專利名稱：慢性疲勞綜合癥的診斷的制作方法
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政府許可參考在此描述的發(fā)明是在美國政府公眾健康服務(wù)基金R21AI38378所支持的工作的期間完成的，美國政府對此發(fā)明有一定的權(quán)利。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過檢測一種與疾病相關(guān)的獨特的分子標(biāo)記診斷慢性疲勞綜合癥(CFS)。
本發(fā)明的背景慢性疲勞綜合癥(CFS)是一種未知病因的疾病，時常伴有突然的發(fā)作，流感樣癥狀，進行性疲勞，低燒，肌痛和神經(jīng)認知障礙，慢性疲勞綜合癥患者典型表現(xiàn)為Karnofsky行為值(KPS)降低。Karnofsky行為試驗檢查個體的行為和完成正常活動的能力。Kamofsky行為值為零表示無行為能力或死亡患者，100表示完全正常的功能。但仍然不能診斷慢性疲勞綜合癥。
累計的證據(jù)表明慢性疲勞綜合癥與體液和細胞免疫的紊亂相關(guān)，包括促分裂原反應(yīng)、病毒的復(fù)活、細胞因子的產(chǎn)生異常、自然殺傷細胞功能降低和中間代謝的改變。有證據(jù)表明在慢性疲勞綜合癥中觀察到的臨床和免疫的異常可能包括雙鏈RNA依賴性干擾素誘導(dǎo)途徑如2’、5’-寡腺苷酸(2-5A)合成酶/RNA酶L和p68激酶(PKR)抗病毒防御途徑的缺陷。(Suhadolnilk等，臨床感染性疾病(Clin.Infect.Dis.)18:S96-S104,1994；Suhadolnik等，In Vivo8:599-604(1994).2-5A合成酶/RNA酶L途徑是哺乳動物細胞抗病毒機制的一部分；這個途徑在調(diào)節(jié)細胞生長和分化當(dāng)中也起著一定的作用(Lengyel，生物化學(xué)年度綜述(Ann.ReviewBiochem.)51:251-282,1982；Sen等，高級病毒研究(Adv.Virus Res.)42:57-102,1993)。
由雙鏈RNA激活后，2’5’寡腺苷酸合成酶將ATP轉(zhuǎn)換為5’-末端磷酸化的2’,5’-連接的寡腺苷酸，有生物學(xué)活性的活化的2’,5’-寡腺苷酸可以結(jié)合和激活一種潛伏的內(nèi)切核糖核酸酶，即RNA酶L，它水解單鏈的病毒的和細胞的RNA，主要是在UpNp序列之后的RNA，從而抑制蛋白合成。
以前的關(guān)于慢性疲勞綜合癥中2’,5’-寡腺苷酸合成酶/RNA酶L途徑的研究揭示了存在一種有顯著差異的調(diào)節(jié)異常，其中2-5A合成酶主要是以它的激活形式存在，生物活性2-5A水平提高了，RNA酶L的活性升高(Suhadolnik等，臨床感染性疾病，同上；Suhadolnik等，In Vivo，同上)。在慢性疲勞綜合癥中，絲氨酸-蘇氨酸激酶(PKR)的表達是降低的(Suhadolink等，In Vivo，同上)。PKR控制通過eIF-2磷酸化途徑的蛋白翻譯的起始。
盡管已經(jīng)知道這些，一個明確的關(guān)于慢性疲勞綜合癥的分子標(biāo)記還沒有得到確認?，F(xiàn)在需要的是一種生物化學(xué)試驗，它依賴于明確的慢性疲勞綜合癥分子標(biāo)記，它可以成為慢性疲勞綜合癥明確診斷的基礎(chǔ)。
縮寫本文可能使用下列縮寫AMP腺嘌呤核苷5’-單磷酸2-azido-AMP2-腺苷5’-單磷酸8-azido-AMP8-腺嘌呤核苷5’-單磷酸；2,8-azido-AMP2,8-腺嘌呤核苷5’-單磷酸；2-5A 2’,5’-寡腺苷酸，即具有(2’→5’)磷酸二脂鍵和5’-三磷酸化的腺苷酸低聚物；CFS 慢性疲勞綜合癥；dsRNA雙鏈RNA；ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗；etheno-AMP N1N6-亞乙烯基腺苷5’-單磷酸；GST 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；HEPES4-(2-羥乙基)-哌嗪乙磺酸PMBC 外周血單核細胞；PBS 磷酸鹽緩沖鹽溶液p3A3 具有(2’→5’)-磷酸二脂鍵和5’-三磷酸的腺苷酸三聚體；pApAp(8-azidoA) 5’-O-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-疊氮基腺苷；poly(U)-3’-pCp 多聚尿苷酸，有胞嘧啶殘基結(jié)合于3’末端；SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
發(fā)明概述一種診斷慢性疲勞綜合癥的方法，包含檢測患者樣品以探察一種大約30kDa的RNA酶L的存在。
在一個實施方案中，本方法包括(a)在非變性條件之下，根據(jù)分子量分離患者樣品中的蛋白質(zhì)，(b)在分離的蛋白質(zhì)中，檢測大約30kDa具有RNA酶L活性的蛋白質(zhì)。RNA酶L活性測定可以包含，例如檢測在水解28S和/或18SRNA中形成的特異的裂解產(chǎn)物(SCP)，或者檢測poly(U)-3’-pCp的水解。
根據(jù)另外的實施方案，本發(fā)明包括一種診斷慢性疲勞綜合癥的方法，包括(a)將外源蛋白酶抑制劑存在下制備的患者樣品與一種探針接觸，該探針中包含一種如式(Ⅰ)所示的帶有可檢測標(biāo)志的化合物或該化合物的水溶性鹽，接觸條件足以形成所述標(biāo)記探針化合物與樣品中2’,5’-寡腺苷酸結(jié)合蛋白的共價結(jié)合物
其中m是從0到3的整數(shù)，n是從1到3的整數(shù)，每個R1和R2彼此獨立于其他的R1和R2，為氫或N3，條件是至少一個R1或R2是N3；(b)將包含所說共價結(jié)合物的樣品與一種抗體接觸，該抗體能與樣品中的RNA酶L種類相結(jié)合；(c)通過凝膠電泳分離所述樣品中的蛋白質(zhì)；和(d)檢查分離的蛋白質(zhì)，尋找標(biāo)記蛋白質(zhì)，它(ⅰ)已經(jīng)與標(biāo)記探針化合物形成共價結(jié)合物，(ⅱ)已經(jīng)與所說抗體結(jié)合；根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，存在約37kDa表觀分子量的標(biāo)記蛋白質(zhì)，可以診斷為慢性疲勞綜合癥。
根據(jù)本發(fā)明的又一實施方案，本發(fā)明涉及一種診斷嚴(yán)重慢性疲勞綜合癥的方法，它包括一種診斷慢性疲勞綜合癥的方法，包括(a)將外源蛋白酶抑制劑存在下制備的患者樣品與一種探針接觸，該探針中包含一種如式(Ⅰ)所示的帶有可檢測標(biāo)志的化合物或該化合物的水溶性鹽，接觸條件足以形成所述標(biāo)記探針化合物與樣品中2’,5’-寡腺苷酸結(jié)合蛋白的共價結(jié)合物
其中m是從0到3的整數(shù)，n是從1到3的整數(shù)，每個R1和R2彼此獨立于其他的R1和R2，為氫或N3，條件是至少一個R1或R2是N3；(b)將包含所說共價結(jié)合物的樣品與一種抗體接觸，該抗體能與樣品中的RNA酶L種類相結(jié)合；(c)通過凝膠電泳分離所述樣品中的蛋白質(zhì)；和(d)檢查分離的蛋白質(zhì)，尋找標(biāo)記蛋白質(zhì)，它(ⅰ)已經(jīng)與標(biāo)記探針化合物形成共價結(jié)合物，(ⅱ)已經(jīng)與所說抗體結(jié)合；根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，存在約37kDa表觀分子量的標(biāo)記蛋白質(zhì)，且根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，不存在約80kDa表觀分子量的標(biāo)記蛋白質(zhì)，可以診斷為嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥。
根據(jù)本發(fā)明的又一實施方案，本發(fā)明提供一種評價慢性疲勞綜合癥的相對的嚴(yán)重程度的方法，包括在自然的條件下檢測患者樣品中的分子量大約30kDa和80kDa的RNA酶L分子的存在。存在分子量大約30kDa的RNA酶L分子而不存在分子量大約80kDa的RNA酶L分子，表示嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥。兩種分子量的RNA酶L分子均存在，表明病情較輕。檢測可以按下列方法實施(a)在非變性條件之下，根據(jù)分子量分離患者樣品中的蛋白質(zhì)，及(b)在分離的蛋白質(zhì)中，檢測大約30kDa和80kDa的具有RNA酶L活性的蛋白質(zhì)。


圖1顯示在外周血單核細胞(PBMC)提取物與2-5A顯影探針[32P]pApAp(8-azidoA)培養(yǎng)、UV(紫外線)照射和與抗重組人RNA酶L的多克隆抗體培養(yǎng)后，從中收集的蛋白A-瓊脂糖結(jié)合蛋白的分離(10％SDS-PAGE)和放射自顯影。P=患者；C=對照。泳道1,4-9患慢性疲勞綜合癥的個體；泳道2,3代表健康的對照。在核糖體RNA裂解試驗中檢測到的RNA酶L活性泳道1-9分別為79,54,37,73,59,253,127,＞500和253。
圖2顯示在自然的(非變性)條件下，對健康的(板塊A)和慢性疲勞綜合癥(板塊B和C)的個體外周血單核細胞中的提取物進行分析性凝膠滲透HPLC分離的結(jié)果。提取物是用[32P]pApAp(8-azidoA)進行顯影標(biāo)記后進行分離的。通過閃爍光度法，測定從每個外周血單核細胞提取物中分離的各個級分的放射活性。板塊D、E和F顯示的是與板塊A、B和C相同的健康(板塊D)和慢性疲勞綜合癥(板塊E,F)個體外周血單核細胞提取物的分析性凝膠滲透HPLC分離結(jié)果，本次是在自然的(非變性)條件下進行，然后對各級分進行RNA酶L活性檢測。各個級分的等份試樣均在p3A3和poly(U)-3’-pCp存在的情況下進行檢測。在級分0-150中沒有檢測到2-5A結(jié)合或2-5A依賴的RNA酶L活性。分子量標(biāo)志由箭頭標(biāo)示。健康個體的外周血單核細胞提取物(板塊A和D)也示于圖1的第2泳道。圖2中的板塊B和E所代表的慢性疲勞綜合癥的外周血單核細胞提取物也示于圖1的第1泳道。圖2中的板塊C和F所代表的慢性疲勞綜合癥的外周血單核細胞提取物也示于圖1的第8泳道。
圖3表示在存在(+)或不存在(-)蛋白酶抑制劑情況下，經(jīng)用2-5A顯影探針[32P]pApAp(8-azidoA)進行光親和標(biāo)記、用抗重組人80kDa RNA酶L多克隆抗體免疫沉淀后制備的外周血單核細胞提取物(100μg蛋白質(zhì))，用10％SDS-PAGE分離后收集的蛋白質(zhì)級分。經(jīng)過光親和標(biāo)記和免疫反應(yīng)性2-5A結(jié)合蛋白由10％SDS-PAGE分離，并由磷光定量。2-5A結(jié)合蛋白的分子量已在圖中標(biāo)明。泳道1、2慢性疲勞綜合癥外周血單核細胞提取物。泳道3、4健康對照的外周血單核細胞提取物。
本發(fā)明的詳細描述生物學(xué)活性的2-5A結(jié)合和激活潛伏的內(nèi)切核糖核酸酶，即RNA酶L。激活的RNA酶L進而水解單鏈的病毒和細胞RNA，藉此抑制蛋白質(zhì)合成。目前已經(jīng)明確健康個體的細胞提取物中含有一種大約80kDa的2-5A結(jié)合蛋白，它具有2-5A依賴的RNA酶L活性。提取物中可能還含有一種大約42kDa的2-5A結(jié)合蛋白，也具有2-5A依賴的RNA酶L活性。慢性疲勞綜合癥患者已經(jīng)被證明具有一種不同的30kDa的2-5A結(jié)合蛋白，也具有2-5A依賴的RNA酶L活性?！癛NA酶L活性”指RNA酶L水解它的RNA底物的酶活性。
一組慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞經(jīng)檢查含有分子量大約在80和30kDa的2-5A結(jié)合蛋白，其具有2-5A依賴的RNA酶L活性。在制備患者的外周血單核細胞提取物時不加入蛋白酶抑制劑，也可以觀察到分子量大約42kDa的具有2-5A依賴的RNA酶L活性的2-5A結(jié)合蛋白。大約80kDa蛋白的存在相應(yīng)于較輕的慢性疲勞綜合癥。另一組慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞中，僅僅在30kDa處含有2-5A結(jié)合活性和2-5A依賴的RNA酶L活性。這種情況與更嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥相關(guān)。無論疾病的嚴(yán)重程度如何，患慢性疲勞綜合癥的人可以通過其體內(nèi)存在大約30kDa的RNA酶L而得到確認，它在不受慢性疲勞綜合癥困擾的人體內(nèi)是找不到的。通過在自然條件下檢測這種獨特和在此之前未知的大約30kDa的RNA酶L，第一次可能進行慢性疲勞綜合癥的明確和毫不含糊的生化檢驗。與此相類，在非自然條件下檢測到一種大約37kDa的蛋白也與慢性疲勞綜合癥相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明，采集懷疑患慢性疲勞綜合癥的個體的樣品，并檢測這種大約30kDa的2-5A依賴的RNA酶L。樣品可以取自任何合適的含有RNA酶L的細胞?？梢杂醚夯蚱湟徊糠?，如血清或血漿。RNA酶L在單核細胞中大量存在。因而，樣品的優(yōu)選來源包括外周血單核細胞。樣品要經(jīng)過離心收集細胞、裂解細胞、去除細胞殘渣，才能獲得無細胞的提取物。該提取物然后用來檢測這種大約30kDa的RNA酶L的存在。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，外周血單核細胞是從肝素化的血液中用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離的，胞漿提取物按照Suhadolnik等，生物化學(xué)(Biochemistry)22:4153-4158(1983)提供的方法進行制備。為了避免RNA酶L的活性丟失，胞漿提取物必須在血液采集后的兩小時之內(nèi)進行。簡而言之，肝素化的血液用PBS按1∶1比例稀釋。將兩倍體積的稀釋后血液置于一倍體積的密度為1.080的Ficoll-Hypaque之上(Boyum,Seand.J.Clin.Lab.Invest.97:1-109,1968)，于20℃以1000g離心30分鐘。取出外周血單核細胞層，用5倍體積的PBS洗一次。將分離后的外周血單核細胞重懸于5ml的紅細胞裂解緩沖液中(155mM NH4Cl,10mM NaHCO3,pH7.4,0.1mM EDTA)，冰浴中放置5分鐘，用PBS洗兩遍。分離后的外周血單核細胞重懸于0.1或0.2ml(大約10倍于細胞體積)的緩沖液(20mM HEPES,pH7.5,5mM MgCl2,120mM KCI,10％甘油，1mM二硫蘇糖醇)中，該緩沖液還包含0.5％NONIDET P-40，繼續(xù)冰浴10分鐘裂解細胞。在25℃以8000g離心6分鐘，獲得胞漿提取物。無細胞提取物可以在分裝后于-70℃無限期保存，每份25或50μl。
蛋白酶抑制劑可以隨意加入胞漿提取物中，例如Mini-CompleteTM蛋白酶抑制劑混合片劑(Boehringer/Mannheim)，根據(jù)廠商說明使用。Mini-CompleteTM抑制劑包含抑肽酶、亮抑蛋白酶肽、pefablocSC和EDTA。在此所說的與細胞提取物的準(zhǔn)備有關(guān)的“外源蛋白酶抑制劑”意思是另外添加的外源蛋白酶抑制劑，不包括在細胞提取物中天然存在的蛋白酶抑制劑。當(dāng)細胞提取物被表述為“在外源的蛋白酶抑制劑存在的情況下制備”時，所指的是在細胞提取物中有大量的蛋白酶抑制劑存在并足以完全抑制蛋白酶的活性。
然后該無細胞的細胞提取物可用于檢測大約30kDa慢性疲勞綜合癥RNA酶L的存在。用″大約″來表述不同的RNA酶L的分子量，指一個所述分子量加或減1kDa范圍內(nèi)的分子。細胞提取物在自然的非變性的條件下按分子量進行分級分離。然后，大約30kDa的成分被用于在2-5A或其能夠結(jié)合到并激活級分中RNA酶L的類似物存在下檢測2-5A依賴的RNA酶L活性。“自然條件”指在分級分離過程中可以使樣品中的RNA酶L的活性大體上得以保持的實驗條件。值得指出的是，自然條件指不使蛋白質(zhì)變性的條件，特別是不使酶變性的條件。按分子量分離蛋白質(zhì)的非變性條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。按分子量進行蛋白質(zhì)的非變性分離可以有利地通過凝膠滲透高壓液相層析技術(shù)進行。用于這一目的的一種層析材料是SUPERDEX200，來自Pharmacia LKB Biotechnology,Piscataway,NJ。該材料可以有效地分離分子量在15kDa到200kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。
分子量大約30kDa的成分的2-5A依賴的RNA酶L活性可以通過大量不同的RNA酶L分析試驗來確定。RNA酶L的活性分析試驗可以采用檢測中心纖維素(core-cellulose)的形式(Silverman等，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)144:450-460,1985，該文引入這里作為參考)，它包括在2-5A中心纖維素上固定和部分純化2-5A結(jié)合蛋白，并通過將poly(U)[32P]pCp轉(zhuǎn)變?yōu)樗崛苄云蝸頇z測樣品中的RNA酶L活性。
此外，2-5-A依賴的RNA酶L活性可以通過一種核糖體RNA裂解實驗來檢測，即測定一種高特異性的特殊裂解產(chǎn)物(SCP)(Suhadolnik等，臨床感染性疾病，同上，該文引入這里作為參考)。相應(yīng)地，樣品與一種缺乏RNA酶L的L929細胞亞克隆(完整的28S和18S核糖體RNA來源)的胞漿提取物(每實驗用140μg蛋白)在30℃孵育60分鐘。提取總RNA，變性并進行1.8％瓊脂糖凝膠電泳分析。溴化乙錠染色后，紫外光下可見RNA類似物。由于RNA酶L的活性所形成的特殊裂解產(chǎn)物可以通過凝膠攝影的光密度示蹤進行測定，它表示為在孵育結(jié)束時反應(yīng)產(chǎn)物(SCP)與殘留底物(28S和18S核糖體RNA)的比率。關(guān)于SCP的討論請參考Wreschner等，自然(Nature)289:414-417(1981)，該文引入這里作為參考。
按照另一種方法，大約30kDa分子量級分的2-5-A依賴的RNA酶L活性可以通過測定經(jīng)過合適標(biāo)記的RNA酶L的底物如放射底物的水解來進行檢測。例如，存在于蛋白級分中的RNA酶L可以通過將該級分與底物poly(U)-3’-[32P]PCp在p3A3存在下接觸，然后通過閃爍光度法測定放射活性，從而測定酶的活性。
除測定30kDa RNA酶L以外，相同的方法也可用于測定大約80kDa蛋白種類的存在，該蛋白存在于正常個體的細胞中。機體中存在約30kDa RNA酶L分子而缺乏約80kDa RNA酶L分子，表明患者患有嚴(yán)重的或后期的慢性疲勞綜合癥。兩種分子量的RNA酶L分子均存在，表明患者的病情較輕?；加袊?yán)重慢性疲勞綜合癥，即其細胞提取物中只有30kDa RNA酶L分子，而沒有80kDa 2-5A分子的患者，其Karnofsky行為值(KPS)一般為60或更低。這些患者同樣也缺乏約42kDa的RNA酶L種類，后者在健康人對照和病情較輕的慢性疲勞綜合癥患者中是可以觀察到的。那些細胞提取物中含有約30kDa和約80kDa RNA酶L兩種種類的慢性疲勞綜合癥患者的KPS值一般為60。
根據(jù)按分子量分離蛋白的另一種可選擇的方法，患者樣品中的蛋白質(zhì)可以通過傳統(tǒng)的方法使用鹽類如硫酸銨以及某些溶劑如丙酮或丁醇進行部分純化，然后再進行二乙氨基乙基纖維素色譜分離。本方法進行蛋白質(zhì)分離的基礎(chǔ)在于電荷。由于總電荷的不同，30和80kDa形式的RNA酶L可以運用本方法進行分離。
根據(jù)本發(fā)明的另一項可用于判定患有嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥的患者的實施方案，細胞提取物用含有一種2-5A疊氮基類似物的光探針進行光親和標(biāo)記，然后與RNA酶L的抗體進行免疫沉淀和按分子量分離。本方法可以特異性識別那些能與2-5A結(jié)合的并與RNA酶L進行免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)，并清除那些能與RNA酶L進行免疫反應(yīng)，但不是2-5A結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)。本方法同樣可以清除那些不能與抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的2-5A結(jié)合蛋白。
經(jīng)過光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的、在無外源蛋白酶抑制劑的情況下制備的健康個體的細胞提取物，和經(jīng)過光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的癥狀較輕的慢性疲勞綜合癥患者的細胞提取物，均進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，檢測分子量為80和37kDa的2-5A結(jié)合蛋白。在無外源蛋白酶抑制劑存在的情況下，分子量大約42kDa的2-5A結(jié)合蛋白也能被檢測到。對于癥狀較輕的慢性疲勞綜合癥患者，本方法檢測的是分子量大約37kDa的2-5A結(jié)合蛋白。分子量為約80kDa的2-5A結(jié)合蛋白沒有被觀察到。即使在無外源蛋白酶抑制劑的情況下，分子量為42kDa的2-5A結(jié)合蛋白也沒有被觀察到。當(dāng)健康個體的細胞提取物在存在外源蛋白酶抑制劑的情況下制備時，經(jīng)過光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的細胞提取物中也沒有觀察到分子量約37和約42kDa的2-5A結(jié)合蛋白。
因此，光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的方法也可以用來檢測大約80kDa 2-5A結(jié)合蛋白的缺乏，并因而判定患有嚴(yán)重慢性疲勞綜合癥的患者。請記住，當(dāng)細胞提取物是在無外源蛋白酶抑制劑的情況下制備的時，本方法不能區(qū)分健康個體和那些癥狀較輕的慢性疲勞綜合癥患者。若健康個體的細胞提取物是在加入外源蛋白酶抑制劑的情況下制備的，大約37kDa的2-5A結(jié)合蛋白沒有被觀察到，而在同樣加入外源蛋白酶抑制劑的情況下，該分子可在慢性疲勞綜合癥患者的細胞提取物中檢測到。因此，如果細胞提取物是在加入外源蛋白酶抑制劑的情況下制備的，這種光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的方法就可以用于區(qū)分正常細胞提取物與慢性疲勞綜合癥患者的細胞提取物。
應(yīng)該認識到，如果用前述的光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的方法，在無外源蛋白酶抑制劑的情況下，在健康個體的細胞提取物中檢測到大約37kDa的2-5A結(jié)合蛋白，那么檢測到的這種分子在健康個體中是缺乏2-5A RNA酶L活性的。
在光標(biāo)記/免疫沉淀/分離的方法中使用的光探針包括上述式Ⅰ的2-5A類似物，其中一個或多個2-5A分子的腺嘌呤殘基上的2-或8-氫被疊氮基所取代，或兩個氫都被疊氮基取代。對細胞提取物中的2-5A結(jié)合蛋白進行光標(biāo)記的方法包括，細胞提取物與標(biāo)記的光探針(如放射性探針)互相接觸，在足以形成光探針與2-5A結(jié)合蛋白的共價結(jié)合物的條件下進行。一般而言，這一過程就是在低強度紫外光下將細胞提取物與光探針的混合物孵育來完成的。用作光探針的2-5A疊氮基類似物的制備方法在美國專利4,990,498(酶法合成)和Charubala等，Helv.Chim.Acta72:1354-1361(1989)(化學(xué)合成)中有描述。將這兩份文獻的整個公開內(nèi)容引入本文作為參考。2-5A疊氮基類似物可以有效地結(jié)合并激活RNA酶L。由于疊氮基具有光敏感性，在低強度紫外光照射下，2-5A疊氮基類似物迅速形成氮烯自由基活性中間產(chǎn)物(C-N)。該氮烯自由基中間產(chǎn)物與生物分子反應(yīng)并對其進行共價的光標(biāo)記。2-5A疊氮基類似物的原位光活化以及結(jié)合到RNA酶L上并不會妨礙RNA酶L的活性(參見美國專利4,990,498，圖2)。
式(Ⅰ)的2-5A疊氮基類似物可以包含一種疊氮基-AMP(如2-疊氮基-AMP)的低聚體，如2-疊氮基腺苷酰-(2’→5’)2-疊氮基腺苷酰-(2’→5’)2-疊氮基腺苷酸；2-疊氮基-AMP和8-疊氮基-AMP兩者的低聚體，如2-疊氮基腺苷酰-(2’→5’)8-疊氮基腺苷酰-(2’→5’)2-疊氮基腺苷酸；AMP和2-疊氮基-AMP或8-疊氮基-AMP的低聚體，如2-疊氮基腺苷酰-(2’→5’)2-疊氮基腺苷酰-(2’→5’)2-疊氮基腺苷酸，或者可以是由AMP、2-疊氮基-AMP、8-疊氮基-AMP或2,8-疊氮基AMP單體任意組合而成的低聚體，條件是其中至少有一種這樣的單體是疊氮基-腺苷酸。
用于本發(fā)明的實踐的式Ⅰ2-5A疊氮基類似物優(yōu)選是三聚體(n=1)。5’-磷酸化程度優(yōu)選是單磷酸化(m=1)。特別優(yōu)選其中含有一個或多個8-疊氮基殘基的低聚物，尤其是2’-末端核苷酸是8-疊氮基腺苷酸的2-5A疊氮基類似物，如5’-O-磷?；?腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-疊氮基腺苷酸。
2-5A疊氮基類似物優(yōu)選帶有一種可被檢測的標(biāo)志，以保證它可以被辨認。標(biāo)志可以包括，如放射性標(biāo)志，象32P,3H,14C或15N。32P是最強的β粒子發(fā)射源，因而是優(yōu)選的標(biāo)志。此外標(biāo)志可以包括一個或多個亞乙烯基基團，它具有很強的熒光。一個或多個腺嘌呤核心的6位碳原子上的氨基可以轉(zhuǎn)變成亞乙烯基以形成N1N6-亞乙烯基腺苷酸，或者熒光低聚體可以由亞乙烯基-腺苷酸從頭合成，或者形成-個由亞乙烯基-AMP、疊氮基-AMP單體、和AMP單體組成的復(fù)合物，復(fù)合物中要保證至少有一個單體含有亞乙烯基-AMP。參見Suhadolnik等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)252:4125-4133(1977)，其整個公開內(nèi)容引入本文作為參考。其他檢測生物分子的標(biāo)志是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
用2-5A疊氮基類似物光標(biāo)記之后，細胞提取物即與RNA酶L的多克隆抗體結(jié)合。用于免疫沉淀的抗體包含抗人重組80kDa RNA酶L的多克隆抗血清，該抗血清也可以識別慢性疲勞綜合癥的約30kDa的RNA酶L。由于全長的cDNA序列已知，人重組80kDa的RNA酶L可以用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)進行表達(Zhou等，細胞(Cell)72:753-765,1993，引入本文作為參考，GeneBank序列，登記號L10381，引入本文作為參考)?？谷酥亟M80kDaRNA酶L的多克隆抗血清的獲得是應(yīng)用已知技術(shù)，用重組蛋白免疫動物并收獲抗血清而得到的。
抗RNA酶L抗體可以包括完整的抗體，或能結(jié)合抗原的片段，包括但不僅限于Fab和F(ab’)2片段。因此，這里所說的“抗體”，包括完整的抗體分子和那些具有抗原結(jié)合能力的片段。標(biāo)記的第二抗體可以隨意選用，以幫助識別由抗RNA酶L抗體所形成的抗原-抗體復(fù)合物。第二抗體能夠結(jié)合到RNA酶L上，或者能結(jié)合到抗RNA酶L的第一抗體上。標(biāo)記的第二抗體可以包括如綿羊抗兔、山羊抗兔、或鼠抗兔IgG，在這種情況下，選用的第一抗體是兔的抗體。
第二抗體的標(biāo)記可以通過物理或化學(xué)的方法檢測。這類標(biāo)記包括放射標(biāo)記；發(fā)光標(biāo)記如熒光、紫外吸收或光吸收標(biāo)記；以及酶標(biāo)記。任何合適的放射性同位素均可作為標(biāo)記，如125I,131I3H和14C。在酶聯(lián)免疫吸附實驗中，標(biāo)記物是一種酶，如堿性磷酸酶，它可以裂解發(fā)光底物，釋放發(fā)光的裂解產(chǎn)物。在使用堿性磷酸酶的情況下，底物可以包括如酚酞單磷酸酯或?qū)ο趸交姿狨ァ?br> 免疫沉淀之后，對提取物中形成的包括抗體、光探針和2-5A結(jié)合蛋白的復(fù)合物進行純化，通過蛋白A-樹脂(如蛋白A-瓊脂糖)吸附，然后洗滌、將蛋白從樹脂中洗脫出來。洗脫出的蛋白經(jīng)過凝膠電泳分離，通過檢測光探針或抗體上的標(biāo)記，那些經(jīng)過光標(biāo)記/免疫沉淀的2-5A結(jié)合蛋白就可以被觀察到。標(biāo)記條帶的分子量可以參考已知的分子量標(biāo)準(zhǔn)而確定。
本發(fā)明的實際應(yīng)用可以通過下面的非限制性例子而闡明。所有慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞提取物在非變性條件下進行檢測，均可檢出特征性的30kDa的RNA酶L，而所有健康對照均缺乏這種低分子量的RNA酶L。因此，這種約30kDa的RNA酶L是慢性疲勞綜合癥的分子標(biāo)志。在此提供的資料同時表明除了以這種大約30kDa的RNA酶L為特征以外，最嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥的病例還以細胞內(nèi)缺乏大約80kDa的RNA酶L種類為特征。癥狀較輕的慢性疲勞綜合癥患者細胞內(nèi)還有這種大約80kDa的RNA酶L種類，同時也有大約30kDa的RNA酶L種類種類。因此，基于所獲得的資料，80kDa和30kDa的RNA酶L的出現(xiàn)模式與慢性疲勞綜合癥臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度相關(guān)。
用疊氮基-光標(biāo)記、免疫沉淀和在非變性條件下對2-5A結(jié)合蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，也獲得了類似的結(jié)果。檢測到表觀分子量大約37kDa的2-5A結(jié)合蛋白而沒有大約80kDa的2-5A結(jié)合蛋白，與嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥相一致。而兩種蛋白條帶都存在，則與較輕的慢性疲勞綜合癥癥狀相關(guān)。
實施例1在變性條件下通過疊氮基光親和標(biāo)記和免疫沉淀確定慢性疲勞綜合癥的標(biāo)志分子A 研究對象和對照本研究的對象是那些先前已經(jīng)被診斷為符合慢性疲勞綜合癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的個體和健康人對照，該診斷標(biāo)準(zhǔn)是美國疾病預(yù)防和控制中心(CDC)于1988年發(fā)布的(Holmes等，Ann.Intern.Med.108:387-389,1988)?；颊吆蛯φ帐菑脑趦?nèi)華達州和北卡羅來納州進行的醫(yī)學(xué)實踐中挑選的。患者和對照的挑選標(biāo)準(zhǔn)以及研究開始時的臨床變量由Suhadolnik等，臨床感染性疾病18:S96-S104(1994)描述。在抽取血樣時，選擇的癥狀要經(jīng)過一個自定等級癥狀列表進行評估。疲勞的程度使用Karnfsky行為值進行評估(平均KPS值=56)。收入了十個年齡和性別匹配的對照對象。對每個慢性疲勞綜合癥患者和對照都要詢問病史和進行體檢。對照組的年齡分布與慢性疲勞綜合癥患者組沒有顯著性差異(慢性疲勞綜合癥組平均年齡=46歲，對照組平均年齡=41.7歲)。所有對照個體均經(jīng)過面試并明確排除患有慢性疲勞或其他任何值得注意的癥狀；體檢的結(jié)果均正常。本研究獲得了當(dāng)?shù)氐膶W(xué)術(shù)審查委員會(Institutional Review Boards)的批準(zhǔn)。每個患者和對照均在被充分告知后同意參加實驗。外周血單核細胞用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從肝素化的血液(50ml)中分離，胞漿提取物按前述方法Suhadolnik等，生物化學(xué)22:4153-4158(1983)制備，該文獻的整個公開內(nèi)容引入本文作為參考。胞漿提取物是在無外源蛋白酶抑制劑的情況下制備的。B． 重組的人RNA酶L多克隆抗體的產(chǎn)生全長的人類RNA酶L cDNA已由Zhou等，細胞72:753-765(1993)描述，其整個公開內(nèi)容引入本文作為參考，它在GenBank的登記號是L10381，后者也引入本文作為參考。產(chǎn)生抗RNA酶L多克隆抗體所需要的純化的重組人80kDa RNA酶L用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白策略獲得。按照Sobol等，生物化學(xué)雜志270:5963-5978(1995)(整個公開內(nèi)容引入本文作為參考)描述的步驟，獲得了在大腸桿菌中表達的谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白?？雇ㄟ^用高度純化的重組人谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白免疫在新西蘭白兔體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生重組人80kDa RNA酶L的多克隆抗體。免疫前制備血清，留作對照(免疫前血清)。第一天初次免疫使用100μg谷胱甘肽-RNA酶L與等體積的完全弗氏佐劑的混合物。加強免疫是在第14,21,19和84天進行，使用50μg谷胱甘肽-RNA酶L(50％天然和50％熱變性蛋白)與不完全弗氏佐劑的混合物。用于制備抗體的血清樣品在第120、150和180天抽取，此前還要附加加強免疫。用人凝血酶裂解谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白后，按廠商說明書操作，將RNA酶L共價偶聯(lián)到戊二醛活化的柱上(Whatman)。將氫硼化鈉循環(huán)過柱以減少未偶聯(lián)RNA酶L的戊二醛。將含有抗RNA酶L多克隆抗體的兔抗血清在室溫過戊二醛柱1小時，按廠商說明書進行洗脫。使用人293細胞(ATCC CRL1573)提取物和大腸桿菌表達的重組谷胱甘肽-RNA酶L融合蛋白，按Sobol等(同上)描述的方法，用Western印跡法確認抗RNA酶L多克隆抗體。C．在變性條件下對外周血單核細胞提取物中的2-5A結(jié)合蛋白進行疊氮基光親和標(biāo)記和免疫沉淀2-5A疊氮基光探針ApAp(8-azidoA)的化學(xué)合成、用[γ-32P]-三磷酸腺苷(ATP)和多核苷酸激酶對其進行5’-單磷酸化制備[32P]pApAp(8-azidoA)和對存在于外周血單核細胞中的2-5A結(jié)合蛋白進行光標(biāo)記，這些已由Charubala等，Helv.Chim.Acta72:1354-1361(1989)描述，其整個公開內(nèi)容引入本文作為參考。2-5A結(jié)合蛋白的光標(biāo)記按如下進行，將在無外源蛋白酶抑制劑情況下制備的外周血單核細胞提取物(100μg蛋白質(zhì))，與2-5A光探針[32P]pApAp(8-azidoA)(60μCi/nmal,5μCi)在4℃共孵育30分鐘，繼而于0℃用紫外光(8000瓦特/cm2)照射30秒。光標(biāo)記混合物再與親和純化的RNA酶L多克隆抗體(24μg蛋白質(zhì))和30μl蛋白A-瓊脂糖以及100μl PBS混合。該混合物于4℃旋轉(zhuǎn)混合一小時。用PBS洗三次，再與40μl蛋白助溶液混合，煮沸5分鐘，室溫下10,600xg離心5分鐘。上清用10％SDS-PAGE分離。對干膠進行放射自顯影，可顯示由疊氮基-光標(biāo)記/免疫沉淀的2-5A結(jié)合蛋白。這種聯(lián)合的疊氮基-光標(biāo)記/免疫沉淀方法去除了那些能與抗RNA酶L多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)但不是2-5A結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)；同樣也可以去除那些不能與抗RNA酶L多克隆抗體結(jié)合的2-5A結(jié)合蛋白。D．結(jié)果在本實驗的變性條件下，在健康對照(圖1，泳道2,3)和一組慢性疲勞綜合癥患者(圖1，泳道1,4,5)的外周血單核細胞中可以觀察到三種2-5A結(jié)合蛋白，分子量分別為80、42和37kDa。然而，光親和標(biāo)記/免疫沉淀法顯示在另一組慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞中(圖1，泳道6,7,8,9)只觀察到一種估計分子量為37kDa的2-5A結(jié)合蛋白；沒有觀察到80或42kDa的2-5A結(jié)合蛋白。泳道1、4、5所代表的患者，其慢性疲勞綜合癥的癥狀較輕。泳道6、7、8、9所代表的患者，其慢性疲勞綜合癥的癥狀要嚴(yán)重得多。因此，本研究中的檢測結(jié)果與患者的慢性疲勞綜合癥癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)。
在對外周血單核細胞的制備和處理時，并沒有從蛋白酶介導(dǎo)的約80kDa的RNA酶L的降解中產(chǎn)生約37kDa的2-5A結(jié)合蛋白。磷光分析定量顯示在慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞提取物中觀察到的37kDa的蛋白條帶，不論蛋白酶抑制劑存在與否，其強度都是一致的。這表明這種約37kDa的蛋白是穩(wěn)定的。
實施例2在自然(非變性)條件下通過疊氮基光親和標(biāo)記和檢測2-5A依賴的RNA酶L的酶活性確定慢性疲勞綜合癥的標(biāo)志分子A． 自然條件下，用分析性凝膠滲透高壓液相層析(HPLC)方法估定外周血單核細胞中的2-5A結(jié)合蛋白的分子量慢性疲勞綜合癥患者和健康對照的外周血單核細胞提取物(200μg蛋白質(zhì))于4℃與[32P]pApAp(8-azidoA)(109pCi/nmol,10pCi)共孵育30分鐘，紫外光照射(8000瓦特/cm2,30秒，0℃)，上樣于Superdex200(Hiload16/60)凝膠過濾柱(Pharmacia Biotech Inc.)，室溫下用25mMTris-Cl(pH7.4),80mM KCl,1mM EDTA,5mM MgCl2,0.1mM ATP及14mMβ-氫硫基乙醇混合液以0.5ml/分的流速洗脫，按每份0.5ml收集。每份收集液中共價連接到2-5A結(jié)合蛋白上的[32P]azido2-5A光探針在TmAnalytics model6895閃爍分光光度計中，采用Cerenkov放射(50％的效率)閃爍光度法進行測量。Superdex200柱用肌球蛋白、β-半乳糖苷酶、磷酸化酶b、牛血清白蛋白、卵清蛋白、碳酸脫水酶和大豆胰蛋白酶抑制物(分子量分別為220,116,97.4,68,44,31，和21.5kDa)進行校準(zhǔn)。B． 在自然條件下經(jīng)過分析性凝膠滲透高壓液相層析(HPLC)后外周血單核細胞提取物中的2-5A依賴的RNA酶L的酶活性在自然條件下，慢性疲勞綜合癥患者和健康對照的外周血單核細胞提取物(200μg蛋白質(zhì))經(jīng)Superdex200凝膠過濾柱分離，方法已在前段述及。分離后的每個部分各取等分樣品(5-20μl)，通過水解反應(yīng)混合物(15-30ul)中的poly(U)-3’-[32P]pCp(20,000dpm)，來測定RNA酶L的活性。反應(yīng)混合物中含有p3A3(1×10-8M到1×10-7M)(Sobol等，同上)。非特異性RNA酶活性是通過在反應(yīng)混合物中不含有p3A3時檢測其對反應(yīng)混合物(15-30μl)中的poly(U)-3’-[32P]pCp(14,000dpm)的水解來測定的。使用Scintiverse Ⅰ(Fisher)(效率＞99％)來完成放射活性測量。C．結(jié)果在自然條件下分析健康對照的外周血單核細胞提取物，發(fā)現(xiàn)RNA酶L的活性存在于80和42kDa蛋白中(圖2，板塊A和D)。在一組慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞提取物中，觀察到了三種具有2-5A依賴的RNA酶L活性的2-5A結(jié)合蛋白。在這一組中，在80、42和37kDa或在80、42和30kDa處觀察到2-5A依賴的RNA酶L活性(圖2，板塊B和E)。在第二組慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞的提取物中(如圖1，板塊6,7,8,9),80或42kDa處沒有觀察到2-5A依賴的RNA酶L活性，然而在30kDa蛋白中觀察到2-5A依賴的RNA酶L活性(圖2，板塊C和F)。在對照實驗中使用poly(C)-3’-[32P]pCp，以表明在外周血單核細胞提取物中觀察到的2-5A依賴的RNA酶L酶活性并不是非特異的RNA酶活性。在任何級分中均未發(fā)現(xiàn)水解poly(C)-3’-[32P]pCp的現(xiàn)象，這也可作為2-5A依賴的RNA酶L存在的一個附加證據(jù)。[32P]pApAp-(8-azidoA)光探針的特異性在使用可靠的p3A3所進行的競爭性實驗中已經(jīng)得到證明(資料未列出)。此外，在缺乏2-5A時，未觀察到poly(U)-3’-[32P]pCp的水解，2-5A是RNA酶L的變構(gòu)活化物。
在變性條件下經(jīng)過SDS-PAGE分析而觀察到的37kDa 2-5A結(jié)合蛋白，有理由相信與在自然條件下觀察到的30kDa蛋白一致。這是參考了在自然條件下和變性條件下所觀察到的分子量上的差異的計算的有關(guān)著作后得出的結(jié)論(Somerville等，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)117:3837-3842,1995)。
實施例3免疫反應(yīng)性2-5A結(jié)合蛋白對蛋白水解作用的穩(wěn)定性在制備外周血單核細胞提取物時，分別在存在蛋白酶抑制劑和不存在蛋白酶抑制劑的情況下進行，以評估提取物的制備和處理過程中可能的蛋白降解作用。在存在蛋白酶抑制劑的情況下制備胞漿提取物時，制備方法按照廠商的指導(dǎo)進行(Mini-CompleteTM蛋白酶抑制劑混合片劑，Boehringer/Mannheim，含有抑肽酶、亮抑蛋白酶肽、pefablocSC和EDTA)。Suhadolnik等，臨床感染性疾病，同上。疊氮基光探針[32P]pApAp(8-azidoA)共價結(jié)合到2-5A結(jié)合蛋白上并進一步用重組的人80kDa抗RNA酶L多克隆抗體進行免疫沉淀而純化。經(jīng)過SDS-PAGE后，經(jīng)過光親和標(biāo)記的免疫反應(yīng)性2-5A結(jié)合蛋白通過磷光顯影分析而定量。在有蛋白酶抑制劑存在的情況下，慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞提取物中除了80kDa的2-5A依賴的RNA酶L以外，還含有一種37kDa的低分子量的免疫反應(yīng)性2-5A結(jié)合蛋白(圖3，泳道1)。在沒有蛋白酶抑制劑存在情況下，對同一慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞提取物進行光親和標(biāo)記和免疫沉淀，則顯示除了80kDa的2-5A依賴的RNA酶L以外，還存在分子量為37和42kDa的免疫反應(yīng)性2-5A結(jié)合蛋白(圖3，泳道2)。磷光顯影定量表明在慢性疲勞綜合癥患者的外周血單核細胞提取物中觀察到的37kDa蛋白條帶，無論蛋白酶抑制劑存在與否，都具有同樣的光強度，這表明該37kDa的蛋白是穩(wěn)定的(圖3，泳道1,2)。在有蛋白酶抑制劑存在情況下，健康對照的外周血單核細胞提取物中僅能探測到80kDa的RNA酶L(圖3，泳道3)。在沒有蛋白酶抑制劑存在情況下植被的相同提取物中，80kDa的RNA酶L的量減少了70％(圖3，比較泳道3和4)。然而，無論蛋白酶抑制劑存在與否，健康對照的外周血單核細胞提取物中均未檢測到37kDa的2-5A結(jié)合蛋白(圖3，泳道3和4)。在被檢測的少數(shù)健康對照的外周血單核細胞提取物中，觀察到一種50kDa的2-5A結(jié)合蛋白，但沒有37kDa的蛋白(圖3，泳道4)。然而，這種50kDa的2-5A結(jié)合蛋白在檢測其對poly(U)-3’-[32P]pCp的水解時，卻沒有發(fā)現(xiàn)它表現(xiàn)出2-5A依賴的RNA酶L活性(資料未顯示)。
在此引用的關(guān)于合成、制備和分析步驟所有參考資料均被引入本文作為參考。
本發(fā)明可能在不脫離其實質(zhì)或根本的情況下以其他具體形式實施，因此，關(guān)于本發(fā)明的范圍應(yīng)參考所附的權(quán)利要求書，而不是前面的說明書。
權(quán)利要求
1．一種診斷慢性疲勞綜合癥的方法，包括檢測患者樣品中一種約30kDa的RNA酶L的存在。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(a)在自然條件下對患者樣品中的蛋白質(zhì)按分子量分離；(b)在分離后的蛋白質(zhì)中檢測一種具有RNA酶L活性的約30kDa的蛋白質(zhì)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2方法，其中所述樣品包括血液或其中的其一部分。
4．根據(jù)權(quán)利要求3方法，其中所述樣品包括外周血單核細胞的胞漿提取物。
5．根據(jù)權(quán)利要求2到4任意一項的方法，其中RNA酶L的活性的檢測包括檢測水解28S和/或18S RNA后的特異裂解產(chǎn)物的形成。
6．根據(jù)權(quán)利要求2到4任意一項的方法，其中RNA酶L活性的檢測包括檢測poly(U)-3’-pCp的水解。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中包含在所說的poly(U)-3’-pCp上的標(biāo)志包括一種放射性標(biāo)志。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述標(biāo)記的poly(U)-3’-pCp是poly(U)-3’-[32P]pCp。
9．一種診斷慢性疲勞綜合癥的方法，包括(a)將外源蛋白酶抑制劑存在下制備的患者樣品與一種探針接觸，該探針中包含一種如式(Ⅰ)所示的帶有可檢測標(biāo)志的化合物或該化合物的水溶性鹽，接觸條件足以形成所述標(biāo)記探針化合物與樣品中2’,5’-寡腺苷酸結(jié)合蛋白的共價結(jié)合物
其中m是從0到3的整數(shù)，n是從1到3的整數(shù)，每個R1和R2彼此獨立于其他的R1和R2，為氫或N3，條件是至少一個R1或R2是N3；(b)將包含所說共價結(jié)合物的樣品與一種抗體接觸，該抗體能與樣品中的RNA酶L種類相結(jié)合；(c)通過凝膠電泳分離所述樣品中的蛋白質(zhì)；和(d)檢查分離的蛋白質(zhì)，尋找標(biāo)記蛋白質(zhì)，它(ⅰ)已經(jīng)與標(biāo)記探針化合物形成共價結(jié)合物，(ⅱ)已經(jīng)與所說抗體結(jié)合；根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，存在約37kDa表觀分子量的標(biāo)記蛋白質(zhì)，可以診斷為慢性疲勞綜合癥。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的形成共價結(jié)合物的條件包括用紫外光照射所說的樣品，使所說的探針化合物共價結(jié)合到樣品中的2’,5’-寡腺苷酸-結(jié)合蛋白上。
11．根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中探針化合物中的n等于1。
12．根據(jù)權(quán)利要求9或11的方法，其中探針化合物中的m等于1。
13．根據(jù)權(quán)利要求9到12中任意一項的方法，其中探針化合物中的各個R1是氫。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中探針化合物是5’-0-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-疊氮基腺苷酸或其鹽。
15．根據(jù)權(quán)利要求9到14中任意一項的方法，其中所述樣品包括血液或其一部分。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述樣品包括外周血單核細胞的胞漿提取物。
17．根據(jù)權(quán)利要求9到16中任意一項的方法，其中所述探針化合物上的可檢測標(biāo)志是一種放射標(biāo)志。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述放射標(biāo)志是32P原子。
19．一種檢測嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥的方法，包括(a)將外源蛋白酶抑制劑存在下制備的患者樣品與一種探針接觸，該探針中包含一種如式(Ⅰ)所示的帶有可檢測標(biāo)志的化合物或該化合物的水溶性鹽，接觸條件足以形成所述標(biāo)記探針化合物與樣品中2’,5’-寡腺苷酸結(jié)合蛋白的共價結(jié)合物
其中m是從0到3的整數(shù)，n是從1到3的整數(shù)，每個R1和R2彼此獨立于其他的R1和R2，為氫或N3，條件是至少一個R1或R2是N3；(b)將包含所說共價結(jié)合物的樣品與一種抗體接觸，該抗體能與樣品中的RNA酶L種類相結(jié)合；(c)通過凝膠電泳分離所述樣品中的蛋白質(zhì)；和(d)檢查分離的蛋白質(zhì)，尋找標(biāo)記蛋白質(zhì)，它(ⅰ)已經(jīng)與標(biāo)記探針化合物形成共價結(jié)合物，(ⅱ)已經(jīng)與所說抗體結(jié)合；根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，存在約37kDa表觀分子量的標(biāo)記蛋白質(zhì)，且根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，不存在約80kDa表觀分子量的標(biāo)記蛋白質(zhì)，可以診斷為嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中形成共價結(jié)合物的條件包括用紫外光照射所說的樣品，使所說的探針化合物共價結(jié)合到樣品中的2’,5’-寡腺苷酸-結(jié)合蛋白上。
21．根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中探針化合物中的n等于1。
22．根據(jù)權(quán)利要求19到21中任意一項的方法，其中探針化合物中的m等于1。
23．根據(jù)權(quán)利要求19到22中任意一項的方法，其中探針化合物中的每個R1都是氫。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中探針化合物是5’-O-磷酰基-腺苷酰-(2’→5’)-腺苷酰-(2’→5’)-8-疊氮基腺苷酸或其鹽。
25．一種評估慢性疲勞綜合癥的相對嚴(yán)重程度的方法，包括在自然條件下檢測患者樣品中的分子量約30kDa和約80kDa的RNA酶L分子的存在，(ⅰ)存在分子量約30kDa的RNA酶L分子，而不存在分子量約80kDa的RNA酶L分子，表示嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥；(ⅱ)兩種分子量的RNA酶L分子均存在，表示慢性疲勞綜合癥病情較輕。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的方法，包括(a)在非變性條件下，按照分子量分離患者樣品中的蛋白質(zhì)；(b)在分離的蛋白質(zhì)中檢測約30kDa和約80kDa的具有RNA酶L活性的蛋白質(zhì)。
27．根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中所述樣品包括血液或其一部分。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述樣品包括外周血單核細胞的胞漿提取物。
29．根據(jù)權(quán)利要求26到28任意一項的方法，其中RNA酶L活性的檢測包括檢測poly(U)-3’-pCp的水解。
30．根據(jù)權(quán)利要求26到28任意一項的方法，其中RNA酶L活性的檢測包括檢測水解28S和/或18S RNA后的特異裂解產(chǎn)物的形成。
全文摘要
慢性疲勞綜合癥可以通過在自然的條件下檢測體內(nèi)細胞(例如外周血單核細胞)的蛋白提取物中的約30kDa的RNA酶L分子而進行診斷。在非變性情況下,將蛋白按分子量進行分離,在分離后的蛋白中檢測具有2’,5’－寡腺苷酸RNA酶L活性的約30kDa的蛋白的存在。可以通過檢測分子量大約30kDa和80kDa的RNA酶L分子在體內(nèi)的存在情況來判定病情的嚴(yán)重程度。存在大約30kDa的RNA酶L分子而缺乏大約80kDa的RNA酶L分子,與嚴(yán)重的慢性疲勞綜合癥相關(guān);兩種RNA酶L分子均存在,表明病情較輕。在變性情況下并同時存在蛋白酶抑制劑時,慢性疲勞綜合癥可以通過檢測一種大約37kDa的2－5A結(jié)合蛋白而進行診斷。
文檔編號C12Q1/34GK1232508SQ9719860
公開日1999年10月20日 申請日期1997年9月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月9日
發(fā)明者R·J·舒哈多尼克 申請人:坦普爾大學(xué)