基于dna條形碼的鑒別烏梢蛇的引物及pcr-rflp方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥品種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，提出一種鑒別烏梢蛇及其偽品的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR-RFLP)。本發(fā)明提出的PCR擴(kuò)增所用引物序列為：DK1-CO1：5’-CAA?CTA?ACC?ACA?AAG?ACA?TCG?G-3’，DK1-CO2：5’-CTT?CTG?GGT?GGC?CGA?AAAATC?A-3’；烏梢蛇的特征DNA堿基序列為：5’-ACTAGT-3’(位于COI序列第121位至126位)及5’-GGAAACC-3’(位于COI序列第353位至359位)；限制性內(nèi)切酶Spe?I可識別并切割特征序列5’-ACTAGT-3’，而限制性內(nèi)切酶BstE?II不能識別特征序列5’-GGAAACC-3’，兩種限制性內(nèi)切酶僅將烏梢蛇雙酶切成兩條片段。本發(fā)明鑒定過程為：提取樣本DNA；用引物DK1-CO1、DK1-CO2進(jìn)行PCR擴(kuò)增；純化PCR產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶Spe?I和BstE?II消化PCR產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果；通過與烏梢蛇的PCR-RFLP特征結(jié)果相比較，即可判斷供試品是否為烏梢蛇。本發(fā)明還提供用于鑒別方法的試劑盒。本發(fā)明方法準(zhǔn)確、快速、可靠，可廣泛用于中藥材鑒定。
【專利說明】基于DNA條形碼的鑒別烏梢蛇的引物及PCR-RFLP方法和試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥的品種鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鑒別烏梢蛇的引物及PCR-RFLP鑒定方法和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]烏梢蛇(Zaocys dhumnades)來源于游蛇科動物的干燥體,具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止疫之功效，用于風(fēng)濕頑痹、麻木拘攣、半身不遂、抽搐痙攣等。目前商品流通中烏梢蛇藥材的混淆品種越來越多，而且游蛇科的常見種類都有可能被當(dāng)做烏梢蛇，難以根據(jù)形態(tài)學(xué)上的特征進(jìn)行單一鑒別，使得品種的鑒定越來越困難。因此尋找快速、準(zhǔn)確的方法鑒別烏梢蛇是保證烏梢蛇用藥安全的重要任務(wù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確鑒別烏梢蛇的PCR-RFLP分子鑒定方法，包括烏梢蛇的特征DNA堿基序列、一對PCR引物、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、鑒定方法及其試劑盒。
[0004]本發(fā)明基于DNA條形碼。DNA條形碼(DNA barcoding)是利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)DNA片段對物種進(jìn)行識別和鑒定的一項(xiàng)新技術(shù)。2003年Herbert等選取線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I的一段序列在動物界不同分類水平上(門、目、種)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無論在哪個(gè)分類水平上該基因都具有良好的識別能力，從而提出建立以一段長度為650bp的COI基因序列為基礎(chǔ)的條形碼識別方法。隨后的研究表明，COI (線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I)基因序列種內(nèi)變異小，種間變異大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，對動物物種的識別和鑒定切實(shí)可行，被公認(rèn)為動物界中標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼基因。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:首先從各樣本中提取總DNA，利用引物DKl-COl及DK1-C02,用PCR方法擴(kuò)增COI片段，經(jīng)純化后，對該片段進(jìn)行DNA序列測定，將所得序列登錄到Genbank系統(tǒng)獲得登錄號，并建立各樣品的DNA序列數(shù)據(jù)庫；在比較數(shù)據(jù)庫DNA序列的基礎(chǔ)上，得到烏梢蛇的特征DNA堿基序列:5’ -ACTAGT-3’ (位于COI序列第121位至126位)，該序列可被限制性內(nèi)切酶Spe I識別并切割；然而該特征DNA序列并非烏梢蛇所特有，在金錢白花蛇原動物銀環(huán)蛇的COI序列中也存在該特征序列，為了有效區(qū)分烏梢蛇與銀環(huán)蛇，本發(fā)明人加選了烏梢蛇的另一特征DNA序列5’ -GGAAACC-3’ (位于COI序列第353位至359位)，在銀環(huán)蛇的相同位點(diǎn)出現(xiàn)的是5’ -GGTAACC-3’，僅有銀環(huán)蛇的特征序列可被限制性內(nèi)切酶BstE II識別并切割；序列5’ -ACTAGT-3’與序列5’ -GGAAACC-3’共同組成烏梢蛇的特征DNA序列，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列(5’-ACTAGT-3’)的限制性內(nèi)切酶Spe I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列(5’-GGAAACC-3’)的限制性內(nèi)切酶BstEII，共同對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，產(chǎn)生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜，通過分析上述雙酶切圖譜差異，達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒別烏梢蛇的目的。
[0006]對需要鑒定的烏梢蛇樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(DK1-C0UDK1-C02)擴(kuò)增，供試品能夠擴(kuò)增出一段DNA片段；用限制性內(nèi)切酶Spe I及BstEII對供試品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，烏梢蛇會出現(xiàn)分子量為121bp和537bp的兩條DNA片段，而其它種類的蛇不出現(xiàn)上述兩條片段或多于上述兩條片段。當(dāng)供試品經(jīng)本法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶雙酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準(zhǔn)確鑒定供試品是否為烏梢蛇。
[0007]本發(fā)明用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP方法的PCR擴(kuò)增引物，所述引物序列為:
[0008]DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
[0009]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
[0010]本發(fā)明用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP分子鑒定方法，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5’ -ACTAGT-3’的限制性內(nèi)切酶Spe I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5 ’ -GGAAACC-3 ’的限制性內(nèi)切酶BstE 11，共同對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，產(chǎn)生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；具體步驟如下:
[0011]I)提取待測樣品DNA ；
[0012]2)擴(kuò)增DNA片段，PCR反應(yīng)參數(shù)包括:93°C預(yù)變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復(fù)性45s，70。。延伸45s, 35個(gè)循環(huán);70°C延伸5min。所述引物DKl-COl和DK1-C02，其序列為:
[0013]DKl-COl:5’ -CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]3)純化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0016]4)純化產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Spe I和BstE II進(jìn)行雙酶切，限制性內(nèi)切酶SpeI酶切位點(diǎn)為:A~CTAGT ;限制性內(nèi)切酶BstE II的酶切位點(diǎn)為:G~GTNACC ；
[0017]5)瓊脂糖凝膠電泳分析；
[0018]6)鑒定結(jié)果的判斷，若在所述電泳產(chǎn)物中檢測到分子量為121bp和537bp的兩條片段，則待測樣品為烏梢蛇；若不出現(xiàn)上述兩條片段或多于兩條片段，則供試品不為烏梢蛇。
[0019]本發(fā)明方法中，步驟I)和3)中，采用現(xiàn)有技術(shù)的試劑盒提取DNA及純化PCR產(chǎn)物的方法，不需要配制任何試劑，使得操作時(shí)間大大縮短。
[0020]本發(fā)明還提出了一種用于烏梢蛇PCR-RFLP鑒定方法的試劑盒。所述試劑盒包括:引物DKl-COl(1yM);引物DK1-C02 (10 μ M) ；2XTaq DNA聚合酶混合緩沖液，其包括:TaqDNA聚合酶(0.1U/ μ L)，四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500 μ Μ)，Tris-HCl (20 μ Μ、ρΗ8.3)，KCl (100 μ Μ)，MgCl2 (3 μ Μ)等；Spe I 酶(1U/ μ L) ；BstE II 酶(?ου/μ L);酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
[0021]綜上所述，本發(fā)明解決了鑒定烏梢蛇與其它品種蛇的難題，提供了鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應(yīng)條件、烏梢蛇特征DNA堿基序列、兩種限制性內(nèi)切酶、鑒定方法及其試劑盒，建立了快速、便捷、準(zhǔn)確的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證烏梢蛇的藥材質(zhì)量，打擊烏梢蛇偽品的市場行為具有重要的價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為各樣本擴(kuò)增COI條形碼序列PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果:1.銀環(huán)蛇2.金環(huán)蛇3.眼鏡蛇4.赤鏈蛇5.灰鼠蛇6.黑背白環(huán)蛇7.玉斑錦蛇8.百花錦蛇9.赤鏈華游蛇10.滑鼠蛇11.烏梢蛇12.黃斑漁游蛇13.陰性對照(其它反應(yīng)條件不變，以水替代模板DNA)；MK.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn):從上到下依次為 1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
[0023]圖2各樣本PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果:1.銀環(huán)蛇2.金環(huán)蛇3.眼鏡蛇4.赤鏈蛇5.灰鼠蛇6.黑背白環(huán)蛇7.玉斑錦蛇8.百花錦蛇9.赤鏈華游蛇10.滑鼠蛇11.烏梢蛇12.黃斑漁游蛇；MK.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn):從上到下依次為1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、10bp0

【具體實(shí)施方式】
[0024]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0025]1、材料
[0026]12份蛇類原動物，主要采自廣東省、湖南省、廣西壯族自治區(qū)(表1)。全部樣本均由華南瀕危動物研究所張亮進(jìn)行性狀鑒定。
[0027]表1 12份蛇類原動物樣本
[0028]

【權(quán)利要求】
1.用于鑒別烏梢蛇PCR-RFLP方法的PCR擴(kuò)增引物，其特征在于，所述引物序列為:
DKl-COl:5，-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3，；
DK1-C02:5’ -CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。
2.一種烏梢蛇的PCR-RFLP鑒定方法，其特征在于，利用能夠識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5’ -ACTAGT-3’的限制性內(nèi)切酶Spe I，與不能識別烏梢蛇特征DNA堿基序列5 ’ -GGAAACC-3 ’的限制性內(nèi)切酶BstE 11，共同對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，產(chǎn)生瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜；所述鑒定方法包括以下步驟: 1)樣品DNA的提?。? 2)擴(kuò)增DNA片段:利用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，得到聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物，所述PCR反應(yīng)參數(shù)包括:93°C預(yù)變性5min，55°C 2min ;93°C變性30s，55°C復(fù)性45s, 70°C延伸 45s, 35 個(gè)循環(huán);70°C延伸 5min ； 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化PCR產(chǎn)物； 4)在所述PCR純化產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶SpeI和BstE II進(jìn)行雙酶切，所述限制性內(nèi)切酶Spe I的酶切位點(diǎn)為A'CTAGT ;所述限制性內(nèi)切酶BstE II的酶切位點(diǎn)為G'GTNACC ； 5)瓊脂糖凝膠電泳分析； 6)鑒定結(jié)果的判斷:若在所述電泳產(chǎn)物中檢測到分子量為121bp和537bp的兩條片段，則待測樣品為烏梢蛇；若不出現(xiàn)上述兩條片段或多于兩條片段，則供試品不為烏梢蛇。
3.一種用于烏梢蛇PCR-RFLP鑒定方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:10μΜ引物 DKl-COl ;10y]\^_DKl-C02 ；2XTaq DNA 聚合酶混合緩沖液，其包括:0.1U/μ L TaqDNA 聚合酶，dATP、dTTP、dCTP 及 dGTP 各 500yM，20yMTris-HCl、pH8.3,100 μ M KCl,3yMMgCl2 ;10υ/μ L Spe I酶；10U/yL BstE II酶；酶切緩沖液；終止緩沖液；滅菌雙蒸水。
【文檔編號】C12N15/11GK104164494SQ201410348910
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】晁志 申請人:晁志