半胱氨酸或甲硫氨酸濃度的影響。根據(jù)這方面的公開，可用于本發(fā)明實(shí)例中的同型半胱氨酸酶包含一個或多個，優(yōu)選2-15個，最優(yōu)選5-8個組成型地位于天然同型半胱氨酸酶Met1的N末端側(cè)的組氨酸殘基。
實(shí)施例實(shí)施例通過雙酶減法檢測包含半胱氨酸樣品中的同型半胱氨酸如下測定血漿樣品中的同型半胱氨酸的濃度。使用EDTA作為抗凝劑用標(biāo)準(zhǔn)真空器收集血樣(0.1-5.0ml)，接著離心制備血漿。
雖然希望血樣中的游離同型半胱氨酸的測定為臨床醫(yī)生提供提供有用的預(yù)測信息，但認(rèn)識到大部分同型半胱氨酸以與其它分子經(jīng)二硫鍵結(jié)合存在(例如游離半胱氨酸、其它同型半胱氨酸分子和可獲得的蛋白質(zhì)巰基基團(tuán))。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，通常優(yōu)選在方法中使用二硫化物還原劑(如二硫蘇糖醇，“DTT”)以使得能檢測更寬范圍的同型半胱氨酸分子。
還制備150單位/ml陰道毛滴蟲酶的同型半胱氨酸酶貯液。雖然取決于各種因素，包括樣品中的同型半胱氨酸的濃度，確切的活性要經(jīng)實(shí)驗者選擇，但酶貯液范圍通常為1-1000單位/ml，優(yōu)選100-200單位/ml。
如上所述，還優(yōu)選以類似的活性水平使用惡臭假單胞菌酶。
在緩沖液中為適宜稀釋度的血漿樣品被分成等體積的兩份，份1和份2。向份1中加入適宜量的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(“SAHH”)和一定量的腺苷(SAHH可來自真核和原核來源，提供了在陰道毛滴蟲中克隆它的方法，Bagnara等，分子和生物化學(xué)寄生蟲學(xué)，81，pp.1-11，1996)。在存在足夠的腺苷時，血漿中的同型半胱氨酸被轉(zhuǎn)化為S-腺苷同型半胱氨酸。份2體積不與SAHH反應(yīng)。
接著將陰道毛滴蟲同型半胱氨酸酶加入至份1和份2樣品中并反應(yīng)約10-30分鐘。優(yōu)選同型半胱氨酸酶的最終濃度為0.5-1單位/ml的范圍，雖然如所需可調(diào)節(jié)準(zhǔn)確的量。注意到保留在份1樣品中的腺苷防止水解反應(yīng)向反方向進(jìn)行，因此選擇其起始濃度應(yīng)考慮這一點(diǎn)。需要量考慮取決于選擇的SAHH，但有用的起始點(diǎn)為不少于存在的同型半胱氨酸的濃度。接著測定份1和份2的硫化氫，通過從份2中減去份1的硫化氫測定值，并將結(jié)果乘以2來計算存在于起始樣品中的同型半胱氨酸的量。通過將范圍為約0.1-1.0mol的乙酸鉛加入到樣品中，從而沉淀硫化物來進(jìn)行硫化氫的測定。在360nm或其它可測定不溶性沉淀的適宜波長下(如在可見光范圍)用標(biāo)準(zhǔn)分光光度計測定沉淀物。
可用于雙酶減法的實(shí)例中的另一種酶為胱硫醚β合成酶，它催化從同型半胱氨酸和絲氨酸產(chǎn)生胱硫醚骨架。對于血清或血漿樣品，可通過利用血液中相對高濃度的絲氨酸在胱硫醚方向驅(qū)動反應(yīng)。該酶適宜的來源包括從毛滴蟲屬、假單胞桿菌屬或來自哺乳動物組織，包括例如肝臟分離的物質(zhì)。該酶可以提供與上面對S-腺苷同型半胱氨酸水解酶描述的范圍相等的單位/ml的量使用。如上面與使用SAHH結(jié)合所述的，優(yōu)選采取步驟以防止該酶促反應(yīng)朝可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的反方向進(jìn)行?？赏ㄟ^將外源絲氨酸加入至反應(yīng)樣品中，或通過一旦完成對胱硫醚的轉(zhuǎn)化不可逆地抑制酶在胱硫醚方向驅(qū)動，接著保持反應(yīng)。適宜的抑制劑包括對活性位點(diǎn)具有高親和性的絲氨酸類似物。
可獲得其它基于雙酶減法的方法。最近公開的研究可能表明酶甲硫氨酸t(yī)RNA合成酶(甲硫氨酸t(yī)RNA合成酶)能接受同型半胱氨酸作為反應(yīng)物(參見H.Jakubowsky等，F(xiàn)EBS通訊，317，pp.237-246，1993)。因此，使用該酶可重復(fù)上面的結(jié)果。
實(shí)施例2另一種S-腺苷同型半胱氨酸水解酶法將根據(jù)實(shí)施例1產(chǎn)生的S-腺苷同型半胱氨酸進(jìn)行下面的操作在其產(chǎn)生后，將其分離，并在S-腺苷同型半胱氨酸被轉(zhuǎn)化回至同型半胱氨酸的條件下，與另外量的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶接觸；此后，將用所述酶制劑產(chǎn)生的同型半胱氨酸與同型半胱氨酸酶接觸以從中產(chǎn)生硫化氫。
實(shí)施例3通過直接酶促減法對包含半胱氨酸的樣品中的同型半胱氨酸的檢測在實(shí)施例1的起始步驟后，制備包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的血漿樣品。不將樣品分成份；相反，在存在的半胱氨酸與tRNA混合的條件下加入酶半胱氨酸t(yī)RNA合成酶樣品。酶可選自真核或原核生物，并且現(xiàn)有技術(shù)熟知其反應(yīng)條件。
接著，如上所述將缺乏半胱氨酸的樣品與同型半胱氨酸反應(yīng)，直接從硫化氫的測定值確定同型半胱氨酸的濃度。
在下面實(shí)施例10中提供另一種直接酶減法的實(shí)例，其基于可為真核或原核來源的酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶。描述了引入使用該酶的分析體系。
可用于缺失半胱氨酸的其它酶包括半胱氨酸氧化酶和胱硫醚β-合成酶。
實(shí)施例4檢測與其它生物分子結(jié)合的同型半胱氨酸的方法如上所述，同型半胱氨酸與其它生物分子結(jié)合存在于生物液體中，以這種形式“儲存”的同型半胱氨酸被認(rèn)為導(dǎo)致病理學(xué)過程。因此，可望確定總的同型半胱氨酸的量，這包括(1)同型半胱氨酸二聚體，(2)同型半胱氨酸/半胱氨酸異源二聚體，(3)同型半胱氨酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合物，其中同型半胱氨酸通過二硫鍵與蛋白質(zhì)的半胱氨酸結(jié)合，以及(4)同型半胱氨酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合物，其中同型半胱氨酸(包括其N-?；男问?與蛋白質(zhì)的氨基酸的R基團(tuán)結(jié)合，最顯著的是與蛋白質(zhì)賴氨酸的ε氨基結(jié)合。
對于形式(1)至(3)，還原溶液被用來釋放共價結(jié)合的同型半胱氨酸。在一個實(shí)施例中，制備約0.1M或更小的硼氫化鈉貯液或氰基氫硼化鈉溶液。通過室溫下，在pH6-8下將硼氫化物加入到血漿樣品中(在實(shí)施例起始步驟之后)達(dá)5分鐘來進(jìn)行反應(yīng)。消除過量的氫硼化物，接著將樣品進(jìn)行實(shí)施例1或3的酶促步驟。另外，樣品被根據(jù)下面的步驟進(jìn)一步處理，可用HCl中和硼氫化物。
然而，在某些環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)硼氫化鈉可使同型半胱氨酸酶變性，因此優(yōu)選使用DTT。
實(shí)施例5酸條件下的處理對于上面形式(4)，可以約50/50蛋白質(zhì)樣品的稀釋度使用6NHCl。氮?dú)夥障拢诜序v溫度下回流1-2小時后，真空下，將水從樣品中除去至完全干燥。如果與其它氨基酸結(jié)合，這釋放同型半胱氨酸，并且還完成同型半胱氨酸內(nèi)酯化過程。在干燥點(diǎn)，加入乙酸鈉(1M)和乙酸酐(10M)。沸騰溫度下再回流1小時以產(chǎn)生乙?；耐桶腚装彼崃蛄u丙酮。
通過蒸發(fā)除去酐至干燥。用乙醚選擇性地提取N-乙酰化的同型半胱氨酸硫羥丙酮。35℃下，真空蒸發(fā)乙醚。接著加入打開硫羥丙酮環(huán)的生理緩沖液(磷酸鹽緩沖液，pH7.5)。此時，進(jìn)行其中一個反應(yīng)。可接著加入同型半胱氨酸，反應(yīng)10-30分鐘，接著如上檢測硫化氫，或優(yōu)選加入豬腎脫乙酰酶以使同型半胱氨酸脫乙?；?，隨后加入同型半胱氨酸酶。
實(shí)施例6通過直接酶促減法檢測還包含半胱氨酸的樣品中的同型半胱氨酸的其它方法通常來講，這一另外的方法利用了這一事實(shí)，即通過同型半胱氨酸酶作用從半胱氨酸產(chǎn)生的丁酮酸可獨(dú)立于通過同型半胱氨酸酶對生物樣品，如血漿中存在的同型半胱氨酸和半胱氨酸作用產(chǎn)生的硫化氫而被檢測。因此，同型半胱氨酸的確定可通過一次減法來進(jìn)行。根據(jù)該方法，丁酮酸可通過任何數(shù)量的從中產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶來測定。類似的，可使用亮氨酸脫氫酶根據(jù)硫化氫確定α-丁酮酸(從同型半胱氨酸而非半胱氨酸產(chǎn)生)。
該方法的兩個基本過程，丁酮酸的檢測和硫化氫的檢測可在有適宜對照的情況下，在一個樣品中同時進(jìn)行，或它們可在平行樣品中獨(dú)立地進(jìn)行。
在一個優(yōu)選的實(shí)例中，被用來檢測丁酮酸的酶為哺乳動物乳酸脫氫酶，并且使用標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計在一個杯中進(jìn)行丁酮酸和總的硫化氫測定。在實(shí)施例1的起始步驟后，優(yōu)選包含同型半胱氨酸和半胱氨酸的血漿樣品。不將樣品分成份，代之以在從同型半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫、氨和α丁酮酸，和另外，硫化氫、氨和丁酮酸從半胱氨酸產(chǎn)生的條件下，加入同型半胱氨酸酶(來自陰道毛滴蟲或惡臭假單胞菌)。還在致使它將與從半胱氨酸產(chǎn)生的丁酮酸反應(yīng)的條件下，加入酶乳酸脫氫酶的樣品(以可與用于前面實(shí)施例的單位/ml的量)，接著在340nm或其附近以熟知的方法檢測反應(yīng)(對于NADH)。
如前(參見實(shí)施例1)，可通過測定從同型半胱氨酸酶產(chǎn)生的全部的硫化氫，并且在可檢測沉淀的有色鉛鹽的任何適宜波長下，如在可見光的范圍或在或靠近例如360nm下用比色法測定樣品中同型半胱氨酸和半胱氨酸的總濃度。如現(xiàn)有技術(shù)所知，還可根據(jù)其它發(fā)色金屬鹽的形成來檢測硫化氫。通過將(從半胱氨酸和同型半胱氨酸)產(chǎn)生的全部硫化氫與(僅從半胱氨酸)產(chǎn)生的全部丁酮酸比較來確定原始樣品中的同型半胱氨酸的濃度。該方法也可很容易自動進(jìn)行，并可同時監(jiān)測兩個檢測波長。
雖然使用乳酸脫氫酶檢測血液或來自血液的溶液中的丁酮酸可遵循一些現(xiàn)有技術(shù)公知的方法，但應(yīng)重復(fù)某些預(yù)防措施。丁酮酸在血液和從其產(chǎn)生的物質(zhì)中極不穩(wěn)定，并且它甚至可聚合。因此，如現(xiàn)有技術(shù)所知，可望在回收樣品的無蛋白質(zhì)過濾物和僅當(dāng)用偏磷酸處理的樣品中進(jìn)行丁酮酸的測定。
實(shí)施例7大腸桿菌BL21(DE3)pAC2-1克隆的產(chǎn)生如下所述地完成陰道毛滴蟲的pAC2-1同型半胱氨酸酶基因的克隆。通常來講，被認(rèn)為可用于其它微生物中的重組方法對于毛滴蟲DNA的操作也是可用，尤其是因為如上所述許多毛滴蟲基因缺乏內(nèi)含子。有用的參考文獻(xiàn)因此可參考Y.Tan等蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化，pp.233-245，(1997)和1996，12，19公開的Y.Tan等的國際專利
發(fā)明者譚玉英, 馬丁·倫茲, 安德魯·W·佩里, 羅伯特·M·霍夫曼 申請人:抗癌公司