使用生長因子組合的骨髓干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞之骨生成分化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cell，BMSC)或間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)之骨生成分化的方法，特別是使用人血漿或血清以及FGF和TGFB生長因子。本發(fā)明還提供了由此獲得的細(xì)胞和細(xì)胞群，以及包含它們的進(jìn)一步產(chǎn)物及其在骨治療中的用途。
【專利說明】使用生長因子組合的骨髓干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞之骨生成 分化
[0001] 本申請(qǐng)是中國專利申請(qǐng)200980105172. 2的分案，后者是2009年1月9日提交的 PCT申請(qǐng)PCT/EP2009/050209于2010年8月13日進(jìn)入中國國家階段的申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cell, BMSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell, MSC)的骨生成分化方法，涉及可由所述方法獲得的細(xì)胞和細(xì)胞 群，還涉及其用途特別是在骨治療領(lǐng)域中的用途。

【背景技術(shù)】
[0003] 移植能夠進(jìn)行骨生成分化的干細(xì)胞或者定向于骨生成分化的細(xì)胞是治療骨相關(guān) 疾?。ㄌ貏e是當(dāng)所述治療需要新骨產(chǎn)生時(shí)）的有前景的途徑。
[0004] 先前已使用骨髓干細(xì)胞（BMSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)治療骨疾?。℅angji等， 2005, Expert Opin Biol Ther 5:437-42)。然而，盡管可以將這些相對(duì)未分化的干細(xì)胞進(jìn) 行移植，但是它們并不定向分化為骨生成譜系，因此這樣移植的干細(xì)胞中有相當(dāng)大的比例 最終可能不會(huì)形成期望的骨組織。
[0005] 而且，可從骨髓或其它來源組織獲得的這些干細(xì)胞的量常常不能令人滿意并且在 多種環(huán)境下還可能減少，例如由使用糖皮質(zhì)激素或?yàn)E用酒精或遺傳原因所致。
[0006] W0 2007/093431公開了一種使分離的BMSC或MSC在體外充分?jǐn)U增并獲得已顯示 出成骨表型之細(xì)胞的方法。在所述方法中，人BMSC或MSC在血清或血漿以及堿性成纖維細(xì) 胞生長因子（FGF)存在下培養(yǎng)。W0 2007/093431未教導(dǎo)使用特定的FGF和TGF生長因子組 合用于獲得成骨細(xì)胞并且未提示其任何優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 需要另外的簡單可靠的方法用于從BMSC和MSC產(chǎn)生可用的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或 成骨細(xì)胞表型細(xì)胞。特別期望這些方法可實(shí)現(xiàn)更大程度的細(xì)胞擴(kuò)增和/或產(chǎn)生具有額外有 利性質(zhì)的細(xì)胞，例如在同種異體對(duì)象中導(dǎo)致較低組織排斥的細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供這樣的方法以及由此獲得的成骨細(xì)胞表型細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在血清或血漿、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)以及轉(zhuǎn)化生長因子 β (TGFB)存在下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，成體干細(xì)胞（更具體地，骨髓干細(xì)胞（BMSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC))的擴(kuò)增潛力可在骨生成分化后大大增加，由此可實(shí)現(xiàn)可用的骨原細(xì)胞或成骨細(xì)胞表 型細(xì)胞及細(xì)胞群的數(shù)量增加。
[0010] 因此，在一方面中，本發(fā)明提供了用于從人骨髓干細(xì)胞（BMSC)或人間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)體外或離體獲得骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的方法，包括使所述BMSC 或MSC與人血漿或血清、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)或者其生物活性變體或衍生物、以及轉(zhuǎn) 化生長因子β (TGFB)或者其生物活性變體或衍生物相接觸。 toon] 本發(fā)明的方法可以將顯著部分（例如大多數(shù)）的經(jīng)處理干細(xì)胞向骨原細(xì)胞或成骨 細(xì)胞表型分化。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明的方法可用于獲得骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨 細(xì)胞表型細(xì)胞本身。
[0012] 然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法通?？僧a(chǎn)生骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì) 胞占顯著部分（例如大多數(shù)）的細(xì)胞群。這樣的細(xì)胞群任選地可包含其它細(xì)胞類型。
[0013] 因此，在一方面中，本發(fā)明涉及用于從人BMSC或人MSC體外或離體獲得包含骨原 細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞之細(xì)胞群的方法，包括使所述BMSC或MSC與人血漿或 血清、FGF或者其生物活性變體或衍生物、以及TGFB或者其生物活性變體或衍生物相接觸。
[0014] 本發(fā)明方法允許產(chǎn)生用于移植目的的大量骨生成細(xì)胞。這使得進(jìn)一步減少了為獲 得初始BMSC或MSC細(xì)胞而需要從對(duì)象取出的組織的量。其還允許從對(duì)象中獲得具有減少 的BMSC或MSC細(xì)胞數(shù)的足夠量的骨生成細(xì)胞。同時(shí)，所述方法使得縮短了經(jīng)分化細(xì)胞可移 植進(jìn)患者的時(shí)間，因此導(dǎo)致治療更快捷。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的上述方法可包括以下步驟：
[0016] (a)從包含BMSC或MSC的人對(duì)象生物樣品中回收細(xì)胞；
[0017] (b)任選地，從（a)中回收的細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞；
[0018] (c)將（a)或（b)的細(xì)胞添加至包含人血漿或血清、FGF或者其生物活性變體或衍 生物以及TGFB或者其生物活性變體或衍生物的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)該細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物，從 而使細(xì)胞貼附至基底表面；
[0019] (d)除去未貼附物，并繼續(xù)在（c)中所限定之培養(yǎng)基中培養(yǎng)貼附細(xì)胞，從而獲得骨 原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0020] 在上述任一方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可將BMSC或MSC細(xì)胞同時(shí)暴露于FGF和 TGFB，或者暴露于其生物活性變體或衍生物。
[0021] 在上述任一方法的另一些實(shí)施方案中，所述人血漿或血清可以與所述BMSC或MSC 細(xì)胞是自體的，或者其可以與所述BMSC或MSC細(xì)胞是同種異體的（同源的）。
[0022] 在上述任一方法的另一些實(shí)施方案中，在所述BMSC或MSC細(xì)胞的培養(yǎng)中不使用非 人動(dòng)物材料（例如，血清組分）。這降低了培養(yǎng)細(xì)胞在人體中異種排斥的風(fēng)險(xiǎn)，以及降低了 病原體污染患者的風(fēng)險(xiǎn)。
[0023] 上述方法的另一些優(yōu)選實(shí)施方案還涉及例如但不限于孵育時(shí)間、傳代、組分量等 的特征，這些特征單獨(dú)地或組合起來還構(gòu)成提供本發(fā)明之細(xì)胞和細(xì)胞群的基礎(chǔ)。
[0024] 本發(fā)明人還出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明方法獲得的成骨細(xì)胞表型細(xì)胞中HLA-DR 主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)比使用W0 2007/093431之方法觀察到的HLA-DR表達(dá)顯著 更低。這樣更低的HLA-DR表達(dá)可增強(qiáng)本發(fā)明獲得之成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的免疫豁免特性 (immunoprivileged character)，從而降低這些細(xì)胞的排斥風(fēng)險(xiǎn)并使其還能更廣泛地用于 同種異體患者中。
[0025] 因此，本發(fā)明還提供了與現(xiàn)有技術(shù)相比表現(xiàn)出新的有利特性的成骨細(xì)胞表型細(xì) 胞。因而，本發(fā)明的一些方面提供了通過本發(fā)明方法可獲得或直接獲得的骨原細(xì)胞、成骨細(xì) 胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞以及包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0026] 本發(fā)明人還對(duì)本發(fā)明得到的成骨細(xì)胞進(jìn)行了分析，定義了包含這些細(xì)胞的新細(xì)胞 類型和細(xì)胞群，其可為治療（特別是骨移植治療）提供特別的優(yōu)越性。
[0027] 因此，在一方面中，本發(fā)明提供了具有如下特征的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì) 胞表型細(xì)胞以及包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，所述細(xì)胞（1)包含⑶90、⑶105、⑶73、⑶63、⑶166 和堿性磷酸酶（ALP)(更具體地為骨-肝-腎型ALP)的表達(dá)，（2)不表達(dá)⑶45、⑶14、⑶19， 以及（3)少于25%的細(xì)胞、優(yōu)選地少于20%的細(xì)胞以及更優(yōu)選地少于15%的細(xì)胞（例如少 于10%的細(xì)胞或少于7%的細(xì)胞）表達(dá)HLA-DR(即，相當(dāng)大比例的細(xì)胞不表達(dá)HLA-DR)。
[0028] 如上提及，本發(fā)明還涉及包含本文所定義之骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型 細(xì)胞的細(xì)胞群。示例性的細(xì)胞群可包含至少10 %、優(yōu)選地至少30 %、更優(yōu)選地至少50 % (例 如至少60% )、更優(yōu)選地至少70% (例如至少80% )、甚至更優(yōu)選地至少90% (例如至少 95%)的如本文所定義的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞群可包 含少于50%、優(yōu)選地少于40%、更優(yōu)選地少于30%、更優(yōu)選地少于20%以及更優(yōu)選地少于 10% (例如少于7%、少于5%或少于2%)的除本文所定義之骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì) 胞表型細(xì)胞之外的其它細(xì)胞類型。
[0029] 如本發(fā)明所教導(dǎo)地，相關(guān)方面涉及骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者 包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群在骨相關(guān)疾病中的治療性用途以及包含所述細(xì)胞或細(xì)胞群的相應(yīng) 藥物制劑。
[0030] 本發(fā)明的這些及其它特征在下文和所附權(quán)利要求中進(jìn)一步得到解釋，并通過非限 制性的實(shí)例進(jìn)行說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1顯示在含有血漿和10ng/ml TGFB-1或者含有血漿和10ng/ml FGF2及10ng/ ml TGFB-1 (η = 4)的培養(yǎng)基中得到的成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)物的箱線圖比較。
[0032] 圖2顯示在補(bǔ)充有或未補(bǔ)充10ng/ml TGFb-Ι的培養(yǎng)基中得到的成骨細(xì)胞培養(yǎng)物 之比較。（A)原代培養(yǎng)物，（B)繼代培養(yǎng)物，（C)全體。
[0033] 圖3顯示在（A)僅FGF2或（B) FGF2及TGFb-Ι存在下所培養(yǎng)細(xì)胞的礦化情況，其 通過基質(zhì)茜素紅（alizarin red)染色來測定。
[0034] 圖4示意在TGFb-l/FGF2中培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)經(jīng)PHA刺激之PBMC的免疫抑制作用。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 本文使用的無數(shù)量詞修飾形式包括單數(shù)和復(fù)數(shù)含義，除非上下文另有指明。例如， "細(xì)胞"是指一種（個(gè)）或多種（個(gè)）細(xì)胞。
[0036] 本文所用的術(shù)語"包含"與"包括"或"含有"是同義詞，并且為開放式的，不排除另 外的未記述之成員、要件或方法步驟。
[0037] 由端點(diǎn)記載的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)涵蓋的所有數(shù)字和分?jǐn)?shù)以及所述端點(diǎn)。
[0038] 當(dāng)涉及可測量值例如參數(shù)、數(shù)量、持續(xù)時(shí)間等時(shí)，本文所用的術(shù)語"約"，意在包括 從指定值變化+/-10 %或更少、優(yōu)選地+/_5 %或更少、更優(yōu)選地+/-1 %或更少以及更優(yōu)選 地+/-0. 1 %或更少，在該變化范圍內(nèi)適于進(jìn)行本發(fā)明公開內(nèi)容。應(yīng)理解，修飾詞"約"所指 的值本身也是具體且優(yōu)選公開的值。
[0039] 本說明書中引用的所有文獻(xiàn)均通過引用以整體并入本文中。特別地，本文中具體 指出的所有文獻(xiàn)之教導(dǎo)通過引用并入本文中。
[0040] 除非另有定義，本發(fā)明公開使用的所有術(shù)語（包括技術(shù)和科學(xué)術(shù)語）具有本發(fā)明 所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解的含義。
[0041] 1.發(fā)明方法
[0042] 如概述部分中所詳述地，在一方面中，本發(fā)明涉及用于從人骨髓干細(xì)胞體外或離 體獲得骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的方法，以及用于從人骨髓干細(xì)胞體外或 離體獲得包含骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。
[0043] 如本文所用地，所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞一般包括可有助于 形成骨材料或骨基質(zhì)的細(xì)胞或者能夠發(fā)育成可有助于形成骨材料或骨基質(zhì)之細(xì)胞的細(xì)胞。 特別地，本發(fā)明的方法得到可用于在治療背景下恢復(fù)骨形成的細(xì)胞和細(xì)胞群，如本發(fā)明人 通過實(shí)驗(yàn)所證實(shí)地。因此，所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞應(yīng)理解為希望涵蓋 由本發(fā)明方法得到的任何可如此應(yīng)用的骨生成譜系細(xì)胞。
[0044] 骨髓是占據(jù)長骨髓腔、某些哈弗管以及松質(zhì)骨（cancellous bone)或海綿骨 (spongy bone)之骨小梁之間空間的軟組織。該術(shù)語特別地但非限制性地涵蓋紅骨髓（其 發(fā)現(xiàn)于幼年的所有骨中和成年的有限位置（例如在海綿骨中）中）以及黃骨髓。
[0045] 總的來說，骨髓是包含造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞和白細(xì)胞及其前體、間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)、間質(zhì)細(xì)胞（stromal cell)及其前體以及包括成纖維細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞在 內(nèi)的一組細(xì)胞和形成結(jié)締組織網(wǎng)絡(luò)（稱為"間質(zhì)（stroma)"）之細(xì)胞等的復(fù)雜組織。
[0046] 在小鼠和人中進(jìn)行全身移植后，骨髓細(xì)胞有助于形成多種不同的組織。這種能力 可反映出骨髓中存在多種干細(xì)胞（例如，造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和/或骨髓多能干細(xì) 胞）的活性。
[0047] 因此，本文使用的術(shù)語"骨髓干細(xì)胞"或"BMSC"是指存在于骨髓中的任何成體干 細(xì)胞，以及特別地存在于或（部分地）分離自骨髓樣品的任何成體干細(xì)胞。骨髓（BMSC)樣 品可從例如對(duì)象的髂嵴、股骨、脛骨、脊柱、肋骨或另一些髓質(zhì)空間獲得。術(shù)語BMSC還包括 BMSC的后代，例如從對(duì)象之樣品獲得的BMSC經(jīng)體外或離體增殖而得到的BMSC后代。
[0048] 涉及特定組分時(shí)，術(shù)語"分離"表示將該組分與待分離該組分之組合物中至少一種 另外組分相分離。本文使用的與任意細(xì)胞群有關(guān)的"分離的"也暗指這些細(xì)胞群不形成動(dòng) 物體或人體的一部分。
[0049] 術(shù)語"干細(xì)胞"一般是指未特化或相對(duì)低特化并且能增殖的細(xì)胞，其能夠自我更 新，即可進(jìn)行增殖但不分化，并且其或其后代可產(chǎn)生至少一種相對(duì)更特化的細(xì)胞類型。該術(shù) 語涵蓋了能夠基本上無限自我更新的干細(xì)胞（即，其中干細(xì)胞的后代或其至少一部分基本 上保留了親本干細(xì)胞的未特化或相對(duì)低特化的表型、分化潛力和增殖能力）以及顯示出有 限自我更新的干細(xì)胞（即，與親本細(xì)胞相比，其中后代或其一部分的進(jìn)一步增殖和/或分化 的能力可被證明降低）。例如但非限制性地，干細(xì)胞可產(chǎn)生可沿一個(gè)或多個(gè)譜系分化以產(chǎn)生 逐漸相對(duì)更特化之細(xì)胞的后代，其中這些后代和/或逐漸相對(duì)更特化的細(xì)胞本身可以為本 文所定義的干細(xì)胞，或者產(chǎn)生終末分化的細(xì)胞（即，完全特化的細(xì)胞，其可以是終末分化的 (post-mitotic))〇
[0050] 本文使用的術(shù)語"成體干細(xì)胞"是指存在于或獲得自（例如，分離自）胎兒期或出 生后之生物體的干細(xì)胞。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的骨髓干細(xì)胞具有產(chǎn)生至少骨生成（骨）譜系之細(xì)胞（例如骨 生成細(xì)胞和/或骨原細(xì)胞和/或前成骨細(xì)胞和/或成骨細(xì)胞和/或骨細(xì)胞等）的潛力。
[0052] 優(yōu)選地，本發(fā)明的至少某些骨髓干細(xì)胞還可具有產(chǎn)生包含在本發(fā)明方法所得細(xì)胞 群中的另一些細(xì)胞（例如內(nèi)皮譜系的細(xì)胞，例如內(nèi)皮祖細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞）的潛能。
[0053] 例如但非限制性地，具有產(chǎn)生至少骨生成譜系細(xì)胞之潛力的BMSC類型為間充質(zhì) 干細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"間充質(zhì)干細(xì)胞"或"MSC"是指中胚層來源的成體干細(xì)胞，其能夠 產(chǎn)生間充質(zhì)譜系（通常為兩種或更多種間充質(zhì)譜系，例如骨細(xì)胞譜系（骨）、軟骨細(xì)胞譜系 (軟骨）、肌細(xì)胞譜系（肌肉）、腱細(xì)胞譜系（腱）、成纖維細(xì)胞譜系（結(jié)締組織）、脂肪細(xì)胞譜 系（脂肪）和間質(zhì)生成譜系（骨髓間質(zhì)））的細(xì)胞。MSC可分離自例如骨髓、血液、臍帶、胎盤、 胎兒卵黃囊、皮膚（真皮）（特別是胎兒和青少年的皮膚）、骨膜和脂肪組織。人MSC、其分 離、體外擴(kuò)增以及分化已經(jīng)描述在例如美國專利No. 5, 486, 359、美國專利No. 5, 811，094、 美國專利No. 5, 736, 396、美國專利No. 5, 837, 539或美國專利No. 5, 827, 740中。本領(lǐng)域中 描述的任何MSC以及通過本領(lǐng)域所述任意方法分離的任何MSC均適用于本發(fā)明，只要這些 MSC能夠產(chǎn)生至少骨細(xì)胞（骨）譜系的細(xì)胞即可。
[0054] 術(shù)語"MSC"還涵蓋了 MSC的后代，例如，從動(dòng)物或人對(duì)象的生物樣品獲得的MSC經(jīng) 體外或離體增殖而得到的后代。
[0055] 可能但非限性地，至少某些MSC還可以能夠產(chǎn)生包含在本發(fā)明方法所得細(xì)胞群中 的另一些細(xì)胞。
[0056] 如實(shí)施例中所示，本發(fā)明的方法涉及選擇在特定培養(yǎng)條件下貼附于基底表面的 BMSC細(xì)胞。本領(lǐng)域已知，可以通過選擇可貼附于基底表面（例如，塑料表面）的（單個(gè)核） 細(xì)胞來從骨髓（或其它來源）分離MSC。因此，不受任何假設(shè)的限制，本發(fā)明人推測在本方 法中MSC可至少部分地有助于從BMSC獲得成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞。
[0057] 因此，在一方面中，本發(fā)明還涉及用于從人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)體外或離體獲得 骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的方法，包括使所述MSC細(xì)胞與人血漿或血清、 FGF或其生物活性變體或衍生物以及TGFB或其生物活性變體或衍生物接觸。
[0058] MSC可包含在生物樣品中（例如，在包含BMSC樣品中），或者可至少部分地從其 分離，如本領(lǐng)域已知地。而且，MSC可至少部分地分離自骨髓或者分離自除骨髓以外的包含 MSC之任何合適來源，例如血液、臍帶、胎盤、胎兒卵黃囊、皮膚（真皮）（特別是胎兒和青少 年的皮膚）、骨膜和脂肪組織。
[0059] BMSC細(xì)胞旨在涵蓋其任意或所有亞型，例如但不限于"快速自我更新細(xì)胞" RS-1 或 RS-2(如 Colter 等，2000(PNAS 97(7) :3213-8)中所述）、"側(cè)群細(xì)胞"(side population， SP)(如 Goodell 等，1997 (Nat Med 3(12) :1337-45 中所述）、骨生成前體（osteogenic precursor, OP)細(xì)胞（其最初由于其低密度（例如通過密度梯度離心來實(shí)現(xiàn)）、不貼附性質(zhì) 和低水平表達(dá)骨生成標(biāo)志物而被鑒定出來，如Long等，1995. J Clin Invest. 95(2) :881-7 和美國5, 972, 703中所述）、原始的前體細(xì)胞（其可以產(chǎn)生造血和非造血譜系的細(xì)胞，如 Krause 等，2001(Cell 105 :369-377)和 Dominici 等，2004(PNAS 101(32) :11761-6)中所 述）等。
[0060] 應(yīng)理解，鑒于骨髓干細(xì)胞群的復(fù)雜性，本發(fā)明不應(yīng)被限制于一種或多種特定的 BMSC類型。相反，在本發(fā)明的方法中，一種或多種BMSC細(xì)胞類型（例如，如上所述的細(xì)胞類 型）可有助于（可能以不同的程度）獲得骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞表型細(xì)胞，或者有 助于獲得包含上述細(xì)胞的細(xì)胞群。另一方面，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法還可利用特定的BMSC 群，例如，至少部分地分離自其它BMSC群的MSC。
[0061] 術(shù)語"體外" 一般表示在動(dòng)物體或人體的外面或外部。術(shù)語"離體"通常是指組織 或細(xì)胞從動(dòng)物體或人體取出并在機(jī)體外（例如，在培養(yǎng)容器中）維持或增殖。本文使用的 術(shù)語"體外"應(yīng)當(dāng)理解為包括"離體"。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，BMSC或MSC從對(duì)象的生物樣品中獲得。
[0063] 本文使用的術(shù)語"對(duì)象"是指動(dòng)物，更特別地是指非人哺乳動(dòng)物和人。非人動(dòng)物對(duì) 象還可包括動(dòng)物的出生前形式，例如胚胎或胎兒。人對(duì)象也可包括胎兒，但優(yōu)選不包括胚 胎。人對(duì)象是優(yōu)選的。
[0064] 本文使用的術(shù)語"生物樣品"或"樣品" 一般是指從生物來源獲得的樣品，例如從 生物體、器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物等獲得的樣品。動(dòng)物或人對(duì)象的生物樣品是指從動(dòng)物或人 對(duì)象取出并包含其細(xì)胞的樣品。動(dòng)物或人對(duì)象的生物樣品可包括一種或多種組織類型以及 一種或多種組織類型的細(xì)胞。獲得動(dòng)物或人對(duì)象之生物樣品的方法是本領(lǐng)域公知的，例如 組織活檢或取血。
[0065] 對(duì)象的可用生物樣品包括其BMSC或MSC。這些樣品通?？蓮墓撬璜@得，例如從對(duì) 象的髂嵴、股骨、脛骨、脊柱、肋骨或其它髓質(zhì)空間獲得。另外的包含MSC的可用生物樣品例 如可以源自對(duì)象的血液、臍帶、胎盤、胎兒卵黃囊、皮膚（真皮）（特別是胎兒和青少年的皮 膚）、骨膜或脂肪組織。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方案中，BMSC或MSC可從健康對(duì)象獲得，這可有助于確保從所述BMSC 或MSC獲得之成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的功能性。
[0067] 在另一實(shí)施方案中，BMSC或MSC可從如下對(duì)象中獲得，所述對(duì)象具有骨相關(guān)疾病 的風(fēng)險(xiǎn)或患有骨相關(guān)疾病，并且可因而特別地受益于施用根據(jù)本發(fā)明方法從所述BMSC或 MSC獲得的成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞。
[0068] 本文使用的術(shù)語"骨相關(guān)疾病"是指任何類型的骨疾病，對(duì)其的治療可受益于向患 有該疾病之對(duì)象施用骨生成譜系細(xì)胞（例如骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞）。特 別地，這些疾病可表征為例如：骨形成降低或過度的骨吸收，骨中存在的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞 的數(shù)目、生存力或功能降低，對(duì)象中的骨量降低，骨薄，骨強(qiáng)度或骨彈性降低等。
[0069] 例如而非限制性地，可受益于施用本發(fā)明之成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的骨相 關(guān)疾病可包括局部或全身性的疾病，例如任意類型的骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)減少（例如原發(fā)的、 絕經(jīng)后的、老年性的、腎上腺皮質(zhì)激素誘發(fā)的、任何繼發(fā)的、單部位或多部位的骨壞死）、 任意類型的骨折（例如不愈合的、不良愈合的、延遲愈合的骨折或壓迫性骨折）、需要骨 融合的情況（例如，脊柱融合以及重建、頜面骨折、骨重建（例如，在外傷性損傷或癌癥手 術(shù)后的骨重建）、頡面骨重建）、成骨不全、溶骨性骨癌、佩吉特病（Paget's Disease)、內(nèi) 分泌疾病、低磷酸血癥、低鈣血癥、腎性骨營養(yǎng)不良、骨軟化、無力性骨疾病、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、牙周病、 Gorham-Stout 病和麥-阿綜合征（McCune-Albright syndrome)。
[0070] 在本發(fā)明的方法中，將BMSC或MSC與人血漿或血清、FGF或者其生物活性變體或 衍生物以及TGFB或者其生物活性變體或衍生物相接觸。
[0071] 本文使用的術(shù)語"接觸"意指將一種或多種分子、組分或材料與另一分子、組分或 材料直接地或間接地拉攏在一起，從而促進(jìn)它們之間的相互作用。通常，可通過將生長因子 或者其生物活性變體或衍生物以及人血漿或血清包含在培養(yǎng)BMSC的培養(yǎng)基中，從而使它 們與所述BMSC相接觸。
[0072] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，人血漿和血清是復(fù)雜的生物組合物，其可包含一種或多 種生長因子、細(xì)胞因子或激素。因此，還提供了除外源加入或補(bǔ)充到血漿或血清中以外的所 述生長因子FGF和TGFB或者它們各自的生物活性變體或衍生物。
[0073] 在另一實(shí)施方案中，除了 FGF和TGFB以外，BMSC或MSC還可以與一種或多種外源 加入的其它生長因子（除FGF和TFGB以外）相接觸。本文使用的術(shù)語"生長因子"是指這 樣的生物活性物質(zhì)，其影響不同細(xì)胞類型的增殖、生長、分化、存活和/或遷移并且可影響 生物體的發(fā)育變化、形態(tài)變化和功能變化，其單獨(dú)地或被其它物質(zhì)調(diào)節(jié)而起作用。生長因 子通?？勺鳛榕潴w通過與細(xì)胞中存在的響應(yīng)于該生長因子的受體（例如，表面或細(xì)胞內(nèi)受 體）結(jié)合來起作用。特別地，本文中的生長因子可以是包含一個(gè)或多個(gè)多肽鏈的蛋白質(zhì)實(shí) 體。
[0074] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的任何一種或多種或所有生長因子 (泛指本文使用的生長因子，特別地涵蓋FGF和TGFB生長因子以及任選地一種或多種另外 的生長因子）均為人生長因子。本文使用的術(shù)語"人生長因子"是指與天然的人生長因子 基本上相同的生長因子。例如，當(dāng)所述生長因子是蛋白質(zhì)實(shí)體時(shí)，其組成肽或多肽可具有與 天然的人生長因子一致的一級(jí)氨基酸序列。在本發(fā)明方法中使用人生長因子是優(yōu)選的，由 此預(yù)計(jì)生長因子對(duì)人的細(xì)胞功能具有期望的作用。
[0075] 術(shù)語"天然的"用于描述可在自然界中發(fā)現(xiàn)的物體或?qū)嶓w，其與人工制備的有實(shí)質(zhì) 性區(qū)別。例如，生物體中存在的多肽序列（其可從天然來源中分離并且未在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行 人為修飾）是天然的。當(dāng)涉及特定實(shí)體（例如，多肽或蛋白質(zhì)）時(shí)，該術(shù)語涵蓋天然存在的 其所有形式和變體，例如由于物種間和個(gè)體間的正常變異導(dǎo)致的形式和變體。例如，當(dāng)涉及 蛋白質(zhì)生長因子時(shí)，術(shù)語"天然的"涵蓋這樣的生長因子，其在其組成肽或多肽的一級(jí)序列 中具有由于物種間的遺傳趨異和個(gè)體間的正常等位基因變異所導(dǎo)致的差異。
[0076] 本文使用的術(shù)語"FGF"涵蓋成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)家族之生長因子的任何及 所有成員。特別地，本發(fā)明方法中使用的FGF可選自FGF-UFGF-2和FGF-3,更優(yōu)選地其為 FGF-2。
[0077] 酸性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF-1)也常稱為"肝素結(jié)合生長因子l(HBGF-l)"、 "aFGF"、" β -內(nèi)皮細(xì)胞生長因子"或"ECGF-β "。示例性的人FGF-1包括但不限于具有如 Uniprot/Swissprot (http ://www. expasy. org/)登記號(hào) Ρ05230 所示之一級(jí)氨基酸序列的 FGF-1。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述序列是前體FGF-1的序列并可包含成熟FGF-1經(jīng)加工 除去的部分。示例性的人FGF-1也描述于Jaye等，1986 (Science 233:541-545)和Harper 等，1986 (Biochemistry 25:4097-4103)等中。
[0078] 堿性成纖維細(xì)胞生長因子也常稱為" FGF-b "、" FGF-2 "、" BFGF "、" HBGH-2 "、 "prostatropin"和"肝素結(jié)合生長因子2前體（HBGF-2) "。示例性的人FGF-2包括但不限 于具有如Uniprot/Swissprot登記號(hào)P09038所示之一級(jí)氨基酸序列的FGF-2。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以理解，所述序列是前體FGF-2的序列并可包含成熟FGF-2經(jīng)加工除去的部分。示 例性的人 FGF-2 已描述于 Abraham 等，1986 (ΕΜΒ0 J 5 :2523-8)和 Kurokawa 等，1987 (FEBS Lett 213 :189-94)等中。
[0079] 成纖維細(xì)胞生長因子3(FGF-3)也常稱為"INT-2原癌基因蛋白"或"HBGF-3"。示 例性的人FGF-3包括但不限于具有如Uniprot/Swissprot登記號(hào)P11487所示之一級(jí)氨 基酸序列的FGF-3。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述序列是前體FGF-3的序列并可包含成 熟FGF-3經(jīng)加工除去的部分。示例性的人FGF-3已描述于Brooks等，1989 (Oncogene 4 : 429-436)等中。
[0080] 本文使用的術(shù)語"TGFi3 "或"TGFB"涵蓋轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFB)家族之生長因子 的任何及所有成員。特別地，本發(fā)明方法中使用的TGFB可選自TGFB-UTGFB-2和TGFB-3， 更優(yōu)選地其為TGFB-1。
[0081] 轉(zhuǎn)化生長因子β -1也稱為"TGFB-1"和"TGF-β -1"。示例性的人TGFB-1包括但 不限于具有如Uniprot/Swissprot登記號(hào)Ρ01137所示之一級(jí)氨基酸序列的TGFB-1。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以理解，所述序列是前體TGFB-1的序列并可包含成熟TGFB-1經(jīng)加工除去的 部分。不例性的人TGFB-1已描述于Derynck等，1985 (Nature 316:701-5)等中。
[0082] 轉(zhuǎn)化生長因子β_2也稱為"TGFB_2"、"源自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的T細(xì)胞抑制因子"、 "G-TSF"、"BSC-1細(xì)胞生長抑制劑"、"polyergin"或"cetermin"。示例性的人TGFB-2包括 但不限于具有如Uniprot/Swissprot登記號(hào)P61812所示之一級(jí)氨基酸序列的TGFB-2。本 領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述序列是前體TGFB-2的序列并可包含成熟TGFB-2經(jīng)加工除去 的部分。示例性的人TGFB-2已描述于Webb等，1988ΦΝΑ 7:493-497)等中。
[0083] 轉(zhuǎn)化生長因子β -3也稱為"TGFB-3"。示例性的人TGFB-3包括但不限于具有如 Uniprot/Swissprot登記號(hào)Ρ10600所示之一級(jí)氨基酸序列的TGFB-3。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以理解，所述序列是前體TGFB-3的序列并可包含成熟TGFB-3經(jīng)加工除去的部分。示例性 的人了6?8-3已描述于0〇_1?5等，1988(?嫩3 85:4715-4719)和06巧1?^等，1988出]\^0了7: 3737-3743)等中。
[0084] 本發(fā)明的方法可利用任何一種或多種或所有生長因子的生物活性變體或衍生物。 在本發(fā)明的方法中，當(dāng)其它條件基本上一樣時(shí)，生長因子的"生物活性"變體或衍生物至少 與該生長因子實(shí)現(xiàn)大致一樣的從BMSC獲得成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞的能力。
[0085] 當(dāng)生長因子通過結(jié)合其相關(guān)受體來行使其作用時(shí)，所述生長因子的生物活性變體 或衍生物可顯示出結(jié)合該相關(guān)受體的親和力和/或特異性，其至少約與所述生長因子結(jié)合 該受體的親和力和/或特異性一樣高。例如，所述生物活性變體或衍生物可具有如下的結(jié) 合相關(guān)受體的親和力和/或特異性，其為各自生長因子結(jié)合該受體之親和力和/或特異性 的至少80% (例如至少85% )，優(yōu)選地至少90% (例如至少90% )或100%或更高。
[0086] 當(dāng)給定生長因子的活性可通過已有測定（例如體外或細(xì)胞測定（例如測量細(xì)胞培 養(yǎng)物中的促有絲分裂活性）容易地測量時(shí)，所述生長因子的生物活性變體或衍生物可在這 些測定中顯示活性，其至少約與該生長因子的活性一樣高。例如，所述生物活性變體或衍生 物可顯示出如下的活性，其為各自生長因子之活性的至少80% (例如，至少85% )，優(yōu)選地 至少90% (例如，至少90%)或100%或更高。
[0087] 多肽的"變體"具有與該多肽之氨基酸序列基本上一致（即，很大程度上而非完全 一致）的氨基酸序列。本文中，"基本上一致"是指至少85%-致，至少90%-致，優(yōu)選地至 少95%-致，例如至少99%-致。序列差異可通過插入（添加）、缺失和/或替換一個(gè)或多 個(gè)氨基酸而得到。
[0088] 兩個(gè)多肽之間的序列一致性可通過最優(yōu)比對(duì)（兩個(gè)蛋白質(zhì)序列之間的最優(yōu)比對(duì) 是使配對(duì)得分的總和盡可能大并使引入空位的罰分盡可能少的比對(duì)；并且可優(yōu)選地通過 計(jì)算機(jī)化執(zhí)行的算法來進(jìn)行，例如使用Needleman和Wunsch 1970算法（J Mol Biol 48: 443-453)的 "Gap"、或使用 Smith 和 Waterman 1981 算法（J Mol Biol 147:195-197)的 "Bestfit"，它們可以在例如Accelrys的GCG? v. 11. 1. 2軟件包中獲得）所述多肽的氨基酸 序列、并對(duì)在比對(duì)中所述多肽包含相同氨基酸殘基的位置數(shù)（一方面）和在比對(duì)中所述兩 個(gè)多肽序列不同的位置數(shù)（另一方面）進(jìn)行打分來確定。當(dāng)所述多肽在某一位置包含不同 的氨基酸殘基時(shí)（氨基酸替換）或者當(dāng)所述多肽之一在該位置包含氨基酸殘基而另一多肽 不包含氨基酸（反之亦然）時(shí)（氨基酸插入或缺失），這兩個(gè)多肽在比對(duì)中在該位置的序 列不同。序列一致性被計(jì)算為：比對(duì)中多肽包含相同氨基酸殘基的位置與比對(duì)中位置總數(shù) 相比的比例（百分?jǐn)?shù)）。用于進(jìn)行序列對(duì)比和確定序列一致性的另一些合適算法包括基于 最初由Altschul等，1990 (J Mol Biol 215 :403-10)描述的基本局部比對(duì)檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)的算法，例如由 Tatusova 和 Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的"Blast 2 sequences"算法。
[0089] 變體的氨基酸序列和與該變體基本一致之各多肽的氨基酸序列之間的至少一些 差異可包括氨基酸替換。優(yōu)選地，所述差異的至少85% (例如，至少90%)、更優(yōu)選地至少 95% (例如，100%)可以為氨基酸替換。優(yōu)選地，所述氨基酸替換可以是保守性的。本文 使用的術(shù)語"保守性替換"表示一個(gè)氨基酸殘基被生物學(xué)上相似的另一氨基酸殘基所替代。 保守性替換的非限制性實(shí)例包括疏水氨基酸殘基（例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨基酸或甲 硫氨酸）之間相互替換，或者極性殘基之間相互替換（例如，精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酸 和天冬氨酸之間，或谷氨酰胺和天冬酰胺之間），等等。
[0090] 本文使用的多肽之"變體"還特別地包括與所述多肽具有一定程度之相似性的多 肽。優(yōu)選地，這樣的變體可以為至少90%相似，例如優(yōu)選地至少91 %相似，例如至少92%相 似、93%相似，更優(yōu)選地至少94%相似，例如95%相似，更優(yōu)選地至少96%相似，例如至少 97%相似，更優(yōu)選地至少98%相似，例如至少99%相似。
[0091] 兩個(gè)多肽之間的序列相似性可如下確定：最優(yōu)比對(duì)（見上文）所述多肽的氨基酸 序列并對(duì)（一方面）比對(duì)中所述多肽包含相同或相似（即，保存性替換）氨基酸殘基的位 置數(shù)以及（另一方面）比對(duì)中所述兩個(gè)多肽序列不同的位置數(shù)進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)多肽在給定位 置包含非保守性氨基酸殘基時(shí)，或者當(dāng)多肽之一在給定位置包含氨基酸殘基而另一多肽在 該位置不合氨基酸殘基（反之亦然）時(shí)（氨基酸插入或缺失）時(shí)，兩個(gè)多肽在所述位置的 序列不同。序列相似性計(jì)算為：比對(duì)中多肽包含相同或相似氨基酸殘基的位置與比對(duì)中位 置總數(shù)相比的比例（百分?jǐn)?shù)）。
[0092] 變體生長因子可包括一種或多種肽或多肽，其中至少一種是如上定義的生長因子 之各組成肽或多肽的變體。
[0093] 多肽的"衍生物"可通過化學(xué)方式改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基和/或在一個(gè)或多 個(gè)氨基酸殘基位置添加一個(gè)或多個(gè)實(shí)體而衍生化，例如，通過糖基化、磷酸化、?；?、乙酰 化、硫化、脂化、烷基化等。通常，衍生多肽中少于50% (例如，少于40%)、優(yōu)選地少于30% (例如，少于20% )、更優(yōu)選地少于15% (例如，少于10%或少于5%，例如少于4%、3%、 2%或1%)的氨基酸可這樣進(jìn)行衍生化。衍生蛋白質(zhì)生長因子可包括一種或多種肽或多 肽，其中至少一種可以在至少一個(gè)氨基酸殘基上進(jìn)行衍生化。
[0094] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生長因子或者其生物活性變體或衍生物可以是 重組的，即由宿主生物通過表達(dá)重組核酸分子而產(chǎn)生，所述重組核酸分子已被引入該宿主 生物（例如，細(xì)菌諸如但不限于大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌（S. tymphimurium)、粘質(zhì)沙雷 氏菌（Serratia marcescens)，枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis);酵母諸如釀酒酵母 (S. cerevisiae)和畢赤酵母（Pichia pastoris);栽培植物細(xì)胞諸如擬南芥（Arabidopsis thaliana)和煙草（Nicotiana tobaccum)細(xì)胞等；動(dòng)物細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞；或 多細(xì)胞生物諸如植物或動(dòng)物）或其祖先中并且其包含編碼所述多肽的序列。使用重組表達(dá) 的生長因子或者其生物活性變體或衍生物降低病原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)。重組產(chǎn)生TGFB-1已描 述于Bourdrel等，1993(Protein Expr Purif4:130_40)等中。重組生長因子也常常是市 售的（例如，從Sigma，Biological Industries，R&D Systems，Peprotech 等）。
[0095] 術(shù)語"血漿"如常規(guī)定義。血漿通常從提供了抗凝劑（例如，肝素、檸檬酸鹽、草酸 鹽或EDTA)或與抗凝劑接觸的全血樣品獲得。隨后，通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)（通常通過離心）將 血液樣品中的細(xì)胞組分與液體組分（血漿）分離。因此，術(shù)語"血漿"所指的組合物不構(gòu)成 人或動(dòng)物體的一部分。
[0096] 術(shù)語"血清"如常規(guī)定義。通?？扇缦聫娜獦悠帆@得血清：首先使樣品中發(fā)生凝 結(jié)，隨后通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)（通常通過離心）將血液樣品中這樣形成的凝塊和細(xì)胞組分與液 體組分（血清）分離。惰性催化劑（例如，玻璃珠或粉末）可促進(jìn)凝結(jié)。或者，可以通過從 血漿除去抗凝劑和血纖蛋白來獲得血清。因此，術(shù)語"血清"所指的組合物不構(gòu)成人或動(dòng)物 體的一部分。
[0097] 所述分離的血漿或血清可直接用于本發(fā)明的方法中。也可以將它們適當(dāng)?shù)貎?chǔ)存 以備用（例如，儲(chǔ)存較短的時(shí)間段，例如最多約1?2周，在高于血漿或血清各自凝固點(diǎn)但 低于環(huán)境溫度的溫度下，該溫度通常為約4°C?5°C ;或者通過冷凍儲(chǔ)存較長時(shí)間，通常為 約-70°C和約-80°C之間。
[0098] 如本領(lǐng)域已知地，所述分離的血漿或血清可進(jìn)行熱滅活，特別地用以除去補(bǔ)體。當(dāng) 本發(fā)明方法使用的血漿或血清與在它們存在下所培養(yǎng)的細(xì)胞是自體時(shí)，對(duì)血漿或血清進(jìn)行 熱滅活可以不是必需的。當(dāng)血漿或血清至少部分地與所培養(yǎng)細(xì)胞是同種異體時(shí)，對(duì)血漿或 血清進(jìn)行熱滅活可以是有利的。
[0099] 任選地，還可以在儲(chǔ)存或使用前對(duì)血漿或血清進(jìn)行滅菌，其使用常規(guī)的微生物濾 器，優(yōu)選地使用〇. 2 μ m或更小的孔徑。
[0100] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可使用這樣的人血漿或血清，其與其所接觸的人 BMSC或MSC是自體的。涉及血漿或血清時(shí)，術(shù)語"自體"表示血漿或血清獲得自所述血漿或 血清待接觸之BMSC或MSC的同一對(duì)象。
[0101] 在另一實(shí)施方案中，所述方法可使用這樣的人血漿或血清，其與其所接觸之人 BMSC或MSC是"同源的"或"同種異體的"，即，其獲得自除獲得所述BMSC或MSC之對(duì)象以 外的一個(gè)或多個(gè)（合并）人對(duì)象。
[0102] 在另一實(shí)施方案中，所述方法可使用如上定義之自體和同源（同種異體）血漿或 血清的混合物。
[0103] 如所述，在一方面，本發(fā)明方法通?？砂ㄒ韵虏襟E：
[0104] (a)從包含BMSC或MSC的人對(duì)象生物樣品回收細(xì)胞；
[0105] (b)任選地，從（a)中回收的細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞；
[0106] (c)將（a)或（b)的細(xì)胞添加至包含人血漿或血清、FGF或者其生物活性變體或衍 生物以及TGFB或者其生物活性變體或衍生物的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)該細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物，從 而使細(xì)胞貼附至基底表面；
[0107] (d)除去未貼附物，并繼續(xù)在（c)中所限定之培養(yǎng)基中培養(yǎng)貼附細(xì)胞，從而獲得骨 原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0108] 步驟（b)可使用常規(guī)方法例如密度梯度離心來進(jìn)行。
[0109] 在培養(yǎng)基（常常為液體細(xì)胞培養(yǎng)基）存在下培養(yǎng)來自步驟（a)或（b)的細(xì)胞懸液。 通常，所述培養(yǎng)基包含本領(lǐng)域已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方?？墒褂枚喾N基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方（例如 可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)獲得，或者可從Invitrogen，Carlsbad, California 獲得）培養(yǎng)本文中的細(xì)胞，包括但不限于可從Invitrogen或Cambrex(New Jersey)獲得 的 Eagle 低限量基本培養(yǎng)基（Eagle，s Minimum Essential Medium，MEM)、Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco，s Modified Eagle' s Medium，DMEM)、α 改良低限量基本培養(yǎng)基 (a -MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Basal Medium Essential，BME)、BGJb、F-12 營養(yǎng)混合物（Ham)、 Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基（MDM)或X-Vivo-10無血清培養(yǎng)基（臨床級(jí)），及其變型和/ 或組合。上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組合物一般是本領(lǐng)域已知的，并且必要時(shí)針對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞修飾 或調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)基補(bǔ)充劑濃度在本領(lǐng)域技術(shù)人員技能范圍內(nèi)。
[0110] 這樣的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育所必需的成分，其本身是已知的。 通過舉例說明但非限制性地，這些成分可包括無機(jī)鹽（特別是鹽，包括Na、K、Mg、Ca、Cl、P 以及可能的Cu、Fe、Se和Zn)、生理緩沖液（例如，HEPES、重碳酸鹽）、核苷酸、核苷和/或 核酸堿基、核糖、脫氧核糖、氨基酸、維生素、抗氧化劑（例如，谷胱甘肽）和碳源（例如，葡 萄糖、丙酮酸鈉、醋酸鈉）等。
[0111] 為了用于培養(yǎng)，可向基礎(chǔ)培養(yǎng)基提供一種或多種另外的組分。例如，可使用另一些 補(bǔ)充劑向細(xì)胞提供必需痕量元素和物質(zhì)用于最佳的生長和擴(kuò)增。這些補(bǔ)充劑包括胰島素、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒鹽及其組合。這些組分可包含在鹽溶液中，所述鹽溶液例如但不限于Hanks' 平衡鹽溶液（HBSS)、Earle鹽溶液?？商砑恿硗獾目寡趸瘎┭a(bǔ)充劑，例如β-巰基乙醇。盡 管許多基礎(chǔ)培養(yǎng)基已包含氨基酸，但仍可在之后補(bǔ)充某些氨基酸，例如L-谷氨酰胺（已知 其在溶液中較不穩(wěn)定）。還可向培養(yǎng)基補(bǔ)充抗生素和/或抗真菌化合物，通常例如青霉素和 鏈霉素的混合物和/或另外的化合物例如但不限于：兩性霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、博 來霉素、潮霉素、卡那霉素、絲裂霉素、霉酌'fe、奈陡fe、新霉素、制霉困素、巴龍霉素、多粘困 素、嘌呤霉素、利福平、壯觀霉素、四環(huán)素、泰樂菌素和吉?dú)W霉素（zeocin)。
[0112] 還可使用脂質(zhì)和脂質(zhì)載體補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基。這樣的脂質(zhì)和載體可包括但不限于環(huán) 糊精、膽固醇、綴合于白蛋白的亞油酸、綴合于白蛋白的亞油酸和油酸、未綴合的亞油酸、綴 合于白蛋白的亞油酸-油酸-花生四烯酸、未綴合和綴合于白蛋白的油酸等。白蛋白可類 似地用于不含脂肪酸的配方中。
[0113] 在一些實(shí)施方案中，人血漿或血清可以如下比例（血漿或血清體積/培養(yǎng)基體積） 包含在所述培養(yǎng)基中：約0. 5%至約30%，優(yōu)選地約1%至約15%。本發(fā)明方法可令人滿意 地用相對(duì)較低的血漿或血清量來進(jìn)行，例如，約5 (體積）％或10 (體積）％，或者更低，例如 約1 (體積）％、約2 (體積）％、約3 (體積）％或約4 (體積）％，從而允許降低為培養(yǎng)BMSC 所需獲得的血漿或血清體積。
[0114] FGF和TGFB以如下濃度包含在所述培養(yǎng)基中，所述濃度足以誘導(dǎo)BMSC分化為成骨 細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞。通常，F(xiàn)GF或者其生物活性變體或衍生物可以如下濃度包含所述 培養(yǎng)基中，即 〇· 1 ?l〇〇ng/ml，優(yōu)選地 0· 5 ?20ng/ml，例如約 19、18、17、16、15、14、13、12、 11、10,9、8、7 或 6ng/ml，或者約 5ng/ml 或更低，例如約 4、3、2、1 或 0. 5ng/ml。通常，TGFB 或者其生物活性變體或衍生物可以如下濃度包含在所述培養(yǎng)基中，即0. 1?l〇〇ng/ml，優(yōu) 選地 0· 25 ?20ng/ml，例如約 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7 或 6ng/ml，或者約 5ng/ml或更低，例如約4、3、2、1或0. 5ng/ml。所述值旨在指各生長因子或者其生物活性變 體或衍生物外源補(bǔ)充至培養(yǎng)基中的濃度。
[0115] 在一個(gè)實(shí)施方案中，BMSC或MSC可持續(xù)地與人血漿或血清、FGF和TGFB或者其生 物活性變體或衍生物接觸，也即，所述組分將包含在所有這樣的培養(yǎng)基中，在所述培養(yǎng)基中 以本發(fā)明的方法培養(yǎng)BMSC或MSC、其后代和/或源自其的細(xì)胞。通常，所述血漿或血清和生 長因子可以基本上一致的各自濃度向所有（新鮮）培養(yǎng)基提供，以用于在所述方法中培養(yǎng) BMSC 或 MSC。
[0116] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟（c)中以5X102?5X106個(gè)細(xì)胞/cm 2、優(yōu)選5X103? 5X105個(gè)細(xì)胞/cm2、更通常以約5X10 4個(gè)細(xì)胞/cm2將（a)或（b)的細(xì)胞鋪板用于培養(yǎng)。
[0117] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)容器可提供塑料表面以使得細(xì)胞能夠貼附。 在另一實(shí)施方案中，所述表面可以是玻璃表面。在又一實(shí)施方案中，所述表面可包被有助于 細(xì)胞貼附和生長的材料，例如Matrigel (R)、層粘連蛋白或膠原蛋白。
[0118] 在一些實(shí)施方案中，可使細(xì)胞貼附約1?8天，更通常地約2?6天，更通常地約 4天，然后在步驟（d)中除去未貼附物。
[0119] 通常，所述細(xì)胞可以在步驟（c)和（d)中培養(yǎng)總共約7至約18天，通常約11至約 15天，更優(yōu)選地約12?14天?；蛘撸黾?xì)胞可以在步驟（c)和（d)中培養(yǎng)至它們的匯合 度達(dá)到約60 %或更高，或者約80 %或更高，或者約90 %或更高，或者甚至高達(dá)100 %。
[0120] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟（d)之后，所述方法可包括收集由此獲得的細(xì)胞或細(xì) 胞群。
[0121] 在另一實(shí)施方案中，在步驟（d)之后，可將所獲得的細(xì)胞傳代一次或多次，通常為 一或兩次，更優(yōu)選一次。所述傳代數(shù)是指細(xì)胞群從培養(yǎng)容器中移出并進(jìn)行繼代培養(yǎng)（即，一 次傳代）的次數(shù)。例如，傳代可通常包括使用二價(jià)離子螯合劑（例如，EDTA或EGTA)和/或 胰蛋白酶或合適的蛋白酶來剝離細(xì)胞；重懸所剝離的細(xì)胞；以及以期望的細(xì)胞密度在同一 培養(yǎng)容器或新培養(yǎng)容器中將細(xì)胞重新鋪板。
[0122] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在上述步驟（d)之后，所述方法還包括步驟（e)傳代（特 別是傳代一次），以及繼續(xù)在（c)中所定義的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自步驟（d)的細(xì)胞或細(xì)胞群。 在該步驟（e)之后，可收集所述細(xì)胞或細(xì)胞群。
[0123] 在所述傳代步驟（e)中，所述細(xì)胞優(yōu)選地以如下密度鋪板用于繼續(xù)培養(yǎng)，即 5 X 101?5 X 106個(gè)細(xì)胞/cm2,優(yōu)選地5 X 102?5 X 104個(gè)細(xì)胞/cm2,更通常地約5 X 103個(gè) 細(xì)胞/cm2。
[0124] 通常，在傳代后，所述細(xì)胞在步驟（e)中培養(yǎng)約3天至約12天、通常約6天至約10 天、更通常約一周的時(shí)間段。該時(shí)間段提供了令人滿意的細(xì)胞擴(kuò)增。
[0125] 以上詳述的本發(fā)明方法產(chǎn)生具有如下優(yōu)越特征的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞 表型細(xì)胞或者細(xì)胞群，所述特征例如特別高的擴(kuò)增率和低的HLA-DR表達(dá)，這樣的細(xì)胞和細(xì) 胞群適用于患者骨組織中的預(yù)防性或治療性移植。
[0126] 因此，本發(fā)明的一些方面涉及可使用上述本發(fā)明方法獲得或直接獲得的人骨原細(xì) 胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，以及涉及用于療法中和/ 或用于治療骨相關(guān)疾?。ɡ纾诒菊f明書其它部分列出的那些）的這些細(xì)胞或細(xì)胞群，以 及涉及這些細(xì)胞或細(xì)胞群用于制備治療骨相關(guān)疾病之藥物的用途。
[0127] 在另一方面中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含可通過本發(fā)明方法獲得或直接獲 得并適于在骨損傷部位施用的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì) 胞的細(xì)胞群。
[0128] 在一方面，本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和/或治療有此需要之對(duì)象中骨疾病的方法， 其包括：（i)如上所述進(jìn)行本發(fā)明的方法，以獲得人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì) 胞，或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，以及（ii)向所述對(duì)象施用這樣獲得的細(xì)胞或細(xì)胞群，例 如在骨損傷（如手術(shù)或骨折）部位施用。
[0129] 2.本發(fā)明的細(xì)朐和細(xì)朐群
[0130] 對(duì)由本發(fā)明方法產(chǎn)生之成骨細(xì)胞的進(jìn)一步研究定義了新的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或 成骨細(xì)胞表型細(xì)胞類型，這可以揭示用于骨治療中所觀察到的有利特性。
[0131] 特別地，本發(fā)明的一方面提供了人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞以及 包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，特征在于所述細(xì)胞（1)包含⑶90、⑶105、⑶73、⑶63、CD166和堿 性磷酸酶（ALP)(更特別地骨-肝-腎型ALP)的表達(dá)，（2)不表達(dá)⑶45、⑶14、⑶19,以及 (3)少于25%的細(xì)胞、優(yōu)選地少于20%的細(xì)胞以及更優(yōu)選地少于15%的細(xì)胞表達(dá)HLA-DR。
[0132] 當(dāng)述及細(xì)胞對(duì)特定標(biāo)志物呈陽性時(shí)，這意味著本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)推斷出，當(dāng)進(jìn)行 適當(dāng)測量時(shí)，與合適的對(duì)照相比存在或顯示針對(duì)該標(biāo)志物的獨(dú)特信號(hào)，例如可用抗體檢測 的信號(hào)或通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測的信號(hào)。當(dāng)所述方法允許定量評(píng)估標(biāo)志物時(shí)，陽 性細(xì)胞可平均產(chǎn)生顯著不同于對(duì)照的信號(hào)，例如但不限于比對(duì)照細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)高出至 少1. 5倍的信號(hào)，例如高出至少2倍、至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40 倍、至少50倍或者更高。
[0133] 可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的免疫學(xué)技術(shù)（例如免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)或親和吸 附、Western印跡分析、FACS、ELISA等）或通過任何合適的酶活性生化測定（例如，針對(duì) ALP)或通過任何合適的測量mRNA標(biāo)志物數(shù)量的技術(shù)（例如,Northern印跡、半定量或定量 RT-PCR等）來檢測上述細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。本公開內(nèi)容中列出的標(biāo)志物的序列數(shù)據(jù) 是已知的并且可以從公共數(shù)據(jù)庫（例如GenBank(http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/))獲得。
[0134] 在另一實(shí)施方案中，當(dāng)暴露于骨生成培養(yǎng)基（Jaiswal等，1997. J Cell Biochem 64 :295-312)時(shí)，所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞顯示出使外周環(huán)境 (external surrounding)礦化的能力或合成含|丐細(xì)胞外基質(zhì)的能力。細(xì)胞內(nèi)的|丐積 累和在基質(zhì)蛋白質(zhì)中的沉積可通過以下方式常規(guī)測量，例如通過在 45Ca2+培養(yǎng)，清洗以 及再次培養(yǎng)，然后測定細(xì)胞中存在的或者細(xì)胞外基質(zhì)中沉積的任何放射性（美國專利 No. 5, 972, 703)，或通過使用Ca2+測定試劑盒（Sigma試劑盒#587)測定培養(yǎng)基質(zhì)的礦化，或 如實(shí)施例中所述。
[0135] 在另一實(shí)施方案，所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞基本上不向脂肪 細(xì)胞譜系的細(xì)胞（例如脂肪細(xì)胞）或軟骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞（例如軟骨細(xì)胞）中的任一 種分化，優(yōu)選地不向上述兩者分化?？墒褂帽绢I(lǐng)域建立的標(biāo)準(zhǔn)分化誘導(dǎo)條件（例如參見 Pittenger等，1999. Science 284 :143-7)和測定方法（例如，當(dāng)被誘導(dǎo)時(shí)，通常用油紅0染 色脂肪細(xì)胞以顯示脂質(zhì)積累；通常用愛茜藍(lán)（alcian blue)或番紅0染色軟骨細(xì)胞）測試 不向這些細(xì)胞譜系分化?；旧先狈ο蛑旧煞只蜍浌巧煞只膬A向通常可意味 著，當(dāng)應(yīng)用于各測試時(shí)，少于65%、或少于50%、或少于35%、或少于20%或少于10%的測 試細(xì)胞將顯示脂肪生成分化或軟骨生成分化的跡象。
[0136] 在另一實(shí)施方案中，所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞還可表達(dá)骨鈣 蛋白（0CN)(在一些具體實(shí)驗(yàn)中，通過FACS檢測8?85 %的細(xì)胞表達(dá)0CN)。
[0137] 在另一實(shí)施方案中，所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞還可表達(dá)骨涎 蛋白（BSP)(在一個(gè)具體的半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，所述細(xì)胞表達(dá)弱的至中等水平的BSP)。
[0138] 如上文表征的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的細(xì) 胞群顯示了優(yōu)越的特征，例如特別高的擴(kuò)增率和低HLA-DR表達(dá)，這些細(xì)胞和細(xì)胞群適用于 患者骨組織中的預(yù)防性或治療性移植。
[0139] 因此，本發(fā)明的一些方面涉及如上表征的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型 細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，其用于療法中和/或用于治療骨相關(guān)疾?。ɡ缭诒菊f 明書其它部分列出的那些），以及涉及這些細(xì)胞或細(xì)胞群用于制備治療骨相關(guān)疾病之藥物 的用途。
[0140] 在另一方面中，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含如上表征的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞 或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，并適于在骨損傷部位施用。
[0141] 在一方面，本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和/或治療有此需要之對(duì)象中骨疾病的方法， 其包括向所述對(duì)象施用如上表征的所述人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包 含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，例如在骨損傷（如手術(shù)或骨折）部位施用。
[0142] 3.渉及本發(fā)明細(xì)朐和細(xì)朐群的方面
[0143] 以下描述涉及包含上述方面和如下的另一些方面：通過上面第一部分所述方法獲 得或可獲得的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞以及包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群；或者， 如上面第二部分表征的骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞以及包含這些細(xì)胞的細(xì)胞 群。
[0144] 如所解釋地，本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞群可以被引入人對(duì)象之手術(shù)或骨折部位的骨 中。將本發(fā)明的成骨細(xì)胞引入骨中可用于治療骨折和骨相關(guān)異常，例如在本發(fā)明說明書其 它部分列出的那些。
[0145] 在一個(gè)實(shí)施方案中，成骨細(xì)胞可以從將要引入分化成骨細(xì)胞之對(duì)象的BMSC或MSC 獲得（即，自體細(xì)胞）。在另一任選方案（由于本發(fā)明細(xì)胞的低HLA-DR表達(dá)而在本文及其 它中可用的方案）中，成骨細(xì)胞可以從除了將要引入分化成骨細(xì)胞之人對(duì)象以外的一個(gè)或 多個(gè)人對(duì)象的BMSC或MSC獲得（S卩，同種異體細(xì)胞）獲得。在又一實(shí)施方案中，成骨細(xì)胞可 以從非人動(dòng)物（優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物）的BMSC或MSC獲得并引入人對(duì)象中（S卩，異種細(xì)胞）。
[0146] 如所述，可將本發(fā)明的成骨細(xì)胞配制成藥物組合物并且以藥物組合物的形式施 用。
[0147] 除了本文所述的成骨細(xì)胞之外，這樣的藥物組合物可包含可藥用的賦形劑、載體、 緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它材料。這些材料應(yīng)是無毒 的并且應(yīng)當(dāng)不干擾細(xì)胞的活性。所述載體或其它材料的精確性質(zhì)將取決于施用途徑。例 如，所述組合物可采用腸胃外可接受的水溶液形式，其為無熱原的并且具有合適的pH、等 滲性和穩(wěn)定性。針對(duì)一般的醫(yī)藥配制原則，讀者可參考G Morstyn&W. Sheridan編的Cell Therapy ：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, Cambridge University Press，1996 ;以及Hematopoietic Stem Cell Therapy,E. D. Ball, J. Lister&P. Law, Ch urchill Livingstone，2000。
[0148] 這些藥物組合物可包含確保其中細(xì)胞生存力的另外組分。例如，所述組合物可包 含合適的緩沖液系統(tǒng)（例如，磷酸鹽或碳酸鹽緩沖系統(tǒng)）以實(shí)現(xiàn)期望的PH，更通常為接近中 性pH，并且可包含足夠的鹽以確保針對(duì)細(xì)胞的等滲條件從而避免滲透壓。例如，出于這些目 的的合適溶液可以是如本領(lǐng)域已知的磷酸鹽緩沖液（PBS)、氯化鈉溶液、林格注射液或乳酸 林格注射液。此外，所述組合物可包含載體蛋白質(zhì)，例如白蛋白（其可增加所述細(xì)胞的生存 力）。
[0149] 所述藥物組合物可包含可用于修復(fù)骨創(chuàng)傷和缺陷的另一些組分。例如，這樣的組 分可包括但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白、羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒（HA/TCP)、明膠、聚乳酸、聚 乳酸乙醇酸、透明質(zhì)酸、殼聚糖、聚L-賴氨酸和膠原蛋白。例如，所述成骨細(xì)胞可與脫礦骨 基質(zhì)（demineralised bone matrix，DBM)或另一些基質(zhì)聯(lián)用從而產(chǎn)生成骨復(fù)合材料（其自 身形成骨）以及骨誘導(dǎo)復(fù)合材料。使用自體骨髓細(xì)胞以及同種異體DBM的類似方法產(chǎn)生了 好的結(jié)果（Connolly 等，1995. Clin Orthop 313:8-18)。
[0150] 所述藥物組合物還可包含補(bǔ)充性的生物活性因子（例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)，如 BMP-2、BMP-7或BMP-4,或任何其它生長因子）或與其共同施用。其它可能的伴隨組分包括 適于輔助骨再生的鈣或磷酸鹽無機(jī)物來源（W0 00/07639)。需要時(shí)，可利用載體基質(zhì)或材 料來施用細(xì)胞制備物以提供改善的組織再生。例如，所述材料可以陶瓷顆粒或生物聚合物 例如明膠、膠原蛋白、骨連蛋白、凝血因子I或骨鈣蛋白。多孔基質(zhì)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來合成 (例如，Mikos 等，Biomaterials 14 :323,1993 ;Mikos 等，Polymer 35 :1068,1994 ;Cook 等， J. Biomed. Mater. Res. 35 :513,1997)。
[0151] 作為替代或另外地，所述BMSC或MSC細(xì)胞或者本發(fā)明所得的成骨細(xì)胞或細(xì)胞群可 在引入對(duì)象的骨損傷（例如手術(shù)或骨折部位）前用目的核酸穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。目的核酸序 列包括但不限于編碼增強(qiáng)成骨細(xì)胞生長、分化和/或礦化之基因產(chǎn)物的核酸序列。例如，可 出于治療難愈合骨折（non-healing fracture)或骨質(zhì)疏松的目的將針對(duì)BMP-2的表達(dá)系 統(tǒng)以穩(wěn)定或瞬時(shí)方式引入BMSC或MSC中。轉(zhuǎn)化BMSC或MSC的方法和轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞的方法 是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0152] 因此，本發(fā)明還涵蓋了通過混合本發(fā)明的細(xì)胞與上述一種或多種另外組分產(chǎn)生所 述藥物組合物的方法。
[0153] 在另一方面中，本發(fā)明涉及裝置，其包含用于將組合物施用在骨損傷部位處的手 術(shù)器械，還包含本發(fā)明的成骨細(xì)胞或細(xì)胞群或包含所述細(xì)胞或細(xì)胞群的藥物組合物，其中 所述裝置適于將所述藥物組合物施用在骨損傷部位處。例如，合適的手術(shù)器械能夠?qū)?本發(fā)明細(xì)胞的液體組合物注射至骨損傷部位。
[0154] 所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或細(xì)胞群可采用如下方式施用，所 述方式允許它們移植或遷移至目標(biāo)組織部位并重建或再生該功能缺陷區(qū)域。所述組合物的 施用將取決于所修復(fù)的骨胳肌肉部位。例如，手術(shù)方法使組織重塑或者插入裂口或假體裝 置（如髖關(guān)節(jié)置換）可有助于骨生成。在另外的情形中，不需要侵入性手術(shù)，可通過注射或 (例如，針對(duì)脊柱修復(fù)）使用可引導(dǎo)內(nèi)窺鏡來施用所述組合物。
[0155] 在一個(gè)實(shí)施方案中，如上定義的藥物細(xì)胞制備物可采用液體組合物的形式施用。 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞或包含這些細(xì)胞的藥物組合物可全身性、局部地或在損傷部 位施用。
[0156] 在另一實(shí)施方案中，所述成骨細(xì)胞或細(xì)胞群可以被轉(zhuǎn)移至和/或培養(yǎng)在合適的基 底上以用于移植。所述細(xì)胞可施加并培養(yǎng)于其上的基底可以是金屬（例如鈦、鈷/鉻合金 或不銹鋼）、生物活性表面（例如磷酸鈣）、多聚體表面（例如聚乙烯）等。盡管不是最優(yōu) 選地，硅質(zhì)材料（例如玻璃陶瓷）也可用作基底。最優(yōu)選的是金屬，例如鈦和磷酸鈣，盡管 磷酸鈣不是所述基底中必不可少的組分。所述基底可以是多孔的或無孔的。
[0157] 例如，必要時(shí)，可將在培養(yǎng)皿中已增殖的細(xì)胞或正在分化的細(xì)胞移至三維固體支 持物上，從而通過在本發(fā)明的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中孵育所述固體支持物而使它們?cè)鲋澈?或 繼續(xù)分化過程?？衫缤ㄟ^用含有所述細(xì)胞的液體懸液填充三維固體支持物而將細(xì)胞移至 該支持物上。這樣獲得的經(jīng)填充支持物可被移植入人對(duì)象中。這樣的經(jīng)填充支持物還可通 過在最終移植前將它們浸于液體培養(yǎng)基中來再次培養(yǎng)。
[0158] 所述三維固體支持物需要為生物相容性的，從而使其能夠被移植入人中。它可 以具有任何適當(dāng)?shù)男螤?，例如圓柱、球、平板或任意形狀的一部分。在適用于所述生物相 容性三維固體支持物的材料中，特別關(guān)注碳酸鈣，尤其是霰石，具體采用基于礬土、氧化 鋯、磷酸三鈣的珊瑚骨骼、多孔陶瓷的形式，和/或羥磷灰石、通過水熱交換使碳酸鈣轉(zhuǎn)化 成羥磷灰石而獲得的仿珊瑚骨骼、或者磷灰石-硅灰石玻璃陶瓷、生物活性玻璃陶瓷例如 Bioglass (TM)玻璃。
[0159] 以上方面和實(shí)施方案通過以下非限制性實(shí)施例得到進(jìn)一步支持。
[0160] 實(shí)施例
[0161] 實(shí)驗(yàn)方法
[0162] 細(xì)朐培養(yǎng)和血槳制各物
[0163] 從患有骨疾病的患者或從健康志愿者的髂嵴獲得20?60ml經(jīng)肝素化的骨髓 (BM)。將BM與磷酸鹽緩沖液（PBS，體積比2 :1)混合，并層鋪在密度梯度Ficoll溶液上。 離心后，從分界面收集單個(gè)核細(xì)胞并用PBS清洗兩次。平行地，將排至干試管的160ml血液 離心后，獲得來自患者或健康供者的血清。所述細(xì)胞用補(bǔ)充有15%同種異體血漿（可使用 自體血漿，結(jié)果基本上一致）、l〇ng/ml FGF2和10ng/ml TGFb-Ι的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。 所述細(xì)胞以1X 1〇8個(gè)細(xì)胞/175cm2 (燒瓶）的密度鋪板，并維持在含5% C02的37°C濕潤氣 氛中。在第一次更換培養(yǎng)基之前，使所述細(xì)胞貼附1天。另外兩次部分培養(yǎng)基更換（更換 一半體積）在第7天和第11天進(jìn)行。第14天，在37°C使用胰蛋白酶/EDTA溶液剝離細(xì)胞 1?5分鐘。對(duì)所述細(xì)胞計(jì)數(shù)并以IX 105個(gè)細(xì)胞/175cm2鋪板，再培養(yǎng)一周。
[0164] 表型分析
[0165] 通過流式細(xì)胞術(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)（第14天和第21天）分析細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的標(biāo) 志物。對(duì)于細(xì)胞表面標(biāo)志物來說：用以下經(jīng)綴合的單克隆抗體孵育細(xì)胞15分鐘：抗CD45、 CD90、CD105、CD73、CD166、CD63、CD14、CD19、HLA-ABC、HLA-DR、CD28、CD80、CD86 和 CTLA-4, 然后用PBS清洗，繼而進(jìn)行離心并用0. 3ml PBS重懸。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物（0CN和ALP)來 說，使用透化試劑盒，并根據(jù)制造商的使用說明（Analis)使用經(jīng)綴合的特異性抗ALP單克 隆抗體。然后，用PBS清洗細(xì)胞，繼而用0. 3ml PBS進(jìn)行重懸。
[0166] ALP 測定
[0167] 通過基于pNPP (對(duì)硝基苯磷酸鹽）水解的生化測定來測量堿性磷酸酶的酶活性。 當(dāng)pNPP被ALP去磷酸化時(shí)，它變?yōu)辄S色并且可通過分光光度計(jì)在410nm處檢測。在第21 天，確定相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的所述細(xì)胞ALP酶活性，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是基于純化的小牛腸堿性 磷酸酶的活性。所述ALP活性表示為每毫克蛋白質(zhì)的ALP單位。一個(gè)單位的ALP在37°C在 1分鐘內(nèi)水解1 μ mol pNPP。
[0168] 礦化測定
[0169] 通過向培養(yǎng)物中添加骨生成培養(yǎng)基來評(píng)估細(xì)胞礦化潛力的誘導(dǎo)。在第14天，在補(bǔ) 充有0. 1 μ Μ地塞米松、0. 05mM抗壞血酸和3mM甘油磷酸鹽的血漿的存在下，將5, 700個(gè)骨 形成細(xì)胞/cm2鋪板至6孔板中。培養(yǎng)2周后，用3. 7%甲醛/PBS固定細(xì)胞并通過茜素紅 (alizarin red)染色。如下給出每個(gè)培養(yǎng)物的礦化分?jǐn)?shù)：0=無礦化，1 =正在進(jìn)行的礦化， 以及2 =完全礦化。
[0170] T細(xì)朐增葙測定
[0171] 將補(bǔ)充有或沒有10ng/ml TGFb-Ι的來自個(gè)體A (PREOBa)的每毫升2, 000? 20, 000個(gè)前成骨細(xì)胞與來自個(gè)體B(PBMCb)的每毫升200, 000個(gè)T細(xì)胞共培養(yǎng)。使用濃度 為10μ g/ml的植物血凝素（phytohemaglutinine，PHA)用作T細(xì)胞增殖的陽性對(duì)照。在24 孔微量滴定板中培養(yǎng)所述細(xì)胞7天，并在培養(yǎng)期間的最后18個(gè)小時(shí)中用3H-胸苷進(jìn)行脈沖 以測量T細(xì)胞增殖。用冰冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，并用冰冷的5%三氯乙酸（TCA)清洗兩 次。最后，利用含有〇. IN NaOH和0. 1% Triton-XlOO的溶液裂解細(xì)胞。收集上清液并將其 與閃爍液混合，從而利用β_計(jì)數(shù)器進(jìn)行分析。
[0172] 結(jié)果
[0173] 血槳和TGF相比于血槳和TGF/FGF2
[0174] 我們首先測試作為唯一生長因子的TGFb-Ι (其被添加至含有15%同種異體血漿 的培養(yǎng)基）的作用。如圖1所示，僅有TGFB-1的原代培養(yǎng)物無法得到合適數(shù)量的擴(kuò)增細(xì)胞； 事實(shí)上，與只含有TGFb-Ι的培養(yǎng)瓶中相比，從培養(yǎng)基中含有FGF2和TGFb-Ι的培養(yǎng)瓶中收 集的細(xì)胞幾乎多出20倍（p = 0. 0317,雙尾Mann Whitney檢驗(yàn)）。
[0175] 血槳和FGF相比于血槳和TGF/FGF2
[0176] 評(píng)估了來自15名患者的成骨細(xì)胞在含有同種異體血漿和FGF2(添加有或沒有 10ng/ml TGFb-Ι)的增殖速率（圖2)。以下實(shí)驗(yàn)顯示，在原代培養(yǎng)物（1.07X)、繼代培養(yǎng) 物（2. 5X)和全部培養(yǎng)物（3. 08X)中，在補(bǔ)充有TGFb-Ι的血漿中培養(yǎng)的細(xì)胞的平均擴(kuò)增 產(chǎn)率大大地優(yōu)于無 TGFb-Ι時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞之產(chǎn)率（表1)。
[0177] 表1 :用FGF2和FGF2/TGFb_l培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)率
[0178]

【權(quán)利要求】
1. 用于從成人骨髓干細(xì)胞（BMSC)或成人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)體外或離體獲得骨原細(xì) 胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞之細(xì)胞群的方法，其包括將所述BMSC 或MSC與人血漿或血清、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)或者其生物活性變體或衍生物、以及轉(zhuǎn) 化生長因子β (TGFB)或者其生物活性變體或衍生物相接觸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括以下步驟： (a) 從包含BMSC或MSC的人對(duì)象生物樣品回收細(xì)胞； (b) 任選地，從（a)中回收的細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞； (c) 將（a)或（b)的細(xì)胞添加至包含人血楽或血清、FGF或者其生物活性變體或衍生 物、以及TGFB或者其生物活性變體或衍生物的培養(yǎng)基，并培養(yǎng)該細(xì)胞-培養(yǎng)基混合物，從而 使細(xì)胞貼附至基底表面； (d) 除去未貼附物，并繼續(xù)在（c)中所限定之培養(yǎng)基中培養(yǎng)貼附細(xì)胞，從而獲得骨原細(xì) 胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞樣細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在步驟（c)和（d)中培養(yǎng)所述細(xì)胞總共約7天至約18 天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3中任一項(xiàng)的方法，其還包括收集步驟（d)中獲得的所述細(xì)胞或 細(xì)胞群。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3中任一項(xiàng)的方法，其還包括步驟（e)，傳代并繼續(xù)在（c)中所限 定之培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自步驟（d)的細(xì)胞或細(xì)胞群。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中在步驟（e)中培養(yǎng)所述細(xì)胞約3天至約12天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述FGF為FGF-1、FGF-2或FGF-3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述TGFB為TGFB-UTGFB-2或TGFB-3。
9. 能通過權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法獲得的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表 型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的分離細(xì)胞群。
10. 人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的細(xì)胞群，其特征在 于所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞（1)包含⑶90、⑶105、⑶73、⑶63、⑶166、 堿性磷酸酶（ALP)更具體地為骨-肝-腎型ALP的表達(dá)，（2)不表達(dá)⑶45、⑶14、⑶19,以 及（3)少于15%的細(xì)胞表達(dá)!11^-01?。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的人骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞 的細(xì)胞群，其中所述骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞表型細(xì)胞還包含骨鈣蛋白（OCN)的表 達(dá)。
12. 權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)定義的細(xì)胞或細(xì)胞群，其用于治療骨相關(guān)疾病。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞或細(xì)胞群，其中向同種異體對(duì)象施用所述細(xì)胞或細(xì)胞群。
14. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)定義的細(xì)胞或細(xì)胞群并適用于將所 述細(xì)胞或細(xì)胞群施用在骨損傷部位處。
15. 裝置，其包含用于將組合物施用在骨損傷部位處的手術(shù)器械，還包含權(quán)利要求14 中定義的藥物組合物，其中所述裝置適于將所述藥物組合物施用在骨損傷部位處。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK104250633SQ201410427665
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2008年1月11日
【發(fā)明者】辛迪·巴德, 恩里科·巴斯蒂亞內(nèi)利, 澤維爾·佩塞斯 申請(qǐng)人:骨治療公司