茶葉多酚氧化酶同工酶單體pp01和pp02及其制備方法
【專利摘要】一種茶葉多酚氧化酶同工酶單體PP01和PP02及其制備方法，是針對(duì)當(dāng)前茶葉多酚氧化酶純化倍數(shù)低、上載樣品蛋白量少、操作時(shí)間長(zhǎng)，獲得的同工酶僅為某一相對(duì)分子量的同工酶而未能獲得氨基酸序列結(jié)構(gòu)、分子量、等電點(diǎn)、酶學(xué)性質(zhì)等明確的同工酶單體的技術(shù)現(xiàn)狀，依次采用丙酮粉富集酶蛋白、硫酸銨分級(jí)沉淀、強(qiáng)陰離子交換色譜、凝膠介質(zhì)層析、分子鑒定、酶學(xué)性質(zhì)分析等技術(shù)及優(yōu)化工藝，分離制備了氨基酸序列結(jié)構(gòu)、分子量、等電點(diǎn)、酶學(xué)性質(zhì)等明確的兩種茶葉多酚氧化酶同工酶單體。該方法不僅具有成本低、制備量大、針對(duì)性強(qiáng)、操作周期短等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)深化茶葉多酚氧化酶同工酶的分離純化技術(shù)、推動(dòng)利用茶葉多酚氧化酶同工酶單體定向酶促合成茶黃素組分以及茶葉多酚氧化酶優(yōu)勢(shì)同工酶開(kāi)發(fā)利用、同工酶固定化、酶蛋白結(jié)構(gòu)解析、酶基因克隆與功能驗(yàn)證等具有重要理論實(shí)踐意義。
【專利說(shuō)明】茶葉多酚氧化酶同工酶單體PP01和PP02及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶制備技術(shù)，具體涉及一種茶葉多酚氧化酶同工酶單體PPOl和PP02， 及該二同工酶單體的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多酷氧化酶（Polyphenol Oxidase, PPO)是一種氧化還原酶，普遍存在于生物體 中，具有多種同工酶及不同生理功能，并且不同生物體、不同品種、不同生長(zhǎng)季節(jié)、不同組織 中的多酚氧化酶同工酶存在顯著差異。王坤波對(duì)不同來(lái)源多酚氧化酶同工酶進(jìn)行了電泳分 析，發(fā)現(xiàn)梨有11條同工酶、茶葉有5條、蘑菇有5條、蘋果有4條、而漆酶只有1條。劉仲華 在研宄紅茶加工工藝過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)PPO同工酶酶帶數(shù)目和同一酶帶在不同加工階段酶活性 具有差異，并且對(duì)底物專一性也有不同。Buzen等通過(guò)聚丙烯酸胺凝膠電泳分離出6種多酚 氧化酶組分，并借助電子計(jì)算機(jī)估算其分子量均在35-117KDa范圍內(nèi)。龔志華對(duì)20種茶樹 品種茶鮮葉同工酶電泳比較發(fā)現(xiàn)PPO同工酶在酶帶數(shù)目、迀移率和酶帶染色深淺方面存在 差異。
[0003] 茶葉多酚氧化酶是茶樹體內(nèi)最重要的酶類之一，它不僅對(duì)茶樹生理代謝起重要作 用，而且在茶葉加工過(guò)程中，通過(guò)不同程度地抑制或利用多酚氧化酶活性，可以將茶鮮葉加 工成不同茶類。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通常將茶葉PPO作為一個(gè)整體，圍繞PPO的提取與分離、酶 學(xué)特性、生理遺傳、酶源篩選與利用、酶促合成茶黃素以及PPO的固定化等內(nèi)容，作了大量 而系統(tǒng)的研宄，并取得了顯著的研宄成果。但在茶葉PPO同工酶單體的分離鑒定以及利用 同工酶單體來(lái)定向酶促合成茶黃素及其組分方面，則未能取得突破性進(jìn)展。
[0004] 無(wú)論是開(kāi)展多酚氧化酶分子生物學(xué)、酶工程研宄，還是利用PPO同工酶定向酶促 合成茶黃素及其組分，都要從相應(yīng)酶源中提取分離出多酚氧化酶單體。目前分離純化多酚 氧化酶同工酶的方法，通常是采用鹽析、透析、層析等技術(shù)，但由于PPO同工酶分子間有特 異性，如分子大小、酸堿性、極性和電荷等，從而使得制備同工酶單體成為這一領(lǐng)域的關(guān)鍵 技術(shù)瓶頸。國(guó)內(nèi)外最新報(bào)道的茶葉多酚氧化酶同工酶的分離制備技術(shù)，也由于受研宄方法 與技術(shù)手段的限制，存在純化倍數(shù)低、上載樣品蛋白量少、操作時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)，獲得的同工 酶僅為某一相對(duì)分子量的同工酶，而未能獲得氨基酸序列結(jié)構(gòu)、分子量及等電點(diǎn)等明確的 同工酶單體。
[0005] 因此，建立茶葉多酚氧化酶同工酶單體的制備方法，對(duì)于深化現(xiàn)有多酚氧化酶同 工酶的分離純化技術(shù)、推動(dòng)利用多酚氧化酶同工酶單體定向酶促合成茶黃素組分以及開(kāi)展 多酚氧化酶優(yōu)勢(shì)同工酶的開(kāi)發(fā)利用、同工酶的固定化、酶蛋白結(jié)構(gòu)解析、酶基因克隆與功能 驗(yàn)證等具有重要的理論實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種茶葉多酚氧 化酶同工酶單體PPOl和PP02及其制備方法，根據(jù)茶鮮葉中多酚氧化酶同工酶種類多、同工 酶含量低的特點(diǎn)，依次采用丙酮粉富集目標(biāo)酶蛋白、硫酸銨分級(jí)沉淀、強(qiáng)陰離子交換色譜、 凝膠介質(zhì)層析等技術(shù)及優(yōu)化工藝，從茶葉中制備出兩種多酚氧化酶組分，本方法具有成本 低、制備量大、針對(duì)性強(qiáng)、操作周期短等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種茶葉多酚氧化酶 同工酶單體PPOl和PP02,所述同工酶單體PPOl的分子量為85089Da、等電點(diǎn)為6. 1、 能測(cè)定的 4 個(gè)肽段氨基酸序列為 YLFAGVVDGR、AGINVIQIDEAALR、YGAGIGPGVYDIHSPR 和 LQEELDIDVLVHGEPER ;同工酶單體PP02的分子量為42531. 7Da、等電點(diǎn)為5. 49、能測(cè)定的3 個(gè)肽段氨基酸序列為 YSLKPLVPR、LASLADLYVNDAFGTAHR 和 VDLNVPLDDNLNTDDTR。
[0008] 本發(fā)明提供的另一種技術(shù)方案是：一種制備上述茶葉多酚氧化酶同工酶單體 PPOl和PP02的方法，該方法步驟如下，結(jié)合參見(jiàn)圖1-圖4 :
[0009] 1)粗酶液制備：取茶樹鮮葉，按每50-70g茶樹鮮葉加150-220mL-30?-20°C 預(yù)冷的體積濃度為100%的丙酮的比例，于茶樹鮮葉中加入丙酮，快速勻漿2_3min，依次 用80 %體積濃度和100 %體積濃度的-30?-20°C預(yù)冷丙酮真空抽濾淋洗，直至淋洗液無(wú) 色，茶渣冷凍干燥（是指在-40?-30°C真空冷凍干燥24-30小時(shí)）成丙酮粉；再于丙酮 粉中加入0-4°C預(yù)冷的pH為5. 6的0. IM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液勻漿浸提1-3小時(shí)， 期間震蕩4-8次，取浸提液過(guò)濾、離心（離心溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為8000-12000r/min，時(shí)間為 15-20min)，得上清液即為粗酶液；其中，該0. IM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中含有8-10% 甘油、0. 08-0. 12%維生素 C、lmM EDTA及3-5% PVPP，加入量為每50-70g茶樹鮮葉制得的 丙酮粉加180-200mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；
[0010] 上述茶樹鮮葉取自一芽二葉的政和大白、福云6號(hào)、桃源大葉茶樹品種。
[0011] 2)硫酸銨分級(jí)沉淀：于粗酶液中加入無(wú)水硫酸銨粉末至30 %飽和度，0-4°C靜置 2小時(shí)，在4°C以8000-12000r/min離心15-20min，收集上清液，再加入無(wú)水硫酸銨粉末至 80%飽和度，0-4°C靜置4小時(shí)，以12000-18000r/min于4°C離心10_15min，收集沉淀；按 Ig沉淀加 l〇_15ml pH為7. 5的含有8-10%甘油的20mM Tris-HCl平衡緩沖液的比例，于 沉淀中加入Tris-HCl平衡緩沖液，置于超濾管中離心以濃縮脫鹽，得超濾液；
[0012] 上述于超濾管中離心以濃縮脫鹽時(shí)，超濾管為Amicon Ultra IOK型號(hào)規(guī)格，在 0-4°〇、3500-500017^11轉(zhuǎn)速下離心，所用緩沖液是？!1為7.5的含8-10%甘油的201111 Tris-HCl緩沖液，期間置換緩沖液3-4次，每次離心時(shí)間為20-30min。
[0013] 3)離子交換色譜：將上述超濾液上Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換柱，先 用平衡緩沖液上柱至280nm吸收基線平衡，再用含有0-0. 25mol/L氯化鈉的平衡緩沖液進(jìn) 行梯度洗脫（NaCl 濃度分別為 0Μ、0· 025Μ、0· 05Μ、0· 075Μ、0· 1Μ、0· 15Μ、0· 2Μ、0· 25M)，每個(gè) 梯度洗脫6個(gè)柱床體積，自動(dòng)收集器收集洗脫液，檢測(cè)收集管酶活和280nm吸光值，分別合 并具有酶活性的不同梯度洗脫液，分別置于超濾管中離心以濃縮脫鹽，獲得酶比活性較高 的二酶液（圖1及圖2);其中，平衡緩沖液是pH為7. 5的含8-10%甘油的20mM Tris-HCl 緩沖液；
[0014] 上述于超濾管中離心以濃縮脫鹽時(shí)，超濾管為Amicon Ultra IOK型號(hào)規(guī)格，在 0-4°〇、3500-500017^11轉(zhuǎn)速下離心，所用緩沖液是？!1為7.5的含8-10%甘油的201111 Tris-HCl緩沖液，期間置換緩沖液2-3次，每次離心時(shí)間為20-30min。
[0015] 4)凝膠介質(zhì)層析：將上述兩酶液分別上Sephadex G-75凝膠柱，先用平衡緩沖液 上柱至280nm吸收基線平衡，再用含0. 10-0. 15M NaCl的平衡緩沖液洗脫2個(gè)柱床體積，自 動(dòng)收集器收集洗脫液，檢測(cè)酶活和280nm吸光值，合并具有酶活性的部分，最后將兩酶液有 酶活性的部分分別置于超濾管中離心以濃縮脫鹽，得到凝膠介質(zhì)層析純化后的二酶液；
[0016] 收集洗脫液，檢測(cè)酶活和280nm吸光值，合并具有酶活性的部分，最后將分別置于 超濾管中離心以濃縮脫鹽，得到二酶液；
[0017] 上述平衡緩沖液是指pH為7. 5的含8-10 %甘油的20mM Tris-HCl緩沖液或pH為 6. 8的含8-10 %甘油的20mM磷酸緩沖液。
[0018] 上述于超濾管中離心以濃縮脫鹽時(shí)，超濾管為Amicon Ultra IOK型號(hào)規(guī)格，在 0-4°〇、3500-500017^11轉(zhuǎn)速下離心，所用緩沖液是？!1為7.5的含8-10%甘油的201111 Tris-HCl緩沖液或pH為6. 8的含8-10 %甘油的20mM磷酸緩沖液，期間置換緩沖液2-3次， 每次離心時(shí)間為20-30min。
[0019] 5)將所得凝膠介質(zhì)層析純化后的二酶液分別再次重復(fù)步驟4)的凝膠介質(zhì)層析步 驟，獲得兩種多酚氧化酶同工酶單體，對(duì)獲取的同工酶單體進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，切膠、酶 解、ZipTop脫鹽，采用MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜測(cè)試，分別為同工酶單體PPOl和PP02。
[0020] 上述二種同工酶單體的分子鑒定的具體步驟如下：
[0021] 1)膠內(nèi)酶解及ZipTip脫鹽
[0022] 將膠粒切碎后轉(zhuǎn)入EP管中，加入200-400 μ L IOOmM NH4HC03/30% CAN脫色液，清 洗脫色至透明，吸棄上清液，加入IOOmM NH4HCO3，室溫孵育15min。吸棄上清凍干，再加入 5 yL 2. 5-10ng/yL測(cè)序級(jí)Trypsin (Promega)溶液，37°C反應(yīng)過(guò)夜，20小時(shí)左右；吸取酶解 液，轉(zhuǎn)移至新EP管中，原管加入100 yL60% ACN/0. 1% TFA，超聲15min，合并酶解液凍干； 若有較多鹽分，貝1J用ZipTip(millipore)進(jìn)行脫鹽。
[0023] 2)質(zhì)譜分析
[0024] 凍干后的酶解樣品，取2yL 20%乙腈復(fù)溶。取IyL溶解樣品，直接點(diǎn)于樣品靶 上，讓溶劑自然干燥后，再取〇. 5 μ L過(guò)飽和CHCA基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥。 樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪艉蠓湃雰x器進(jìn)靶槽并用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（5800MALDI-T0F/T0F，AB SCIEX)進(jìn)行測(cè)試分析，激光源為335nm波長(zhǎng)的NchYAG激光源，加速電壓為2KV，采用正離 子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級(jí)質(zhì)譜（MS)掃描范圍為800-4000Da，選擇信噪 比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS)分析，每個(gè)樣品上樣選擇8個(gè)母離子，二級(jí)質(zhì)譜 (MS/MS)累計(jì)疊加2500次，碰撞能量2KV，CID關(guān)閉。
[0025] 3)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索
[0026] 質(zhì)譜測(cè)試用Mascot2. 2軟件檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到兩種同工酶單體結(jié)果如下 表1所示。
[0027] 表1同工酶單體鑒定結(jié)構(gòu)表
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種茶葉多酚氧化酶同工酶單體PP01和PP02,其特征在于，所述同工酶單體 PP〇 1的分子量為85089Da、等電點(diǎn)為6. 1、匹配的4個(gè)肽段氨基酸序列為YLFAGVVDGR、 AGINVIQIDEAALR、YGAGIGPGVYDIHSPR 和 LQEELDIDVLVHGEPER ;同工酶單體 PP02 的分子量為 42531. 7Da、等電點(diǎn)為5. 49、匹配的3個(gè)肽段氨基酸序列為YSLKPLVPR、LASLADLYVNDAFGTAHR 和 VDLNVPLDDNLNTDDTR。
2. -種制備權(quán)利要求1所述的茶葉多酚氧化酶同工酶單體PP01和PP02的方法，其特 征在于：該方法步驟如下： 1) 粗酶液制備：取茶樹鮮葉，按每50-70g茶樹鮮葉加150-220mL-30?-20°C預(yù)冷的體 積濃度為100%的丙酮的比例，于茶樹鮮葉中加入丙酮，快速勻漿2-3min，依次用80%體積 濃度和100%體積濃度的-30?_20°C預(yù)冷丙酮真空抽濾淋洗，直至淋洗液無(wú)色，茶渣冷凍 干燥成丙酮粉；再于丙酮粉中加入0-4°C預(yù)冷的pH為5. 6的0. 1M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩 沖液勻漿浸提1-3小時(shí)，期間震蕩4-8次，取浸提液過(guò)濾、離心，得上清液即為粗酶液；其中， 該0. 1M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中含有8-10%甘油、0. 08-0. 12%維生素 C、lmM EDTA及 3-5% PVPP，加入量為每50-70g茶樹鮮葉制得的丙酮粉加180-200mL檸檬酸-磷酸氫二鈉 緩沖液； 2) 硫酸銨分級(jí)沉淀：于粗酶液中加入無(wú)水硫酸銨粉末至30%飽和度，0-4°C靜置2小 時(shí)，在4°C以8000-12000r/min離心15-20min，收集上清液，再加入無(wú)水硫酸銨粉末至80% 飽和度，〇_4°C靜置4小時(shí)，以12000-18000r/min于4°C離心10_15min，收集沉淀；按lg沉 淀加 l〇_15ml pH為7. 5的含有8-10%甘油的20mM Tris-HCl平衡緩沖液的比例，于沉淀中 加入Tris-HCl平衡緩沖液，置于超濾管中離心以濃縮脫鹽，得超濾液； 3) 離子交換色譜：將上述超濾液上Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換柱，先用平 衡緩沖液上柱至280nm吸收基線平衡，再用含有0-0. 25mol/L氯化鈉的平衡緩沖液進(jìn)行梯 度洗脫，每個(gè)梯度洗脫6個(gè)柱床體積，自動(dòng)收集器收集洗脫液，檢測(cè)酶活和280nm吸光值，分 別合并具有酶活性的不同梯度洗脫液，分別置于超濾管中離心以濃縮脫鹽，獲得酶比活性 較高的二酶液；其中，平衡緩沖液是pH為7. 5的含8-10%甘油的20mM Tris-HCl緩沖液； 4) 凝膠介質(zhì)層析：將上述兩酶液分別上S印hadex G-75凝膠柱，先用平衡緩沖液上柱 至280nm吸收基線平衡，再用含0. 10-0. 15M NaCl的平衡緩沖液洗脫2個(gè)柱床體積，自動(dòng)收 集器收集洗脫液，檢測(cè)酶活和280nm吸光值，合并具有酶活性的部分，最后將兩酶液有酶活 性的部分分別置于超濾管中離心以濃縮脫鹽，得到凝膠介質(zhì)層析純化后的二酶液； 5) 將所得凝膠介質(zhì)層析純化后的二酶液分別再次重復(fù)步驟4)的凝膠介質(zhì)層析步 驟，獲得兩種多酚氧化酶同工酶單體，通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定，分別為同工酶單體PP01和 PP02〇
3. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于，所 述步驟1)中的茶樹鮮葉為一芽二葉的政和大白、福云6號(hào)、桃源大葉茶樹品種鮮葉。
4. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于，所 述步驟1)中的茶渣在-40?-30°C真空冷凍干燥24-30小時(shí)成丙酮粉。
5. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于，所 述步驟1)中的離心溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為8000-12000r/min，時(shí)間為15-20min。
6. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于， 所述步驟2)中于超濾管中離心以濃縮脫鹽時(shí)，超濾管為Amicon UltralOK型號(hào)規(guī)格，在 0-4°〇、3500-500017^11轉(zhuǎn)速下離心，所用緩沖液是？11為7.5的含8-10%甘油的201111 Tris-HCl緩沖液，期間置換緩沖液3-4次，每次離心時(shí)間為20-30min。
7. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于， 所述步驟3)中于超濾管中離心以濃縮脫鹽時(shí)，超濾管為Amicon UltralOK型號(hào)規(guī)格，在 0-4°〇、3500-500017^11轉(zhuǎn)速下離心，所用緩沖液是？11為7.5的含8-10%甘油的201111 Tris-HCl緩沖液，期間置換緩沖液2-3次，每次離心時(shí)間為20-30min。
8. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于，所 述步驟4)中的平衡緩沖液是pH為7. 5的含8-10%甘油的20mM Tris-HCl緩沖液或pH為 6. 8的含8-10 %甘油的20mM磷酸緩沖液。
9. 如權(quán)利要求2所述的一種制備茶葉多酚氧化酶同工酶單體的方法，其特征在于， 所述步驟4)中于超濾管中離心以濃縮脫鹽時(shí)，超濾管為Amicon UltralOK型號(hào)規(guī)格，在 0-4°〇、3500-500017^11轉(zhuǎn)速下離心，所用緩沖液是？11為7.5的含8-10%甘油的201111 Tris-HCl緩沖液或pH為6. 8的含8-10%甘油的20mM磷酸緩沖液，期間置換緩沖液2-3次， 每次離心時(shí)間為20-30min。
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK104498448SQ201410849876
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】肖文軍, 滕杰, 龔志華, 鄧燕莉 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)