一株高產(chǎn)油蓮園綠球藻及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)油蓮園綠球藻及其用途。本發(fā)明的蓮園綠球藻(Chlorococcum?lianyuanensis)于2013年12月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC?No.8605。蓮園綠球藻可以在生產(chǎn)生物柴油、處理生活廢水、生產(chǎn)色素、固定二氧化碳或作為漁業(yè)養(yǎng)殖中的開口餌料中的應(yīng)用。
【專利說明】一株高產(chǎn)油蓮園綠球藻及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物及生物能源【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高產(chǎn)油蓮園綠球藻及其用 途。

【背景技術(shù)】：
[0002] 微藻是生產(chǎn)生物柴油的理想原料，但高生產(chǎn)成本制約了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，利用微藻 生產(chǎn)生物柴油首先需要獲得具有優(yōu)良性狀的產(chǎn)油微藻藻株，但目前已報(bào)道的產(chǎn)油微藻仍然 存在諸多缺點(diǎn)：
[0003] 1)藻種的生長速度慢且生物量低，特別是在油脂快速積累期，絕大部分藻種的生 物量低于4. 0g Γ1，無法滿足下游生物柴油提煉的原料需求。
[0004] 2)許多微藻僅可在逆境條件下積累較高含量的油脂，但逆境條件下微藻的生長受 到嚴(yán)重抑制，導(dǎo)致生物質(zhì)積累量降低，而在正常培養(yǎng)階段，其油脂含量低于30 %，無法滿足 規(guī)?；a(chǎn)的需要。
[0005] 3)中性脂含量未公布或相對較低，微藻脂類可分為中性脂、糖脂和磷脂，其中中 性脂是生產(chǎn)生物柴油的最理想材料，而過高含量的糖脂和磷脂將會(huì)嚴(yán)重影響生物柴油的品 質(zhì)。
[0006] 4) -些產(chǎn)油微藻，如小球藻，其細(xì)胞體積較少，米收困難，目前針對此類微藻的米 收方法僅有高速離心，設(shè)備成本高，能耗大，導(dǎo)致微藻生物柴油成本增加。
[0007] 5)產(chǎn)油微藻的耦合培養(yǎng)方式研發(fā)不足。微藻生物柴油的高成本是制約其產(chǎn)業(yè)化開 發(fā)的主要瓶頸，獲得可在生活廢水生長的產(chǎn)油微藻，并以生活廢水替代部分營養(yǎng)鹽培養(yǎng)產(chǎn) 油微藻，在生產(chǎn)生物柴油的同時(shí)凈化環(huán)境，具有雙重作用。目前已公開的專利中，一些專利 產(chǎn)油微藻不能在廢水中生長，如衣藻，另外，一些專利產(chǎn)油微藻并未提及其廢水處理特性。
[0008] 世界能源危機(jī)的加劇激發(fā)了科學(xué)家探尋持續(xù)、可再生、環(huán)境友好型能源形式的興 趣，產(chǎn)油微藻（oleaginous microalgae)相對于其他陸生高等油料作物具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡 單、光合效率高、生長速率快、單位面積油脂產(chǎn)量高、可合成高附加值產(chǎn)品、可在廢水中生 長、同時(shí)可吸收二氧化碳（發(fā)電廠、水泥廠等）凈化環(huán)境等優(yōu)勢，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油 (biodiesel)的理想原料。
[0009] 微藻種類多樣，目前自然界中發(fā)現(xiàn)的微藻種類已超過40, 000種，不同門類的藻類 在形態(tài)、生長特性、環(huán)境適應(yīng)性、營養(yǎng)需求、油脂積累特性和脂肪酸組成等方面存在較大差 異，上述差異為產(chǎn)油藻株的篩選提供了廣闊的空間。正常條件下，綠藻的平均總脂含量為 25. 5% DW，硅藻為22.7% DW，其他藻類（金藻綱，真眼點(diǎn)藻綱，甲藻門，黃藻綱和紅藻綱） 為27. 1% DW，而在脅迫條件下綠藻的總脂含量提高為45. 7 % DW，硅藻提高為44. 6 % DW，其 他藻類（金藻綱，真眼點(diǎn)藻綱，甲藻門，黃藻綱和紅藻綱）提高為44. 6% DW，藍(lán)藻中未發(fā) 現(xiàn)儲(chǔ)藏性脂類的積累。選育性能優(yōu)越的藻株是開展產(chǎn)油微藻生理生化研究和產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)的 基礎(chǔ)，可用于產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)的工程藻株應(yīng)具備：（1)生長速度快、生物質(zhì)濃度高；（2)油脂積累 速度快且含量高；（3)廣溫適應(yīng)性；（3)易培養(yǎng)，可抵抗環(huán)境中細(xì)菌、雜藻、真菌、原生動(dòng)物、 變形蟲侵害；(4)具有較低的夜間呼吸作用；（5)具備遺傳改造的可行性。
[0010]目前產(chǎn)油微藻藻種資源開發(fā)中存在的問題主要包括：1)專利藻種較少，目前已申 請專利保護(hù)的產(chǎn)油微藻主要集中在小球藻和柵藻兩種類型，其他藻類（如硅藻、金藻等）較 少報(bào)道；2)小球藻細(xì)胞相對較小，后續(xù)采收成本高；3)產(chǎn)油微藻用途單一，按目前微藻生物 柴油的成本進(jìn)行核算，遠(yuǎn)不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要，如能進(jìn)行整合技術(shù)研發(fā)，將在一定程 度上降低微藻生物柴油的生產(chǎn)成本，如耦合廢水處理、耦合二氧化碳減排、耦合高附加值活 性物質(zhì)的開發(fā)等；4)目前已報(bào)道的大部分藻株與理想的工程藻株還存在一定差距（生長速 率、總脂產(chǎn)量、抗逆性等），不具備規(guī)?；囵B(yǎng)價(jià)值。綜上所述，目前已公開的產(chǎn)油微藻藻株 并不能完全用于微藻生物產(chǎn)油的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中，有必要進(jìn)行新資源產(chǎn)油微藻的持續(xù)探索。 [0011]目前已公開的"微藻生物柴油專利"中，涉及藻種保護(hù)的專利主要包括：
[0012] 1) 一株小球藻及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用（專利申請?zhí)枺篊N201110145547. 7)，該發(fā)明公 開了一株小球藻藻株（Chlorella sp. MRA-1，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4652)，該藻可適應(yīng)多種 培養(yǎng)基、溫度、氮源濃度、C02濃度條件，在低氮條件下的油脂含量和產(chǎn)率高，該藻株可應(yīng)用 在co 2的固定，廢水的凈化，油脂、蛋白質(zhì)、色素、淀粉、多糖、核酸等生物質(zhì)的生產(chǎn)。
[0013] 2)柵藻藻株及其應(yīng)用（專利申請?zhí)枺篊N201210318629. 1)，該發(fā)明公開了一種柵藻 藻株（Scenedesmus sp.，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6347)及其應(yīng)用，該藻具有生長速度快、油 脂積累快、含油量高、能夠有效去除水中的含氮化合物等優(yōu)點(diǎn)，可用于生物柴油、食品、保健 品、飼料、水產(chǎn)品餌料、藥物以及化妝品和色素的生產(chǎn)。
[0014] 3) -種柵藻藻株及其用途（專利申請?zhí)枺篊N201110448718. 3)，該柵藻 (Desmodesmus sp·，保藏編號(hào)為CGMCC No.5150)能夠在較大的溫度范圍內(nèi)生長，生長速度 快且易于收集，并且能夠有效產(chǎn)生脂肪酸、類胡蘿卜素等物質(zhì)，具有在污水處理、生物柴油 生產(chǎn)、以及飼料或食品行業(yè)等應(yīng)用的潛力。
[0015] 4)小球藻Yun-32及其制備方法（專利申請?zhí)枺篊N201010143672. X)，該發(fā)明公開 了一種小球藻Yun-32(保藏編號(hào)為：CCTCC NO M2010071)。該藻株能在自養(yǎng)培養(yǎng)條件下快 速生長并積累油脂，油脂含量高，其制備培養(yǎng)方法的工藝過程簡單、培養(yǎng)周期短、投入低和 易于保存等特點(diǎn)，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0016] 5) 一株淡水小球藻Chlorella pyrenoidosa XJ01及其在固定C02和生產(chǎn)微藻油 脂中的應(yīng)用（專利申請?zhí)枺篊N201310187830.5)，該藻（保藏編號(hào)為：CCTCC NO M2013103) 能夠高效固定〇. 03?20 %的C02，脂肪酸組成主要為C16、C18脂肪酸，適合生物柴油的生產(chǎn)。
[0017] 6) -株柵藻藻株及其應(yīng)用（專利申請?zhí)枺篊N201110427579.6)，該藻（保藏編號(hào)為 CGMCC N0. 4323)具有耐高溫、易收集的特點(diǎn)，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，適于高密度養(yǎng)殖，可用于含氮 磷污水的處理、二氧化碳減排、生物柴油生產(chǎn)或用于水產(chǎn)品餌料或動(dòng)物飼料等，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用 潛力較大。
[0018] 7) -株衣藻藻株及其應(yīng)用（專利申請?zhí)枺篊N201010002968.X)，該衣藻（保藏編號(hào) 為CGMCC No. 3577)油脂含量較高，可應(yīng)用于制備生物柴油、飼料或食用油。
[0019] 通過對已申請專利保護(hù)的產(chǎn)油藻株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，一些產(chǎn)油微藻雖然具有較高的 油脂含量，但其生物質(zhì)濃度較低，產(chǎn)業(yè)化潛力不明顯；還有一些產(chǎn)油微藻存在采收成本高、 抗生物污染能力弱等問題。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0020] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種可用于微藻油脂生產(chǎn)的高產(chǎn)油能源的微藻一蓮 園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)，該藻株具有生長速率快、油脂含量高、細(xì)胞體積 大等特點(diǎn)，可利用生活廢水作為營養(yǎng)液進(jìn)行生長。
[0021] 本發(fā)明的蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月6日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC No. 8605。
[0022] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是上述蓮園綠球藻在生產(chǎn)生物柴油、處理生活廢水、生產(chǎn)色 素、固定二氧化碳或作為漁業(yè)養(yǎng)殖中的開口餌料中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)相比于現(xiàn)有技術(shù)中的微藻， 具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1)蓮園綠球藻在正常培養(yǎng)條件下的生物量可達(dá)8. 89g Γ1，其總脂含量可占細(xì)胞干 重的55. 54% (大多為三酰甘油TAG)，總脂產(chǎn)量4. 94g Γ1，脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)，蓮園綠球 藻的脂肪酸以C16:0和C18:1為主，適宜用來生產(chǎn)生物柴油。
[0025] 2)蓮園綠球藻可利用生活廢水作為營養(yǎng)液進(jìn)行生長，大幅度降低生活廢水中的 氮、磷和重金屬元素的濃度，起到凈化環(huán)境的目的；另一方面可以減少營養(yǎng)鹽的需求，降低 微藻的培養(yǎng)成本。
[0026] 3)蓮園綠球藻的細(xì)胞體積較大、結(jié)構(gòu)簡單，易采收，大細(xì)胞也是基礎(chǔ)研究的理想材 料。
[0027] 4)蓮園綠球藻還含有一些有益的色素，可以應(yīng)用到色素生產(chǎn)領(lǐng)域。
[0028] 5)蓮園綠球藻可以作為漁業(yè)養(yǎng)殖中的開口餌料，也可以作為動(dòng)物飼料的添加劑。
[0029] 因此，本發(fā)明的蓮園綠球藻可應(yīng)用在產(chǎn)油微藻的基礎(chǔ)研究、油脂生產(chǎn)、生活廢水處 理、色素生產(chǎn)、二氧化碳固定、餌料和飼料開發(fā)等，具有非常重要的開發(fā)利用潛力。
[0030] 本發(fā)明的蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月06日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC No. 8605。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0031] 圖1為蓮園綠球藻細(xì)胞的形態(tài)，其中A為放大40倍，B為放大40倍，C為放大17500 倍；
[0032] 圖2為蓮園綠球藻的生長曲線；
[0033] 圖3為蓮園綠球藻色素組成
[0034] 圖4為蓮園綠球藻脂肪酸組成；
[0035] 圖5為蓮園綠球藻在生活廢水中生長狀況；
[0036] 圖6為蓮園綠球?qū)φ右旱乃|(zhì)凈化的能力；
[0037] 圖7為蓮園綠球?qū)φ右褐胁糠种亟饘匐x子的去除效果。

【具體實(shí)施方式】：
[0038] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0039] 實(shí)施例1 :
[0040] 本發(fā)明的蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)分離自水深較淺的人造湖 水體，該蓮園綠球藻為單細(xì)胞，橢圓形，細(xì)胞壁較薄或常見不規(guī)則增厚，色素體在新生細(xì)胞 中呈周生、杯狀，具1個(gè)蛋白核，細(xì)胞逐漸成熟后分散并充滿整個(gè)細(xì)胞；細(xì)胞核1個(gè)，淀粉顆 粒多個(gè)；無性繁殖形成多數(shù)動(dòng)孢子，偶爾亦會(huì)形成不動(dòng)孢子（圖1)。蓮園綠球藻細(xì)胞大小 在8-12 μ m，細(xì)胞較大。
[0041] 1.環(huán)境條件：
[0042] 蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)適宜生長溫度為15_30°C，光照強(qiáng)度 為10-1000 μ mol photons mS1，pH為6-10,可在(1)2濃度為0-10%的通氣條件下生長。
[0043] 2.營養(yǎng)條件：
[0044] a). NaN03100-1500mg/L ；b). Κ2ΗΡ04 · 3H2010-100mg/L ；c). MgS04 · 7H2010-80mg/ L ；d) . CaCl2 · 2H2010-5 0mg/L ；e) . NaC03l〇-30mg/L ；f) . FeCl3 · 6H202-6mg/ L ；g). Citric acid4_8mg/L ;h) · EDTANa22_5mg/L ;i) · H3B032_4mg/L ; j). MnCl2 · 4H201-2mg/L ；k). ZnS04 · 7H200. l-〇. 3mg/L ；1). Na2Mo04 · 2H200. 2-0. 4mg/L ； m) · Co (N03)2 · 6H200. 02-0. 05mg/L ;n) · CuS04 · 5H200. 06-0. 09mg/L。
[0045] 3、蓮園綠球藻的總脂百分含量的分析和脂肪酸成份分析
[0046] 蓮園綠球藻在正常培養(yǎng)條件（BG-11培養(yǎng)基，其他為常規(guī)條件）下的生物量可達(dá) 8. 89g 圖2)，其總脂含量可占細(xì)胞干重的55. 54% (大多為三酰甘油TAG)，總脂產(chǎn)量 4. 94g Γ1，脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)，蓮園綠球藻的脂肪酸以C16:0和C18:1為主，適宜用來生 產(chǎn)生物柴油（圖4)，其細(xì)胞體積較大，易于采收。該藻色素中含有β-胡蘿卜素和葉黃素， 可以用于色素的生產(chǎn)（圖3)，以及作為飼料添加劑，可以提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值。蓮園綠球藻 細(xì)胞大小在8-12 μ m，可用于漁業(yè)養(yǎng)殖的開口餌料。
[0047] 其中總脂百分含量分析方法為：
[0048] 準(zhǔn)確稱取100_150mg凍干藻粉于螺口玻璃瓶中，加入2mL10% DMS0溶于甲醇（體 積比）溶劑，加熱到45攝氏度，攪拌45分鐘，3000rpm，離心10min，收集上清；再重復(fù)以上 步驟兩次；之后取4mL乙醚：己烷=1 :1(體積比）溶劑加入樣品中，加熱到45攝氏度攪拌 60min，離心10min，收集上清液，再重復(fù)步驟兩次，合并所得上清液；添加6mL去離子水使溶 液分層，上層包含總脂成分，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱蒸發(fā)溶劑后轉(zhuǎn)移含有少量溶劑的總脂到預(yù) 稱重的EP管中，在氮保護(hù)下蒸發(fā)溶劑至恒重，稱重求得總脂含量。
[0049] 其中脂肪酸成分的分析方法為：
[0050] 稱取2〇1^凍干藻粉，置于1〇1^帶蓋玻璃管中，加入2.5 1^含有2%硫酸的甲醇溶 液，震蕩均勻，密閉容器在80攝氏度水浴中攪拌加熱2. 5小時(shí)（每半小時(shí)觀察攪拌情況）； 冷卻卻到室溫后，加入lmL飽和食鹽水和lmL正己烷（高效氣相色譜液），震蕩均勻后靜置 分層；上層正己烷有機(jī)相通過無水硫酸鈉過濾（在5mL大槍頭中加入小塊脫脂棉，再添加無 水硫酸鈉），再用3-4mL正己烷沖洗，氮吹蒸發(fā)多余溶劑至lmL容量瓶中；最后加入C17作 為內(nèi)標(biāo)，再加入色譜級(jí)正己烷定容至lmL，進(jìn)行色譜分析。
[0051] 該蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)于2013年12月06日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)：CGMCC No. 8605。
[0052] 實(shí)施例2 :蓮園綠球藻處理生活廢水
[0053] 1.廢水來源
[0054] 實(shí)驗(yàn)中的廢水取自廣東省廣州市某果蔬農(nóng)貿(mào)市場的果蔬垃圾經(jīng)發(fā)酵后的廢棄沼 液與BG-11培養(yǎng)基混合，配制出不同實(shí)驗(yàn)組的具有體積濃度梯度的廢水培養(yǎng)基。
[0055] 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0056] 實(shí)驗(yàn)以BG-11培養(yǎng)基為對照組，分別用BG-11將沼液稀釋為25%、50%、75%和 100% (體積比），然后接入蓮園綠球藻，利用管式光生物反應(yīng)器通氣培養(yǎng)8天，通過測定單 位體積葉綠素含量（mg/L)反映蓮園綠球藻生長及對果蔬垃圾發(fā)酵廢液的適應(yīng)性，并運(yùn)用 普通光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化，收獲藻粉用于總脂和碳水化 合物含量的測定，通過測定對果蔬垃圾發(fā)酵廢液的COD、TN、TP、色度及Pb、As、Cu等十四種 金屬元素含量變化，評價(jià)蓮園綠球藻對果蔬垃圾發(fā)酵廢液的凈化效果。
[0057] 3.處理效果
[0058] 蓮園綠球藻對沼液的適應(yīng)性較好，可作為廢水培養(yǎng)的優(yōu)良藻種，生物量在一定濃 度的沼液培養(yǎng)基里優(yōu)于BG-11培養(yǎng)基的，最高含量是BG-11的2倍（圖5);顯微鏡觀察發(fā) 現(xiàn)，沼液培養(yǎng)中，細(xì)胞均較大，細(xì)胞密度大，電鏡顯示，細(xì)胞中積累了大量的碳水化合物，但 是形態(tài)和數(shù)量有較大區(qū)別，其中低體積濃度沼液培養(yǎng)基中常規(guī)的淀粉顆粒較多；蓮園綠球 藻對果蔬垃圾發(fā)酵后的廢棄液的凈化效果也十分顯著，能有效的降低其C0D、TN、TP，其中最 突出的是總氮的去除率可達(dá)到63. 39% (圖6);培養(yǎng)后，廢沼液的色度降低，原液中多種對 人體有害的重金屬元素去除率超過60% (圖7,原液為原始的沼液）。
[0059] 蓮園綠球藻可利用生活廢水作為營養(yǎng)液進(jìn)行生長，大幅度降低生活廢水中的氮、 磷和重金屬元素的濃度。微藻在培養(yǎng)過程中通過光合作用可高效固定二氧化碳，用在二氧 化碳固定減排領(lǐng)域。
【權(quán)利要求】
1. 蓮園綠球藻（Chlorococcum lianyuanensis)，其保藏號(hào)為：CGMCC Ν〇·8605。
2. 權(quán)利要求1所述的蓮園綠球藻在生產(chǎn)生物柴油、處理生活廢水、生產(chǎn)色素、固定二氧 化碳或作為漁業(yè)養(yǎng)殖中的開口餌料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/12GK104140930SQ201410333181
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】袁振宏, 許瑾, 王忠銘, 孔曉英, 朱順妮 申請人:中國科學(xué)院廣州能源研究所