一種鑒別飼料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的核苷酸序列和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的試劑盒和寡核苷酸，具體涉及一組鑒別羊肉骨粉成分的寡核苷酸，見序列表SEQ ID No.3至SEQ ID No.4所示的寡核苷酸序列，及含有這些寡核苷酸的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明所述的試劑盒靈敏度高、特異性強、成本低、操作簡便。
【專利說明】-種鑒別飼料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的核苷酸序列和 方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗檢疫和生物【技術(shù)領域】，具體地說，涉及一種鑒別飼料中羊乳成分 和羊肉骨粉成分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 羊癢病是與瘋牛病密切相關的一類動物傳染病。為防止羊癢病通過相關產(chǎn)品的貿(mào) 易傳入我國，我國頒布了貿(mào)易禁令對該病進行防控。1996年7月，我國農(nóng)業(yè)部就發(fā)布了《關 于嚴防癢病傳入我國的通知（農(nóng)檢疫發(fā)〔1996〕7號）》，規(guī)定"禁止從上述有癢病的國家口 (包括直接進口和轉(zhuǎn)口）羊、羊胚胎、羊精液、羊內(nèi)臟（含腸衣）及其制品、肉骨粉、骨粉、羊 月旨（油）以及含有羊蛋白的動物飼料等"。
[0003] 飼料和飼料添加劑生產(chǎn)中可能添加的來源于牛羊的原料包括：肉粉、骨粉、血液及 其制品、內(nèi)臟及其制品、奶及其制品。在這些可能原料中，除奶及其制品是允許在進口飼料 及添加劑中存在的之外，其它成分都是不允許添加的。
[0004] 目前國內(nèi)外對于同一種屬不同組織成分來源的鑒別研究還比較少，主要有酶聯(lián)免 疫吸附法（ELISA)、氯仿分離后PCR檢測法、水和次氯酸鈉洗滌后PCR檢測法，這些方法的使 用范圍很窄，且特異性不高，因此也很少在實際中應用。目前我國對進口動物飼料和飼料添 加劑的把關主要采用普通PCR方法或?qū)崟r熒光PCR方法對飼料中是否含有羊源性成分進行 檢測，但這類方法是對種屬來源進行鑒別，無法對成分的組織來源進行鑒別和區(qū)分，即無法 區(qū)分其中添加的是允許添加的乳源性成分，還是加入了貿(mào)易禁令范圍內(nèi)的組織成分。本技 術(shù)建立的是一種可以對飼料中的羊源性成分進行組織來源鑒別的檢測方法，對飼料中貿(mào)易 禁令范圍內(nèi)和范圍外的羊源性組織成分進行鑒別，滿足進境飼料和飼料添加劑中羊癢病危 險物質(zhì)檢測的需要，以實現(xiàn)科學、有效的執(zhí)法把關，同時也可用來規(guī)范我國的飼料生產(chǎn)，保 障畜產(chǎn)品安全和人民生命健康。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種用于鑒別羊肉骨粉成分的寡核苷酸。
[0006] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的用 于鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種鑒別飼料中羊肉骨粉成分的方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了用于鑒別羊肉骨粉成分的組織標的物：羊骨粘連蛋白mRNA的一段 117bp的核糖核酸序列（第309位-第425位），其具有如序列表SEQ ID No. 1所示的堿基 序列。
[0010] 5 ' -CCCCAUCGGCGA⑶UUGAGAAGGUGUGCAGCAAUGACAACAAGACCUUCGACUCUUCCUGCCACUU CUUUGCCACCAAGUGCACACUGGAGGGCACCAAGAAGGGCCACAAGCUCCA-3，
[0011] 其中，羊骨粘連蛋白對應的堿基序列如SEQ ID No. 2所示。
[0012] 根據(jù)上述選取的羊骨粘連蛋白的mRNA序列，本發(fā)明提供了一組用于鑒別羊肉骨 粉成分的寡核苷酸，其具有SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的堿基序列，具體序列如下：
[0013] 上游引物序列：5' -CCCCATCGGCGAGTTTGA-3'（SEQ ID No. 3)
[0014] 下游引物序列：5' -TGGAGCTTGTGGCCCTTC-3'（SEQ ID No. 4)
[0015] 本發(fā)明還提供了一種靈敏度高、特異性強、操作簡便的鑒別羊肉骨粉成分的試劑 盒，包括以下試劑：
[0016] I) RT-PCR反應液，其包括：
[0017] 上游引物、下游引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer ;
[0018] 其中，上游引物和下游引物分別是SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序 列；
[0019] 進一步地，本發(fā)明所用的逆轉(zhuǎn)錄酶通常為商品化試劑，例如PrimeScript? RT Enzyme Mix II，購自Takara公司；本發(fā)明所用的Taq聚合酶通常為商品化試劑，例如 TaKaRa Ex Taq? HS (5U/ μ 1)，購自 Takara 公司；本發(fā)明所用的 RT-PCR buffer 通常為 商品化試劑，例如 2 X One Step SYBR? RT-PCR Buffer III，購自 Takara 公司。
[0020] 2) RNase Free dH20 ；
[0021] 3)陰性對照，所述陰性對照為從羊乳中提取的總RNA ;
[0022] 4)陽性對照，所述陽性對照為從羊肉骨粉中提取的總RNA。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種鑒別羊肉骨粉成分的試劑盒的使用方法，該方法基于羊骨粘 連蛋白的mRNA片段序列，并以其作為目標片段設計特異性引物、通過實時熒光RT-PCR鑒別 飼料中羊肉骨粉成分，包括以下步驟：
[0024] 1)取待測樣品研磨，提取總RNA ;
[0025] 其中，提取總RNA是按照Trizol法或商品化試劑方法等總RNA提取方法來進行提 取的；
[0026] 2)進行熒光RT-PCR擴增，其中使用的引物為序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 所示的上、下游引物；該反應體系按照一步法反應體系配制，具體組分及配比見表1 :
[0027] 表1實時熒光RT_PCR反應體系組分及配比（總體積20 μ 1)
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一組用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列由SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸在制備用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的試劑盒中的 應用。
3. -種用于鑒別飼料中羊肉骨粉成分的試劑盒，其特征在于，由以下組分組成： 1. RT-PCR反應液，其包括：上游引物、下游引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer ； 其中，上游引物和下游引物分別是SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列； 2. RNase Free dH20 ； 3) 陰性對照； 4) 陽性對照。
4. 一種鑒別飼料中羊肉骨粉成分的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取待測樣品，提取總RNA ; 2) 進行實時熒光RT-PCR擴增，并繪制擴增曲線和溶解曲線，其中使用的引物為序列表 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物； 3) 結(jié)果判定： 陰性檢測結(jié)果：樣品在82°C處未出現(xiàn)溶解峰，則判定樣品中不含有羊肉骨粉成分。 陽性檢測結(jié)果：樣品在82°C處出現(xiàn)溶解峰，則判定樣品中含有羊肉骨粉成分。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313022SQ201410592070
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】李冰玲, 馬貴平, 高志強, 劉全國, 李炎鑫, 蒲靜, 史喜菊 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局