專利名稱：用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的包裝細(xì)胞系及其用途，特別涉及將AAV全基因組但不包含其兩端反向重復(fù)序列(Inverted terminalrepeats，ITRs)的191～4484核苷酸共約4.3kb序列，克隆于以EB病毒復(fù)制子為基礎(chǔ)的自主復(fù)制型載體而產(chǎn)生的AAV-EBV嵌合質(zhì)粒型載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系A(chǔ)549，經(jīng)抗性選擇，所建立的細(xì)胞系A(chǔ)E1201。細(xì)胞系A(chǔ)E1201能表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白，以提供反式功能用于包裝攜帶外源基因的重組腺病毒伴隨病毒(recombrant adeno-associated virus，rAAV)的基因組，從而可用于生產(chǎn)rAAV。
AAV屬于微小病毒科，它的基因組是單鏈DNA，由4682個核苷酸組成，兩端各有145個核苷酸的反向重復(fù)序列，是AAV基因組的復(fù)制起點(diǎn)和與復(fù)制及整合相關(guān)的順式序列元件的所在，病毒基因組的編碼信息按蛋白的功能可分成兩部分，左端(Rep區(qū))編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄必需的蛋白，右端(Cap區(qū))編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
AAV是非自主復(fù)制的病毒，它的產(chǎn)毒性復(fù)制需要有輔助病毒如腺病毒ADV或單純皰疹病毒HSV的協(xié)助才能進(jìn)行。當(dāng)輔助病毒不存在時，AAV感染人細(xì)胞后，病毒DNA以很高的頻率整合于宿主染色體的特定位置，建立隱性感染，不產(chǎn)生子代病毒；但當(dāng)宿主細(xì)胞被腺病毒或單純皰疹病毒感染時，可將AAV從整合于染色體的原病毒狀態(tài)激活，并從中拯救出來，從而破壞了AAV的隱性感染，復(fù)制產(chǎn)生子代AAV毒粒。
AAV分子生物學(xué)的一個重要特點(diǎn)是，用克隆于大腸桿菌質(zhì)粒的AAV全基因組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，當(dāng)有腺病毒或單純皰疹病毒感染時，質(zhì)粒中的AAV基因組也可被拯救出來，產(chǎn)生野生型的AAV毒粒。這一特性構(gòu)成了制備重組AAV病毒載體的理論基礎(chǔ)。
含AAV全基因組的質(zhì)粒，通過遺傳工程的方法，去除了基因組中用于編碼病毒蛋白的部分或全部序列元件，僅保留AAV基因組中兩端的ITRs，插入了相當(dāng)于被刪去AAV基因片段大小的外源DNA，可得到含外源基因的重組AAV病毒表達(dá)載體質(zhì)粒(I)；同時，除去克隆化AAV全基因組兩端的ITRs，保留其編碼病毒蛋白的全部基因序列，可得到用于輔助重組AAV載體包裝的助手包裝質(zhì)粒(II)，它轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在輔助病毒如ADV或HSV存在時，可表達(dá)與AAV輔助和包裝必需的病毒蛋白，但由于缺失了復(fù)制必需的順式元件，不能進(jìn)行復(fù)制和包裝出野生型AAV毒粒。而當(dāng)感染了輔助病毒的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染I和II這兩種質(zhì)粒時，(轉(zhuǎn)染方法可以是磷酸鈣共沉淀法或脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)，助手包裝質(zhì)粒II表達(dá)的反式蛋白，識別重組AAV病毒表達(dá)載體質(zhì)粒I中AAV的ITRs順式作用元件，將重組AAV兩端的ITRs連同外源基因一起從質(zhì)粒I中拯救出來，進(jìn)行復(fù)制和包裝出重組AAV病毒顆粒。采用化學(xué)或物理手段除去和滅活輔助病毒，得到的重組AAV毒?？勺鳛橐环N轉(zhuǎn)導(dǎo)性載體，通過病毒感染的方式將外源基因?qū)氲郊?xì)胞中，并可整合于宿主染色體中而得到穩(wěn)定的表達(dá)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，重組AAV載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)有絲分裂后細(xì)胞和分化終端細(xì)胞，AAV具有超感染的特性，可進(jìn)行重復(fù)感染，同時在人類至今還未發(fā)現(xiàn)與AAV直接相關(guān)的疾病，這些特點(diǎn)使它在人類疾病的基因治療領(lǐng)域中具有應(yīng)用前景。
目前制備重組AAV毒粒的方法基本上是按上述原理進(jìn)行，也就是采用兩種不同的AAV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，一種載體提供AAV的反式作用蛋白，另一種提供復(fù)制和包裝必需的順式序列元件和外源基因，在輔助病毒的協(xié)助下，獲得攜帶外源基因的AAV毒粒。
為提高重組AAV載體的包裝效率，Samulski將克隆化野生型AAV基因組的兩端ITRs用腺病毒5型基因組兩端的重復(fù)序列所取代，獲得AAV包裝質(zhì)粒pAd8(Samulski et alHelperfree stocks of recombinant adeno-associated virusnormal intergration does not require viral geneexpression.J.Virology 633822-3828)，雖然ADV的末端重復(fù)能允許被導(dǎo)入已感染ADV的細(xì)胞中的pAd8按腺病毒復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行有限的擴(kuò)增，但還未能離開上述的工作模式，盡管這過程相對簡單，但操作起來仍較為繁瑣。表現(xiàn)為由于沒有獲得一種能支持重組AAV復(fù)制和包裝的細(xì)胞系的存在，每次操作都需要將兩種載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，由于共轉(zhuǎn)染兩種載體同時到大量的細(xì)胞個體的頻率較低，因此也影響到產(chǎn)生重組AAV病毒的效率。
Lebkowski等人(Applied Immune Science，Inc.)提出了一種改進(jìn)，將帶外源基因的重組AAV載體克隆于自主復(fù)制的EB復(fù)制子載體中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)可維持多拷貝的重組AAV載體的存在，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞感染上一種將AAV全基因組的蛋白編碼序列重組于腺病毒E3區(qū)的重組腺病毒時，該重組腺病毒不僅能提供輔助病毒的功能，同時也表達(dá)出AAV包裝所必需的反式蛋白，使細(xì)胞中多拷貝存在的，位于EB載體上的帶外源基因的重組AAV基因組可被包裝出重組AAV病毒顆粒(US5173414，US5354678)。這過程看起來相當(dāng)簡化，但使用起來對于克隆不同外源基因的重組AAV載體，都需要分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得不同的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系后，才能進(jìn)一步用重組腺病毒感染來包裝出重組病毒。
將AAV基因組的所有編碼病毒蛋白的序列元件轉(zhuǎn)化到細(xì)胞，構(gòu)建出一種能提供包裝重組AAV的反式包裝細(xì)胞系，能提供一種可行的包裝重組AAV的簡單通用的包裝體系，Vincint等將AAV的基因組轉(zhuǎn)化Hela細(xì)胞，獲得整合了AAV基因組的包裝細(xì)胞系，但包裝重組病毒的效率很低，可能是受制于該轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中AAV基因組的低拷貝數(shù)和整合于受體細(xì)胞染色體中的AAV基因組的低效率表達(dá)所致(Vincint et alReplication and packaging ofHIV envelope genes in a novel adeno-associated virus vector，Vaccine 90353-359)。
本發(fā)明的目的是，提供一種能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系，它含有不包括兩端包裝信號ITRs的AAV全基因組編碼序列，在輔助病毒存在時，能支持?jǐn)y帶外源基因的重組AAV載體包裝成重組AAV病毒顆粒。它的構(gòu)建是由載體pEB-AAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549后，在潮霉素B選擇壓力下獲得一種能高效提供反式包裝重組AAV病毒的所有病毒蛋白的包裝細(xì)胞系，我們將其命名為細(xì)胞系A(chǔ)E1201。AAV的全基因組蛋白編碼信息在AE1201細(xì)胞染色體外以多拷貝的附加子形式穩(wěn)定存在并自主復(fù)制，當(dāng)此包裝細(xì)胞系感染輔助病毒后，自主復(fù)制載體上的AAV的編碼蛋白基因就能表達(dá)，如再轉(zhuǎn)染進(jìn)該細(xì)胞系含外源基因的重組AAV載體質(zhì)粒，就能從質(zhì)粒中拯救出來并包裝成重組病毒。
本發(fā)明的特點(diǎn)是，包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201中所含的自主復(fù)制載體pEB-AAV是采用EB病毒復(fù)制子載體荷載AAV的基因組序列。EB病毒復(fù)制子載體能游離于人細(xì)胞染色體外自主復(fù)制，能以較高的頻率轉(zhuǎn)染細(xì)胞，很容易通過抗藥性篩選得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，只要培養(yǎng)液中加以抗生素壓力，就能維持EB復(fù)制子載體在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，這樣，AAV的基因不需整合到宿主細(xì)胞的染色體上，作為載體上目標(biāo)基因，其表達(dá)由于處于附加子的環(huán)境，能保證AAV基因組中所有編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)，不受細(xì)胞染色體的影響。
本發(fā)明的用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒包裝細(xì)胞系所使用的自主復(fù)制載體，由以下DNA元件組成1，AAV病毒蛋白編碼序列AAV基因組191--4484核苷酸。
2，EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制子OriP及其反式作用因子EBNA-I。
3，真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)。
4，大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因)。
本發(fā)明用于構(gòu)建可生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系的原始質(zhì)粒有pEB-AAV顏?zhàn)臃f等，中國專利申請?zhí)?6 105366.6，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊的編號為CGMCC NO.0266)。
本發(fā)明用于構(gòu)建可生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系的原始細(xì)胞有
人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC CCL185)。
用質(zhì)粒pEB-AAV轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，經(jīng)潮霉素選擇，挑取克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，即可建立能實(shí)施AAV包裝功能的細(xì)胞系。我們將由此建立的細(xì)胞系命名為AE1201。此細(xì)胞系細(xì)胞可用含潮霉素100-400μg的1640或DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，并維持其對重組AAV的包裝功能。
細(xì)胞系A(chǔ)E1201中由于含有自主復(fù)制載體pEB-AAV，因而在輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒誘導(dǎo)時，能表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白，并用于包裝攜帶外源基因的重組AAV基因組，產(chǎn)生重組AAV病毒顆粒。此細(xì)胞系細(xì)胞已于1997年1月9日保存于中國典型培養(yǎng)物保存中心，登記如冊的編號為CCTCCC97001。
以下實(shí)施例對本發(fā)明的用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系的制備和用途作了詳細(xì)說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。在實(shí)施例中，所用的重組AAV載體質(zhì)粒pAAVlac是AAV原始質(zhì)粒pSub201(J.Virology，633822-3828，1989)AAV編碼病毒蛋白部分4.3kb XbaII片段為一片段大小相同的β半乳糖苷酶的表達(dá)單位所取代，A549細(xì)胞是人肺癌細(xì)胞系(ATCC CCL185)。
荷載AAV的結(jié)構(gòu)基因的自主復(fù)制型載體pEB-AAV是將AAV的基因組中191-4484的序列克隆于EB病毒復(fù)制子載體中。
實(shí)施例1質(zhì)粒的制備。
大腸桿菌DH5α/pEB-AAV接種于200ml LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24小時，離心收菌體，加5ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重懸菌體，冰浴下加10ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，5分鐘后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)混勻，15000rpm離心1 5分鐘，上清加0.6倍體積異丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH5.0)溶解，等體積酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提除蛋白質(zhì)，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝膠過濾，收集流出的質(zhì)粒峰，經(jīng)乙醇沉淀和洗鹽后，溶于純水中即可。
實(shí)施例2AAV反式包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201的建立。
A549細(xì)胞以加10％的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代于100mm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞呈70％匯片時，pEB-AAV采用Lipofectin試劑(BRL公司)，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入細(xì)胞，2-3天后，按1∶4稀傳細(xì)胞于含200μg潮霉素B的培養(yǎng)液中，期間隔2、3天換新鮮的含潮霉素的培養(yǎng)液，除去死細(xì)胞，2-3周后長出細(xì)胞集落，挑出細(xì)胞集落擴(kuò)增，獲得質(zhì)粒pEB-AAV在其中以附加子形式存在，并隨細(xì)胞分裂周期自主復(fù)制的AAV反式包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201。這個細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)應(yīng)使用含100-400μg潮霉素B的1640或DMEM培養(yǎng)液，以確保質(zhì)粒在細(xì)胞傳代過程的維持。
實(shí)施例3利用構(gòu)建的反式包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201制備重組AAV病毒顆粒。
實(shí)施例2所獲的細(xì)胞系在使用時不加潮霉素B，傳代于100mm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞呈40％匯片時，接種5型腺病毒(ADV5)，接種的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，mio)可在1-5，感染2-4小時后，將10μg重組質(zhì)粒采用Lipofectin試劑(BRL公司)，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入細(xì)胞，或以磷酸鈣共沉淀法導(dǎo)入細(xì)胞，1天后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)時，可收獲混合了輔助病毒ADV5的重組AAV。收毒時，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞都回收，反復(fù)凍融或以超聲處理使細(xì)胞完全裂解，離心去掉細(xì)胞碎片，56℃加熱1小時以滅活腺病毒，再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過濾除菌，得到可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的重組AAVlac。
實(shí)施例4重組AAV病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)人細(xì)胞系。
實(shí)施例3所獲的帶報道基因β半乳糖苷酶的重組腺病毒伴隨病毒顆粒AAVlac可用于感染培養(yǎng)細(xì)胞系，在培養(yǎng)的A549細(xì)胞感染AAVlac，48小時后，以細(xì)胞化學(xué)的方法檢測β半乳糖苷酶的表達(dá)，(Somatic Cell Mol.Genet.，13(3)，253-265，1987)，細(xì)胞以磷酸鈉緩沖液洗滌2遍，加入含X-Gal的染色液，30分鐘或更長時間后觀察，可見被感染細(xì)胞因外源基因的表達(dá)而呈藍(lán)色，其典型的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為當(dāng)病毒滴度為107時，感染培養(yǎng)有106個細(xì)胞的培養(yǎng)皿，可見培養(yǎng)皿的細(xì)胞全部變藍(lán)。
實(shí)施例5含質(zhì)粒pEB-AAV的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201用于擴(kuò)增重組AAV。
實(shí)施例2所獲的細(xì)胞系A(chǔ)E1201在使用時不加潮霉素B，傳代于100mm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞呈80％匯片時，感染從實(shí)施例3所獲的帶報道基因β半乳糖苷酶的重組腺病毒伴隨病毒顆粒AAVlac，24小時后，感染接種5型腺病毒(ADV5)，接種的感染復(fù)數(shù)(multiplicity ofinfection，mio)可在1-5，再過24-72小時后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)時，可收獲混合了輔助病毒ADV5的重組AAVlac。收毒時，細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞都回收，反復(fù)凍融或以超聲處理使細(xì)胞完全裂解，離心去掉細(xì)胞碎片，56℃加熱1小時以滅活腺病毒，再經(jīng)0.22μm醋酸纖維膜過濾除菌，得到可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的重組AAVlac，經(jīng)此過程，可使AAVlac的滴度進(jìn)一步提高。
權(quán)利要求
1，能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201，其特征在于含有能反式提供AAV基因組編碼蛋白的EB病毒自主復(fù)制型載體pEB-AAV，pEB-AAV由下列DNA元件組成1，AAV病毒蛋白編碼序列AAV基因組191-4484核苷酸；2，EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制子OriP及其反式作用因子EBNA-I；3，真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)；4，大腸桿菌質(zhì)粒骨架(包括大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性β內(nèi)酰胺酶基因)。
2，能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的包裝細(xì)胞系，是由載體pEB-AAV轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，經(jīng)潮霉素壓力選擇所建立的。其特征在于，只要培養(yǎng)液中加以潮霉素壓力，pEB-AAV在細(xì)胞系A(chǔ)E1201中就能以附加子的形式穩(wěn)定存在，并自主復(fù)制。載體上的目標(biāo)基因表達(dá)處于附加子環(huán)境，保證了AAV基因組中所有編碼基因的表達(dá)不受細(xì)胞染色體的影響。
3，能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(Adeno-associated virus，AAV)的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201，其特征在于在腺病毒或單純皰疹病毒誘導(dǎo)時，細(xì)胞能表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白，以提供反式功能用于包裝攜帶外源基因的重組AAV基因組，用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
4，根據(jù)權(quán)利要求1和2和3，能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201，其特征在于，將細(xì)胞系轉(zhuǎn)染克隆了外源基因的重組AAV質(zhì)粒載體，在輔助病毒存在時，可支持重組腺病毒伴隨病毒基因組的包裝，產(chǎn)生攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
5，根據(jù)權(quán)利要求1和2和3，能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201，其特征在于，細(xì)胞系用攜帶外源基因的重組AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后，在輔助病毒存在時，可用于進(jìn)一步擴(kuò)增攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
6，根據(jù)權(quán)利要求1和2和3和4和5，能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201，其特征在于可在助手包裝質(zhì)粒不存在時，也能與外加的輔助病毒一起，用于生產(chǎn)或擴(kuò)增攜帶外源基因的重組AAV病毒顆粒。
全文摘要
能用于生產(chǎn)重組腺病毒伴隨病毒(AAV)的包裝細(xì)胞系A(chǔ)E1201,是用EB病毒復(fù)制子載體pEB－AAV轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,經(jīng)抗性篩選構(gòu)建的AAV結(jié)構(gòu)基因以多拷貝附加子形式穩(wěn)定存在并自主復(fù)制的AAV反式包裝細(xì)胞系。EB病毒復(fù)制子載體pEB－AAV含有AAV基因組編碼所有病毒蛋白基因的191～4484核苷酸序列元件、EB病毒質(zhì)粒型復(fù)制子及其反式作用因子、真核細(xì)胞抗性選擇標(biāo)志、以及帶大腸桿菌復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌質(zhì)粒骨架。細(xì)胞系A(chǔ)E1201在輔助的腺病毒或單純皰疹病毒誘導(dǎo)時,能表達(dá)AAV基因組編碼的蛋白,以提供反式功能用于包裝攜帶外源基因的AAV基因組,用于生產(chǎn)重組AAV病毒顆粒。
文檔編號C12N15/64GK1177006SQ9711509
公開日1998年3月25日 申請日期1997年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月4日
發(fā)明者姚二梅, 顏?zhàn)訚}, 侯云德 申請人:病毒基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室