專利名稱：抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體細胞株建立及其單克隆抗體的制作方法
丙型肝炎是世界性傳染病，主要通過輸血和血液制品傳播。1988年由美國學者首次克隆并表達出了編碼丙型肝炎病毒HCV非結構區(qū)3～4(NS3～4)部分序列的蛋白質(C-100-3)并相繼建立了人工抗原為基礎的測定抗體的免疫學方法，對HCV傳播的控制起到了很重要的作用。但是，由于HCV病毒分離困難重重，病毒學研究尚未獲得突破性進展，由此目前均以抗HCV抗體作為HCV感染的唯一指征。但所用的抗原均為人工合成多肽或基因工程表達的抗原，與自然抗原無論在一級結構還是在空間構型上必然存在著一定的差別。由此加強HCV病毒的深入研究及建立高敏感的抗原抗體測定方法有著非常重要的意義。用抗HCV特異性的單克隆抗體可以構建高敏感特異的抗原抗體測定方法、用于HCV病毒抗原的分離、鑒定以及病毒及病毒感染的基礎研究。與HCV特異性的鼠單克隆抗體國內外尚未見諸報道。
本發(fā)明的目的是制備抗HCV特異性的鼠單克隆抗體，我們用HCV基因編碼的不同抗原成功地制備出了抗HCV的核心區(qū)、膜區(qū)、NS3、NS4及NS5區(qū)抗原的特異性單克隆抗體，從而為HCV的基礎研究及應用打下了基礎。
一、單克隆抗體細胞株的建立
(一)、抗HCV核心區(qū)單克隆抗體細胞株的建立1、免疫原的制備合成核心區(qū)多肽[購自美國UBI生物技術有限公司的人工合成多肽(20肽)]2mg、BSA4mg/ml PH7.2，0.1M乙酸銨緩沖液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室溫攪拌2小時，在0.02M PH7.2 PBS4℃透析48小時(12小時)換液一次，分裝，-20℃?zhèn)溆谩?br> 2、免疫動物按多肽20μg/只 BALB/c小鼠(4-6周齡)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐劑(FCA)乳化后，四腳掌及皮下多點注射。4周后同劑量抗原加弗氏不完全佐劑乳化后腹腔加強，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效價測定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸緩沖液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小時4℃過夜。次日，10%牛血清1%脫脂奶粉0.02MPH7.2PBS 0.15ml/孔，37℃，2小時，4℃過夜，用于鼠血清效價測定。
鼠血清用10%牛血清PBS(同上)以102～106倍稀釋，加入96孔板，0.1ml/孔37℃，2小時，水洗六次后加入2，000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的兔抗鼠(Sigma)，37℃2小時同上洗后，加50ul含有0.1%(W/V)鄰苯二胺0.1%(V/V)雙氧水PH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，0.1ml/孔，室溫避光20分鐘，測492吸收值，免前鼠血清作陰性對照，以測定值與對照值的比≥2.1為陽性來判斷免疫鼠血清的效價。
4、細胞融合建株末次加強后，無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與小鼠骨髓瘤細胞按10∶1混合，用分子量6，000的PEG作為融合劑，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，使雜交瘤細胞能生長，待細胞長至105/ml濃度時，同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體的情況;分泌抗體陽性細胞孔以1個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，用10%DMSO的培養(yǎng)液配制106/ml細胞，細胞融合一次共建6株穩(wěn)定分泌抗體細胞株。分別命名JDSHCC39(CCTCC NOC94005)，JDSHCC58，JDSHCC81，JDSHCC105，JDSHCC123，JDSHCC221細胞系。
(二)、抗HCV膜區(qū)單克隆抗體細胞株的建立1、免疫原的制備將合成多肽(購自美國UBI生物技術有限公司的人工合成多肽)2mg、BSA4mg/ml，PH7.20.1M乙酸銨緩沖液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室溫攪拌2小時，在0.02M PH7.2，PBS 4℃透析48小時(12小時)換液一次，分裝，-20℃?zhèn)溆谩?br> 2、免疫動物按多肽20μg/只 BALB/c小鼠(4-6周齡)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐劑(FCA)乳化后，四腳掌及皮下多點注射。4周后同劑量抗原加福氏不完全佐劑乳化后腹腔加強，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效價測定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸緩沖液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小時4℃過夜，次日，10%牛血清1%脫脂奶粉0.02MPH7.2PBS0.15ml/孔，37℃，2小時，4℃過夜，用于鼠血清效價測定。
鼠血清用10%牛血清PBS(同上)以102～106倍稀釋，加入96孔板，0.1ml/孔37℃，2小時，水洗六次后加入2，000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的兔抗鼠(Sigma)，37℃2小時同上洗后，每孔加100ul底物液(0.1%(W/V)鄰苯二胺0.1%(V/V)雙氧水)PH5.0檸檬酸磷酸緩沖液)，室溫避光20分鐘，測492nm吸收值，免前鼠血清作陰性對照，以測定值與對照值的比≥2.1為陽性來判斷免疫鼠血清的效價。
4、細胞融合建株末次加強后，無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與小鼠骨髓瘤細胞按10∶1混合，用分子量6，000的PEG作為融合劑，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，使雜交瘤細胞能生長，待細胞長至105/ml濃度時，同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體的情況;分泌抗體陽性細胞孔以1個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，10%DMSO的培養(yǎng)液配制細胞至106/ml液氮凍存。細胞融合一次共建4株穩(wěn)定分泌抗體細胞株。分別命名為JDSHCE-44，JDSHCE-56，JDSHCE-125(CCTCC NOC94009)，JDSHCE-246細胞系。
(三)、抗HCVNS3區(qū)單克隆抗體細胞株建立1.免疫動物按抗原[購自日本東燃公司基因工程抗原(MW20KD)]20μg/只BALB/c小鼠(4-6周齡)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐劑(FCA)乳化后，四腳掌及皮下多點注射。4周后同劑量抗原加弗氏不完全佐劑乳化后腹腔加強，一周后小鼠眼球放血。
2、免疫效價測定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸緩沖液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小時4℃過夜，次日，10%牛血清1%脫脂奶粉0.02M PH7.2PBS 0.15ml/孔，37℃，2小時，4℃過夜，用于鼠血清效價測定。
鼠血清用10%牛血清PBS(同上)以102～106倍稀釋，加入96孔板，0.1ml/孔37℃，2小時，水洗六次后加入2，000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的兔抗鼠(Sigma)，37℃2小時同上洗后，加50μl含有0.1%(W/V)鄰苯二胺0.1%(V/V)雙氧水PH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，0.1ml/孔，室溫避光20分鐘，OD492測定吸收值，免前鼠血清作陰性對照，以測定值與對照值的比≥2.1為陽性來判斷免疫鼠血清的效價。
3、細胞融合建株末次加強后的小鼠無菌取脾臟，制成脾細胞懸液與小鼠骨髓瘤細胞按10∶1混合，用分子量6，000的PEG作為融合劑，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，使雜交瘤細胞能生長，待細胞長至105/ml濃度時，同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體的情況;分泌抗體陽性細胞孔以1個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，10%DMSO的培養(yǎng)液配制細胞至106/ml液氮凍存。細胞融合一次共建5株穩(wěn)定分泌抗體細胞株。分別命名JDSHCNS3-1(CCTCC NOC94006)，JDSHCNS3-3，JDSHCNS3-6，JDSHCNS3-8，JDSHCNS3-9。
(四)、抗HCVNS4區(qū)單克隆抗體細胞株建立1、免疫原的制備合成多肽[購自加拿大Yes公司的人工合成多肽(25肽)]2mg、BSA4mg/ml PH7.20.1M乙酸銨緩沖液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室溫攪拌2小時，0.02M PH7.2 PBS4℃透析48小時(12小時)換液一次，分裝，-20℃?zhèn)溆谩?br> 2、免疫動物按多肽20ug/只 BALB/c小鼠(4-6周齡)，0.25ml加0.25ml福氏完全佐劑(FCA)乳化后，四腳掌及皮下多點注射。4周后同劑量抗原加福氏不完全佐劑乳化后腹腔加強，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效價測定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸緩沖液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小時4℃過夜，次日，10%牛血清1%脫脂奶粉0.02MPH7.2PBS0.15ml/孔，37℃，2小時，4℃過夜，用于鼠血清效價測定。
鼠血清用10%牛血清PBS(同上)以102～106倍稀釋，加入96孔板，0.1ml/孔37℃，2小時，水洗六次后加入2，000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的兔抗鼠(Sigma)，37℃2小時同上洗后，加50μl含有0.1%(W/V)鄰苯二胺0.1%(V/V)雙氧水PH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，0.1ml/孔，室溫避光20分鐘，OD492測定吸收值，免前鼠血清作陰性對照，以測定值與對照值的比≥2.1為陽性來判斷免疫鼠血清的效價。
4、細胞融合建株
末次加強后，無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與小鼠骨髓瘤細胞按10∶1混合，用分子量6，000的PEG作為融合劑，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，使雜交瘤細胞能生長，待細胞長至105/ml濃度時，同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體的情況;分泌抗體陽性細胞孔以1個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，10%DMSO的培養(yǎng)液配制細胞至106/ml液氮凍存。細胞融合一次共建3株穩(wěn)定分泌抗體細胞株。分別命名為JDSHCNS4-93(CCTCC NOC94007)，JDSHCNS4-40，JDSHCNS4-13。
(五)抗HCVNS5區(qū)單克隆抗體細胞株建立1、免疫原的制備合成多肽[購自美國UBI生物技術有限公司的人工合成多肽(20肽)]2mg、BSA4mg/ml PH7.20.1M乙酸銨緩沖液，滴加0.02M戊二醛0.5ml，室溫攪拌2小時，0.02M PH7.2 PBS4℃透析48小時(12小時)換液一次，分裝，-20℃?zhèn)溆谩?br> 2、免疫動物按多肽20ng/只BALB/c小鼠(4-6周齡)，0.25ml加0.25ml弗氏完全佐劑(FCA)乳化后，四腳掌及皮下多點注射。4周后同劑量抗原加弗氏不完全佐劑乳化后腹腔加強，一周后小鼠眼球放血。
3、免疫效價測定配制5μg/ml多肽的0.01M PH9.6碳酸緩沖液96孔聚苯乙烯板，0.1ml/孔37℃2小時4℃過夜，次日，10%牛血清1%脫脂奶粉0.02M PH7.2PBS0.15ml/孔，37℃，2小時，4℃過夜，用于鼠血清效價測定。
鼠血清用10%牛血清PBS(同上)以102～106倍稀釋，加入96孔板，0.1ml/孔37℃，2小時，水洗六次后加入2，000倍稀釋的辣根過氧化酶標記的兔抗鼠(Sigma)，37℃2小時同上洗后，加50μl含有0.1%(W/V)鄰苯二胺0.1%(V/V)雙氧水PH5.0檸檬酸磷酸緩沖液，0.1ml/孔，室溫避光20分鐘，測492nm吸收值，免前鼠血清作陰性對照，以測定值與對照值的比≥2.1為陽性來判斷免疫鼠血清的效價。
4、細胞融合建株末次加強后，無菌取小鼠脾臟，制成脾細胞懸液與小鼠骨髓瘤細胞按10∶1混合，用分子量6，000的PEG作為融合劑，在37℃下加入0.7ml，使其融合，用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，使雜交瘤細胞能生長，待細胞長至105/ml濃度時，同上免疫效價測定法篩選檢測細胞分泌抗體的情況;分泌抗體陽性細胞孔以1個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆，篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆三次，擴大培養(yǎng)后，10%DMSO的培養(yǎng)液配制細胞至106/ml液氮凍存。細胞融合一次共建2株穩(wěn)定分泌抗體細胞株。分別命名為JDSHCNS5-1(CCTCC NOC94008)，JDSHCNS5-2。
二、單克隆抗體的制備及HRP標記(一)抗HCV核心區(qū)單克隆抗體1、單克隆抗體的制備及純化收集培養(yǎng)細胞計數配成5×106/ml的濃度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同時注射液體石蠟0.5ml/只，7～10天后采集腹水3，000轉離心30分鐘，取上清為單抗腹水;以1倍體積的腹水加2倍體積的PH4.0 0.06M乙酸緩沖液，按3.3%(V/V)滴加正辛酸，室溫攪拌20分鐘，10，000轉離心20分鐘，上清過濾后中性PBS 4℃透析過夜;次日按25.8%的濃度加入所需的固體硫酸銨4℃≥2小時，3，000轉離心20分鐘，沉淀用1倍體積的中心PBS溶解加1/2體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用1/2體積的中性PBS溶解，同液體4℃透析48小時(12小時換液一次)。Lowry法測蛋白的濃度后分裝-20℃保存。
2、HRP-單克隆抗體結合物制備4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M過碘酸鈉氧化20分鐘，中性PBS4℃透析過夜，次日加25ul 0.2M碳酸鈉后加預先用PH9.60.01M碳酸緩沖液平衡的10mg單抗，室溫避光攪拌2小時，加0.1ml4mg/ml的硼氫化鈉，4℃2小時，中性PBS 4℃透析過夜，次日加等體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用50%硫酸銨洗兩次后，1ml中性PBS溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br> (二)抗HCV膜區(qū)單克隆抗體1、單克隆抗體制備及純化收集培養(yǎng)細胞計數配成5×106/ml的濃度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同時注射液體石蠟0.5ml/只，7～10天后采集腹水3，000轉離心30分鐘，取上清為單抗腹水;以1倍體積的腹水加2倍體積的PH4.0 0.06M乙酸緩沖液，按3.3%(V/V)滴加正辛酸，室溫攪拌20分鐘，10，000轉離心20分鐘，上清過濾后中性PBS 4℃透析過夜;次日按25.8%的濃度加入所需的固體硫酸銨4℃≥2小時，3，000轉離心20分鐘，沉淀用1倍體積的中性PBS溶解加1/2體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用1/2體積的中心PBS溶解，同液體4℃透析48小時(12小時換液一次)。Lowry法測蛋白的濃度后分裝-20℃保存。
2、HRP-單克隆抗體結合物制備4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M過碘酸鈉氧化20分鐘，中性PBS4℃透析過夜，次日加25ul 0.2M碳酸鈉后加預先用PH9.60.01M碳酸緩沖液平衡的10mg單抗，室溫避光攪拌2小時，加0.1ml 4mg/ml的硼氫化鈉，4℃2小時，中性PBS 4℃透析過夜，次日加等體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用50%硫酸銨洗兩次后，1ml中性PBS溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br> (三)抗HCVNS3區(qū)單克隆抗體1、單克隆抗體的制備及純化收集培養(yǎng)細胞計數配成5×106/ml的濃度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同時注射液體石蠟0.5ml/只，7～10天后采集腹水3，000轉離心30分鐘，取上清為單抗腹水;以1倍體積的腹水加2倍體積的PH4.0 0.06M乙酸緩沖液，按3.3%(V/V)滴加正辛酸，室溫攪拌20分鐘，10，000轉離心20分鐘，上清過濾后中性PBS 4℃透析過夜;次日按25.8%的濃度加入所需的固體硫酸銨4℃≥2小時，3，000轉離心20分鐘，沉淀用1倍體積的中心PBS溶解加1/2體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用1/2體積的中性PBS溶解，同液體4℃透析48小時(12小時換液一次)。Lowry法測蛋白的濃度后分裝-20℃保存。
2、HRP-單克隆抗體結合物制備4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M過碘酸鈉氧化20分鐘，中性PBS4℃透析過夜，次日加25ul 0.2M碳酸鈉后加預先用PH9.60.01M碳酸緩沖液平衡的10mg單抗，室溫避光攪拌2小時，加0.1ml4mg/ml的硼氫化鈉，4℃2小時，中性PBS 4℃透析過夜，次日加等體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用50%硫酸銨洗兩次后，1ml中性PBS溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br> (四)抗HCVNS4區(qū)單克隆抗體1、單克隆抗體制備及純化收集培養(yǎng)細胞計數配成5×106/ml的濃度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同時注射液體石蠟0.5ml/只，7～10天后采集腹水3，000轉離心30分鐘，取上清為單抗腹水;以1倍體積的腹水加2倍體積的PH4.0 0.06M乙酸緩沖液，按3.3%(V/V)滴加正辛酸，室溫攪拌20分鐘，10，000轉離心20分鐘，上清過濾后中性PBS 4℃透析過夜;次日按25.8%的濃度加入所需的固體硫酸銨4℃≥2小時，3，000轉離心20分鐘，沉淀用1倍體積的中性PBS溶解加1/2體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用1/2體積的中性PBS溶解，同液體4℃透析48小時(12小時換液一次)。Lowry法測蛋白的濃度后分裝-20℃保存。
2、HRP-單克隆抗體結合物制備4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M過碘酸鈉氧化20分鐘，中性PBS4℃透析過夜，次日加25ul 0.2M碳酸鈉后加預先用PH9.60.01M碳酸緩沖液平衡的10mg單抗，室溫避光攪拌2小時，加0.1ml4mg/ml的硼氫化鈉，4℃2小時，中性PBS 4℃透析過夜，次日加等體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用50%硫酸銨洗兩次后，1ml中性PBS溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br> (五)抗HCVNS5區(qū)單克隆抗體1、單克隆抗體制備及純化收集培養(yǎng)細胞計數配成5×106/ml的濃度腹腔注射，每只0.5ml BALB/c小鼠同時注射液體石蠟0.5ml/只，7～10天后采集腹水3，000轉離心30分鐘，取上清為單抗腹水;以1倍體積的腹水加2倍體積的PH4.0 0.06M乙酸緩沖液，按3.3%(V/V)滴加正辛酸，室溫攪拌20分鐘，10，000轉離心20分鐘，上清過濾后中性PBS 4℃透析過夜;次日按25.8%的濃度加入所需的固體硫酸銨4℃≥2小時，3，000轉離心20分鐘，沉淀用1倍體積的中心PBS溶解加1/2體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用1/2體積的中性PBS溶解，同液體4℃透析48小時(12小時換液一次)。Lowry法測蛋白的濃度后分裝-20℃保存。
2、HRP-單克隆抗體結合物制備4mg HRP溶解在1ml水中，加0.1ml 0.1M過碘酸鈉氧化20分鐘，中性PBS4℃透析過夜，次日加25ul 0.2M碳酸鈉后加預先用PH9.6 0.01M碳酸緩沖液平衡的10mg單抗，室溫避光攪拌2小時，加0.1ml 4mg/ml的硼氫化鈉，4℃2小時，中性PBS 4℃透析過夜，次日加等體積的飽和硫酸銨，4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，沉淀用50%硫酸銨洗兩次后，1ml中性PBS溶解，-20℃?zhèn)溆谩?br> 三、單克隆抗體的免疫學性狀分析(一)抗HCV核心區(qū)單克隆抗體1、特異性測定用不同區(qū)域的抗原同上免疫效價測定法測定。結果發(fā)現，與核心區(qū)抗原反應外，與HCV其它區(qū)域抗原及對照抗原無特異性反應。
2、單克隆抗體識別位點測定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小時后，加單抗腹水50μl及HRP標記的單抗50μl，37℃1小時后，加底物液，測492nm吸收值，以單抗腹水對同一HRP標記的單抗抑制為100%，以已知無關單抗腹水對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率，及抑制率為(1-測定值OD/陰性對照OD)×100;抑制率≥75%為相關，≥50%為不完全相關，≤50%為不相關，≤25%為完全不相關。表2結果提示，6株單抗識別三個不完全相關抗原相關區(qū)域。
3、單抗類及亞類測定30ml細胞培養(yǎng)上清按25.8%加入固體硫酸銨4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1%的瓊脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫雙擴散，24小時后觀察沉淀線。結果單抗均為IgG1。
4、單抗識別自然抗原位點的分析同上固相抗原，50ulHCV核心區(qū)抗體陽性病人血清，50ulHRP標記的單抗，37℃2小時。同上加顯色液測492nm吸收值，陽性血清抑制率計算同上位點分析;≥50%的抑制為陽性。結果16份HCV核心區(qū)抗體陽性血清對三組抗體均顯示了不同程度的陽性抑制率，由此顯示自然感染后的抗體可抑制單抗與人工抗原的反應，因此提示此三株單抗所識別的位點也存在于自然抗原上(見表3)。
(二)抗HCV膜區(qū)單抗1、特異性測定用不同區(qū)域的抗原同上免疫效價測定法測定。結果顯示抗體與膜區(qū)抗原反應外，與HCV其它區(qū)域抗原及對照抗原無特異性反應(見表1)。
2、單抗識別位點測定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小時后，加單抗腹水50μl及HRP標記的單抗50μl，37℃1小時后，加底物液，測492nm吸收值，以單抗腹水對同一HRP標記的單抗抑制為100%，以已知無關單抗腹水對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率，及抑制率為(1-測定值OD/陰性對照OD)×100;抑制率≥75%為相關，≥50%為不完全相關，≤50%為不相關，≤25%為完全不相關，結果4株單抗識別二個不完全相關抗原相關位區(qū)。
3、單抗類及亞類測定30ml細胞培養(yǎng)上清按25.8%加入固體硫酸銨4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1%的瓊脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫雙擴散，24小時后觀察沉淀線。結果所有抗體均為鼠IgG1。
(三)抗HCVNS3區(qū)單抗1、特異性測定用不同區(qū)域的抗原同上免疫效價測定法測定。結果與NS3區(qū)抗原反應外，與HCV其它區(qū)域抗原及對照抗原無特異性反應(見表1)。
2、單抗識別位點測定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小時后，加單抗腹水50μl及HRP標記的單抗50μl，37℃1小時后，加底物液，測492nm吸收值，以單抗腹水對同一HRP標記的單抗抑制為100%，以已知無關單抗腹水對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率，即抑制率為(1-測定值OD/陰性對照OD)×100;抑制率≥75%為相關;≥50%為不完全相關，≤50%為不相關，≤25%為完全不相關。結果5株單抗識別兩個不完全相關抗原位區(qū)。
3、單抗類及亞類測定30ml細胞培養(yǎng)上清按25.8%加入固體硫酸銨4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1%的瓊脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫雙擴散，24小時后觀察沉淀線。結果所有單抗均為鼠IgG1。
4、單抗識別自然抗原位點的分析同上固相抗原，50ulHCVNS3區(qū)抗體陽性病人血清，50ulHRP標記的單抗，37℃2小時。同上加顯色液測492nm吸收值，陽性血清抑制率計算同上位點分析;≥50%的抑制為陽性。結果19份HCVNS3區(qū)抗體陽性血清對兩組抗體均顯示了不同程度的陽性抑制率，由此顯示自然感染后的抗體可抑制單抗與人工抗原的反應，因此提示此兩組單抗所識別的位點也存在于自然抗原上。
(四)抗HCVNS4區(qū)單抗1、特異性測定用不同區(qū)域的抗原同上免疫效價測定法測定。結果顯示與NS4區(qū)抗原反應外，與HCV其它區(qū)域抗原及對照抗原無特異性反應(見表1)。
2、單抗識別位點測定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小時后，加單抗腹水50μl及HRP標記的單抗50μl，37℃1小時后，加底物液，測492nm吸收值，以單抗腹水對同一HRP標記的單抗抑制為100%，以已知無關單抗腹水對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率，即抑制率為(1-測定值OD/陰性對照OD)×100;抑制率≥75%為相關;≥50%為不完全相關，≤50%為不相關，≤25%為完全不相關。結果4株單抗識別兩個不完全相關抗原位區(qū)。
3、單抗類及亞類測定30ml細胞培養(yǎng)上清按25.8%加入固體硫酸銨4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1%的瓊脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫雙擴散，24小時后觀察沉淀線。結果所有單抗均為鼠IgG1。
4、單抗識別自然抗原位點的分析同上固相抗原，50ulHCVNS4區(qū)抗體陽性病人血清，50ulHRP標記的單抗，37℃2小時。同上加顯色液測492nm吸收值，陽性血清抑制率計算同上位點分析;≥50%的抑制為陽性。結果顯示份HCVNS4區(qū)抗體陽性血清對兩組抗體均顯示了不同程度的陽性抑制率，由此顯示自然感染后的抗體可抑制單抗與人工抗原的反應，因此提示此兩組單抗所識別的位點也存在于自然抗原上。
(五)抗HCVNS5區(qū)單抗1、特異性測定用不同區(qū)域的抗原同上免疫效價測定法測定。結果與NS5區(qū)抗原反應外，與HCV其它區(qū)域抗原及對照抗原無特異性反應(見表1)。
2、單抗識別位點測定5μg/ml抗原0.1ml/孔加入96孔板，37℃固相2小時后，加單抗腹水50μl及HRP標記的單抗50μl，37℃1小時后，加底物液，測492nm吸收值，以單抗腹水對同一HRP標記的單抗抑制為100%，以已知無關單抗腹水對標記單抗的抑制為陰性對照，計算各單抗間的抑制率，即抑制率為(1-測定值OD/陰性對照OD)×100;抑制率≥75%為相關;≥50%為不完全相關，≤50%為不相關，≤25%為完全不相關。結果3株單抗識別兩個不完全相關抗原位區(qū)。
3、單抗類及亞類測定30ml細胞培養(yǎng)上清按25.8%加入固體硫酸銨4℃2小時，3，000轉離心30分鐘，溶液用0.1ml中性PBS溶解。1%的瓊脂糖，PBS用兔抗鼠分型血清(Sigma)作免疫雙擴散，24小時后觀察沉淀線。結果顯示3株單抗均為鼠IgG1。
4、單抗識別自然抗原位點的分析同上固相抗原，50ulHCVNS5區(qū)抗體陽性病人血清，50ulHRP標記的單抗，37℃2小時。同上加顯色液測492nm吸收值，陽性血清抑制率計算同上位點分析;≥50%的抑制為陽性。結果顯示份HCVNS5區(qū)抗體陽性血清對兩組抗體均顯示了不同程度的陽性抑制率，由此顯示自然感染后的抗體可抑制單抗與人工抗原的反應，因此提示此兩組單抗所識別的位點也存在于自然抗原上。
四、單抗的應用研究(一)抗HCV核心區(qū)單抗1、抗原測定40ug/ml單抗0.01M PH9.6 CB 0.1ml/孔，加入血清，0.1ml/孔，37℃2小時后再加HRP標記的單抗，加顯色液測492nm吸收值，以工作液作陰性對照，測定值/對照值≥2.1判為陽性。結果顯示用第一組單抗測定96份高危人血清，5份顯示了陽性結果，由此提示病人血清中存在有可測得出的抗原，同時也提示此單抗有很大的應用價值(見表6)。
2、抗體測定5ug/ml抗原0.01MPH9.6CB0.1ml/孔加50ul待檢人血清，50ulHRP標記單抗同上測492nm吸收值，計算抑制率，≥50%為陽性。結果酶標記單抗顯示僅96份HCV抗體陽性血清有50%的血清抑制單抗與抗原的反應≥50%，這些血清經間接ELISA證實均含有抗HCV核心區(qū)單抗，由此提示單抗在抗HCV抗體檢測中特異性高，操作簡便，有一定的應用價值(見表3)。
應用研究結果提示我們用HCV不同區(qū)段的人工抗原制備出了識別HCV天然抗原的特異性單抗，我們所獲得的單抗不僅在HCV基礎研究，而且在HCV抗原抗體檢測試劑中均有很高的應用價值。
1，應用某一區(qū)段的單抗可準確地分析病人血清中的此類抗體的消長情況，以了解病情的發(fā)展愈后及治療效果的考察。
2，各不同區(qū)域單抗混合，構建抗原抗體篩選檢測試劑盒，其操作簡便，快速;且特異性也有很大的提高。
3，用單抗直接或間接測定或定位HCV感染后的病毒抗原。
4，單抗交聯(lián)Sepharose-4B后親和層析純化分離體液或組織中的HCV抗原成份，分析研究天然抗原，取代人工抗原，促進HCV的基礎研究，提高現有檢測試劑盒的特異性。
5，用單抗分析不同國家、不同地區(qū)以致不同感染者HCV感染后的抗原，確定HCV的型別以提高HCV治療的效果。
6，用同一區(qū)域識別不同位點的單抗分析感染者，識別某一位點的抗體消長情況，以了解HCV與感染者之間關系及感染者的免疫應答情況。
7，用特異性HCV單抗制備抗獨特型抗體，用作疫苗的制備及取代現有的人工抗原。
8，用單抗檢測群體感染者中HCV不同抗原成份的變化，以了解HCV變異情況。
9，具有中和作用的單抗可用作HCV感染者的治療，及高危人群的預防治療。
10，單抗固相在合適的載體上濃縮分離HCV病毒顆粒，以提高HCV病毒分離培養(yǎng)的可能性。
11，用已知單抗探討相應的HCV基因區(qū)編碼的蛋白質的功能。
表1抗HCV單克隆抗體組份特異性測定單抗 抗原:核心區(qū) 膜區(qū) NS3 NS4 NS5JDSHCC39 + - - - -JDSHCC58 + - - - -JDSHCC81 + - - - -JDSHCC105 + - - - -JDSHCC123 + - - - -JDSHCC221 + - - - -JDSHCE-44 - + - - -JDSHCE-56 - + - - -JDSHCE-125 - + - - -JDSHCE-246 - + - - -JDSHCNS3-1 - - + - -JDSHCNS3-3 - - + - -JDSHCNS3-6 - - + - -JDSHCNS3-8 - - + - -JDSHCNS3-9 - - + - -JDSHCNS4-93 - - - + -JDSHCNS4-40 - - - + -JDSHCNS4-13 - - - + -JDSHCNS5-1 - - - - +JDSHCNS5-2 - - - - +
表2:單抗對不同來源的核心區(qū)抗原反應性測定單抗 抗原: N.J C11 J.Core CP10 CP9JDSHCC39 + + + - -JDSHCC58 + + + - -JDSHCC81 + + + - -JDSHCC105 + + + - -JDSHCC123 + + + + +JDSHCC221 + + + + +N.J、C11、J.Core為基因工程抗原CP10、CP9日本合成多肽抗原表3競爭抑制法測定抗體結果抑制率(%) 陽性血清(份) 陰性血清(份)0-9 4 3410-19 7 1320-29 9 2430-39 6 1540-49 20 1050-59 28 0≥60 22 0計: 60/96 0/96
表4:膜區(qū)單抗對不同肽段抗原反應的測定單抗 抗原:肽A 肽BJDSHCE-44 + -JDSHCE-246 + -JDSHCE-56 - +JDSHCE-125 - +表5:抗NS3區(qū)單抗識別位點測定酶標單抗(抑制率%)單抗腹水 NS3-1 NS3-3 NS3-6 NS3-8 NS3-9NS3-1 90.5 87.3 94.2 0 68.8NS3-3 85.0 96.5 92.7 0 59.6NS3-6 91.7 95.1 89.7 0 66.2NS3-8 86.0 95.8 83.6 95.6 91.9NS3-9 91.2 94.0 97.6 0 86.3
表6:HCV抗原測定結果P/N比值 樣品(份)≤1.0 351.1-2.0 56≥2.1 5計: 5/9權利要求
1.一種雜交瘤細胞株，其特征在于該細胞株JDSHCC39(CCTCC NO.C94005)能分泌抗HCV核心區(qū)的單克隆抗體。
2.一種雜交瘤細胞株，其特征在于該細胞株JDSHCNS3-1(CCTCC NO.C94006)能分泌抗HCV膜區(qū)的單克隆抗體。
3.一種雜交瘤細胞株，其特征在于該細胞株JDSHCNS4-93(CCTCC NO.C94007)能分泌抗HCV NS3區(qū)的單克隆抗體。
4.一種雜交瘤細胞株，其特征在于該細胞株JDSHCNS5-1(CCTCC NO.C94008)能分泌抗HCV NS4區(qū)的單克隆抗體。
5.一種雜交瘤細胞株，其特征在于該細胞株JDSHCE125(CCTCC NO.C94009)能分泌抗HCV NS5區(qū)的單克隆抗體。
6.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該抗體特異性地抗HCV核心區(qū)。
7.由權利要求2所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該抗體特異性地抗HCV膜區(qū)。
8.由權利要求3所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該抗體特異性地抗HCVNS3區(qū)。
9.由權利要求4所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該抗體特異性地抗HCVNS4區(qū)。
10.由權利要求5所述的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該抗體特異性地抗HCVNS5區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明建立了能分泌分別與非甲非乙型肝炎病毒的核心區(qū)、膜區(qū)、NS3、NS4及NS5區(qū)抗原具特異性的單克隆抗體的5個雜交瘤細胞株，并且得到了由這些雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。用這些抗HCV的特異性單克隆抗體可以構建高敏感特異的抗原抗體測定方法，并且可以分離、鑒定HCV病毒抗原。
文檔編號C12P21/08GK1105703SQ9411501
公開日1995年7月26日 申請日期1994年8月25日 優(yōu)先權日1994年8月25日
發(fā)明者李德富, 尹紅章, 李秀華, 孟淑芳, 劉熒, 張寧 申請人:中國藥品生物制品檢定所