一種從禾本科作物感病組織上直接提取病原菌dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從發(fā)病的水稻和玉米等禾本科的葉片病斑上直接提取病原真菌和細(xì)菌DNA的方法。采用本發(fā)明的方法可以從感染稻瘟病的水稻葉片、穂頸及玉米葉片病斑上直接提取病原菌的DNA，提取方法簡(jiǎn)單、快速、成本低，提取的DNA適用于病原微生物的分子檢測(cè)與診斷、病原菌的無毒基因檢測(cè)以及群體遺傳多樣性等基于PCR技術(shù)的分析。
【專利說明】一種從禾本科作物感病組織上直接提取病原菌DNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物分子檢測(cè)領(lǐng)域，特別的，屬于一種從禾本科作物感病組織上直接提取病原菌DNA的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]作物病原微生物DNA的提取是開展相關(guān)病原分子檢測(cè)與分析的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)病原真菌DNA的提取常采用的方法是CTAB提取法和細(xì)胞壁裂解法等。CTAB法需要前期液氮的研磨，或者使用酶進(jìn)行細(xì)胞破壁，然后要使用氯仿等有毒試劑抽提以去除蛋白，進(jìn)行DNA沉淀和洗脫等多個(gè)步驟，雖然能獲得質(zhì)量高的DNA，但整個(gè)過程耗時(shí)長(zhǎng)，效率低。而且，DNA分離的前期需要完成病原微生物的分離與培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。采用試劑盒提取的方法，雖然比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便了許多，但又存在成本高的問題，不利于大量樣品的分析與檢測(cè)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，建立在真菌rDNA的ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增序列比較分析的真菌病害診斷鑒定技術(shù)、建立在細(xì)菌16S rDNA區(qū)段PCR擴(kuò)增序列比較分析的細(xì)菌病害診斷鑒定技術(shù)已成熟；諸多的無毒基因不斷從病原菌中被成功分離克隆以及大量可用的分子標(biāo)記信息，為采用建立在PCR基礎(chǔ)上的病原微生物快速診斷、病原菌群體的遺傳多樣性分析以及病原菌無毒基因的快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。建立一種快速分離病原微生物的DNA技術(shù)，特別是能直接從發(fā)病組織直接分離病原菌的DNA技術(shù)，用于建立在PCR技術(shù)上的分子診斷與檢測(cè)，將極大地提高工作效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]采用一步法，直接從水稻稻瘟病葉瘟和穂頸瘟病斑上直接提取病原菌的DNA的方法，該方法提取的DNA可用于稻瘟病菌群體無毒基因的分子檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，將極大地提高工作效率，省去水稻稻瘟病病原菌的分離、保存、培養(yǎng)等前期數(shù)天的準(zhǔn)備過程，而且DNA的提取僅需一步即可完成，提取的DNA可直接用作PCR的擴(kuò)增的模板進(jìn)行有效擴(kuò)增，與已有的DNA提取方法相比，可大大縮短DNA提取的時(shí)間，減少工作的繁瑣性，實(shí)現(xiàn)基于PCR技術(shù)的田間稻瘟病菌種群無毒基因構(gòu)成的快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)。
[0004]同時(shí)，應(yīng)用本方法，成功從玉米灰斑病病斑上成功分離玉米灰斑病病原真菌的DNA,從水稻細(xì)菌性條斑病病斑上成功分離到病原細(xì)菌的DNA，表明該方法不僅能在用于感染稻瘟病的水稻組織病原菌的DNA提取，同時(shí)可應(yīng)用于禾本科其它作物的真菌或細(xì)菌病害感病組織的病原菌DNA的提取，為開展其它病害病原菌的分子遺傳多樣性及新病害的快速分子診斷提供一種DNA提取的重要方法和途徑。
[0005]一方面，本發(fā)明提供一種從禾本科作物感病組織直接提取DNA的方法，該方法包括:1)、提前分別配制以下四種試劑，滅菌后備用“1)、100mM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3)、1M KCl 和(4)、10% Tween 20 ；
[0006]2)、采集待檢測(cè)的感染病害的禾本科作物的葉片或其它組織作為樣品，從發(fā)病的禾本科的葉片病斑上切取約2mmX 2mm大小的葉片或從水稻穂頸上取l_2mm長(zhǎng)的發(fā)病穂頸分別放置于PCR-96孔板中；
[0007]3)、根據(jù)樣品的數(shù)量，將步驟(I)中的 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA (ρΗ8.0)和IM KCl各取適量等體積混合后，然后再根據(jù)3種混合液的總體積按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均勻后，在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液；
[0008]4)、將上述處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理lOmin，或?qū)悠贩湃霛駸釡缇?，?05°C下處理lOmin，取出樣品放置于-20°C備用。
[0009]在一些優(yōu)選的方式中，PCR-96孔板可以被任何容器所代替，只要這種容器可以被加熱進(jìn)行步驟4的處理就可以了。
[0010]在一些優(yōu)選的方式中，單個(gè)病斑的大小可是任意合適的面積，例如2mmX2mm ；ImmX2mm ；0.5mmX2mm或者多個(gè)相同面積的病斑。除了葉片或穂頸上的病斑外，其他組織的病斑也可以采用本發(fā)明的方法進(jìn)行。
[0011]在另外一方面，本發(fā)明提供一種從感病禾本科作物組織上直接提取病原菌DNA的方法，該方法由以下步驟組成:
[0012]1)、配制以下四種試劑，滅菌后備用:(l)、100mM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2)、1mMEDTA (pH 8.0)、(3)、1M KCl 和(4)、10% Tween 20 ；
[0013]2)、采集待檢測(cè)的感染病害的組織，從發(fā)病的禾本科作物葉片上切取2_X2_大小的發(fā)病葉片分別放置于PCR-96孔板中；
[0014]3)、根據(jù)樣品的數(shù)量，將步驟(I)中的 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA(ρΗ8.0)和IM KCl各取適量等體積混合后，然后再根據(jù)3種混合液的總體積按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均勻后，在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液；
[0015]4)、將上述處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理lOmin，或?qū)悠贩湃霛駸釡缇?，?05°C下處理lOmin，取出樣品放置于-20°C備用。
[0016]在一些優(yōu)選的方式中，其中禾本科植物病害為水稻的稻瘟病，玉米灰斑病或者水稻細(xì)菌性條斑病。
[0017]優(yōu)選的，其中禾本科植物組織樣品為水稻葉片或穂頸上的稻瘟病病斑；玉米的葉片上玉米灰斑病病斑或者水稻葉片上水稻細(xì)菌性條斑病病斑。
[0018]在一些優(yōu)選的方式中，禾本科的單個(gè)病斑的大小可是任意合適的面積，一般為單個(gè)病斑的大小，例如2mmX 2mm、ImmX 2mm、0.5mmX 2mm等。實(shí)際上，本發(fā)明所采用的組織樣本不是整個(gè)病斑的大小，而是一個(gè)病斑的很小一部分作為提取DNA的樣本，例如整個(gè)病斑的1/5，1/10，1/2，或其他面積。除了水稻葉片或穂頸上的稻瘟病病斑外，其他組織的稻瘟病單個(gè)病斑也可以米用本發(fā)明的方法進(jìn)行。例如，稻瘟病的感病病斑長(zhǎng)度有大有小，田間一般超過5mm(穂頸)，長(zhǎng)的可超過1mm(或20平方毫米)(葉片上)，而本發(fā)明僅僅是取單個(gè)病斑的很小的一部分就能實(shí)現(xiàn)DNA的直接提取和快速檢測(cè)。實(shí)際上，本發(fā)明中的2X2mm或者是穂頸的1-2_其實(shí)只是病斑的很少部分，大約只有整個(gè)單個(gè)病斑的五分之一或更小。這有利于稻瘟病菌無毒基因的檢測(cè)，如果需要分離稻瘟病菌時(shí)，可從剩余的病斑中完成病原菌的分離；而且對(duì)于取樣的大小沒有太多的要求，在如此小面積的部分單個(gè)病斑上可以實(shí)現(xiàn)稻瘟病菌基因DNA的提取和檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了痕量樣品檢測(cè)的目的。
[0019]有益效果
[0020]通過本技術(shù)發(fā)明，(I).可省去傳統(tǒng)常規(guī)方法中病原菌的分離、培養(yǎng)及病菌收集的過程，簡(jiǎn)化了程序；(2).實(shí)現(xiàn)一步法直接從禾本科作物感病組織中上直接分離病原菌的DNA，省去了常規(guī)中多次抽提的繁瑣步驟；(3).獲得的DNA可直接用于病原菌群體遺傳多樣性、病原菌無毒基因檢測(cè)及新病害的快速分子診斷分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為從水稻感病葉片和穂頸上提取稻瘟病菌DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，M,分子量標(biāo)記，DL2000 ;圖1a指從感病葉片提取DNA后擴(kuò)增真菌rDNA的ITS區(qū)段的通用引物對(duì)(ITS1/ITS4)擴(kuò)增的結(jié)果，預(yù)期片段大小544bp，其中帶1_15為感病葉片提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康葉片作空白對(duì)照；圖1b指從感病葉片提取DNA后用AvrPizt-1Fw/AvrP i z t-1 Rv引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，預(yù)期片段大小1186bp，其中帶1-15為感病葉片提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康葉片作空白對(duì)照；圖1c指從感病穂頸提取DNA后用ITS1/ITS4引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，其中帶1-15為感病穂頸提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康穂頸作空白對(duì)照；圖1d指從感病穂頸提取DNA后用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，預(yù)期片段大小1186bp，其中帶1-15為感病穂頸提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康穂頸作空白對(duì)照。
[0022]圖2為從玉米感病葉片上提取玉米灰斑病菌DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，M，分子量標(biāo)記，DL2000 ;帶1-2指從感病葉片提取DNA后擴(kuò)增真菌rDNA的ITS區(qū)段的通用引物對(duì)(ITS1/ITS4)擴(kuò)增的結(jié)果，獲得了與預(yù)期片段一樣，大小約500bp.
[0023]圖3.為從水稻感病的葉片上提取水稻細(xì)菌性條斑病菌DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中，M，分子量標(biāo)記，DL2000 ;帶1-2指從感病葉片提取DNA后擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的通用引物27F/1942R擴(kuò)增的結(jié)果，獲得了與預(yù)期片段大小一樣的片段，約1.5kb.

【具體實(shí)施方式】
[0024]就是以舉例的方式說明本發(fā)明是如何進(jìn)行的，這些舉例僅僅是為了說明本發(fā)明是如何實(shí)現(xiàn)的，或者最佳實(shí)施方式，這些實(shí)施例子并不能對(duì)本發(fā)明做任何限制，本發(fā)明的范圍為權(quán)利要求所限定。
[0025]實(shí)施例子1:水稻葉片和穂頸稻瘟病菌的DNA的提取和驗(yàn)證。
[0026]具體實(shí)施的方法:
[0027]I)試劑:提前配制以下試劑，滅菌后備用:(I)UOOmM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3、)IM KCl、(4) ,10% Tween 20。
[0028]2)樣品準(zhǔn)備:隨機(jī)分別選取從田間采集后室溫保存于實(shí)驗(yàn)室的典型發(fā)病的15個(gè)葉片和穂頸，從發(fā)病的水稻葉片病斑上切取約2mmX2mm大小的發(fā)病葉片、從發(fā)病的穂頸上取l_2mm長(zhǎng)的發(fā)病穂頸，分別放置于PCR-96孔板中，每孔放置一個(gè)樣品，葉片和穂頸設(shè)置一個(gè)健康的水稻材料作為對(duì)照。
[0029]3)提取液配制及應(yīng)用:將 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA (pH 8.0)和 IM KCl各取1.2mL等體積混合，然后加入3.6 μ L 10%的Tween 20，混合均勻后在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液，并蓋上蓋子。如果有樣品漂浮，可用一次性吸頭或滅菌的牙簽將其壓入液體中，即可進(jìn)入下一步程序。
[0030]4) DNA制備:(I)如果樣品僅有96個(gè)以內(nèi)，將上述處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理lOmin，之后儲(chǔ)存于-20攝氏度備用；(2)如果樣品比較多，可將樣品放入濕熱滅菌鍋，在105°C下處理1min后，取出樣品放置于-20°C備用。
[0031]5)PCR反應(yīng):樣品的PCR檢測(cè)用2對(duì)PCR引物進(jìn)行，一對(duì)是擴(kuò)增病原真菌rDNA的ITS序列的通用引物，擴(kuò)增片段大小為544bps，正向引物和反向引物序列分別為，ITSl:TCCGTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ;另外一對(duì)是用于檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AvrPizt的引物，擴(kuò)增大小為1186bps，正向引物和反向引物序列分別為，AvrPizt-1Fw:MG CGT CAC MA ATA TCA TCA AGT,AvrPizt-1Rv:CGG CTA CCA TCG AGA AMGTo PCR反應(yīng)體系20 μ L，包含:2 X Taq MasterMix 10 μ L，正向引物及反向引物各I μ L，制備好的DNA模板I μ L，無菌雙蒸水6 μ L。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3min，然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，即95°C變性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循環(huán)結(jié)束后再延伸7min，然后將PCR產(chǎn)物放置于4°C ；PCR反應(yīng)在ClOOO上進(jìn)行(B1Rad)。
[0032]6)PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物每樣品取5 μ L在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳染色檢測(cè)。
[0033]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0034]如圖1所示，利用感病葉片上的病斑提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功用ITS1/ITS4引物對(duì)擴(kuò)增出預(yù)期片段大小544bp的帶；同樣，利用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物對(duì)，成功擴(kuò)增出預(yù)期片段大小1186bp的目標(biāo)帶；與從感病葉片提取的DNA相似，分別利用2對(duì)引物從穂頸提取的稻瘟病菌DNA中成功擴(kuò)增出544bp和1186bp的目標(biāo)片段。
[0035]從圖1可以看出，M，分子量標(biāo)記，DL2000 ;圖1a指從感病葉片提取DNA后用ITSl/ITS4引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，預(yù)期片段大小544bp，其中帶1-15為感病葉片提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康葉片作空白對(duì)照，沒有任何條帶的擴(kuò)增；圖1b指從感病葉片提取DNA后用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，預(yù)期片段大小1186bp，其中帶1_15為感病葉片提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康葉片作空白對(duì)照，沒有任何條帶的擴(kuò)增；圖1c指從感病穂頸提取DNA后用ITS1/ITS4引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，其中帶1_15為感病穂頸提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康穂頸作空白對(duì)照，沒有任何條帶的擴(kuò)增；圖1d指從感病穂頸提取DNA后用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果，預(yù)期片段大小1186bp，其中帶1_15為感病穂頸提取的DNA擴(kuò)增結(jié)果，帶16為健康穂頸作空白對(duì)照，沒有任何條帶的擴(kuò)增。
[0036]實(shí)施例子2:玉米葉片上玉米灰斑病菌的DNA的提取和驗(yàn)證。
[0037]具體實(shí)施的方法:
[0038]I)試劑:提前配制以下試劑，滅菌后備用:(I)UOOmM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3、)IM KCl、(4) ,10% Tween 20。
[0039]2)樣品準(zhǔn)備:隨機(jī)分別選取從田間采集后室溫保存于實(shí)驗(yàn)室的典型發(fā)病的2個(gè)葉片，從發(fā)病的玉米灰斑病病斑上切取約2mmX 2mm大小的發(fā)病葉片，分別放置于PCR-96孔板中，每孔放置一個(gè)樣品。
[0040]3)提取液配制及應(yīng)用:根據(jù)提取樣品的數(shù)量，將10mM TrisHCl (pH8.7)、1mMEDTA (pH 8.0)和IM KCl各取500 μ L等體積混合，然后加入1.5 μ L 10%的Tween 20，混合均勻后在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液，并蓋上蓋子。如果有樣品漂浮，可用一次性吸頭或滅菌的牙簽將其壓入液體中。
[0041]4) DNA制備:(I)將上述處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理1min,之后儲(chǔ)存于-20攝氏度備用。
[0042]5)PCR反應(yīng):樣品檢測(cè)用擴(kuò)增病原真菌rDNA的ITS序列的I對(duì)通用引物進(jìn)行，擴(kuò)增片段大小約500bps，正向引物和反向引物序列分別為，ITSl:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC JCR反應(yīng)體系 20 μ L，包含:2XTaq MasterMix 10 μ L，正向引物及反向引物各I μ L，制備好的DNA模板I μ L，無菌雙蒸水6 μ L。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3min,然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，即95°C變性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循環(huán)結(jié)束后再延伸7min，然后將PCR產(chǎn)物放置于4°C ；PCR反應(yīng)在ClOOO上進(jìn)行(B1Rad)。
[0043]6)PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物每樣品取5 μ L在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳染色檢測(cè)。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0045]如圖2所示，利用感病葉片上的病斑提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功用擴(kuò)增真菌rDNA的ITS區(qū)段的I對(duì)引物(ITS1/ITS4)擴(kuò)增出預(yù)期片段大小約500bp的玉米灰斑病菌的DNA帶；
[0046]實(shí)施例子3:水稻葉片上水稻細(xì)菌性條斑病菌DNA的提取和驗(yàn)證。
[0047]具體實(shí)施的方法:
[0048]I)試劑:提前配制以下試劑，滅菌后備用:(I)UOOmM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3、)IM KCl、(4) ,10% Tween 20。
[0049]2)樣品準(zhǔn)備:隨機(jī)分別選取從田間采集后室溫保存于實(shí)驗(yàn)室的典型發(fā)病的2個(gè)葉片，從發(fā)病的水稻細(xì)菌性條斑病病斑上切取約2mmX2mm大小的發(fā)病葉片，分別放置于PCR-96孔板中，每孔放置一個(gè)樣品。
[0050]3)根據(jù)提取樣品的數(shù)量，將 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA (pH 8.0)和 IM KCl各取500 μ L等體積混合，然后加入1.5 μ L 10 %的Tween 20，混合均勻后在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液，并蓋上蓋子。如果有樣品漂浮，可用一次性吸頭或滅菌的牙簽將其壓入液體中，即可進(jìn)入下一步程序。
[0051]4) DNA制備:⑴將上述處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理lOmin，之后儲(chǔ)存于-20攝氏度備用。
[0052]5) PCR反應(yīng):樣品檢測(cè)用擴(kuò)增病原細(xì)菌16S rDNA的I對(duì)通用引物進(jìn)行，擴(kuò)增大小約
1.5kb，正向引物和反向引物分別及序列為，27F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG、1942R:ACGGCT ACC TTG TTA CGA CTT。PCR 反應(yīng)體系 20 μ L，包含:2 X Taq MasterMix 10yL，正向引物及反向引物各I μ L，制備好的DNA模板I μ L，無菌雙蒸水6 μ L。PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3min，然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，即95°C變性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循環(huán)結(jié)束后再延伸7min，然后將PCR產(chǎn)物放置于4°C ；PCR反應(yīng)在ClOOO上進(jìn)行(B1Rad)。
[0053]6)PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物每樣品取5 μ L在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳染色檢測(cè)。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0055]如圖3所示，利用感病葉片上的水稻細(xì)菌性條斑病的病斑提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，成功用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的I對(duì)通用引物(27F/1942R)擴(kuò)增出預(yù)期片段大小約1.5kb的水稻細(xì)菌性表斑病菌的帶。
[0056]我們通過比較實(shí)驗(yàn)，采用傳統(tǒng)的提取方法，雖然也可以獲得上述的結(jié)果，但是傳統(tǒng)的方法費(fèi)時(shí)、效率低、而且成本高，不利于大批量樣品的操作。
[0057]通過以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，利用本技術(shù)發(fā)明的方法，可成功從禾本科作物水稻和玉米感病組織中直接提取病原真菌和細(xì)菌的DNA用于分子檢測(cè)分析，提取的DNA能有效擴(kuò)增出超過1.5kb的DNA片段，可滿足一般檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的需要。
[0058]通過本技術(shù)發(fā)明，實(shí)現(xiàn)了(I)DNA提取的簡(jiǎn)易化:可從禾本科作物水稻和玉米上利用極少量的感病組織直接一步提取病菌DNA，無需傳統(tǒng)的多步處理，更加簡(jiǎn)易化；(2)DNA提取的高效化:由于僅一步處理即可完成DNA的提取，每人每天可完成500份以上病害標(biāo)樣的病原菌DNA提取，為病害的快速監(jiān)測(cè)、檢測(cè)與診斷提供了保障，而采用傳統(tǒng)的方法，每人每天只能完成20-50份病害標(biāo)樣的病原菌DNA提??；(3)試劑成本低，集約化:采用本方法所使用的4種試劑均為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)試劑，價(jià)格便宜，購(gòu)買方便，比商業(yè)購(gòu)買的試劑盒要便宜80%以上的價(jià)格；(4)設(shè)備要求簡(jiǎn)單化:無特殊的儀器設(shè)備需求，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的PCR儀或高壓滅菌鍋即可滿足實(shí)驗(yàn)。采用本方法可快速獲得大量檢測(cè)樣品的DNA，為快速開展病原菌群體遺傳多樣性、病原菌無毒基因檢測(cè)及新病害的快速分子診斷分析提供了重要技術(shù)支撐。
【權(quán)利要求】
1.一種從禾本科作物感病組織上直接提取病原菌DNA的方法，該方法包括: (1)、提前分別配制以下四種試劑，滅菌后備用:(I)10mM TrisHCl (pH8.7)、(2) 1mMEDTA(pH 8.0)、(3) IM KCl 和(4) 10% Tween 20 ； (2)、采集待檢測(cè)的禾本科作物感染病害的葉片或其它組織作為樣品，從發(fā)病的禾本科作物的葉片病斑上切取約2mmX2mm大小的葉片放置于PCR-96孔板中； (3)、根據(jù)樣品的數(shù)量，將步驟(I)中的10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA(pH8.0)和IM KCl各取適量等體積混合后，然后再根據(jù)3種混合液的總體積按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均勾后，在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液； (4)、將步驟(3)處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理lOmin，取出樣品放置于_20°C備用，或?qū)悠贩湃霛駸釡缇?，?05°C下處理lOmin，取出樣品放置于-20°C備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，PCR-96孔板可以被塑料試管或玻璃試管所代替。
3.一種從禾本科作物感病組織上直接提取病原菌DNA的方法，該方法由以下步驟組成: 1)、提前分別配制以下四種試劑，滅菌后備用“1)、10mMTrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3)、1M KCl 和(4)、10% Tween 20 ； 2)、采集待檢測(cè)的禾本科作物感染病害的葉片或其它組織作為樣品，從發(fā)病的禾本科作物的葉片病斑上切取約2mmX2mm大小的葉片放置于PCR-96孔板中； 3)、根據(jù)樣品的數(shù)量，將步驟(I)中的10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA(pH 8.0)和IM KCl各取適量等體積混合后，然后再根據(jù)3種混合液的總體積按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均勾后，在預(yù)先放入樣品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液； 4)、將上述處理好的樣品放入PCR儀，95°C加熱處理lOmin，取出樣品放置于-20 V備用，或?qū)悠贩湃霛駸釡缇?，?05°C下處理lOmin，取出樣品放置于-20°C備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，當(dāng)所述的禾本科作物為真菌或細(xì)菌引起的病害的時(shí)候，檢測(cè)的方法如下，真菌病害:將提取感染病害的樣品的DNA用檢測(cè)真菌rDNA的ITS區(qū)段的I對(duì)通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小約500bps，正向引物和反向引物名稱和序列分別為，ITSl:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGATAT GC;當(dāng)禾本科為水稻葉片的稻瘟病菌DNA檢測(cè)時(shí)，用檢測(cè)稻瘟病菌無毒基因AvrPizt的特異引物進(jìn)行，擴(kuò)增片段大小為1186bps,正向引物和反向引物名稱及序列分別為，AvrPizt-1Fw:AAGCGT CAC AAA ATA TCA TCA AGT, AvrPizt-1Rv: CGG CTA CCA TCGAGA AAA GT ;當(dāng)禾本科為水稻葉片的細(xì)菌病害:將提取感染病害的樣品的DNA用檢測(cè)細(xì)菌16S rDNA的I對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約1.5kb，正向引物和反向引物分別及序列為，27F: AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG、1942R:ACG GCT ACCTTG TTA CGA CTT ;PCR 反應(yīng)體系 20 μ L，包含:2 X Taq MasterMix 10 μ L，正向引物及反向引物各I μ L (引物濃度10 μ Μ)，制備好的DNA模板I μ L，無菌雙蒸水6 μ L ；PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3min，然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，即95°C變性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循環(huán)結(jié)束后再延伸7min，然后將PCR產(chǎn)物放置于4°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其中禾本科植物病害為水稻的稻瘟病，玉米的葉片上的玉米灰斑病或者水稻葉片上的水稻細(xì)菌性條斑病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其中禾本科作物組織樣品為水稻葉片和穂頸上的稻瘟病病斑；玉米的葉片上玉米灰斑病病斑或者水稻葉片上水稻細(xì)菌性條斑病斑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，當(dāng)禾本科作物組織樣品為水稻穂頸上的稻瘟病病斑時(shí)，從水稻穂頸上取l_2mm長(zhǎng)的發(fā)病穂頸放置于所述的PCR-96孔板中。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104498474SQ201410674584
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月23日
【發(fā)明者】董麗英, 楊勤忠, 劉樹芳, 徐鵬, 李靜 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所