本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)飼料的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及一種利用枯草芽孢桿菌和裂殖壺藻共培養(yǎng)生產(chǎn)水產(chǎn)飼料的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：誘食劑是水產(chǎn)配合飼料的重要組成成分，合適的誘食劑可增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)人工調(diào)配飼料的嗜好性，提高攝食量，促進(jìn)生長(zhǎng)，從而提高養(yǎng)殖效益，并可大大降低養(yǎng)殖水體的污染。誘食劑的種類眾多，根據(jù)作用機(jī)理，可分為：視覺(jué)誘食劑、味覺(jué)誘食劑和嗅覺(jué)誘食劑；對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物，嗅覺(jué)和味覺(jué)誘食劑研究較多，水產(chǎn)動(dòng)物的嗅覺(jué)比較靈敏，水體中較低濃度的化學(xué)物質(zhì)即可被感受到，使養(yǎng)殖水體具有某種特定氣味，以誘集水產(chǎn)動(dòng)物攝食。二甲基丙酸噻亭(dimethyl-β-propiothetin，DMPT)具有特殊的海洋氣味，是一種安全、無(wú)毒、無(wú)殘留、綠色高效的水產(chǎn)動(dòng)物添加劑。R.G.ackman等人(ProceedingsoftheFifthInternationalSeaweedSymposium,1965,August25-28)對(duì)14種不同海洋藻類進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)6種具有DMPT，但文章中未見(jiàn)裂殖壺藻的相關(guān)研究。ConradWagner等人(ArchivesofBiochemistryandBiophysics,Volume98,Issue2,August1962,Pages331–336)從泥團(tuán)中分離到一株能以DMPT為唯一碳源的梭狀丙酸菌(Clostridiumpropionicum)，能將DMPT分解為丙烯酸、乳酸、二甲硫代物等，文中未涉及枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻的共培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)。劉繼業(yè)等人(劉繼業(yè)、張智、王文民，“水產(chǎn)動(dòng)物誘食劑溴化DMPT的合成研究”，2010，《山東化工》)以二甲硫醚與3-溴丙酸為反應(yīng)物，在一定條件下進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，再分離、純化得到DMPT，反應(yīng)過(guò)程、分離純化復(fù)雜、難 以控制。目前，水產(chǎn)飼料中通過(guò)人為添加DMPT，達(dá)到誘食的目的，而通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生DMPT風(fēng)味物質(zhì)的研究未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)微生物發(fā)酵可有效降解或消除原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?？莶菅挎邨U菌因其蛋白酶活力高、生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，是發(fā)酵豆粕常用的微生物之一。上世紀(jì)八十年代，從紅樹(shù)林地區(qū)分離到了裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)，屬于真菌中的卵囊菌綱、破囊壺菌屬，營(yíng)養(yǎng)體為單細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)為球形。目前，人們對(duì)裂殖壺藻的研究主要集中在DHA的生產(chǎn)上，在其他方面的研究較少。例如，焦建剛，YuanKathy等人(上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，23卷4期)通過(guò)在飼料中添加一定量的裂殖壺藻發(fā)酵粉，研究其對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能和肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果表明：在添加量達(dá)到基礎(chǔ)飼料重量的0.5％時(shí)，能提高個(gè)體增重和降低飼料系數(shù)，但增重率、成活率和飼料系數(shù)沒(méi)有顯著影響；由此可見(jiàn)，在高劑量添加情況下，其效果并不明顯。MengheH.Li等人(Aquaculture，2009，Volume292，232-236)在斑點(diǎn)叉尾鮰的飼料中添加裂殖壺藻干粉，添加量為飼料重量的1.0％、1.5％時(shí)，增重效果明顯，但未對(duì)其風(fēng)味、誘食性效果做報(bào)道。本領(lǐng)域仍然需要一種利用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)水產(chǎn)飼料的方法，采用該方法制備得到的飼料具有特殊風(fēng)味、其不良?xì)馕侗谎谏w，投食后能增加水產(chǎn)動(dòng)物攝食量和增重率、降低飼料系數(shù)，提高養(yǎng)殖效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)發(fā)酵技術(shù)來(lái)生產(chǎn)水產(chǎn)飼料的方法。具體地，本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)共培養(yǎng)來(lái)發(fā)酵豆粕，豆粕經(jīng)發(fā)酵處理后，除降解豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子、增加小肽含量外，還可賦予發(fā)酵豆粕特殊風(fēng)味，掩蓋其不良?xì)馕?，增加水產(chǎn)動(dòng)物攝食量和增重率，降低飼料系數(shù)，提高養(yǎng)殖效益。在本發(fā)明的方法中，采用的是發(fā)酵豆粕固態(tài)發(fā)酵常見(jiàn)的枯草芽孢桿菌，除此之外，地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌等均為 飼料生產(chǎn)中可用的芽孢桿菌屬微生物，其生理生化特性與枯草芽孢桿菌相似，因此，也可采用芽孢桿菌屬的這些微生物來(lái)實(shí)施本發(fā)明。因此，本發(fā)明第一方面提供一種二甲基丙酸噻亭(DMPT)的制備方法，所述方法包括使用芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻發(fā)酵豆粕。本發(fā)明第二方面提供一種飼料生產(chǎn)方法，該方法包括使用芽孢桿菌屬微生物與裂殖壺藻發(fā)酵豆粕，從而制備得到所述飼料。本發(fā)明第三方面提供一種改善發(fā)酵豆粕的風(fēng)味的方法，該方法包括使用芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻發(fā)酵豆粕。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述芽孢桿菌屬微生物選自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌。在一個(gè)具體實(shí)施例中，豆粕的初始含水量在40％～70％之間。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基于含水豆粕總重量，以5％～30％的體積重量比的總接種量接入芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻。在一個(gè)具體實(shí)施例中，以培養(yǎng)液的形式接入芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻。在一個(gè)更具體的實(shí)施例中，芽孢桿菌屬微生物培養(yǎng)液和/或裂殖壺藻培養(yǎng)液經(jīng)十倍稀釋后OD600nm在0.5～1.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.5～1.2的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.5～1.0的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.6～0.8的范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，芽孢桿菌屬微生物培養(yǎng)液與裂殖壺藻培養(yǎng)液的接入比例為8:1至1:3，優(yōu)選5:1至1:1。本發(fā)明第四方面提供一種發(fā)酵豆粕，所述發(fā)酵豆粕使用芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻按本發(fā)明所述方法發(fā)酵獲得。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述發(fā)酵豆粕中，酸溶蛋白占豆粕總蛋白的比例在6％以上，優(yōu)選7％以上，更優(yōu)選8％以上。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述發(fā)酵豆粕中，胰蛋白酶抑制劑的含量低于1.5mg胰蛋白酶抑制劑/g發(fā)酵豆粕，優(yōu)選低于1.0mg胰蛋白酶抑制劑/g發(fā)酵豆粕。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述發(fā)酵豆粕含有占發(fā)酵豆粕總揮發(fā)物重量5％～50％、優(yōu)選占15％～40％、更優(yōu)選占20％～30％的二甲基丙酸噻亭。本發(fā)明第五方面提供一種飼料，該飼料含有本發(fā)明的發(fā)酵豆粕。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述飼料為水產(chǎn)飼料，含5％～10％的所述發(fā)酵豆粕和10～15％的魚(yú)粉。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述飼料為家畜或家禽幼齡動(dòng)物飼料。本發(fā)明還提供芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻在制備二甲基丙酸噻亭、飼料或改善發(fā)酵豆粕的風(fēng)味中的應(yīng)用。附圖說(shuō)明圖1發(fā)酵前豆粕風(fēng)味成分的總離子色譜圖。圖2共培養(yǎng)發(fā)酵后豆粕風(fēng)味成分的總離子色譜。圖3共培養(yǎng)發(fā)酵前后風(fēng)味成分對(duì)比分析。圖4枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕風(fēng)味成分的總離子色譜圖。圖5裂殖壺藻發(fā)酵豆粕風(fēng)味成分的總離子色譜圖。圖6枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻發(fā)酵豆粕風(fēng)味成分的對(duì)比分析。圖7枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻共培養(yǎng)平板圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明使用芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻發(fā)酵豆粕。適用于本發(fā)明的芽孢桿菌屬微生物包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌。適用于本發(fā)明的裂殖壺藻包括本領(lǐng)域已知的各種株系。芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻都可采用它們各自的本領(lǐng)域已知的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，制備含有芽孢桿菌屬微生物或裂殖壺藻的發(fā)酵液(培養(yǎng)液)。作為一個(gè)芽孢桿菌屬微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基的例子，該發(fā)酵培養(yǎng)基可含有蛋白胨、酵母抽提物和氯化鈉。蛋白胨的濃度可以是5～15g/L，酵母抽提物的濃度可以是3～8g/L，氯化鈉的濃度可以是8～12g/L。作為一個(gè)裂殖壺藻的發(fā)酵培養(yǎng)基的例子，該發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖、酵母抽提物、(NH4)2SO4、KH2PO4、Na2SO4、MgSO4、K2SO4、KCl和微量元素。微量元 素包括CaCl2、MnCl2、ZnSO4、CuSO4、Na2MoO4、NiSO4、FeSO4、CoCl2、硫胺素和維生素B12。例如，裂殖壺藻的發(fā)酵培養(yǎng)基含有：葡萄糖80～120g/L、酵母抽提物12～20g/L、(NH4)2SO40.5～1.5g/L、KH2PO41～5g/L、Na2SO410～15g/L、MgSO43～8g/L、K2SO45～10g/L、KCl1～4g/L，和微量元素(mg/L)：CaCl230～80、MnCl24～6、ZnSO44～6、CuSO40.5～1.0、Na2MoO40.01～0.025、NiSO40.5～1.0、FeSO40.005～0.015、CoCl20.050～0.080、硫胺素0.50～1.0和維生素B121.0～1.5。然后，可將含芽孢桿菌屬微生物的發(fā)酵液與含裂殖壺藻的發(fā)酵液混合，并用于發(fā)酵豆粕。應(yīng)理解，并不需要先將兩種發(fā)酵液混合?？煞謩e將兩種發(fā)酵液按所需的接種密度加到豆粕中。基于含水豆粕總重量，接種量一般是5％～30％的體積重量比，分別接入或混合接入的方式加入芽孢桿菌屬微生物與裂殖壺藻的發(fā)酵液或培養(yǎng)液。優(yōu)選地，該芽孢桿菌屬微生物或裂殖壺藻發(fā)酵液或培養(yǎng)液的濃度分別是經(jīng)十倍稀釋后OD600nm在0.5～1.5的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.5～1.2的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.5～1.0的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在0.6～0.8的范圍內(nèi)。對(duì)接入含水豆粕中的芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻發(fā)酵液或培養(yǎng)液的體積比并無(wú)特殊限制，當(dāng)芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻發(fā)酵液或培養(yǎng)液的濃度分別是經(jīng)十倍稀釋后OD600nm如上文所述在0.5～1.5的范圍內(nèi)時(shí)，優(yōu)選地芽孢桿菌屬微生物與裂殖壺藻發(fā)酵液或培養(yǎng)液的接入比例為8:1至1:3，優(yōu)選5:1至1:1。豆粕是大豆提取豆油后得到的一種副產(chǎn)品，按照提取的方法不同，可以分為一浸豆粕和二浸豆粕。其中以浸提法提取豆油后的副產(chǎn)品為一浸豆粕，而先以壓榨取油，再經(jīng)過(guò)浸提取油后所得的副產(chǎn)品稱為二浸豆粕。本發(fā)明可使用一浸豆粕和/或二浸豆粕?？蓮氖袌?chǎng)上購(gòu)得豆粕。例如，本申請(qǐng)使用來(lái)自益海(泰州)糧油食品工業(yè)有限公司的豆粕產(chǎn)品。對(duì)豆粕發(fā)酵條件并無(wú)特殊限制。通常，將豆粕與無(wú)菌水混合后，將含芽孢桿菌屬微生物的發(fā)酵液、含寇氏隱甲藻或裂殖壺藻的發(fā)酵液依次或同時(shí)或?qū)⑵浠旌弦杭拥蕉蛊芍小⒍蛊膳c無(wú)菌水混合后，通常使豆粕的初始含水量在40 ％～70％之間。該含水量可根據(jù)豆粕的品質(zhì)、用量、發(fā)酵設(shè)備等條件予以調(diào)節(jié)。接種后，可在常規(guī)條件下進(jìn)行發(fā)酵。作為例子，本發(fā)明的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度37±3℃，濕度為90％±10％，發(fā)酵時(shí)間可根據(jù)發(fā)酵的生物量通常設(shè)置為24～72小時(shí)。采用上述方法發(fā)酵獲得的發(fā)酵豆粕中原先的大分子量蛋白被有效降解，酸溶蛋白含量顯著增加，胰蛋白酶抑制劑(TI)同時(shí)也被大量降解，同時(shí)產(chǎn)生了二甲基丙酸噻亭(DMPT)。通常，本發(fā)明發(fā)酵豆粕中，酸溶蛋白占豆粕總蛋白的比例在6％以上，優(yōu)選7％以上，更優(yōu)選8％以上。胰蛋白酶抑制劑的含量通常低于1.5mg胰蛋白酶抑制劑/g發(fā)酵豆粕，更優(yōu)選低于1.0mg胰蛋白酶抑制劑/g發(fā)酵豆粕。優(yōu)選的，本發(fā)明的發(fā)酵豆粕中含有占揮發(fā)物重量5％-50％的二甲基丙酸噻亭，優(yōu)選地，本發(fā)明的發(fā)酵豆粕中含有占揮發(fā)物重量15％-40％的二甲基丙酸噻亭，更優(yōu)選地，本發(fā)明的發(fā)酵豆粕中含有占揮發(fā)物重量20％-30％的二甲基丙酸噻亭。通常，本發(fā)明的發(fā)酵豆粕中還含有所述芽孢桿菌屬微生物和裂殖壺藻。本發(fā)明的發(fā)酵豆粕可用作飼料組分，替換飼料中原有的魚(yú)粉。常規(guī)的含魚(yú)粉的飼料中，魚(yú)粉一般占飼料比重15～25％左右。高檔水產(chǎn)飼料對(duì)魚(yú)粉要求更高，為20～25％。使用本發(fā)明的發(fā)酵豆粕，可替換飼料中的魚(yú)粉，從而減少飼料中的魚(yú)粉，使其重量百分比降低至10～15％。因此，本發(fā)明提供一種飼料，所述飼料含有占該飼料重量大約5～10％的本發(fā)明發(fā)酵豆粕，所述豆粕替代了該飼料重量5～10％的魚(yú)粉。飼料中還含有的其它成分及含量與常規(guī)的飼料相同或稍有變動(dòng)，但這都在本領(lǐng)域技術(shù)人員所能掌握的范圍之內(nèi)。除水產(chǎn)飼料外，本發(fā)明的發(fā)酵豆粕還可用于例如家畜及家禽等幼齡動(dòng)物飼料中。如未特別說(shuō)明，以下實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)品分析純(AR)級(jí)，商購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。豆粕來(lái)源：益海(泰州)糧油食品工業(yè)有限公司。分析與檢測(cè)方法：粗蛋白質(zhì)含量：采用微量凱氏定氮法(GB/T5511-2008)檢測(cè)。酸溶蛋白含量：采用三氯乙酸(TCA)法(GB/T22492-2008)檢測(cè)。胰蛋白酶抑制劑(TI)含量：采用紫外分光光度法(AACC71-10)檢測(cè)。實(shí)施例1：菌種活化枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的活化：挑取枯草芽孢桿菌B3甘油管(保藏號(hào)：CGMCCNo.7641)一環(huán)，在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)；裂殖壺藻(Schizochytrium.ATCC20888)(ATCC20888，購(gòu)自廣州微生物研究所)的活化：挑取裂殖壺藻甘油管一環(huán)，在種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上劃線，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖100g/L、酵母抽提物15g/L、(NH4)2SO41g/L、KH2PO43g/L、Na2SO412g/L、MgSO45g/L、K2SO47g/L、KCl2g/L。實(shí)施例2：種子液制備及平板共培養(yǎng)枯草芽孢桿菌B3種子液的制備：從活化好的平板上挑取單菌落，接種于50ml培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為37℃，PH值為6.8，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵時(shí)間為18h；枯草芽孢桿菌種子液濃度為：經(jīng)10倍稀釋后OD600nm＝0.8。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、氯化鈉10g/L。裂殖壺藻(Schizochytriumsp.)種子液的制備：從活化好的平板上挑取單菌落，接種于50ml培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為28℃，PH值為6.8，轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵時(shí)間為72h；裂殖壺藻種子液濃度為：經(jīng)10倍稀釋后菌濃達(dá)到OD600nm＝0.8。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖100g/L、酵母抽提物15g/L、(NH4)2SO41g/L、KH2PO43g/L、Na2SO412g/L、MgSO45g/L、K2SO47g/L、KCl2g/L，微量元素(mg/L)：CaCl250、MnCl25.2、ZnSO45.2、CuSO40.8、Na2MoO40.016、NiSO40.8、FeSO40.01、CoCl20.066、硫胺素0.76、維生素B121.2。此外，在脫脂豆粕粉瓊脂平板上觀察枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)：如圖7所示，兩種菌均可以脫脂豆粕為唯一營(yíng)養(yǎng)源進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖；兩者未出現(xiàn)拮抗或彼此抑制，可以在同一基質(zhì)中共同培養(yǎng)。實(shí)施例3：固態(tài)共培養(yǎng)—I豆粕經(jīng)90℃滅菌30min后，與無(wú)菌水進(jìn)行混勻，使豆粕的初始含水量為50％，以含水豆粕總重量為基礎(chǔ)，以10％的體積重量比的接種量接入實(shí)施例2制備得到的枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻種子液的混合液(1:1)，4層紗布密封，在37℃、濕度為90％恒溫恒濕箱中，發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)果列在下表1中。實(shí)施例4：固態(tài)共培養(yǎng)—II豆粕經(jīng)90℃滅菌30min后，與無(wú)菌水進(jìn)行混勻，使豆粕的初始含水量為50％，以含水豆粕總重量為基礎(chǔ)，以10％的體積重量比的接種量接入實(shí)施例2制備得到的枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻種子液的混合液(3:1)，4層紗布密封，在37℃、濕度為90％恒溫恒濕箱中，發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)果列在下表1中。實(shí)施例5：固態(tài)共培養(yǎng)—III豆粕經(jīng)90℃滅菌30min后，與無(wú)菌水進(jìn)行混勻，使豆粕的初始含水量為50％，以含水豆粕總重量為基礎(chǔ)，以10％的體積重量比的接種量接入實(shí)施例2制備得到的枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻種子液的混合液(5:1)，4層紗布密封，在37℃、濕度為90％恒溫恒濕箱中，發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)果列在下表1中。實(shí)施例6：固態(tài)共培養(yǎng)—IV豆粕經(jīng)90℃滅菌30min后，與無(wú)菌水進(jìn)行混勻，拌勻后的豆粕初始含水量為60％，以含水豆粕總重量為基礎(chǔ)，以10％的體積重量比的接種量接入實(shí)施例2制備得到的枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻種子液的混合液(1:1)，4層紗布密封，在37℃、濕度為90％恒溫恒濕箱中，發(fā)酵48h。發(fā)酵結(jié)果列在下表1中。表1：豆粕進(jìn)行枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻共培養(yǎng)發(fā)酵前后品質(zhì)變化粗蛋白(干基)/％酸溶蛋白(占蛋白)/％TI/(mg/g)發(fā)酵前53.031.426.12I發(fā)酵后59.278.690.97II發(fā)酵后59.679.340.87III發(fā)酵后59.829.680.82IV發(fā)酵后59.889.750.78從上表可以看出，經(jīng)枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻共培養(yǎng)后，豆粕中的大分子量蛋白得到有效降解，酸溶蛋白含量顯著增加，胰蛋白酶抑制劑(TI)同時(shí)也被大量降解，表明枯草芽孢桿菌與裂殖壺藻在以不同比例菌濃及不同初始含水量條件下，在以脫脂豆粕單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中共培養(yǎng)，未出現(xiàn)拮抗，并不影響降解效果。實(shí)施例7：固態(tài)枯草芽孢桿菌單菌種發(fā)酵豆粕經(jīng)90℃滅菌30min后，與無(wú)菌水進(jìn)行混勻，使豆粕的初始含水量為50％，以含水豆粕總重量為基礎(chǔ)，以10％的體積重量比的接種量接入枯草芽孢桿菌種子液(經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)，10倍稀釋后OD600nm＝0.8)，攪拌均勻，4層紗布密封，在37℃、濕度為90％恒溫恒濕箱中，發(fā)酵48h。實(shí)施例8：固態(tài)裂殖壺藻單菌種發(fā)酵豆粕經(jīng)90℃滅菌30min后，與無(wú)菌水進(jìn)行混勻，使豆粕的初始含水量為50％，以含水豆粕總重量為基礎(chǔ)，以10％的體積重量比的接種量接入裂殖壺藻種子液(經(jīng)過(guò)4d培養(yǎng)，10倍稀釋后菌濃達(dá)到OD600nm＝0.8)，與豆粕混勻，4層紗布密封，在37℃、濕度為90％恒溫恒濕箱中，發(fā)酵48h。實(shí)施例9：風(fēng)味分析采用固相微萃取和GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)酵液的主要揮發(fā)性化合物成分。具體方法如下：固相微萃取(SPME)法：取5g發(fā)酵豆粕置于20ml鉗口瓶中，用聚四氟乙烯隔墊密封，于磁力攪拌器上在60℃加熱平衡15min后，通過(guò)隔墊插入已活化好的SPME萃取頭(270℃活化30min)，推出纖維頭，頂空吸附40min后，插入GC進(jìn)樣口解析5min。色譜條件：色譜柱為DB-5MS，30m×0.25mmID×0.25um；載氣：氦氣；柱流量：1ml/min；進(jìn)樣口溫度：250℃，不分流進(jìn)樣；起始溫度40℃保持3min，以5℃/min圣旨150℃，再以10℃/min升至250℃，保持10min。質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，離子化方式：EI，電子能量70eV，質(zhì)量范圍35-350AMU/s。結(jié)果顯示在圖3－6中。從圖3可以看出，發(fā)酵前的脫脂豆粕經(jīng)熱處理后，主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有15種，酮類物質(zhì)較多，其中十一烷酮占總揮發(fā)物質(zhì)近40％，未見(jiàn)DMPT產(chǎn)生；經(jīng)枯草芽孢桿菌和裂殖壺藻共培養(yǎng)發(fā)酵后，在菌濃比例為5:1、3:1、1:1等不同接種方案中，發(fā)酵豆粕都具有特殊的海洋腥味，揮發(fā)性物質(zhì)的種類發(fā)生了較大變化，吡嗪類物質(zhì)明顯增加，賦予發(fā)酵豆粕一定的烤香氣，同時(shí)，大量生產(chǎn)DMPT，占總揮發(fā)物的25％左右，且DMPT的揮發(fā)閾值較低，使得發(fā)酵豆粕的海洋腥味顯著。從圖4-6可以看出，分別以單一菌種裂殖壺藻或枯草芽孢桿菌在豆粕上發(fā)酵后，分析其揮發(fā)性風(fēng)味組分，共產(chǎn)生17種風(fēng)味化合物；其中裂殖壺藻發(fā)酵豆粕具有一定的腥臭味，同時(shí)伴有烤糊味，關(guān)鍵性揮發(fā)性物質(zhì)如乙酸乙酯、3-甲基吡嗪及萘等，都具有特征風(fēng)味；枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕具有一定的菌臭味外，還伴有一定的焙烤食物的甜香氣息，主要揮發(fā)性物質(zhì)為麥芽酚、二叔丁基對(duì)苯酚、己醛等；當(dāng)以單一菌種發(fā)酵時(shí)，揮發(fā)性呈味物質(zhì)中未見(jiàn)DMPT生成。實(shí)施例10：飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)1)飼料中豆粕組分的營(yíng)養(yǎng)成分分析(表2的數(shù)據(jù)采用實(shí)施例6所述的發(fā)酵方法發(fā)酵豆粕)。表2：營(yíng)養(yǎng)成分分析/％2)實(shí)驗(yàn)方案與飼料配方表3：試驗(yàn)飼料配方及主要營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)a：每千克多維成分分析保證值：維生素A12500000IU、維生素D33000000IU、維生素E100000IU、維生素K36870mg、維生素B120000mg、維生素B230000mg、維生素B630000mg、維生素B1240mg、D-生物素800mg、煙酰胺60000mg、D-泛酸鈣50000mg；b：每千克多礦成分分析保證值：Ca(IO3)210g、CoCl2·6H2O10g、CuSO4·5H2O8g、FeSO4·H2O16.7g、ZnSO4·H2O22.9g、MnSO4·H2O6.3g、Na2SeO3·5H2O2g、MgSO4·7H2O66.7g、KCl500g、NaCl200g、Ca(H2PO4)2157.5g；c：配方中添加的蛋氨酸、賴氨酸和蘇氨酸均為微囊型，其有效含量分別為50％、39％和50％；d：其他中含豆粕15％、花生粕15％、肉骨粉5％、魷魚(yú)膏5％、啤酒酵母5％、大豆磷脂1.5％、魚(yú)油2％、磷酸二氫鈣2％、60％氯化膽堿0.5％、35％VC0.1％、98％肌醇0.04％。3)實(shí)驗(yàn)用蝦及飼養(yǎng)管理養(yǎng)殖試驗(yàn)于上海海洋大學(xué)濱海特種養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。從市場(chǎng)上購(gòu)得凡納濱對(duì)蝦，選取規(guī)格一致、體格健壯的凡納濱對(duì)蝦(平均體質(zhì)量為3.96g)960尾，隨機(jī)分配于16口網(wǎng)箱(網(wǎng)箱規(guī)格為2.0m×1.0m×1.2m)中，每個(gè)網(wǎng)箱60尾，試驗(yàn)共4個(gè)處理組，每處理組4個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)前馴養(yǎng)一周，待蝦穩(wěn)定且正常攝食后正式開(kāi)始試驗(yàn)。養(yǎng)殖期間，每日投喂4次(7:00、12:00、17:00和22:00)，日投喂量為蝦體重的4％～7％，并根據(jù)天氣及攝食情況作適當(dāng)調(diào)整，使每網(wǎng)箱的投飼量保持在基本一致的水平，晝夜充氣，每周換水1/5。試驗(yàn)期間水溫28.2℃～30.4℃，溶氧>5.6mg/L，pH7.8～8.5，氨氮≤0.2mg/L，亞硝酸鹽≤0.1mg/L。飼養(yǎng)試驗(yàn)共進(jìn)行6周。4)對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響表4：發(fā)酵豆粕對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響注：同列數(shù)據(jù)后若標(biāo)明不同字母則表示兩者差異顯著(P＜0.05)。由上表可以看出，采用魚(yú)粉的正對(duì)照組具有最高增重率和最低飼料系數(shù)，其次為S941、參考組，但與正對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)；此外，正對(duì)照組和S941具有較好的誘食性，通常在投喂后2h內(nèi)可以攝食完，其他組需要3-4h?？莶菅挎邨U菌與裂殖壺藻共培養(yǎng)的發(fā)酵豆粕較參考組、負(fù)對(duì)照組在增重率上效果顯著。以上結(jié)果說(shuō)明，共培養(yǎng)獲得的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品可替代6％的魚(yú)粉而不影響對(duì)蝦生長(zhǎng)、成活率及飼料利用，其中S941具有良好的誘食性。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3