專利名稱:借助游離基檢測(cè)活生物體或潛在攻擊劑之抗氧化性的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及利用游離基檢驗(yàn)或測(cè)定活生物體或潛在攻擊劑之抗氧化性的新穎方法。
具體的說(shuō),本發(fā)明一方面涉及評(píng)估活生物體細(xì)胞的抗氧化狀態(tài)的方法,另一方面涉及評(píng)估潛在攻擊性化學(xué)劑或物理因子(亦即能夠增加或加速或抑制或延遲被游離基誘導(dǎo)之細(xì)胞溶解作用的化學(xué)劑或物理因子)之氧化活性或抗氧化活性的方法。
已知游離基通常對(duì)生物體,特別是對(duì)該生物體的細(xì)胞具有不良影響。游離基以一定的速率攻擊細(xì)胞壁,該速率系取決于細(xì)胞的酶及分子機(jī)制所提供的細(xì)胞抗性。當(dāng)細(xì)胞壁受到游離基降解,穿孔或打開(kāi)時(shí),細(xì)胞內(nèi)容物即散布于細(xì)胞壁外。具體參見(jiàn)下列文獻(xiàn)化學(xué)文摘107213235V,化學(xué)文摘107,232454g,化學(xué)文摘10099345j,生物學(xué)文摘72(n°9),5914頁(yè);摘要n°57169(1981)及生物學(xué)文摘73(n°12),8817頁(yè)摘要n°84420(1982)。
文摘CA107,213235V,(參見(jiàn)M.MIKI等人,Arch.Biochem.Biophys.,258(n°2),373-380頁(yè)(1987)),指出2-生育酚可使大鼠紅血球免于遭受游離基導(dǎo)致的溶解作用。
根據(jù)上述文摘CA100,99345j(參見(jiàn)E.B.SPEKTOR等人,Lab.Delo(n°1),26-28頁(yè)(1984)一文),樣品(血漿或脊髓液)的總抗氧化活性系利用紫外燈誘導(dǎo)細(xì)胞材料(本特例為紅血球細(xì)胞膜)之自由基后,經(jīng)檢測(cè)532nm吸光率而確定的。根據(jù)本發(fā)明,推薦一種新穎技術(shù)解決方案,借此(ⅰ)游離基不會(huì)于所說(shuō)的細(xì)胞材料內(nèi)產(chǎn)生,而是來(lái)源于加入細(xì)胞材料內(nèi)的游離基引發(fā)劑,及(ⅱ)細(xì)胞材料已首先污染了潛在攻擊劑。
根據(jù)本發(fā)明,推薦一種檢定或估測(cè)活生物體或潛在攻擊劑之抗氧化活性的新穎方法,該方法包括使用游離基作為誘導(dǎo)細(xì)胞溶解的工具材料,該方法的特征在于(1)使游離基產(chǎn)生劑于適當(dāng)液體生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)與選自下列之任一種細(xì)胞材料(Ⅰ)接觸(a)人類(lèi),動(dòng)物及植物細(xì)胞,(b)所說(shuō)之細(xì)胞的碎片,及(c)含有脂質(zhì)體的合成壁及其碎片,所說(shuō)的細(xì)胞材料已首先沾染了潛在攻擊劑(Ⅱ);
(2)誘使游離基從游離基產(chǎn)生劑中釋放出來(lái);及(3)被游離基所溶解之細(xì)胞材料借助與含有未受污染之細(xì)胞材料之對(duì)照組的比較來(lái)估測(cè)游離基對(duì)細(xì)胞材料的溶解作用。
本方法中,檢定了細(xì)胞材料Ⅰ的氧化狀態(tài)或潛在攻擊劑Ⅱ?qū)?xì)胞材料Ⅰ的影響。
具體地說(shuō),可按照“動(dòng)力學(xué)”〔以固定時(shí)間間隔檢測(cè)游離基產(chǎn)生劑、細(xì)胞材料及適當(dāng)待測(cè)試劑Ⅱ之液體試驗(yàn)介質(zhì)的樣品(體積恒定)〕或以“非動(dòng)力學(xué)”〔對(duì)含有細(xì)胞材料、必要時(shí)加有待測(cè)試劑Ⅱ,以及漸增等分游離基產(chǎn)生劑之液體試驗(yàn)介質(zhì)的樣品進(jìn)行劑量-反應(yīng)型檢測(cè)〕方式估價(jià)細(xì)胞材料的溶解。
在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)評(píng)估的情況下,細(xì)胞材料Ⅰ對(duì)游離基的抗性是以對(duì)應(yīng)于50%細(xì)胞材料溶解的時(shí)間來(lái)表示的。
在進(jìn)行劑量-反應(yīng)評(píng)估的情況下,細(xì)胞材料Ⅰ對(duì)游離基的抗性是以可誘使50%細(xì)胞材料溶解之游離基產(chǎn)生劑的濃度來(lái)表示的。
可釋放游離基及常用于產(chǎn)生大分子之聚合反應(yīng)的產(chǎn)物均特別適于作為本發(fā)明的游離基產(chǎn)生劑。此類(lèi)產(chǎn)物中,特別值得提到的是氧化性游離基產(chǎn)生劑如過(guò)氧化苯甲酰,C1-C8且較好為C3-C4烷基過(guò)苯甲酸酯(特別是正丁基,叔丁基,異丙基及正丙基過(guò)苯甲酸酯),其中烷基為含有1至8個(gè)碳原子且較好為3至4個(gè)碳原子的二烷基過(guò)氧基二碳酸酯(特別是二異丙基過(guò)氧基二碳酸酯),羥基過(guò)氧化枯烯,偶氮-雙(異丁腈),2,2'-偶氮-雙(2,4-二甲基戊腈),2,2'-偶氮-雙(2-脒基丙烷),和它們的加成鹽如鹽酸鹽,及其類(lèi)似物。
優(yōu)選的氧化性游離基產(chǎn)生劑為具有零級(jí)動(dòng)力學(xué)或反應(yīng)速率者(游離基的釋放相對(duì)于時(shí)間為恒定的),或較好有1級(jí)動(dòng)力學(xué)或反應(yīng)速率者(游離基的釋放相對(duì)于時(shí)間為線性的)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選氧化性游離基產(chǎn)生劑可以是2,2'-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽,其可于含水介質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)1級(jí)動(dòng)力學(xué);也可以是2,2'-偶氮-雙(2,4-二甲基戊腈),其可于油性或有機(jī)液體介質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)1級(jí)動(dòng)力學(xué)。從游離基產(chǎn)生劑中釋放游離基可根據(jù)已知方法進(jìn)行,例如利用熱、光(特別為可見(jiàn)光譜的光或紫外光)、質(zhì)子、電子或X-射線;此種釋放最好借助質(zhì)子或熱來(lái)發(fā)動(dòng)。例如,可將2,2'-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽的水溶液加熱至37℃,即足以根據(jù)如下反應(yīng)誘發(fā)氧化性游離基的釋放
根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞材料Ⅰ包含人類(lèi)、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的細(xì)胞或細(xì)胞碎片,如細(xì)胞壁。
可有利地使用含有能在游離基作用下釋放之顯色標(biāo)記或螢光標(biāo)記的材料Ⅰ。
適用于本發(fā)明的細(xì)胞材料Ⅰ中,特別有用的是有色素的人、動(dòng)物或植物來(lái)源的活細(xì)胞,亦即含有色素或著色劑如血紅蛋白、葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素及花色素苷的活細(xì)胞,在細(xì)胞溶解之時(shí)特別適于用分光光度計(jì)測(cè)量光密度的改變來(lái)檢測(cè)上述色素或著色劑的釋放。推薦使用之活細(xì)胞為動(dòng)物來(lái)源的紅血球,較好為取自溫血?jiǎng)游锶绮溉閯?dòng)物,特別是人的紅血球。可基于下列各因素來(lái)選擇紅血球-血細(xì)胞如紅血球具有相當(dāng)短之半壽期(人體來(lái)源之紅血球?yàn)?0天);
-紅血球具有所有對(duì)抗游離基的保護(hù)性分子及酶,因此可考慮作為生物體其他細(xì)胞的代表及-紅血球的廣泛可利用性和易得性,特別是以采取少至數(shù)毫升之簡(jiǎn)單采血方式即可利用。
當(dāng)使用游離基對(duì)從血漿中分離的紅血球進(jìn)行氧化型攻擊時(shí),紅血球?qū)⑵渌忻讣胺肿佑脕?lái)對(duì)抗攻擊,直到細(xì)胞壁或細(xì)胞膜被改變以致使細(xì)胞內(nèi)容物放出為止。以紅血球?yàn)槔?,此種內(nèi)容物之釋放很容易利用分光光譜儀檢測(cè)進(jìn)入生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)的血紅蛋白量來(lái)確定。受試紅血球族群的抗性是以釋放50%W/W紅血球內(nèi)所含之血紅蛋白的時(shí)間表示(動(dòng)力學(xué)估測(cè))或以引發(fā)50%溶血所需之游離基產(chǎn)生劑的濃度(CH50%)表示的。(劑量-反應(yīng)估測(cè))細(xì)胞材料也可由細(xì)胞特別是含有色素之細(xì)胞的細(xì)胞壁或其碎片所組成。最適合的細(xì)胞壁為含有足量色素或著色劑且可于受到游離基溶解時(shí)釋放者。
細(xì)胞材料也可由合成的細(xì)胞壁所組成。優(yōu)選的合成細(xì)胞壁為含脂質(zhì)體的物質(zhì),其中能受游離基溶解而釋放的顯色標(biāo)記物可被包被、固定或固相化。含有脂質(zhì)體及此種顯色標(biāo)記物的膜物質(zhì)特別有利,原因在于如此可不必尋找健康人、動(dòng)物或植物個(gè)體作對(duì)照試驗(yàn),從而確保根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法更為標(biāo)準(zhǔn)化。
根據(jù)本發(fā)明所用的細(xì)胞材料較好由紅血球所組成,且最好由遮蓋、包被,固定或固相化了顯色標(biāo)記物的且可被游離基溶解釋放的脂質(zhì)體所組成。此種情況下,對(duì)受試游離基的抗性系50%溶解時(shí)間(亦即放出50%W/W顯色標(biāo)記物所需時(shí)間)表示,(動(dòng)力學(xué)檢測(cè))或以可誘發(fā)50%溶解之游離基產(chǎn)生劑的濃度表示。(劑量-反應(yīng)檢測(cè))“被潛在攻擊劑Ⅱ污染細(xì)胞材料”一詞系代表如上所定義之細(xì)胞材料Ⅰ于進(jìn)行該方法之前已經(jīng)與潛在攻擊劑Ⅱ至少接觸0.5小時(shí),或于進(jìn)行本發(fā)明方法前至少已經(jīng)受到潛在攻擊劑Ⅱ作用0.5小時(shí)者。
使細(xì)胞材料Ⅰ與所說(shuō)的攻擊劑Ⅱ接觸的方法包括將攻擊劑Ⅱ引進(jìn)活生物體內(nèi),然后回收被潛在攻擊劑Ⅱ污染的含色素細(xì)胞以進(jìn)行本發(fā)明的方法。也包括依據(jù)已知技術(shù)將所說(shuō)的潛在攻擊劑Ⅱ摻入細(xì)胞材料Ⅰ的細(xì)胞內(nèi),如使用注射(根據(jù)與體外授精的相關(guān)技術(shù))或滲透方法。
潛在攻擊劑Ⅱ可具有物理性質(zhì)(以X-射線、β-射線,質(zhì)子等照射)或化學(xué)性質(zhì)(試驗(yàn)物質(zhì)或參比物質(zhì),代謝產(chǎn)物等)或物理化學(xué)性質(zhì)(煙草的煙,特別包括借助熱解釋放游離基)。
生物試驗(yàn)介質(zhì)為含水液體介質(zhì)或有機(jī)液體介質(zhì),其包括事先以潛在攻擊劑Ⅱ污染的細(xì)胞材料Ⅰ,游離基產(chǎn)生劑以及必要時(shí)還含有細(xì)胞培養(yǎng)及生物檢定領(lǐng)域慣用的一種或多種添加劑,特別是防腐劑。將構(gòu)成液體試驗(yàn)介質(zhì)部分的潛在攻擊劑Ⅱ于觸發(fā)游離基釋放前至少0.5小時(shí)引進(jìn)含細(xì)胞材料及游離基產(chǎn)生劑的生物介質(zhì)內(nèi);或于污染后方便地與細(xì)胞材料結(jié)合。污染可因(蓄意或意外地)將所說(shuō)的潛在攻擊劑Ⅱ(或其一種前體)投予將由之采取細(xì)胞的生物體或因細(xì)胞膜于體外吸附潛在攻擊劑Ⅱ而造成的。
在經(jīng)投予途徑污染活細(xì)胞的情況下,細(xì)胞將污染物或其至少一種代謝產(chǎn)物攜帶于它們的內(nèi)容物及/或細(xì)胞膜上。在通過(guò)吸附污染活細(xì)胞或合成細(xì)胞的情況下,細(xì)胞壁內(nèi)及/或細(xì)胞壁上可見(jiàn)有大量固定的污染物。借吸附方式污染可有利地應(yīng)用于親脂性污染物。在細(xì)胞壁上吸附可借助于適當(dāng)介質(zhì)中并于適當(dāng)溫度下保溫細(xì)胞材料及污染物而進(jìn)行,所說(shuō)的污染物事先已于選擇的溶劑內(nèi)稀釋;依據(jù)保溫時(shí)間及所用細(xì)胞材料的濃度,保溫介質(zhì)內(nèi)的所有或(更常見(jiàn))僅一部分污染物通過(guò)吸附于天然或合成細(xì)胞壁上而被固定。
如潛在攻擊劑Ⅱ?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì),則可以是任一種試驗(yàn)物質(zhì),特別是氧化物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、產(chǎn)物的組成物或結(jié)合物或其他代謝產(chǎn)物??杀辉囼?yàn)及/或檢定的物質(zhì)中,也可為色素(特別是類(lèi)黃素),蛋白質(zhì)、酶、肽、氨基酸、抗體及抗原,且通常是可由之產(chǎn)生抗體的任何產(chǎn)物。在這些能被試驗(yàn)或檢定的物質(zhì)中,特別應(yīng)提到的是那些作用于生物體和/或細(xì)胞的產(chǎn)物或攻擊劑。
為了進(jìn)行本發(fā)明的檢定方法,將已分離洗滌的細(xì)胞材料懸浮于最好為等張液體生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)。于10至60℃,較好于15至40℃,最好于37℃之溫度范圍,于游離基產(chǎn)生劑存在下進(jìn)行保溫,游離基產(chǎn)生劑之使用比例對(duì)10至20%W/V細(xì)胞材料濃度而言為50至200mmol/l。
完成本發(fā)明方法的最佳方式包括將由紅血球或含脂質(zhì)體及可釋放之呈色標(biāo)記物的合成壁碎片所組成的細(xì)胞材料懸浮于被緩沖的等張生理血清內(nèi),并在37℃下于2,2'-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽以濃度100mM(相對(duì)于最終體積2ml(較好)之含水液體生物介質(zhì)而言)存在下保溫該懸浮液;或于對(duì)有機(jī)生物液體介質(zhì)而言為相等比例的2,2′-偶氮-雙(2,4-二甲戊腈)存在下進(jìn)行保溫。較好借助質(zhì)子,且最好借助熱震蕩(該特定情況下為加熱至37℃)從游離基產(chǎn)生劑放出游離基。以固定時(shí)間間隔(例如每20分鐘)采樣(0.02ml),直到細(xì)胞殘?jiān)⊥隇橹?通常在150至600分鐘內(nèi),且特別是在200-300分鐘內(nèi));各樣品以1ml生理血清稀釋并離心〔例如以3000-9000g,較好以3000-6000g離心10-60秒(過(guò)度激烈離心,特別是高于9000g時(shí)可能會(huì)由于機(jī)械作用產(chǎn)生溶解而干擾測(cè)定結(jié)果)〕;然后將所得上清液整分(0.2ml)轉(zhuǎn)移到微量滴定板之凹槽或一組微孔內(nèi),利用分光光譜術(shù)讀出光密度(特別是于350-600nm,而不考慮含色素細(xì)胞或合成壁的來(lái)源;當(dāng)細(xì)胞材料含有紅血球時(shí),則于405-410及540nm處測(cè)定)。
實(shí)踐中,光密度變化的結(jié)果是以相對(duì)于細(xì)胞材料最大溶解(100%)的百分率表示的。于實(shí)驗(yàn)點(diǎn)調(diào)整理論曲線,從而特別得到對(duì)應(yīng)于50%溶解的時(shí)間(該時(shí)間越長(zhǎng),紅血球或合成壁于前述操作條件下對(duì)體外試驗(yàn)中所施加之氧化性應(yīng)力的抗性越好),即峰與潛伏時(shí)間之S形曲線的斜率(根據(jù)相對(duì)于該S形曲線反折點(diǎn)的切線測(cè)定)。
可由劑量-反應(yīng)型估測(cè)法取代前述動(dòng)力學(xué)估測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明檢定方法極其容易進(jìn)行,且可以檢測(cè)藥盒的形式在市場(chǎng)上出售,或供診斷目的用或?qū)Χ喾N分子及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩檢研究,即一方面研究具有氧化或抗氧化活性的分子,另一方面則研究具有長(zhǎng)期作用的分子。檢定方法用于檢定人或動(dòng)物血漿,以便估測(cè)該分子對(duì)該血漿的影響,隨后于此種檢定中確定潛在攻擊劑Ⅱ。
本發(fā)明方法特別適用于(1)檢定抗瘧劑,它們通??山档图t血球及脂質(zhì)體對(duì)游離基之抗性,(Ⅱ)診斷糖尿病,由于此病會(huì)于生物體內(nèi)產(chǎn)生氧化作用過(guò)低效應(yīng),及(Ⅲ)評(píng)價(jià)食品或食品添加劑特別是著色劑對(duì)生物體的影響。
該檢定法的優(yōu)點(diǎn)在于可于很短時(shí)間內(nèi)完成,特別是可在或等于5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。
如果是使用脂質(zhì)體作為本發(fā)明的細(xì)胞材料,則推薦使用下述脂質(zhì)體制劑制劑A含有脂質(zhì)體、可在游離基作用下釋放出的顯色或螢光標(biāo)記物以及可確保各粒子得以粘附之粘合材料的顆粒。
制劑B由脂質(zhì)體可在游離基作用下釋放出的顯色或螢光標(biāo)記物,及可確?;|(zhì)粘附之粘合材料組成的脂質(zhì)體基質(zhì)。
制劑C其上粘合可由上述制劑B的基質(zhì)構(gòu)成之脂質(zhì)體層的惰性載體。
制劑D惰性載體,其至少一面上具有至少一個(gè)包被了能在游離基作用下可釋放出之有色或螢光標(biāo)記物的區(qū)帶,所說(shuō)的面和所說(shuō)的區(qū)帶是由被含脂質(zhì)體和粘合物的層包被的,所說(shuō)的粘合物則旨在確保所說(shuō)的層得以粘附;此處脂質(zhì)體層遮蓋了由顯色或螢光標(biāo)記物包被的區(qū)帶。
制劑E含有可于游離基作用下釋放出來(lái),且已通過(guò)浸漬而引入之顯色或螢光標(biāo)記物的多孔惰性載體,該載體上包被了類(lèi)似制劑D之脂質(zhì)體層以遮蓋所說(shuō)的標(biāo)記物。
制劑F根據(jù)制劑D的脂質(zhì)體基質(zhì),于其表面上利用顯色肽底物領(lǐng)域中已知的某類(lèi)型的顯色標(biāo)記物敏化(特別參見(jiàn)專利文獻(xiàn)EPA-O 280,610);于游離基作用下,含該標(biāo)記物的脂質(zhì)體碎片或碎片段與基質(zhì)分開(kāi),從基體上分離出這些片段或碎片并借過(guò)濾及離心收集之,然后將所說(shuō)的片段或碎片再次懸浮于可以根據(jù)已知技術(shù)顯色的生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)(參見(jiàn)上述專利文獻(xiàn)EP-A-O 280,610)。
如上所述的制劑D-E中,可在游離基作用下釋放出來(lái)的顯色或螢光標(biāo)記物由脂質(zhì)體基質(zhì)物理遮蓋,該脂質(zhì)體基質(zhì)的厚度必須相當(dāng)小,以便在游離基作用下容易接近標(biāo)記物。制劑A-C中,可以對(duì)能在游離基作用下被釋放出來(lái)的顯色或螢光標(biāo)記物作純物理性遮蓋,或可使標(biāo)記物與脂質(zhì)體有更為精細(xì)地結(jié)合,例如固定,固相化或阻隔。
最后,推薦可包括下列組分的試驗(yàn)藥盒(Ⅰ)根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞材料及(Ⅱ)游離基產(chǎn)生劑和/或液體生物學(xué)稀釋介質(zhì)。
對(duì)本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)及特點(diǎn),將會(huì)從下述實(shí)施例中得以更清楚地了解。總的說(shuō)來(lái),這些資料僅旨在進(jìn)一步闡明而不是限定本發(fā)明。實(shí)施例1-9系涉及動(dòng)力學(xué)檢定法,實(shí)施例10-15則涉及劑量-反應(yīng)型檢定法。
實(shí)施例1為了以本發(fā)明的方法進(jìn)行定量分析,研究2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽之濃度對(duì)大鼠紅血球的影響。
大鼠紅血球取出及洗滌后,懸浮(血容15%W/V)于等張生理血清內(nèi)。使這些紅血球與2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽以O(shè)mM(對(duì)照),25mM,50mM及100mM劑量接觸,含水液體生物學(xué)介質(zhì)之終體積為2ml。將反應(yīng)介質(zhì)加熱至37℃而起始游離基的釋放。每20分鐘采取0.02ml樣品經(jīng)歷200-240分鐘,各樣品于1ml生理血清內(nèi)稀釋并離心(15秒;4000g)。將整分的上清液(0.2ml)移到微平板凹槽內(nèi)用分光光譜儀讀出光密度(特別于540nm處)。
圖1所示結(jié)果以相應(yīng)于達(dá)50%溶血率(t50%)的時(shí)間(分鐘)來(lái)表示。曲線(a)系有關(guān)100mM濃度之2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽,并給出t50%值為158分鐘;曲線(b)系有關(guān)50mM濃度之2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽,并給出t50%值為176分鐘;曲線(c)系有關(guān)25mM濃度之2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽,并給出t50%值為214分鐘;曲線(d)則涉及對(duì)照試驗(yàn),亦即于不存在2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽情況下進(jìn)行的試驗(yàn)。
圖1的結(jié)果顯示了就游離基產(chǎn)生分子來(lái)說(shuō),劑量與對(duì)細(xì)胞溶解之影響間的關(guān)系。
實(shí)施例2本例涉及抗氧化劑之影響,其中使用的抗氧化劑為抗壞血酸。操作程序遵照實(shí)施例1所述,但使用含大鼠紅血球之含水液體生物介質(zhì)(生理血清);100mmol/l 2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽及0(沒(méi)有抗氧化劑)或0.1mmol/l抗壞血酸,游離基的釋放系于抗壞血酸已經(jīng)與紅血球及游離基產(chǎn)生劑接觸后0.5小時(shí)后開(kāi)始。
圖2所示結(jié)果表明,在沒(méi)有抗壞血酸〔曲線(a)〕的情況下,t50%值等于158分鐘;及有0.1mmol/l抗壞血酸共存時(shí)〔曲線(b)〕,t50%值等于244分鐘。換言之,有抗氧化劑如抗壞血酸共存時(shí)會(huì)減慢游離基所引發(fā)的細(xì)胞溶解作用。
實(shí)施例3本例涉及抗氧化劑摻入大鼠紅血球膜的影響,其中使用的抗氧化劑為丁羥基甲苯〔縮寫(xiě)為BHT;系統(tǒng)命名2,6-二(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚〕。
遵照實(shí)施例1所述的操作程序,但使用了健康大鼠紅血球(對(duì)照)及事先于37℃、在BHT及其溶劑即乙醇(將BHT吸附于紅血球細(xì)胞膜上之用)共存之下保溫0.5小時(shí)的紅血球,然后重新制成懸浮液進(jìn)行檢測(cè)。將此方式處理之紅血球置于實(shí)施例1的生理血清內(nèi),使之與100mmol/l 2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽接觸,然后將所得反應(yīng)介質(zhì)加熱至37℃。
結(jié)果如圖3所示。對(duì)照曲線(a)給出t50%為163分鐘。曲線(b)涉及事先已與BHT之溶劑亦即乙醇于37℃以0.5W/V濃度保溫0.5小時(shí)的健康大鼠血清,得到t50%值為157分鐘。曲線(c)系涉及與曲線(b)相同的紅血球,但事先已于相同條件下與BHT及乙醇(試驗(yàn)介質(zhì)含有0.03mmol/l BHT及0.5%W/V乙醇)預(yù)保溫得到t50%值為193分鐘。比較曲線(c)與曲線(a)及(b),顯示BHT可提供對(duì)抗細(xì)胞溶解的保護(hù)作用。換言之,此處所用的抗氧化劑可減慢由游離基所引起的細(xì)胞溶解。
實(shí)施例4本例涉及對(duì)來(lái)自兩個(gè)不同個(gè)體之紅血球的比較。經(jīng)分離并洗滌后,將紅血球以相同濃度重新懸浮,并使之接受來(lái)自游離基產(chǎn)生劑之游離基的作用,本特例中使用了濃度為100mmol/l的2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽。
結(jié)果如圖4所述。曲線(a)顯示成年吸煙者之紅血球的百分溶血率,并給出t50%為84.4分鐘。曲線(b)顯示不吸煙成人的百分溶血率,并給出t50%值為93.3分鐘。比較曲線(a)及(b)顯示吸煙者對(duì)游離基攻擊的正常抗性比不抽煙者低。
實(shí)施例5本例涉及使用植物細(xì)胞估測(cè)照射對(duì)氧化狀態(tài)的影響。將黃金菊(Camomile)細(xì)胞分成兩批,其中一批使用3.7×106Bq(100微居里)的放射源照射,將照射及未照射部分均于惰性氣體(氮或氬)下貯存7個(gè)月。然后將兩批細(xì)胞懸浮于含水液體生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)并與游離基產(chǎn)生劑亦即2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽于15℃下接觸0.5小時(shí)。經(jīng)加熱至37-40℃開(kāi)始釋放游離基,然后按照實(shí)施例1中所述的程序采樣并分析之。對(duì)細(xì)胞材料溶解的動(dòng)力學(xué)研究顯示,事先接受照射的細(xì)胞對(duì)游離基的抗性比未經(jīng)照射的細(xì)胞低。相應(yīng)曲線類(lèi)似于圖3所示的曲線(受照射細(xì)胞的溶解動(dòng)力學(xué)及未受照射細(xì)胞的溶解動(dòng)力學(xué)曲線的形狀分別相似于圖3所示的曲線a及b或c)。
實(shí)施例6用3.7×106Bq的放射源照射一批黃金菊種子,此批種子與未受照射的種子一起于惰性氣體下貯存8個(gè)月。然后將受照射及未經(jīng)照射的種子碾碎,并使所得磨碎產(chǎn)物與大鼠紅血球懸浮液(在生理血清中)15℃下接觸1小時(shí)。然后引進(jìn)游離基產(chǎn)生劑亦即2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽并按照實(shí)施例1所示程序進(jìn)行分析。在經(jīng)照射及未經(jīng)照射之黃金菊種子粉末共存之下研究紅血球溶解的動(dòng)力學(xué),結(jié)果得到分別相似于圖3所示曲線a及b或c的曲線。如此證明種子的酶分子已經(jīng)被修飾,具體地說(shuō)是因照射而受到破壞。
本實(shí)施例6及上述實(shí)施例5說(shuō)明使用本發(fā)明方法可估測(cè)動(dòng)物和/或植物源食物的品質(zhì),得以確定被檢食物在食用前是否已品質(zhì)變差或達(dá)到了什么程度。
實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)程序基本與實(shí)施例3相同,但用酚噻嗪取代BHT。結(jié)果發(fā)現(xiàn),就其可減慢由游離基所誘發(fā)之紅血球溶解來(lái)說(shuō),酚噻嗪具有出人意料的抗氧化功效。
實(shí)施例8實(shí)驗(yàn)程序基本同實(shí)施例7,但其中使用了包括上述制劑C之脂質(zhì)體的合成細(xì)胞材料取代紅血球。按實(shí)施例7中所述的相同方式觀察酚噻嗪的抗氧化作用。
實(shí)施例9用水(已事先煮沸)萃取干燥茶葉并凍干所得濾液而制得茶凍干品。實(shí)驗(yàn)組于凍晶前用離子射線(50kGy)照射,對(duì)照組則未照射。然后將各批于真空下貯存9個(gè)月。
隨后按照實(shí)施例3所示程序進(jìn)行,但用經(jīng)照射的或未經(jīng)照射的對(duì)照茶葉取代BHT。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)照射的茶葉對(duì)游離基抗性比對(duì)照組低。
實(shí)施例10-15下述實(shí)施例10-15舉例說(shuō)明于劑量-反應(yīng)型檢測(cè)條件下測(cè)定抗游離基活性。
將溶解于含水介質(zhì)(水或生理血清)之漸增等分(20至300mmol)的游離基產(chǎn)生劑〔2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽〕置于試管中,然后冷凍干燥。將所述等分游離基產(chǎn)生劑再度溶解于恒定體積之試驗(yàn)生理血清(其中可含或不含所研究的物質(zhì))中后,加入恒定量之根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞材料。
將相應(yīng)試驗(yàn)介質(zhì)于37℃保溫-預(yù)定時(shí)間(2.5小時(shí))。然后根據(jù)細(xì)胞材料之溶解來(lái)估測(cè)游離基的效應(yīng)。
實(shí)施例10系使用健康大鼠紅血球進(jìn)行的,發(fā)現(xiàn)可誘使50%紅血球溶解之游離基產(chǎn)生劑的濃度(CH50%)為108.0±20mmol/l。
實(shí)施例11同樣使用健康大鼠紅血球進(jìn)行,試驗(yàn)介質(zhì)額外含有10mmol/l甘露糖醇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CH50%等于155.6±6.1mmol/l,經(jīng)由與實(shí)施例10的CH50%值比較,證實(shí)了甘露糖醇之抗氧化效能。
實(shí)施例12同樣使用如同實(shí)施例10的健康大鼠紅血球進(jìn)行,試驗(yàn)介質(zhì)另外含有氧化媒介,即濃度為250mM的偶氮二羧酸雙(二甲酰胺)(一種可氧化硫醇的化合物)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)就消耗紅血球內(nèi)的谷胱甘肽效應(yīng)來(lái)說(shuō),該過(guò)氧化劑可使紅血球?qū)τ坞x基作用更為敏感,CH50%值降低(與實(shí)施例10的結(jié)果相比)至60.8±8.1mmol/l。
實(shí)施例13-15中,使用如上制劑c之含脂質(zhì)體的合成細(xì)胞材料代替紅血球,得到了相似實(shí)施例10-12的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種檢定或估測(cè)活生物體或潛在攻擊劑之抗氧化活性的方法,該方法包括使用游離基作為誘使細(xì)胞溶解的工具,該方法之特點(diǎn)為(1)使游離基產(chǎn)生劑于適當(dāng)液體生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)與選自下列之任一種細(xì)胞材料接觸(a)人類(lèi)、動(dòng)物及植物細(xì)胞,(b)所說(shuō)的細(xì)胞碎片段,及(c)含有脂質(zhì)體的合成壁及其碎片,該細(xì)胞材料已首先被潛在攻擊劑污染;(2)誘使游離基從游離基產(chǎn)生劑中釋放出來(lái);及(3)被游離基所溶解之細(xì)胞材料借助與含有未受污染之細(xì)胞材料之對(duì)照組的比較進(jìn)行來(lái)估測(cè)游離基對(duì)細(xì)胞材料的溶解作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特點(diǎn)在于細(xì)胞材料系選自于人類(lèi),動(dòng)物或植物來(lái)源的含色素細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其特征在于所說(shuō)的色素細(xì)胞為人類(lèi)或動(dòng)物來(lái)源的紅血球。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于細(xì)胞材料為合成壁碎片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法,其特征在于細(xì)胞材料為脂質(zhì)體材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于游離基產(chǎn)生劑系選自于可根據(jù)1或2級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放游離基的產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于游離基產(chǎn)生劑系選自于可釋放氧化性游離基的產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1,6及7項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法,其特征在于所說(shuō)的游離基產(chǎn)生劑為2,2′-偶氮-雙(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于使50至200mmol/l的游離基產(chǎn)生劑與濃度為10至20%W/V的細(xì)胞材料在含水生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)接觸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9的方法,其特征在于游離基系借助于37℃下保溫而產(chǎn)生的。
11.一種檢測(cè)試劑盒,其特征在于包括(Ⅰ)如權(quán)利要求1中所述的細(xì)胞材料及必要時(shí)還包括(Ⅱ)游離基產(chǎn)生劑和/或液體生物學(xué)稀釋介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于一種檢測(cè)或評(píng)估活生物體或潛在攻擊劑之抗氧化活性的新穎方法,該方法包括使用游離基作為誘使細(xì)胞溶解的工具,該方法的特征在于(1)使游離基產(chǎn)生劑于適當(dāng)液體生物學(xué)介質(zhì)內(nèi)與選自下列之任一種細(xì)胞材料接觸(a)人類(lèi),動(dòng)物及植物細(xì)胞,(b)所說(shuō)之細(xì)胞的碎片,及(c)含有脂質(zhì)體的合成壁及其碎片,所說(shuō)的細(xì)胞材料已首先污染了潛在攻擊劑。(2)誘使游離基從游離基產(chǎn)生劑中釋放出來(lái);及(3)借助與含有未受污染之細(xì)胞材料之對(duì)照組的比較來(lái)估測(cè)游離基對(duì)細(xì)胞材料的溶解作用。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1057675SQ9010311
公開(kāi)日1992年1月8日 申請(qǐng)日期1990年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1989年1月27日
發(fā)明者馬修·米·普魯斯 申請(qǐng)人:法商·史巴樂(lè)研究發(fā)展中心