一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法及應(yīng)用，屬于毛發(fā)發(fā)育【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是先分別分離培養(yǎng)待測(cè)細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞，再分別將毛乳頭細(xì)胞和待測(cè)細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的上下表面進(jìn)行共培養(yǎng)，同時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平均直徑和共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)平均直徑，再根據(jù)判定公式判定待測(cè)細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。本發(fā)明所提供的方法首次實(shí)現(xiàn)了通過待測(cè)細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，來鑒定待測(cè)細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育，培養(yǎng)條件更加接近生物體內(nèi)環(huán)境，克服了現(xiàn)有技術(shù)中僅僅通過單一或幾個(gè)基因或化學(xué)試劑來研究所帶來的比較片面的問題。
【專利說明】一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法及應(yīng)用，屬于毛發(fā)發(fā)育【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 毛發(fā)發(fā)育不良和發(fā)育過剩一直是困擾人們的一大生命科學(xué)難題。毛發(fā)的發(fā)育起源 于毛囊的毛乳頭細(xì)胞，一個(gè)毛乳頭細(xì)胞團(tuán)形成一根毛發(fā)。毛乳頭細(xì)胞團(tuán)的密度，決定了毛發(fā) 形成的密度；毛乳頭細(xì)胞團(tuán)大，形成的毛發(fā)的毛干粗大；毛乳頭細(xì)胞團(tuán)小，形成的毛發(fā)毛干 細(xì)小。因此，可以通過評(píng)價(jià)毛乳頭細(xì)胞團(tuán)的密度、大小和數(shù)量來預(yù)測(cè)毛發(fā)的發(fā)育狀況。毛乳 頭細(xì)胞團(tuán)的形成和發(fā)育狀況與其所處的微環(huán)境有密切關(guān)系。處于毛囊周圍影響毛囊微環(huán)境 的細(xì)胞均可能直接或間接參與調(diào)控毛乳頭細(xì)胞團(tuán)的形成和發(fā)育。現(xiàn)今，研究人員已充分認(rèn) 識(shí)到毛囊中毛乳頭細(xì)胞團(tuán)的大小與毛發(fā)發(fā)育的關(guān)系，目前主流研究方案均集中在通過基因 沉默、基因過表達(dá)或化學(xué)試劑作用于毛囊和（或）毛乳頭細(xì)胞來影響毛發(fā)發(fā)育。該方案只 能對(duì)單一因子的基因或者化學(xué)試劑來說，的確是很合適，但毛發(fā)的發(fā)育并不僅僅是某個(gè)或 某幾個(gè)基因作用的結(jié)果，而是錯(cuò)綜復(fù)雜的生命體內(nèi)復(fù)雜生化活動(dòng)的綜合結(jié)果。僅通過單個(gè) 基因或者化學(xué)試劑來判定細(xì)胞與毛發(fā)發(fā)育的關(guān)系存在結(jié)果片面，不能夠真實(shí)反映細(xì)胞對(duì)毛 發(fā)發(fā)育影響的問題。因此，模擬體內(nèi)微環(huán)境是探索影響毛發(fā)發(fā)育的某類因素的有效方式。目 前為止尚沒有通過共培養(yǎng)抑制或刺激毛乳頭細(xì)胞團(tuán)來影響毛發(fā)發(fā)育的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法，所采取的技 術(shù)方案如下：
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法，該方法是先分別分離 培養(yǎng)待測(cè)細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞，再分別將毛乳頭細(xì)胞和待測(cè)細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的上下 表面進(jìn)行共培養(yǎng)，同時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平 均直徑和共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)平均直徑，再根據(jù)判定公式判定待測(cè)細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。
[0005] 所述判定公式，是：
[0006] x = (b~a) / a
[0007] 其中，a，單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平均直徑；b，共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)平均直徑。
[0008] 所述按照判定公式進(jìn)行判定，是按照以下情況進(jìn)行判定：
[0009] 1)當(dāng)|x|〈0. 1，待測(cè)細(xì)胞不參與毛發(fā)發(fā)育；
[0010] 2)當(dāng)|x|彡0. 1，待測(cè)細(xì)胞參與毛發(fā)發(fā)育，其中，x彡0. 1，待測(cè)細(xì)胞對(duì)毛發(fā)發(fā)育 具有促進(jìn)作用；x< _〇. 1，待測(cè)細(xì)胞對(duì)毛發(fā)發(fā)育具有抑制作用。
[0011] 所述方法的步驟如下：
[0012] 1)分離培養(yǎng)待測(cè)細(xì)胞，獲得待測(cè)細(xì)胞；
[0013] 2)分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，獲得毛乳頭細(xì)胞；
[0014] 3)將步驟1)所得的待測(cè)細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的下表面，將步驟2)所得的毛 乳頭細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的上表面，進(jìn)行共培養(yǎng)；同時(shí)在相同條件下，單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭 細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，獲得共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)和單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞團(tuán)；
[0015] 4)利用顯微鏡的長(zhǎng)度標(biāo)尺測(cè)定單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平均直徑a和共培養(yǎng)細(xì)胞 團(tuán)平均直徑b，根據(jù)判定公式x = (b_a)/a，判定待測(cè)細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。
[0016] 步驟3)所述共培養(yǎng)，將毛乳頭細(xì)胞和待測(cè)細(xì)胞按10:1的接種量分別接種到插入 皿的上下表面，24孔培養(yǎng)皿毛乳頭細(xì)胞接種量為1 X 105/孔，6孔培養(yǎng)皿毛乳頭細(xì)胞接種量 為1X106/孔；培養(yǎng)條件為37°C，C0 2濃度5%，培養(yǎng)時(shí)間為8-10d，培養(yǎng)基為加入10% FBS 的DMHM培養(yǎng)基。
[0017] 步驟3)所述單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，接種到插入皿中的接種量為：24孔培養(yǎng)皿 1 X 105/孔，6孔培養(yǎng)皿1 X 106/孔。
[0018] 所述方法用于鑒定細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。
[0019] 本發(fā)明取得的有益效果如下：
[0020] 本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了通過待測(cè)細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，來鑒定待測(cè)細(xì)胞是 否參與毛發(fā)發(fā)育，培養(yǎng)條件更加接近生物體內(nèi)環(huán)境，克服了現(xiàn)有技術(shù)中僅僅通過單一或幾 個(gè)基因或化學(xué)試劑來研究所帶來的比較片面的問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞團(tuán)。
[0022] 圖2為毛乳頭細(xì)胞與骨膜干細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞團(tuán)。
[0023] 圖3為毛乳頭細(xì)胞與骨膜細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)。
[0024] 圖4為待測(cè)細(xì)胞驗(yàn)證效果；
[0025] (A，是鹿茸骨膜細(xì)胞移植部位；B，普通骨膜細(xì)胞移植部位）。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0027] 以下實(shí)施例所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試 齊U、儀器和方法。
[0028] 實(shí)施例1毛乳頭細(xì)胞與骨膜干細(xì)胞共培養(yǎng)
[0029] 1)分離培養(yǎng)鹿茸骨膜干細(xì)胞：取鹿茸骨膜組織，消化，細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37°C，C0 2濃度為5%，培養(yǎng)時(shí)間為8-10d，培養(yǎng)基為DMEM加10% FBS。（以下培養(yǎng)條件于此 條件相同）。
[0030] 2)毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)：離體分離鹿皮膚毛乳頭細(xì)胞，消化培養(yǎng)。將毛乳頭細(xì)胞接種 在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的上表面，單獨(dú)培養(yǎng)。
[0031] 3)細(xì)胞共培養(yǎng)：將毛乳頭細(xì)胞接種在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的上表面，鹿茸骨膜干細(xì) 胞接種在插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿的下表面。共同培養(yǎng)至形成毛乳頭細(xì)胞團(tuán)。
[0032] 4)在毛乳頭細(xì)胞團(tuán)形成穩(wěn)定后，在帶有標(biāo)尺功能的倒置顯微鏡下，觀察測(cè)量毛乳 頭細(xì)胞團(tuán)的大小，測(cè)定結(jié)果如表1所示。通過鹿茸毛乳頭細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)（圖1)與鹿茸毛乳 頭細(xì)胞與鹿茸骨膜干細(xì)胞共培養(yǎng)（圖2)相比，毛乳頭細(xì)胞團(tuán)的大小差異明顯，平均直徑差 距為-0.41，低于-0. 1。鹿茸毛乳頭細(xì)胞與鹿茸骨膜干細(xì)胞共培養(yǎng)情況下，形成的毛乳頭細(xì) 胞團(tuán)要小。這個(gè)結(jié)果說明鹿茸骨膜干細(xì)胞對(duì)鹿茸毛乳頭細(xì)胞團(tuán)發(fā)育有明顯的抑制作用。 [0033] 表1.毛乳頭細(xì)胞團(tuán)直徑測(cè)量結(jié)果（單位：Um)

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒定參與毛發(fā)發(fā)育細(xì)胞的方法，其特征在于，先分別分離培養(yǎng)待測(cè)細(xì)胞和毛乳 頭細(xì)胞，再分別將毛乳頭細(xì)胞和待測(cè)細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的上下表面進(jìn)行共培養(yǎng)，同 時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平均直徑和共培養(yǎng)細(xì)胞 團(tuán)平均直徑，再根據(jù)判定公式判定待測(cè)細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。
2. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述判定公式，為： x - (b-￡l) /b 其中，a，單獨(dú)培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平均直徑；b，共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)平均直徑。
3. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述按照判定公式進(jìn)行判定，是按照以下情況進(jìn) 行判定： 1) 當(dāng)| x |〈0.1，待測(cè)細(xì)胞不參與毛發(fā)發(fā)育； 2) 當(dāng)| x |彡0. 1，待測(cè)細(xì)胞參與毛發(fā)發(fā)育，其中，x彡0. 1，待測(cè)細(xì)胞對(duì)毛發(fā)發(fā)育具有 促進(jìn)作用；x < _〇. 1，待測(cè)細(xì)胞對(duì)毛發(fā)發(fā)育具有抑制作用。
4. 權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下： 1) 分離培養(yǎng)待測(cè)細(xì)胞，獲得待測(cè)細(xì)胞； 2) 分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，獲得毛乳頭細(xì)胞； 3) 將步驟1)所得的待測(cè)細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的下表面，將步驟2)所得的毛乳 頭細(xì)胞接種到插入式培養(yǎng)皿的上表面，進(jìn)行共培養(yǎng)；同時(shí)在相同條件下，單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì) 胞，培養(yǎng)結(jié)束后，獲得共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)和單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞團(tuán)； 4) 利用顯微鏡的長(zhǎng)度標(biāo)尺測(cè)定單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞團(tuán)平均直徑a和共培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)平 均直徑b，根據(jù)判定公式x = (b_a)/a，判定待測(cè)細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。
5. 權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，步驟3)所述共培養(yǎng)，將毛乳頭細(xì)胞和待測(cè)細(xì)胞 按10:1的接種量分別接種到插入皿的上下表面，24孔培養(yǎng)皿毛乳頭細(xì)胞接種量為1 X 105/ 孔，6孔培養(yǎng)皿毛乳頭細(xì)胞接種量為IX 106/孔；培養(yǎng)條件為37°C，C02濃度5%，培養(yǎng)時(shí)間 為8-10d，培養(yǎng)基為加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。
6. 權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，步驟3)所述單獨(dú)培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞，接種到插入皿 中的接種量為：24孔培養(yǎng)皿1 X 105/孔，6孔培養(yǎng)皿1 X 106/孔。
7. 權(quán)利要求1-6所述方法，其特征在于，用于鑒定細(xì)胞是否參與毛發(fā)發(fā)育。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK104450858SQ201410794830
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】趙海平, 李春義, 孫紅梅, 褚文輝, 劉振 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所