專利名稱：類固醇多步氧化方法和所用的遺傳工程細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備藥學(xué)上有用的類固醇的多步氧化方法。
11β、17α、21-三羥基-4-孕甾-3，20-二酮(氫化可的松)是一種重要的藥用類固醇，由于它的藥理性質(zhì)，可將其作為皮質(zhì)甾類使用和作為制備許多有用類固醇(特別是其他皮質(zhì)甾類)的起始化合物。氫化可的松由脊椎動物的腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生，最初只能通過繁雜的提取方法從腎上腺皮質(zhì)組織中得到很少的量。只有在闡明其結(jié)構(gòu)后，才發(fā)展出一些新的生產(chǎn)途徑，這些途徑的特點是化學(xué)合成步驟與微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合。只是因為所選用的初始化合物如甾醇、膽酸和皂草配基豐富而且便宜，因此目前的這些方法提供了不太昂貴的產(chǎn)品，但這些方法仍然相當(dāng)復(fù)雜。設(shè)想了幾種改進(jìn)現(xiàn)行方法的可能性，生物化學(xué)的方法也已進(jìn)行過嘗試。
有一種嘗試是使用分離的腎上腺皮質(zhì)蛋白(這些蛋白已知與類固醇在體內(nèi)的酶學(xué)轉(zhuǎn)化有關(guān))的一個體外生化系統(tǒng)，將合適的初始類固醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松。然而，分離這些重要蛋白的困難性和必需的輔助因子的昂貴價格看來使有經(jīng)濟(jì)吸引力的大規(guī)模生產(chǎn)不能實現(xiàn)。另一種方法是使催化酶保留在其天然環(huán)境中，并使腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所需的氫化可的松。但是，由于在實踐中這些細(xì)胞的生產(chǎn)力很低，因此，要使這樣一種生化方法在經(jīng)濟(jì)上具有吸引力看來也是不可能的。
哺乳動物和其他脊椎動物腎上腺皮質(zhì)中的體內(nèi)過程構(gòu)成了一種生化途徑，它是以膽甾醇開始的，經(jīng)由各種中間產(chǎn)物最終得到氫化可的松(

圖1)。這種途徑中直接涉及8種蛋白質(zhì)，其中有5種是酶，這些酶中有4種是細(xì)胞色素P450酶，其他3種是電子傳遞蛋白。
第一步是膽甾醇向3β-羥基-5-孕甾-20-酮(孕烯醇酮)的轉(zhuǎn)化。在這種轉(zhuǎn)化中(即一種單氧化酶反應(yīng))涉及3種蛋白質(zhì)側(cè)鏈裂解酶(P450SCC，一種含血紅素-鐵的蛋白)，腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX，一種含F(xiàn)e2S2的蛋白)和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR，一種含F(xiàn)AD的蛋白)。此外，以膽甾醇作為底物的反應(yīng)進(jìn)一步需要分子氧和NADPH。
接著是通過脫氫作用/異構(gòu)作用將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為4-孕甾-3，20-二酮(孕酮)。該反應(yīng)由蛋白質(zhì)3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD)催化，它需要孕烯醇酮和NAD+。
為了得到氫化可的松，再在孕酮的3個位置進(jìn)行羥化，這種轉(zhuǎn)化由單氧化酶催化。在孕酮轉(zhuǎn)化為17α-羥基孕甾酮時涉及兩種蛋白質(zhì)類固醇17α-羥化酶(P45017α，一種含血紅素-鐵的蛋白)和NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED，一種含F(xiàn)AD-和FMN的蛋白質(zhì))。該反應(yīng)消耗孕酮，分子氧和NADPH。
17α-羥基孕酮轉(zhuǎn)化為17α-21-二羥基-4-孕甾-3，20-二酮(去氧可的松)時也需要兩種蛋白質(zhì)類固醇-21-羥化酶(P450C21，一種含血紅素-Fe的蛋白質(zhì))和前面提及的蛋白質(zhì)RED。該反應(yīng)消耗17α-羥基孕酮，分子氧和NADPH。去氧可的松轉(zhuǎn)化為氫化可的松涉及3種蛋白質(zhì)類固醇11β-羥化酶(P45011β，一種含血紅素-Fe的蛋白質(zhì))和上面提及的蛋白質(zhì)ADX和ADR。
如上所述，細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)是膽甾醇向氫化可的松進(jìn)行生化轉(zhuǎn)化所必需的酶。這些酶隸屬于一個更大的組群即細(xì)胞色素P450蛋白(或簡稱P450蛋白)。它們已經(jīng)在原核生物(各種細(xì)菌)和真核生物(酵母、霉菌、植物和動物)中發(fā)現(xiàn)過。發(fā)現(xiàn)在哺乳動物的腎上腺皮質(zhì)、卵巢、精巢和肝中，P450蛋白質(zhì)含量較高。許多P450蛋白已進(jìn)行了純化及對其特性進(jìn)行了很好的描述。它們的比活已經(jīng)測定。最近，已經(jīng)發(fā)表了許多有關(guān)這方面的綜述，如K.Ruckpaul和H.Rein(編)，“細(xì)胞色素P450”和P.R.Ortiz de Montellano(編)“細(xì)胞色素P450、結(jié)構(gòu)、機(jī)制和生物化學(xué)。”細(xì)胞色素P450蛋白的特征在于用一氧化碳還原后，在450nm處有特異性最大吸收。在原核生物中，P450蛋白既可和膜結(jié)合也可存在于細(xì)胞質(zhì)中。就目前對細(xì)菌P450蛋白的詳細(xì)研究(如P450meg和P450cam)表明，在其羥化活性中涉及一種鐵氧還蛋白和一種鐵氧還蛋白還原酶。對真核生物的兩類P450蛋白質(zhì)，即Ⅰ和Ⅱ型已進(jìn)行了描述。兩者的不同點在于1.亞細(xì)胞定位Ⅰ型定位于微粒體部分，而Ⅱ型位于線粒體內(nèi)膜上。
2.將電子傳遞給P450蛋白的途徑Ⅰ型通過NADPH由P450還原酶還原，而Ⅱ型則通過NADPH由鐵氧化蛋白還原酶(如腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶)和鐵氧還蛋白(如腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白)還原。
根據(jù)EP-A-0281245，細(xì)胞色素P450酶可從鏈霉菌中制備并用于化合物的羥化作用。
該酶以分離形式使用，這是一個相當(dāng)麻煩和昂貴的方法。
JP-A-62236485(德溫特87-331234)中指出，可以將肝細(xì)胞色素P450酶的基因?qū)肫【平湍?Saccharomyces cerevisiae)中并表達(dá)這些基因，以此提供可以利用其氧化活性的酶。
然而，在上述文獻(xiàn)中沒有說明用細(xì)胞色素P450酶來制備類固醇化合物。
按照1989.5.6所提交的申請(荷蘭)，提供了多種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的表達(dá)盒，這些蛋白質(zhì)是在多基因系統(tǒng)中將便宜的類固醇起始物氧化成稀有昂貴的終產(chǎn)物所必需的，其中，這種轉(zhuǎn)化是在一些天然系統(tǒng)中通過多酶催化和輔助因子中介的轉(zhuǎn)化完成的。該發(fā)明的表達(dá)盒可用于最終產(chǎn)生進(jìn)行這些多步轉(zhuǎn)化的多基因系統(tǒng)。
因此，一方面，該發(fā)明涉及能在重組的宿主細(xì)胞中表達(dá)異源DNA編碼序列的表達(dá)盒，這里所說的編碼序列編碼一種酶，該酶能單獨或與另外的蛋白質(zhì)一起，在膽甾醇轉(zhuǎn)化成氫化可的松的生物途徑中催化一個獨立的氧化步驟。因此，本發(fā)明的表達(dá)盒包括在重組宿主中能產(chǎn)生下列蛋白質(zhì)的基因盒，這些蛋白質(zhì)是側(cè)鏈裂解酶(P450SCC);腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX);腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR);3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD);類固醇17α-羥化酶(P45017α);NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED);類固醇-21-羥化酶(P450C21);和類固醇11β-羥化酶(P45011β)。
前文所提到的申請還披露了用這些載體或該發(fā)明的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞，生產(chǎn)上述酶和用它們進(jìn)行氧化的方法，在培養(yǎng)肉湯中使用所述宿主細(xì)胞進(jìn)行特異氧化的方法和含有用該方法制備的化合物的藥物組合物。
特別是該申請還涉及制備和培養(yǎng)適于在大規(guī)模生化生產(chǎn)反應(yīng)器中采用的細(xì)胞，以及使用這些細(xì)胞進(jìn)行化合物的氧化作用的方法，尤其是用于如圖1所示的類固醇的生產(chǎn)。圖示的每個反應(yīng)可分別進(jìn)行。包括在多步反應(yīng)中的一些步驟的相互交換。優(yōu)選的宿主是微生物，但是也可利用其他細(xì)胞，如可以是在細(xì)胞培養(yǎng)中或活的轉(zhuǎn)移基因動植物組織中的植物或動物細(xì)胞。用載體對合適的受體細(xì)胞(最好是合適的微生物細(xì)胞)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化可獲得這些細(xì)胞，這些載體含有的DNA序列編碼與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白，包括側(cè)鏈裂解酶(P450SCC)、腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX)、腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR)、3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD)、類固醇-17α-羥化酶(P45017α)、NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED)、類固醇-21-羥化酶(P450C21)和類固醇-11β-羥化酶(P45011β)。有些宿主細(xì)胞本身已能以足夠的水平產(chǎn)生一種或多種必需蛋白質(zhì)，因此，它們只需用補(bǔ)充的DNA序列轉(zhuǎn)化。這種可能的自身蛋白為鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶、P450還原酶和3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶。
已經(jīng)選擇了一些合適的DNA源，以得到編碼與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白的序列。編碼與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的所有蛋白的一個合適的DNA來源是脊椎動物的腎上腺皮質(zhì)組織，如牛腎上腺皮質(zhì)組織。由各種微生物也能得到有關(guān)的DNA，如從睪丸素假單胞菌(Pseudomonastestosteroni)，灰色肉性鏈霉菌(Streptomycesgriseocarneus)或類固醇短桿細(xì)菌(Brevibacteriumsterolicum)得到編碼3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶的DNA和從Curvularia lunata或布累克氏瘦克銀漢霉菌(Cunninghamella blakesleeana)得到編碼與11β-脫氧皮甾醇的11β-羥化作用有關(guān)的蛋白的DNA。分離編碼牛P450SCC、牛P45011β蛋白或微生物的等同蛋白、牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白、牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶、3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(?；蛭⑸锏?、牛P45017α、?；蛭⑸锏呐450C21和NADPH細(xì)胞色素P450還原酶的DNA序列，分離步驟如下1，真核序列(cDNA)a.由合適的組織制備全RNA。
b.將含多聚A+的RNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA，連接到噬菌體載體中。
c.得到的cDNA文庫用32P標(biāo)記的對所需cDNA特異的寡聚物進(jìn)行篩選，或用一種特異性(125I標(biāo)記的)抗體對異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖(IPTG)誘導(dǎo)的λ-gt11cDNA文庫進(jìn)行篩選。
d.將陽性噬菌斑形成單位(Pfu)的cDNA插段插入合適的載體中以確定-用核苷酸測序法得到的cDNA的完整長度。
2.原核基因a.由一個合適的微生物制備基因組DNA。
b.為了得到DNA文庫，將DNA片段克隆到合適的載體中，并對一種合適的大腸桿菌宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
c.得到的DNA文庫用32P標(biāo)記并對目的基因特異的寡聚物進(jìn)行篩選，或用一種特異(125I標(biāo)記的)抗體對IPTG誘導(dǎo)的λ-gt11cDNA進(jìn)行篩選。
d.分離陽性集落的質(zhì)粒，將DNA插段亞克隆入合適的載體內(nèi)以證明-基因的整個長度。
注根據(jù)改進(jìn)的方法，通過稱為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(Saiki等人，Science239487-491，1988)的方法，用兩種特異性寡聚物擴(kuò)增特異的cDNA(真核序列)或基因(原核序列)。然后，再將擴(kuò)增的cDNA或DNA插入合適的載體中。
提供了一種合適的表達(dá)盒，其中，根據(jù)前述分離的異源DNA被置于適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的調(diào)控序列之間，使得DNA能在合適的宿主細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)，以提供所需的一種或多種蛋白質(zhì)。在這些起始控制序列后也可以含有一個分泌信號序列。
必須通過所述的表達(dá)盒將合適的調(diào)控序列與結(jié)構(gòu)DNA一起導(dǎo)入。通過用含有調(diào)控序列(它與相關(guān)宿主一致，并以可操縱方式與所需表達(dá)的編碼序列連接)的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，可以使表達(dá)變?yōu)榭赡堋?br> 另外，采用了存在于宿主基因組中合適的控制序列。用這樣的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞也可使表達(dá)成為可能，此載體含有的所需蛋白的編碼序列與宿主的序列相連接，使它與宿主基因組以這樣的方式形成同源重組體，即使宿主控制序列適當(dāng)?shù)乜刂茖?dǎo)入DNA的表達(dá)。
正象一般所理解的那樣，術(shù)語“控制序列”包括對以可操縱方式連于其上的編碼序列表達(dá)的合適調(diào)節(jié)是必要的所有DNA片段，例如操縱基因、增強(qiáng)子和尤其是啟動子和控制轉(zhuǎn)譯的序列。
啟動子可受或可以不受環(huán)境調(diào)節(jié)的控制。原核生物的合適啟動子有例如trp啟動子(由色氨酸的喪失來誘導(dǎo))、lac啟動子(由乳糖類似物IPTG誘導(dǎo))、β-內(nèi)酰胺酶啟動子和噬菌體衍生的Pl啟動子(由溫度變化誘導(dǎo))。此外，尤其適用于在桿菌中表達(dá)的有用啟動子有α-淀粉酶、蛋白酶、Spoz、Spac和φ105的啟動子以及合成的啟動子序列。優(yōu)選的啟動子是在圖5中表示的啟動子，用“HpaⅡ”表示。適于在酵母中表達(dá)的合適啟動子有3-磷酸甘油酸激酶啟動子，以及其他糖酵解酶的啟動子和乙醇脫氫酶和酵母磷酸酶的啟動子。轉(zhuǎn)錄延長因子(TEF)和乳糖酶的啟動子也是合適的。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)通常采用來自病毒的啟動子(如腺病毒啟動子和SV40啟動子)，但是它們還包括可調(diào)節(jié)啟動子(如金屬硫因啟動子，它由重金屬或糖皮質(zhì)激素的濃度控制)。近來，以病毒為基礎(chǔ)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和以如胭脂堿合成酶啟動子這樣的植物細(xì)胞啟動子為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)也是適宜的。
轉(zhuǎn)譯控制序列在原核生物系統(tǒng)中有一個核糖結(jié)合位點(RBS)，而在真核生物系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)譯可由含有如AUG這樣的起始密碼子的核苷酸序列來控制。
除了必需的啟動子以外，許多其他的控制序列，包括調(diào)節(jié)終止(如真核生物系統(tǒng)中的多聚腺苷化序列)的序列可用于表達(dá)的調(diào)控。某些系統(tǒng)含有增強(qiáng)子，這些序列對于表達(dá)來說是有利的，但多數(shù)情況下不是必需的。
另一方面，前文提到的申請中還涉及各種載體，這些載體可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
一組載體用pGBSCC-n表示，其中n為1至17的任何整數(shù)，這些載體是為編碼P450SCC酶的DNA專門設(shè)計的。
根據(jù)特殊的具體方案，載體pGBSCC-7被設(shè)計成能夠攜帶編碼pGBSCC/ADX-1的進(jìn)一步異源基因，所述pGBSCC/ADX-1編碼P450SCC和ADX兩種蛋白，這兩種蛋白都是以具有功能的形式產(chǎn)生的。
另一組載體用pGB17α-n表示，其中n為1至5的任何整數(shù)，它們是為編碼P45017α酶的DNA專門設(shè)計的。
還有一組載體用pGBC21-n表示，其中n是1至9的任一整數(shù)，它們是為編碼P450C21酶的DNA專門設(shè)計的。
還有另一組載體用pGB11β-n表示，其中n為1-4的任何整數(shù)。
根據(jù)該發(fā)明的另外一個方面，選擇了能接受該發(fā)明的載體并使得導(dǎo)入DNA表達(dá)的合適宿主細(xì)胞。在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞時，與膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松有關(guān)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在其細(xì)胞成分中?？捎肈NA雜交方法證明所需DNA的存在，用RNA雜交方法證明它們的轉(zhuǎn)錄，通過免疫檢測法證明它們的表達(dá)，通過在體外或體內(nèi)與起始化合物一起保溫以檢測氧化產(chǎn)物的存在，從而證明它們的活性。
優(yōu)選的宿主是轉(zhuǎn)化的微生物，尤其是細(xì)菌(更優(yōu)選的是大腸桿菌和桿菌和鏈球菌)和酵母(如酵母屬和Kluyveromyces)。在植物和動物(包括昆蟲)中還有其他合適的宿主生物，用它們的分離細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如COS細(xì)胞、C127細(xì)胞、CHO細(xì)胞和Spodoptera frugiperda(Sfg)細(xì)胞。另外還可采用轉(zhuǎn)化基因的動物或植物。
一種特殊的重組宿主細(xì)胞是導(dǎo)入了該發(fā)明的兩個或更多表達(dá)盒(如pGBSCC/ADX-1)，或已由一個至少編碼兩種異源蛋白的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使得細(xì)胞能產(chǎn)生至少兩種與圖1中途徑有關(guān)的蛋白。
所制備的新細(xì)胞不僅能產(chǎn)生與類固醇的氧化作用有關(guān)的蛋白質(zhì)，以最終得到氫化可的松，而且完全能使用這些蛋白，以就地氧化加至培養(yǎng)液中的相應(yīng)的類固醇，以完成所期望的轉(zhuǎn)化作用。類固醇是優(yōu)選的底物。用異源DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞尤其適用于與圖1中提到的類固醇培養(yǎng)，包括其他的甾醇如β-巖甾醇。結(jié)果獲得被氧化的類固醇。
由于在宿主細(xì)胞中存在許多由異源DNA編碼的與圖1途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)，因此有可能發(fā)生多種生物化學(xué)轉(zhuǎn)化，包括甾醇的側(cè)鏈裂解和/或C11、C17、C3和C21的氧化修飾。因此，該發(fā)明的表達(dá)盒可用于構(gòu)建一個多基因系統(tǒng)，該系統(tǒng)能以圖1所示的順序同時進(jìn)行多步驟的細(xì)胞內(nèi)連續(xù)轉(zhuǎn)化?？赡鼙仨氃谒璧乃拗髦袑?dǎo)入一些表達(dá)盒，全部基因盒編碼了所需的蛋白質(zhì)。在某些情況中，所述途徑涉及的一種或多種蛋白質(zhì)可能已存在于宿主中，它(們)作為天然蛋白發(fā)揮相同的活性作用。例如，在宿主中可能已經(jīng)存在鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶和P450還原酶。在這些情況下，只有剩下的酶才必須通過重組轉(zhuǎn)化作用提供。
直到前不久，還沒有人成功地制備一個多基因系統(tǒng)，以能夠在一個生化方法中完成至少兩步圖1所示的生化途徑。
按照本發(fā)明，在一個宿主生物中克隆了編碼如下所述蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)能夠催化類固醇分子的兩個獨立的氧化作用，特別是圖1所示的蛋白。實際上，本發(fā)明已經(jīng)實現(xiàn)了在同一宿主生物體內(nèi)克隆如下兩種蛋白質(zhì)，即負(fù)責(zé)類固醇17α羥基化和類固醇C21羥基化的蛋白質(zhì)，并且該宿主生物能以功能形式表達(dá)所述蛋白。另外，本發(fā)明還提供了一種方法，在該方法中。培養(yǎng)在發(fā)酵介質(zhì)中的轉(zhuǎn)化微生物能在類固醇分子的兩個不同位置進(jìn)行氧化，以氧化該介質(zhì)中存在的類固醇底物。尤其是提供了引入17α和21羥基基團(tuán)的一步方法。
優(yōu)選的宿主生物是Kluyveromyceslactis，但也可使用其他的宿主生物，尤其是微生物(特別是在前文提到的那些)。更具體地說，CN89104208所描述的微生物很適于克隆和表達(dá)圖1所示生化途徑的基因。
一種制備能進(jìn)行多步類固醇氧化的宿主的方法是用兩個或多個載體(每個載體都含有用于一個氧化步驟的基因)轉(zhuǎn)化宿主。
另一種獲得宿主的方法是用一個載體轉(zhuǎn)化宿主，該載體所含有的表達(dá)盒包括所有編碼多步氧化反應(yīng)所需的蛋白的基因。
根據(jù)本發(fā)明，該表達(dá)盒含有至少兩種結(jié)構(gòu)基因，每種側(cè)接有合適的控制序列。一種典型的表達(dá)盒含有編碼P45017α蛋白和P450C21蛋白(pGB17-α/C21-1)的DNA。
利用本發(fā)明的方法及本領(lǐng)域其他的已知方法，有可能制備類似的表達(dá)盒，及含有該表達(dá)盒的宿主細(xì)胞，利用該宿主細(xì)胞可以在一步發(fā)酵過程中進(jìn)行其他的多步類固醇氧化作用，以最終將膽甾醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松。
附圖中所用的縮寫字母R1，EcoRⅠ;H，HindⅢ;K，KpnⅠ;X，XbaⅠ;Rv，EcoRV;SⅠ，SacⅠ;B，BamHⅠ;SⅡ;SacⅡ;Sal，SalⅠ;Xh，XhoⅠ。
圖1概括說明了哺乳動物腎上腺皮質(zhì)中進(jìn)行的膽甾醇向氫化可的松連續(xù)轉(zhuǎn)化的各步驟中所涉及的蛋白質(zhì)。
圖2是表達(dá)盒pGB17α-5的物理圖。
圖3是表達(dá)盒pGBC21-9的物理圖。
圖4表示表達(dá)盒pGB17α/C21-1的構(gòu)建，它含有P45017α和P450C21的編碼序列，它們都是由乳糖酶啟動子驅(qū)動的。
通過下列實例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但所舉實例不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。
實例1構(gòu)建編碼牛細(xì)胞色素P450類固醇17α-羥化酶和牛細(xì)胞色素P450類固醇C21-羥化酶的表達(dá)盒并將其轉(zhuǎn)化至酵母菌K.lactis中。
(a)表達(dá)盒的構(gòu)建用SacⅡ和HindⅢ(部分)消化CN89104208(實例14)中所述的表達(dá)盒pGB17α-5(圖2)，利用Klenow DNA聚合酶填平粘性末端。分離含有部分乳糖酶啟動子、編碼P45017α的序列和乳糖酶終止子的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，然后將其插入CN89104208(實例19)所述的pGBC21-9(圖3)中，pGBC21-9首先經(jīng)XbaⅠ消化使其線性化。并用Klenow DNA聚合酶填平粘性末端。所獲得的表達(dá)盒pGB17α/C21-1(圖4)具有單一的SacⅡ限制性位點，因為在側(cè)接于P45017α序列的乳糖酶啟動子中的SacⅡ限制位點被填充反應(yīng)所破壞。
(b)K，lactis的轉(zhuǎn)化如CN89104208實例5(c)中所述方法，用在單一的SacⅡ限制位點被線性化的pGB17α/C21-1轉(zhuǎn)化K，lactisCBS2360。進(jìn)一步對轉(zhuǎn)化株17α/C21-101的P45017α和P450C21進(jìn)行體內(nèi)與體外活性分析(見實例2和實例3)。
實例2K.lactis 17α/C21-101中的P45017α和P450C21的體外活性把實例1中得到的K.lactis17α/C21-101、CN89104208(實例14)中所述的K.lactis17α-101和K.lactisCBS2360置于100ml培養(yǎng)基D中培養(yǎng)。在培養(yǎng)基D中，每升蒸餾水含有酵母膏(Difco)10克Bacto胨(Oxoid)20克右旋糖20克pH＝6.5滅菌并冷卻至30℃后，加入溶于1毫升蒸餾水(膜過濾滅菌)中的25mg geneticin(G418 Sulphate，Gibco Ltd)。培養(yǎng)物在30℃培養(yǎng)72小時。離心收集細(xì)胞(4000xg，15分鐘)用磷酸緩沖液(50mMPH7.0)沖洗沉淀并離心收集細(xì)胞(4000xg，15分鐘)。將沉淀置于磷酸緩沖液中(50mMPH7.0)，得到每毫升濕重0.5g的懸浮液。用聲處理(Braun Labsonic 1510;12×1minute，50W)破碎懸浮液。通過離心除去未破碎的細(xì)胞(12000xg 15分鐘)。
在NADPH存在的條件下，通過測定17α、21二羥基孕甾酮的產(chǎn)生鑒定無細(xì)胞提取液中的P45017α和P450C21活性。檢測混合物中含有以下溶液溶液A50mM磷酸鉀緩沖液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA，2mMNADPH，5mM葡萄糖-6-磷酸和每毫升16單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(NADPH再生系統(tǒng))。
溶液B(底物)在磷酸鉀緩沖液(75mM，PH7.5)中含有在10%(v/v)TergitolTMNP40/乙醇(1∶1 v/v)溶液中的80μM〔4-14C〕孕甾酮(30Ci/mole)膠囊溶液。
檢測時，首先將75μl溶液A與50μl溶液B和125μl無細(xì)胞提取液混合。在30℃輕輕攪拌混合物。保溫60分鐘后抽取50μl試樣，并加至由100μl甲醇和50μl氯仿組成的混合液中。隨后再加入100μl氯仿和100μl水。通過離心收集氯仿層(5000xg，2分鐘)，并用100μl氯仿再次提取水/甲醇層。合并兩個氯仿層并進(jìn)行干燥。將干燥產(chǎn)物溶于100μl乙腈/水(9∶1，v/v)溶液中，并且采用HPLC柱(ChrompackLichr.10RP18，250×4.6mm)和乙腈/水(58∶42，v/v)混合液對50μl試樣進(jìn)行洗脫。用流閃計數(shù)器和紫外探測器檢測洗脫液中的類固醇底物和產(chǎn)物。所收集組分的放射活性通過液閃計數(shù)器測定。
利用此檢測法，發(fā)現(xiàn)由K.lactis17α/C21-101獲得的無細(xì)胞提取液產(chǎn)生了17α、21二羥基孕甾酮，而從K.lactis17α-101和K.lactisCB2360獲得的無細(xì)胞提取液卻不能產(chǎn)生。由K.lactis17α-101產(chǎn)生的主要產(chǎn)物是17α羥基孕甾酮。
實例3K.lactis17α/C21-101中的P45017α和P450C21的活體活性用實例1中的K.lactis17α/C21-101和K.lactisCBS2360接種25ml培養(yǎng)基D。在培養(yǎng)基D中每升蒸餾水含有酵母膏(Difco)10克Bacto胨(Oxoid)20克右旋糖20克PH＝6.5在滅菌并冷卻至30℃后，將溶解于1ml蒸餾水(膜過濾滅菌)中的25mggeneticin加入到1升培養(yǎng)基D中。
然后將含有底物〔4-14C〕孕甾酮的溶液100μl加入到25ml完全培養(yǎng)基中。該底物溶液在10%(v/v)TergitolTMNP40/乙醇(1∶1 v/v)中每毫升含有800μg〔4-14C〕孕甾酮(8Ci/mole)。
培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)搖床中(240rpm)于30℃下生長，在0和68小時后取2ml樣品。每份樣品和2ml甲醇混合。在4℃萃取24小時后，將混合物離心(4000xg，15分鐘)。采用HPIC柱(ChrompackLichr.10RP18，250×4.6mm)和乙腈/水(58∶42，v/v)對所得到的200μl上清液進(jìn)行洗脫。
檢測洗脫液中的類固醇底物和產(chǎn)物。通過液閃計數(shù)法測定所收集組分的放射活性。從K.lactis17α/C21-101培養(yǎng)68小時的培養(yǎng)物中獲得的一個組分清楚表明17α、21二羥基孕甾酮的存在，而在對照菌株K.lactisCBS2360的培養(yǎng)物中沒有產(chǎn)生這種化合物。
實例4編碼蛋白質(zhì)P450SCC和ADX的表達(dá)盒的構(gòu)建及其在酵母菌K.lactis中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)(a)表達(dá)盒的構(gòu)建將表達(dá)盒pGBADX-1(CN89104208實例23)用SacⅡ和HindⅢ(部分地)消化，利用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。分離含有部分乳糖酶啟動子(但仍保持其功能)、ADX編碼序列和乳糖酶終止子的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，然后將其插入pGBSCC-7中，pGBSCC-7首先經(jīng)XbaⅠ消化使其線性化(參見CN89104208實例5(6))，并用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。按照這樣一種方式進(jìn)行構(gòu)建，即產(chǎn)生單一的SacⅡ限制性位點，這個位點是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至K.lactis中所必需的。這個單一的SacⅡ限制性位點位于鄰接SCC序列的乳糖酶啟動子序列中，而鄰接ADX序列的乳糖酶啟動子中的SacⅡ限制性位點被填充反應(yīng)破壞。所得到的表達(dá)盒pGBSCC/ADX-1含有分別被乳糖酶啟動子驅(qū)動的SCC和ADX的編碼序列。
(b)K.lactis的轉(zhuǎn)化如CN89104208實例5(c)中所述方法，用在單一的SacⅡ限制性位點被線性化的15μgpGBSCC/ADX-1進(jìn)行K.lactisCBS2360的轉(zhuǎn)化。選擇一種轉(zhuǎn)化株(SCC/ADX-101)進(jìn)行SCC及ADX表達(dá)的研究。
(c)轉(zhuǎn)化株K.lactisSCC/ADX-101的分析如CN89104208實例5(d)中所述方法，從SCC/ADX-101及對照株CBS2360培養(yǎng)物制備細(xì)胞蛋白質(zhì)成分，并對它們進(jìn)行SDS/PAGE及Western印跡分析。印跡分別用SCC和ADX的特異抗體探測。與對照株相比較，轉(zhuǎn)化株SCC/ADX-101的細(xì)胞蛋白組分顯示出另外兩個期望長度(分別為53和14KDa)的譜帶，表明蛋白質(zhì)SCC與ADX的表達(dá)。轉(zhuǎn)化株SCC/ADX-101中兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可與只表達(dá)一種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化株中觀察到的水平相比擬(對于SCC，參見CN89104208圖15A，泳道3;對于ADX參見CN89104208圖39，泳道5)。轉(zhuǎn)化株SCC/ADX-101體外的SCC活性及ADX活性在CN89104208實例28中有描述。
權(quán)利要求
1.一種重組宿主細(xì)胞及其后代，包括微生物、植物和動物的細(xì)胞，該宿主細(xì)胞及其后代除了含有合適的控制序列外，還含有編碼蛋白質(zhì)的異源DNA，所述蛋白質(zhì)選自由能夠單獨或協(xié)同一種或多種其他蛋白催化類固醇至氫化可的松的生化轉(zhuǎn)化中的氧化步驟的蛋白質(zhì)所構(gòu)成的一組，該步驟選自下列轉(zhuǎn)化過程膽固醇向孕(甾)烯醇酮的轉(zhuǎn)化孕(甾)烯醇酮向孕甾酮的轉(zhuǎn)化；孕甾酮向17α-羥基孕甾酮的轉(zhuǎn)化；17α-羥基孕甾酮向11-脫氧皮(甾)醇的轉(zhuǎn)化；11-脫氧皮(甾)醇向氫化可的松的轉(zhuǎn)化；或者，所述蛋白質(zhì)是由天然蛋白構(gòu)成的一組中選出，即由類固醇轉(zhuǎn)化成氫化可的松的生化轉(zhuǎn)化中的天然蛋白；側(cè)鏈裂解酶(P450SCC)；腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX)；3β-羥基類固醇脫氫酶/異構(gòu)酶(3β-HSD)；腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR)；類固醇-17α-羥化酶(P45017α)；NADPH細(xì)胞色素P450還原酶(RED)；類固醇-21-羥化酶(P450C21)；類固醇-11β-羥化酶(P45011β)；其特征在于，異源DNA編碼至少兩個可表達(dá)的蛋白，它們催化至少兩個獨立的氧化步驟。
2.按照權(quán)利要求1的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，異源DNA編碼序列來自牛。
3.按照權(quán)利要求1或2的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，異源DNA編碼至少P45017α和P450C21蛋白。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的重組宿主細(xì)胞，其特征在于宿主是微生物。
5.按照權(quán)利要求4的重組宿主細(xì)胞及其后代，其特征在于，所述的宿主是酵母、Kluyveromyces或桿菌(Bacillus)或大腸桿菌之一。
6.一種由重組宿主細(xì)胞制備蛋白質(zhì)混合物的方法，包括在能使蛋白質(zhì)形成并在培養(yǎng)物中積累的條件下在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主是權(quán)利要求1-5之一所述定義的。
7.一種在體外對化合物進(jìn)行選擇性多步氧化的方法，該方法包括使待氧化的化合物與至少兩種蛋白質(zhì)與能進(jìn)行所述氧化和在培養(yǎng)液中積累氧化化合物的條件下保溫，接著回收被氧化的化合物，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)由權(quán)利要求6的方法生產(chǎn)。
8.一種對化合物進(jìn)行選擇性多步氧化的方法，該方法包括在該化合物存在下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所用培養(yǎng)條件能使所需要的氧化作用發(fā)生并使氧化化合物在培養(yǎng)液中積累，隨后回收被氧化的化合物，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞是權(quán)利要求1-5中的任何一種。
9.按照權(quán)利要求7或8的方法，其特征在于至少有兩個氧化步驟發(fā)生，它們選自裂解類固醇的側(cè)鏈、將3-羥基-5(6)-脫氫基團(tuán)氧化和異構(gòu)成3-氧代-4(5)-脫氫基團(tuán)、17α-羥基21-羥基或11β-羥基基團(tuán)的插入。
10.按照權(quán)利要求7或8的方法，其特征在于，氧化作用的結(jié)果是將C21-羥基基團(tuán)和C17α-羥基基團(tuán)同時導(dǎo)入孕甾烯醇酮或孕甾酮。
11.一種表達(dá)盒，它可在權(quán)利要求1-5中任一項的重組宿主中表達(dá)，并含有至少兩種編碼權(quán)利要求1所定義的蛋白質(zhì)的基因。
12.按照權(quán)利要求11的表達(dá)盒，其特征在于異源DNA編碼P450-17α和P450C21酶，并且所述的表達(dá)盒為pGB17α/C21-1。
13.含有一種活性化合物的藥物制劑，它是按照權(quán)利要求9-12中任一項所述方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基團(tuán)工程構(gòu)建的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞能夠同時氧化類固醇，優(yōu)選同時導(dǎo)入17α-羥基和C21-羥基基團(tuán)。特別是氧化是用細(xì)胞進(jìn)行的，在該細(xì)胞中插入有編碼至少兩種涉及膽固醇向氫化可的松生化轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)。合適的宿主細(xì)胞包括桿菌屬、酵母屬或Kluyreromyces菌珠。該新的宿主細(xì)胞適于膽固醇、孕甾烯醇酮、孕甾酮和17α-羥基-孕甾酮的生化氧化，它們都是所說的生化轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物。該宿主細(xì)胞還可用于最終制備多基因系統(tǒng)，該系統(tǒng)能一步將膽固醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松。
文檔編號C12N9/02GK1042567SQ89108378
公開日1990年5月30日 申請日期1989年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月23日
發(fā)明者哈門·斯利克會斯, 格拉杜斯·考那利斯·瑪麗·塞爾頓, 埃里克·巴斯廷·斯邁爾 申請人:吉斯特-布羅卡迪斯公司