專(zhuān)利名稱(chēng)：以瓊脂－明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素酰化酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化酶生物技術(shù)，特別是涉及一種以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的制備固定化青霉素?；讣捌渲苽浞椒?。
固定化酶(lmmobilized enzyme)技術(shù)是本世紀(jì)六十年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型生物技術(shù)，其定義為“物理限制或定位于特定空間區(qū)域內(nèi)，保持了催化活性并且可以重復(fù)、連續(xù)使用的酶”。
天然酶在食品、化工和醫(yī)藥工業(yè)中廣泛應(yīng)用。世界范圍內(nèi)，每年用于食品、去垢劑、精細(xì)化工和診斷的酶銷(xiāo)售額達(dá)七億美元。但由于酶是一種可溶性的蛋白質(zhì)，不易回收，不能重復(fù)使用，造成了催化劑浪費(fèi)；此外酶蛋白還會(huì)污染產(chǎn)物，給后處理造成困難，在醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)中此問(wèn)題尤為嚴(yán)重。
六十年代初，Katchallski-Katzir等人為了研究自然狀態(tài)下附著在生物膜上的酶的作用機(jī)制，首先將一些蛋白水解酶固定于不溶性的載體上或包裹在人工膜中，研究其穩(wěn)定性和非均相催化作用的特性，如文獻(xiàn)1:Annu.Rev.Biochem.35,773-908,1966。他們認(rèn)識(shí)到，人工固定的酶，如果穩(wěn)定的話(huà)，可以設(shè)計(jì)合適的反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用，連續(xù)操作。
1967年日本Tanake Seiyaku公司Chibata等人首次成功地將固定化酶技術(shù)用于工業(yè)生產(chǎn)，如文獻(xiàn)2:Biotechnol.Bioeng.9,603-615,1967中描述的。他們使用固定化氨基酸酰化酶將人工合成的外消旋DL-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-型對(duì)映體。1970年前后，另外兩個(gè)固定化酶系統(tǒng)相繼投入中試生產(chǎn)。一個(gè)是英國(guó)用固定化青霉素?；杆馇嗝顾谿或V生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸(Proc.R.Soc.London Ser.B 179,321-334,1971)；另一個(gè)是美國(guó)用固定化葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)果糖(Applied Biochemistry and Bioengineering,Vol.1,pp222-327.Academic Press,1976)。這些成功的工業(yè)應(yīng)用促進(jìn)了固定化酶技術(shù)的廣泛深入研究，使以固定化酶為催化劑的工業(yè)過(guò)程的數(shù)量穩(wěn)定增加。
利用固定化酶進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，不僅使酶可以回收，重復(fù)使用，降低了催化劑成本，還提高了酶的穩(wěn)定性，避免了酶蛋白對(duì)產(chǎn)物造成的污染，簡(jiǎn)化了后處理。其研究和應(yīng)用迅速發(fā)展，在工業(yè)生產(chǎn)和生化分析中獲得廣泛應(yīng)用，成為現(xiàn)代生物技術(shù)中最活躍的領(lǐng)域之一。
目前，世界上工業(yè)產(chǎn)量最高的三種固定化酶為葡萄糖異構(gòu)酶、腈水解酶和青霉素?；?，年產(chǎn)量分別為80000噸、7500噸、1500噸。
酶固定化方法可歸納為載體結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法三大類(lèi)。
載體結(jié)合法是將酶結(jié)合于水不溶性載體上的一類(lèi)固定化方法。根據(jù)結(jié)合的形式不同，又可分為物理吸附法、離子結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法等。物理吸附法是指酶被物理吸附于不溶性載體上。載體有活性碳、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹(shù)脂等。此法具有酶活性中心不易被破壞、酶結(jié)構(gòu)變化小的優(yōu)點(diǎn)，但酶與載體相互作用力弱，酶易脫落。離子結(jié)合法將酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上。此法的載體有多糖類(lèi)離子交換劑和合成高分子離子交換樹(shù)脂，例如DEAE-纖維素、CM-纖維素等。此法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活收率較高的固定化酶。但是載體與酶的結(jié)合力較弱，容易受緩沖液種類(lèi)或pH的影響；在離子強(qiáng)度高的條件下反應(yīng)時(shí)，酶易從載體上脫落。共價(jià)結(jié)合法是將酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上。此法或是將載體有關(guān)的基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)的基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；或是在載體上接一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去?？膳c載體結(jié)合的酶的功能團(tuán)有氨基、羧基、羥基、酚基等。共價(jià)結(jié)合法反應(yīng)條件比較苛刻，操作復(fù)雜，并且易引起酶高級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，破壞了部分活性中心，酶活收率一般為30％左右。但是酶結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好。它是載體結(jié)合法中應(yīng)用最多的一種。
交聯(lián)法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶，不同的是它不使用載體。此法反應(yīng)條件較激烈、酶活收率低。
包埋法可分為包括網(wǎng)格型和微囊型兩種。將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱(chēng)為網(wǎng)格型；將酶包埋在高分子半透膜中的稱(chēng)為微囊型。包埋法一般很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活收率較高。但是包埋法只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶，因?yàn)橹挥行》肿硬趴梢酝ㄟ^(guò)高分子凝膠的網(wǎng)格進(jìn)行擴(kuò)散。適于網(wǎng)格型的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明膠、海藻酸等。微囊型固定化酶顆粒一般為直徑幾微米到幾百微米的球狀體，比網(wǎng)格型顆粒小得多。這有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散。但反應(yīng)條件要求高，制備成本也高。制備微囊型固定化酶常用界面沉淀法、界面聚合法、二級(jí)乳化法以及脂質(zhì)體包埋法等。
在各種固定化方法中，包埋法一般應(yīng)用于制備固定化細(xì)胞。工業(yè)上廣泛采用共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶。
青霉素類(lèi)抗生素是目前臨床使用最廣泛的抗生素，它具有抗菌力強(qiáng)，療效高，毒性低等優(yōu)點(diǎn)，是重要的抗感染藥物。它的抗菌作用機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。其分子內(nèi)β-內(nèi)酰胺環(huán)的完整性是其抗菌作用的前提。天然青霉素，即微生物直接合成的青霉素，有青霉素G(PenG)和青霉素V(PenV)兩種，天然青霉素的長(zhǎng)期使用，產(chǎn)生了抗性細(xì)菌?？剐跃僧a(chǎn)生青霉素酶，水解青霉素分子內(nèi)的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使之失活。若人工改變天然青霉素分子內(nèi)β-內(nèi)酰胺環(huán)上所聯(lián)的側(cè)鏈基團(tuán)，即得到半合成青霉素，側(cè)鏈基團(tuán)的改變可增加β-內(nèi)酰胺環(huán)的穩(wěn)定性；各種半合成青霉素具有殺菌譜廣，穩(wěn)定性好，可口服等優(yōu)點(diǎn)，因而在臨床上迅速取代了天然青霉素，目前，世界范圍內(nèi)80％以上的天然青霉素都是用于半合成青霉素的生產(chǎn)。
6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicillanicacid，簡(jiǎn)稱(chēng)6-APA)是生產(chǎn)半合成青霉素的關(guān)鍵性中間物，目前，臨床上使用的半合成青霉素全部來(lái)自6-氨基青霉烷酸。
6-氨基青霉烷酸是通過(guò)切割青霉素G或青霉素V的側(cè)鏈獲得的。以天然青霉素G或青霉素V為起始物，用化學(xué)法或酶法水解掉其側(cè)鏈，其中酶法采用的是青霉素?；?。化學(xué)法和酶法是同時(shí)起步發(fā)展的，都已用于工業(yè)生產(chǎn)。二者各有優(yōu)點(diǎn)。但是，隨著固定化酶技術(shù)的迅速發(fā)展應(yīng)用及石化產(chǎn)品和能源價(jià)格的不斷上漲，酶法顯現(xiàn)出較大的經(jīng)濟(jì)性；另外，酶法不污染環(huán)境，操作也較方便。因此，現(xiàn)在6-APA的工業(yè)生產(chǎn)主要是通過(guò)采用青霉素酰化酶水解青霉素G或青霉素V實(shí)現(xiàn)的。
工業(yè)上用酶法水解青霉素生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸是在1960年左右開(kāi)始起步的。最初采用的是活性菌種的細(xì)胞懸液，僅能使用一次，生產(chǎn)力非常低，大約為0.5-1Kg6-氨基青霉烷酸/Kg E.coli懸液，后來(lái)，通過(guò)固定化E.coli細(xì)胞，可將生產(chǎn)率提高至50Kg 6-氨基青霉烷酸/Kg固定化催化劑。目前，主要用固定化酶，生產(chǎn)率一般為100-1000Kg 6-氨基青霉烷酸/Kg固定化催化劑。
目前，世界上每年固定化青霉素?；傅挠昧繛?0-30噸。各大制藥公司均有自己的固定化載體和固定化酶。
我國(guó)固定化酶技術(shù)的研究取得了一定成就，發(fā)展了一些獨(dú)特的固定化技術(shù)，如雙功能試劑對(duì)-β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)的使用，便是我國(guó)研究者首創(chuàng)。但是固定化載體方面的研究很少。至今尚沒(méi)有商品化固定化酶專(zhuān)用載體。在固定化酶技術(shù)的研究中，多采用經(jīng)簡(jiǎn)單加工的天然材料和一些工業(yè)副產(chǎn)物或下腳料作為載體，性能較差。這樣雖然降低了載體的成本，但是影響了固定化酶功能的發(fā)揮，并且在一些情況下嚴(yán)重限制了固定化酶技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。
目前，我國(guó)生產(chǎn)半合成青霉素所用的6-氨基青霉烷酸主要靠進(jìn)口。也有廠家進(jìn)口固定化青霉素?；负团涮准夹g(shù)生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸。而國(guó)家每年要花費(fèi)大量外匯進(jìn)口生產(chǎn)半合成青霉素的關(guān)鍵性中間物(如6-APA)，不僅消耗大量人力和物力，同時(shí)也帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染等問(wèn)題，嚴(yán)重影響和制約著我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展。
本發(fā)明的目的發(fā)明的目的是為了開(kāi)發(fā)適合我國(guó)國(guó)情的工業(yè)化固定化載體和固定化酶，促進(jìn)固定化酶技術(shù)的發(fā)展和半合成抗生素原料的國(guó)產(chǎn)化；提供一種瓊脂-明膠復(fù)合微珠載體，既具有各方面的優(yōu)良性能又比較便宜、適合工業(yè)應(yīng)用的固定化酶載體，將青霉素?；腹潭ㄓ谄渖希苽涔潭ɑ嗝顾仵；?，用于6-氨基青霉烷酸的工業(yè)生產(chǎn)，解決我國(guó)半合成青霉素的原料問(wèn)題。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將明膠包埋在瓊脂中，制成復(fù)合凝膠珠。利用瓊脂強(qiáng)度高、易成型和明膠可活化基團(tuán)多、易活化的優(yōu)點(diǎn)，使載體既具有較高的強(qiáng)度又易于活化。瓊脂較瓊脂糖更便宜，但是可活化的基團(tuán)少，本身不適于作為固定化酶載體，在復(fù)合凝膠中，主要起支持作用，使載體具有較高的強(qiáng)度和穩(wěn)定性。而明膠的作用，是向載體中引入易于活化的氨基。復(fù)合載體可用戊二醛一步活第，將青霉素?；附Y(jié)合上去，制備固定化青霉素酰化酶。并且，由于戊二醛本身還是一種消毒劑，在活化載體的同時(shí)，又對(duì)載體進(jìn)行了消毒，有利于生產(chǎn)中保持無(wú)菌狀態(tài)。基本原理
制備步驟1)將瓊脂溶解在熱水中，配成2～15％(重量)的瓊脂溶液，再向其中加入1-5％(重量)的明膠，使之溶解。
采用不同的瓊脂濃度2-15％(重量)制備載體和固定化青霉素酰化酶。瓊脂濃度太低時(shí)，制備的載體強(qiáng)度小，且能包埋的明膠量少。制備的固定化酶活性和強(qiáng)度都較低。瓊脂濃度太高時(shí)，由于母液粘度大，制備困難，制備的載體顆粒球形度差。經(jīng)試驗(yàn)，瓊脂濃度8-12％(重量)范圍，制備的載體強(qiáng)度較好，能包埋的明膠量大，而不致于給制備過(guò)程帶來(lái)較大的困難。在瓊脂濃度為8-12％(重量)時(shí)，改變明膠的用量，制備載體和固定青霉素?；?。明膠濃度太低時(shí)，制備的固定化青霉素?；富钚暂^低。明膠濃度太高時(shí)，也會(huì)給制備帶來(lái)困難，且造成載體穩(wěn)定性下降。試驗(yàn)了明膠濃度1～5％的范圍，結(jié)果表明，明膠濃度2-4％(重量)，固定化酶活性較高，穩(wěn)定性較好，且制備方便。
2)在圓底燒瓶中將瓊脂-明膠混合溶液與等體積的有機(jī)溶劑(如氯仿，甲苯，汽油，乙酸丁酯等，從溶劑的毒性方面考慮，我們建議使用對(duì)人體無(wú)毒的乙酸丁酯)混合，開(kāi)動(dòng)攪拌(裝置如

圖1所示)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分；30秒鐘后向燒杯中加入冰水，繼續(xù)攪拌5分鐘。這時(shí)瓊脂-明膠形成混合微珠載體。
3)將混合物過(guò)濾，除去有機(jī)溶劑；依次以丙酮和蒸餾水洗滌。
4)活化取一定體積(堆積體積)的微珠載體，加入等體積的2.5％(v/v)戊二醛溶液，在室溫下?lián)u動(dòng)4小時(shí)；過(guò)濾除去戊二醛，以蒸餾水洗滌。
5)與青霉素?；附Y(jié)合將活化過(guò)的載體微珠與等體積經(jīng)稀的釋游離青霉素?；溉芤?10-50單位/毫升)混合，在4℃下?lián)u動(dòng)12小時(shí)；吸去溶液，產(chǎn)物依次以0.5M NaCl溶液和pH 8.0的磷酸緩沖液洗滌，得到以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素?；浮?br> 本發(fā)明的效果以本發(fā)明制備的固定化青霉素?；概c以國(guó)外通常采用的瓊脂糖6B微珠制備的固定化酶相比，強(qiáng)度較高，活性處于相同的水平，但產(chǎn)品價(jià)格便宜。并且制備方法簡(jiǎn)單，適于工業(yè)生產(chǎn)，解決我國(guó)半合成青霉素的原料。
本發(fā)明制備的固定化青霉素酰化酶與用其它方法制備的載體的固定化酶活性比較
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明圖1是本發(fā)明制備瓊脂-明膠復(fù)合微珠載體的裝置圖。
圖2是本發(fā)明的以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體制備的固定化青霉素?；傅姆€(wěn)定性圖。
實(shí)施例1①取瓊脂2g放入100ml 95℃熱水中，使其充分溶解，配成濃度為2％(重量)的瓊脂溶液；然后再加入1g明膠，保溫使之溶解，配成瓊脂-明膠混合溶液。
②在圓底燒瓶中將瓊脂-明膠混合溶液與等體積的有機(jī)溶劑乙酸丁酯，混合，開(kāi)動(dòng)攪拌，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分；30秒鐘后向燒杯中加入冰水，繼續(xù)攪拌5分鐘。這時(shí)瓊脂-明膠形成混合微珠載體。
③將所得瓊脂-明膠復(fù)合微珠載體用通常方法過(guò)濾，除去乙酸乙酯，再依次以丙酮和蒸餾水洗滌。
④活化取100ml復(fù)合微珠載體和100ml 2.5％(v/v)的戊二醛溶液混合，在室溫下?lián)u動(dòng)4小時(shí)；過(guò)濾除去戊二醛，以蒸餾水洗滌。
⑤與青霉素?；附Y(jié)合將活化過(guò)的載體微珠與等體積經(jīng)稀釋的游離青霉素酰化酶溶液(10-50單位/毫升)混合，在4℃下?lián)u動(dòng)12小時(shí)；吸去溶液，產(chǎn)物依次以0.5M NaCl溶液和pH=8.0的磷酸緩沖液洗滌，得到以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素酰化酶。
實(shí)施例2完全按實(shí)施例1制備過(guò)程操作，瓊脂取15g，明膠取5g，有機(jī)溶劑使用氯仿。
實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)條件完全按實(shí)施例1。使用瓊脂濃度配成8％，明膠濃度配成3％(重量)固定中科院微生物所篩選的巨大芽孢桿菌的青霉素酰化酶，制備固定化青霉素?；福富钍章势骄鶠?0～83％。在37℃重復(fù)使用時(shí)，酶活力批損失為0.85～0.93％，與用其它方法制備的固定化酶相近。如圖2所示。
權(quán)利要求
1．一種以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素?；?，其結(jié)構(gòu)為-N=CH(CH2)3C=N-R其中R=蛋白酶。
2．一種制備權(quán)利要求1所述的以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素?；阜椒ǎ涮卣髟谟谝来伟聪铝胁襟E進(jìn)行1)將瓊脂溶解在熱水中，配成2-15％(重量％)濃度的瓊脂溶液，再向其中加入1-5％(重量％)的明膠，使之溶解。2)在圓底燒瓶中將瓊脂-明膠混合溶液與等體積的有機(jī)溶劑，混合攪伴，30秒鐘后向燒杯中加入冰水，繼續(xù)攪拌5分鐘。這時(shí)瓊脂-明膠形成混合微珠載體。3)將混合物過(guò)濾，除去有機(jī)溶劑；依次以丙酮和蒸餾水洗滌。4)活化取等體積的3)中得到的瓊脂-明膠復(fù)合堆積體積微珠載體，加入等體積的2.5％(v/v)戊二醛溶液，在室溫下?lián)u動(dòng)4小時(shí)；過(guò)濾除去戊二醛，以蒸餾水洗滌。5)與青霉素?；附Y(jié)合將4)得到的活化過(guò)的載體微珠與等體積經(jīng)稀釋游離青霉素酰化酶溶液(10-50單位毫升)混合，在4℃下?lián)u動(dòng)12小時(shí)；吸去溶液，產(chǎn)物依次以0.5M NaCl溶液和pH=8.0的磷酸緩沖液洗滌，得到以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素?；?。
3．按權(quán)利要求2所述的制備以瓊脂-明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素?；傅姆椒ǎ涮卣髟谟谒褂玫挠袡C(jī)溶劑包括甲苯、氯仿、汽油、乙酸丁酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以瓊脂－明膠復(fù)合微珠為載體的固定化青霉素?；讣捌渲苽浞椒?。本發(fā)明配成濃度為2—15%(重量%)瓊脂溶液,再加入1—5%(重量)的明膠使之溶解,再加入有機(jī)溶劑形成微珠載體,經(jīng)活化再與青霉素?；附Y(jié)合得到固定化青霉素?；浮Ｔ摲椒ê?jiǎn)單,適于工業(yè)生產(chǎn);產(chǎn)品強(qiáng)度高,活性好,價(jià)格便宜。
文檔編號(hào)C12N11/10GK1209454SQ9711620
公開(kāi)日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1997年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月25日
發(fā)明者曲紅波, 叢威 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化工冶金研究所