專利名稱：抗腫瘤的新型人α型干擾素及其突變體的制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新型、高效的抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)藥物-新型人α型干擾素和它們的衍生物制作技術(shù)及其用途。這類新型干擾素與現(xiàn)有干擾素比較，具有活性高或特異性強(qiáng)或副反應(yīng)小的優(yōu)點。
干擾素是一類重要的細(xì)胞素，它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、抗細(xì)胞分裂、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。經(jīng)10多年臨床應(yīng)用研究表明，它是一種重要的抗病毒、抗腫瘤治療藥物。
迄今所知，人、小鼠、牛、馬等哺乳動物的干擾素均有α、β、γ等三個型別。其中α型中又有許多亞型，可分為兩大家族。人干擾素的第Ⅰ類家族(HuIFN-αⅠ)有15～20個基因成員，其中大部分都編碼功能蛋白，彼此在核苷酸水平上有大約90%的同源性;而人干擾素的第Ⅱ類α家族(HuIFN-αⅡ)有5-6個成員，后者與αⅠ家族有50%的同源性，其中大部分是偽基因，但其中ω型干擾素具有生物學(xué)活性;人的β型干擾素(HuIFN-β)和γ型干擾素(HuIFN-γ)公認(rèn)的只有一個亞型。人的α、β干擾素結(jié)構(gòu)基因位于第9對染色體的短臂上，而人γ干擾素基因位于第12對染色體的長臂上。
1986年美國FDA首先批準(zhǔn)基因工程α2a干擾素(Roche公司)和α2b干擾素(Schering公司)投放市場;基因工程β、γ干擾素也相繼于1990年、1993年獲準(zhǔn)投放市場。目前有57個國家批準(zhǔn)上市干擾素治療約30多種疾病。
現(xiàn)有的α干擾素制劑，包括干擾素α2a、2b、自然白細(xì)胞干擾素和由類淋巴母細(xì)胞產(chǎn)生的Namalwa干擾素均不具備針對腫瘤細(xì)胞的特異性，效療尚不理想，大劑量時有不良反應(yīng)等缺點。
人αl型干擾素基因的變異與分類根據(jù)人αl和α型干擾素基因的保守序列所設(shè)計的上游引物為5′TCTGGCCTGTGATCTCCCTG3′;下游引物為3′TTCCTTATTGTAGACCTAGGTGT～5′。以上述引物，采用PCR技術(shù)，從正常中國人胎肝細(xì)胞DNA中克隆出一種IFN-αl的新變種，IFN-αl/158Val，即與Nagata等克隆的IFN-αlcDNA序列比較，在第541位核苷酸為G，而不是T，從而導(dǎo)至第158位氨基酸為Val，而不是Leu。分別克隆2次，均證明序列相同。
采用PCR技術(shù)，檢查20份正常中國人周圍血細(xì)胞DNA。中編碼α干擾素的等位基因中第158位為Val的占59%，而為Leu的占41%。
以2.1.的同一引物，采用PCR技術(shù)，從正常中國人外周血細(xì)胞DNA中克隆出另一個α型干擾素的新變種，IFN-α1/31Val/56Ala/158Val，即與Nagata等克隆的IFN-α1 cDNA序列比較，分別在第95，171，476位有3處變異，導(dǎo)致第31位氨基酸為Val，而不是Met;第56位氨基酸為Ala，而不是Val;第158為氨基酸為Val，而不是Leu。分別克隆2次，均證明序列相同。
根據(jù)我們發(fā)現(xiàn)的人α1型干擾素等位基因的變異，我們將由Goeddel等從KGl細(xì)胞克隆的IFN-αD，Nagata等從正常人白細(xì)胞克隆的IFN-α1以及我們從正常中國人克隆的IFN-α1/158Val和IFN-α1/31Val/56Ala/158Val分別命名為IFN-α1a，1b，1c，1d。(表1)表1 α1和α2型干擾素的等位基因等位基因 核苷酸序列* 氨基酸序列#91 167 341 472 31 56 114 1581a A T T T Met Val Val Leu1b A T C T Met Val Ala Leu1c A T C G Met Val Ala Val1d G C C G Val Ala Ala Val＊以去信號肽編碼區(qū)計算;＃成熟干擾素第一個氨基酸計算。
人α1a，1b，1c，1d干擾素基因全序列如下


IFN-α1/114Ala，/158Val抗病毒活性的特點HuIFN-α1/114Ala、/158Val在MDBK細(xì)胞上的抗病毒活性比WISH高20～30倍左右，而HuIFN-α2a則無差別。
HuIFN-α1/114Ala抑制出血熱病毒繁殖的能力比IFN-α2a高15倍，對其他病毒的敏感性也有差別。
IFN-α1/114Ala的臨床治療效果與副反應(yīng)用人α1/114Ala干擾素治療慢性活動性肝炎，每次20微克，頭3個月，每日1次，肌肉注射，后3個月，每周2次，肌肉注射，在干擾素治療后6個月，大月有40%患者有臨床反應(yīng)。主要表現(xiàn)在HBV DNA，HBV e抗原的陰轉(zhuǎn)和e抗體的陽轉(zhuǎn)。
用IFN α1/114Ala治療毛細(xì)胞性白血病，有40%患者完全緩解或部分緩解。
采用α1/114Ala型干擾素治療丙型肝炎，每次20微克，每周3次，治療6個月后，40-50%的患者肝功恢復(fù)正常。
我們證明，慢性宮頸炎與人乳頭瘤病毒感染有關(guān)，特別是第16型，此外，Ⅱ型皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和沙眼衣原體感染也有關(guān)。采用人α1/114Ala型干擾素治療后有十分明顯的療效。治療方案是，1MU，局部貼敷，每周三次，持續(xù)二周，60%以上有顯效，療效可維持一年以上。治療后不僅臨床癥狀有明顯改善，Ⅱ型皰疹病毒和16型人乳頭瘤病毒的檢出率也大幅度降低。
人α1/114Ala型基因工程干擾素還能有效地防止宮頸人乳頭瘤病毒的母嬰傳播。
人α1/114Ala型干擾素治療單純皰疹性角膜炎，每日3-4次，每次1-2滴，濃度為10ug/ml，療程1周，治愈率達(dá)90%以上。
與人α2a或2b干擾素相比，在相同劑量和獲得相同療效的情況下α1/114Ala型干擾素的副反應(yīng)明顯較低，發(fā)燒率一般為40%左右，并低于38度。
新型人α1型干擾素--HuIFN-α1/86AspHuIFN-α1/86Asp突變體的構(gòu)建人α型干擾素有166個氨基酸，其中1和99位Cys，29和139位Cys之間形成二硫鍵，后者對維持干擾素的生物學(xué)活性是重要的。但是，人α1型干擾素在第86位存在第5個Cys，這與該分子易于形成二聚體，與溫度不穩(wěn)定有關(guān)。我們采用定位突變技術(shù)，將其中編碼第86位Cys的TGC改為編碼Asp的GAC。為此，設(shè)計了20bp的寡核苷酸引物，它與親本干擾素基因的匹配情況如下親本干擾素模板5′CTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTAC 3′寡核苷酸引物3′CTGTTTAAGCTGTGGCTTGA 5′其中原有的TGC(Cys)，將改變?yōu)镚AC(Asp)。方法是先將IFN-α1cDNA的EcoR1片段克隆到M13mp8載體中，提出單鏈作為模板。同時，以EcoRI酶切M13mp8 RF使之也成為線性雙鏈分子，將單鏈模板與改線性雙鏈分子退火，形成缺口雙鏈分子，再加入提純的合成引物，退火后，在Klenow及T4DNA連接酶作用下，延伸引物并連接，形成異源雙鏈DNA分子，室溫作用4小時后，轉(zhuǎn)化致敏的JM103細(xì)胞，再以合成引物為探針，篩選轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的白色噬菌斑，在非嚴(yán)條件下，58℃(T℃＝2(A+T)+4(G+C)-3)進(jìn)行雜交，選出陽性斑。突變體及其母體的核苷酸序列進(jìn)行了測定，結(jié)果證明與原設(shè)計完全一致，由于突變體中改變了2個核苷酸，引進(jìn)了一個TaqⅠ切點(TCGA)，經(jīng)酶切也獲得證明。突變體與母體分子的部分序列如下變異前: nt: 5'...GAC AAA TTC TGC ACC GAA CTC...3'aa: Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu變異后: nt: 5'...GAC AAA TTC GAC ACC GAA CTC...3'aa: Asp Lys Phe Asp Thr Glu Leu HuIFN-α1/86Asp突變體分子量測定采用HuIFN-α1單克隆抗體親和層析對突變體和母體分子進(jìn)行純化。SDS-PAGE表明，突變體和母體分子的分子量均為20000D。
HuIFN-α1/86Asp突變體的抗病毒活性我們采用pBV220表達(dá)載體分別構(gòu)建了pBV220/HuIFN-α1/86Cys和pBV220/HuIFN-α1/86Asp。以WISH細(xì)胞-VSV系統(tǒng)進(jìn)行抗病毒活性的測定，5次實驗結(jié)果表明，每毫升培養(yǎng)液的干擾素抗病毒活性單位為86Cys平均為6709單位;86Asp平均為17151單位(P＜0.001)。
HuIFN-α1/86Asp突變體在4℃的穩(wěn)定性突變體和其母體干擾素的滴度均為116000;在4℃放置1個月后，3次實驗表明，86Cys的抗病毒活性平均為14458;而86Asp突變體則平均為114532;說明86Asp突變體的抗病毒活性基本不變;而86Cys母體分子的抗病毒活性卻只有原來的1/3。
HuIFN-α1/86Asp突變體對不同病毒的抗病毒活性在Vero細(xì)胞上，分別用86Cys和86Asp處理，以如下6種病毒進(jìn)行攻擊濾泡性口腔炎病毒，CoxBl病毒，Sindbis病毒，3型腺病毒，麻疹病毒，Ⅰ型單純皰疹病毒等，以比較突變體和母體干擾素的抗病毒活性。結(jié)果表明，突變體干擾素和其母體干擾素對上述6種人類常見病毒的繁殖抑制作用是相近的，這說明，突變體干擾素的抗病毒敏感性與母體干擾素?zé)o明顯差別。
HuIFN-α1/86Asp突變體的抗細(xì)胞分裂活性突變體干擾素和母體干擾素分別處理Raji細(xì)胞，通過H(3)-TdR攝入量的降低來反映細(xì)胞分裂受抑制的程度，結(jié)果表明，當(dāng)干擾素的膿度為1000IU/ml，100IU/ml，10IU/ml，1IU/ml時，86Cys的Raji細(xì)胞分裂抑制率分別為20.0±3.1，17.7±2.8，8.2±6.1，3.7±3.3%;而86Asp的Raji細(xì)胞分裂抑制率則分別為36.7±5.3，28.0±5.1，26.7±7.9，19.2±5.6;這說明，突變體干擾素的抗Raji細(xì)胞分裂活性比其母體干擾素平均提高2.5倍。
HuIFN-α1/86Asp突變體的NK細(xì)胞殺傷活性采用乳酸脫氫酶(LDH)攝放法測定了突變體及其母體干擾素對NK細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果說明，突變體干擾素的NK細(xì)胞激活活性比其母體干擾素高1.86倍(27.2±4.4對14.6±3.5)。
HuIFN-α1/86Asp突變體質(zhì)粒的穩(wěn)定性
pBV220/HuIFN-α1/86Asp傳100代后，干擾素表達(dá)水平基本不變。
HuIFN-α1/86Asp突變體不僅提高了對溫度的穩(wěn)定性，而且也提高了干擾素的生物學(xué)活性。
腦啡肽干擾素融合蛋白(Enk-HuIFN-α1/86Asp)在干擾素治療帶狀皰疹的過程中，病人在干擾素注射后1小時內(nèi)，神經(jīng)疼痛明顯緩解，說明干擾素有一定鎮(zhèn)痛作用。另一方面，腦啡肽(Enk)是存在于動物體內(nèi)的多肽類生理物質(zhì)，參與體內(nèi)神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌等生理功能過程的調(diào)節(jié);已有證據(jù)表明，一些腫瘤細(xì)胞，如神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌等，其胞膜富含δ型阿片受體。我們構(gòu)建腦啡肽干擾素突變體(Enk-HuIFN-α1/86Asp)在細(xì)胞水平和在動物水平證明有較高的抗腫瘤活性和鎮(zhèn)痛作用。
Enk-IFN-α1/86Asp突變體基因的構(gòu)建采用DNA合成技術(shù)人工合成Met腦啡肽，與人α1/86Asp型干擾素cDNA的N端連接，兩者之間有一3肽作為連接肽。突變體的部分序列如下Tyr Gly Gly Phe Met Ser Gly Ser Cys Asp LeuC ATG TAC GCT GGC TTT ATG TCC GGA TCC TGC GAC CTG C...
EcoRI BamHI Dde(腦啡肽序列) (連接肽序列) (干擾素序列)腦啡肽干擾素(Enk-IFN α1/86Asp)基因全序列測定
Enk-HuIFN-α1/86Asp表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用pBV220表達(dá)載體，使腦啡肽干擾素融合蛋白基因置于PRPL啟動子的控制下表達(dá)。
突變體干擾素的純化與N端測序。
經(jīng)溫度誘導(dǎo)表達(dá)Enk-IFN-α1/86Asp，經(jīng)干擾素單克隆抗體親和層析后，在SDS-PAGE上呈單一條帶。N端測序結(jié)果表明，N端15個氨基酸序列無誤。
Enk-IFN-α1/86Asp的抗病毒活性4次實驗結(jié)果表明，融合蛋白的比活性為98MU/mg，70MU/mg，85MU/mg和75MU/mg，平均為82MU/mg;與HuIFN-α1/86Cys的比活性無明顯差別。
Enk-IFN-α1/86Asp的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性采用H(3)-TdR摻入法測定不同濃度Enk-HuIFN-α1/86Asp對BT325細(xì)胞(多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系)抑制活性。
抑制率%= (實驗組cpm-對照組cpm)/(對照組cpm) (n＝3)當(dāng)干擾素為10，100，1000單位時，Enk-IFN-α1/86Asp的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分別為31.6，39.7，47.1;而IFN-α1/86Asp則分別為7.6，13.9，20.1(P<0.01)。
采用H(3)-TdR摻入法測定不同濃度Enk-HuIFN-α1/86Asp對HCT-8細(xì)胞(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系)的抑制活性。當(dāng)干擾素為10，100，1000單位時，Enk-IFN-α1/86Asp的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性分別為39.7，46.5，56.1;而IFN-α1/86Asp則分別為16.1，22.9，33.6(P＜0.01)。
上述結(jié)果說明，Enk-IFN-α1/86Asp的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性比其母體干擾素有明顯提高。
Enk-IFN-α1/86Asp的小鼠鎮(zhèn)痛作用采用小鼠在高溫銅板上腳爪舔吃潛伏期(Paw Licking Latency，PLL)來測定干擾素對小鼠的鎮(zhèn)痛作用，其潛伏期時間愈長，說明鎮(zhèn)痛作用愈強(qiáng)。
當(dāng)干擾素劑量分別為65，125和350IU時，Enk-IFN-α1/86Asp的PLL值分別為18.8±4.37，44.4±5.86，46.2±4.54秒;當(dāng)干擾素劑量分別為65，125，350和500IU時，母體干擾素的PLL值分別為19.7±2.4，22.0±2.57，27.7±5.43，43.3±8.18秒。
結(jié)果說明，HuIFN-α1/86Asp在小鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于其母體干擾素。
μ和/或δ受體阻斷劑對HuIFN-α1/86Asp和Enk-HuIFN-α1/86Asp鎮(zhèn)痛作用的影響。
IFN-α1/86Asp本身也有鎮(zhèn)痛作用，這一鎮(zhèn)痛作用可為μ和δ受體阻斷劑-鹽酸烯丙基嗎啡酮(Naloxone hydrochloride，C19H21NO4HCl)所抑制。當(dāng)IFN-α1/86Asp為500IU時，同時用生理鹽水，ic，于給藥后5，10和20分鐘后，測定其PLL值各為47.3±8.4，40.7±9.2，38.7±8.5秒;當(dāng)IFN-α1/86Asp為500IU時，同時用Naloxone，5mg/kg，ip，于給藥后5，10和20分鐘后，測定其PLL值各為25.1±6.0，19.1±4.78，14.5±2.41秒;而單純鹽水則為20.4±2.1，16.5±1.7，16.5±1.7秒。
當(dāng)Enk-IFN-α1/86Asp為125IU時，同時用生理鹽水，ic，于給藥后5，10和20分鐘后，測定其PLL值各為49.0±7.3，48.0±7.7，27.2±7.3秒;當(dāng)Enk-IFN-α1/86Asp為125IU時，同時用Naloxone，5mg/kg，ip，于給藥后5，10和20分鐘后，測定其PLL值各為22.9±4.6，31.3±6.5，18.7±2.5秒。
當(dāng)Enk-IFN-α1/86Asp為125IU時，同時用Naltrindole，2mg/kg，ip，于給藥后5，10和20分鐘后，測定其PLL值各為28.5±4.9，20.4±3.9，20.4±4.1;而單純鹽水則為20.4±2.1，16.5±1.7，16.5±1.7。
上述結(jié)果說明，Enk-IFN-α1/86Asp的鎮(zhèn)痛作用可被δ和μ受體阻斷劑所阻斷。
權(quán)利要求
1.用人工生物體系(大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞等)制備的人α1/114Ala型干擾素(HulFNα 1/114Ala)來治療慢性宮頸炎、皰疹性角膜炎、慢性活動性肝炎、丙型肝炎等。它具有療效高、副作用低的優(yōu)點。
2.用人工生物體系(大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞等)制備的人α1/158Val和/或α1/31Val型干擾素進(jìn)行抗病毒和/或抗腫瘤治療。
3.采用DNA重組技術(shù)人工構(gòu)建與人α1/114Ala和l/158Val型干擾素基因序列和/或氨基酸序列相似的干擾素進(jìn)行抗病毒和抗腫瘤治療。
4.采用DNA重組技術(shù)，人工構(gòu)建人α1/86Asp型干擾素(HuIFN-α1/86Asp)基因及用人工生物體系(大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞等)制備該融合蛋白用于治療腫瘤和/或病毒性疾病。這一突變體的生物學(xué)活性高于其母體分子人α1/114Ala型干擾素。
5.采用DNA重組技術(shù)，人工構(gòu)建腦啡肽-人干擾素基因及用人工生物體系(大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞等)制備該融合蛋白用于治療腫瘤和/或病毒性疾病。人干擾素基因包括人α型的各亞型及其突變體。腦啡肽包括甲硫氨酸腦啡肽(Try Gly Gly Phe Met)和亮氨酸腦啡肽(Try Gly Gly Phe Leu)。
6.采用DNA重組技術(shù)，人工構(gòu)建腦啡肽-人α1/86Asp型干擾素(Enk-HuIFN-α1/86Asp)基因及用人工生物體系(大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞等)制備該融合蛋白及用于治療腫瘤和/或病毒性疾病。腦啡肽包括甲硫氨酸腦啡肽(Try Gly Gly Phe Met)和亮氨酸腦啡肽(Try Gly Gly Phe Leu)。
7.采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建如下融合蛋白并用于臨床甲硫氨酸腦啡肽或亮氨酸腦啡肽通過Ser Gly Ser三肽作為連接肽或以Gly為核心的其他三肽與其他型干擾素或與干擾素功能類似的其他細(xì)胞素組成融合蛋白。
全文摘要
采用DNA重組技術(shù)研制成一類高效的抗病毒、抗腫瘤藥物人干擾素α1/114Ala與國外投放市場的人干擾素α2a和2b比較，治療乙型、丙型肝炎具有療效高、臨床副作用小的優(yōu)點；人干擾素α1/86ASp的生物學(xué)活性比其母體有明顯提高；甲硫氨酸腦啡肽人α型干擾素融合蛋白的鎮(zhèn)痛作用和抑瘤作用均比母體分子有明顯提高。
文檔編號C12N15/63GK1109908SQ9411549
公開日1995年10月11日 申請日期1994年9月6日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月6日
發(fā)明者侯云德, 王偉, 黎孟楓, 朱千政, 童葵塘, 郭德本, 錢止維, 吳淑華 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所