一種同時檢測人的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型副流感病毒的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域,涉及一種以TaqMan探針為基礎(chǔ)的同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR方法。本發(fā)明針對人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的HN基因的保守序列設(shè)計特異性引物和探針,建立了含內(nèi)質(zhì)控的一步法多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測方法,操作簡便快捷,克服了常規(guī)單重?zé)晒釸T-PCR單孔單檢的繁瑣,簡化了操作程序,節(jié)省了試驗(yàn)成本,利用其較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性為病毒的現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評價、臨床診斷等方面提供了有力的技術(shù)支撐。
【專利說明】—種同時檢測人的I型、M型及I I I型副流感病毒的方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域,尤其是用于人的I型、II型及III型副流感病毒的同時檢測與鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002]人副流感病毒(Human parainfluenza viruses, HPIVs)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)是一種能引起感冒并誘發(fā)氣管炎、支氣管炎和肺炎的主要病原體之一,人群普遍易感。副流感病毒粒子呈球形,有包膜,直徑一般為150~250nm,基因組由不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA組成,包含大約15000個堿基,編碼至少6種常見的結(jié)構(gòu)蛋白(3,-N-P-C-M-F-HN-L-5,)。人副流感病毒(HPIVs)可分以分為4個血清型(HPIV1-4),HPIV-4根據(jù)抗原性的不同又被分成A和B兩個亞型。HPIV-1和HPIV-3屬于人鼻病毒屬,而PIV2和PIV4屬于腮腺炎病毒屬。HPIV-1、HPIV-2和HPIV-3在嬰幼兒、兒童和免疫缺陷人群中引起下呼吸道感染的主要病原體,同時又是青少年和成年人上呼吸道感染的病原體。特別是HPIV-1和HPIV-3是常常在公共場所引起呼吸道感染主要原因之一,而HPIV-4引起的感染一般癥狀比較輕微,臨床上意義不大,很少引起呼吸道感染的暴發(fā)。所以本發(fā)明檢測方法只針對HPIV1-3三個型別的鑒定。
[0003]人副流感病 毒的HN基因編碼的HN蛋白屬于膜蛋白,主要功能是通過與細(xì)胞唾液酸受體的結(jié)合,促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞的黏附,并且與病毒的釋放有關(guān)。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HN也是主要的保護(hù)性抗原之一,相應(yīng)的抗體對病毒具有中和作用,因此HN成為臨床檢測以及疫苗研究的主要目標(biāo)蛋白之一。
[0004]目前,國內(nèi)外檢測副流感病毒的經(jīng)典方法是病毒的分離培養(yǎng),但是其操作煩瑣,耗費(fèi)時間長;電鏡、免疫組化、ELISA、常規(guī)PCR等具有各自突出的優(yōu)點(diǎn),但都很難檢測微量核酸和準(zhǔn)確定量,20世紀(jì)末發(fā)展起來的實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time fluorescentquantitative PCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對模板的定性和定量,而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)驗(yàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具有實(shí)時性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。因而,在呼吸道病原體檢測中具有巨大應(yīng)用優(yōu)勢。相對普通PCR及單熒光PCR,多重?zé)晒釶CR具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)檢測效率高,即多重?zé)晒釶CR可以實(shí)現(xiàn)一管多檢,通過收集的不同波長的熒光信號來區(qū)分不同的檢測對象,從而簡化操作流程;(2)節(jié)省試劑成本和人員操作時間,尤其在開展大量樣品檢測時,可以顯著地降低檢測成本和操作時間。(3)本方法中含內(nèi)質(zhì)控基因的監(jiān)控,在各類標(biāo)本中,存在各種影響或抑制PCR反應(yīng)的因素,且在標(biāo)本的采集處理、核酸提取、擴(kuò)增和分析過程中,也可能因人為操作失誤而導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性檢測結(jié)果。因此本申請采用內(nèi)質(zhì)控的方法,在標(biāo)本中含有的內(nèi)質(zhì)控基因(LDHA)經(jīng)歷檢測標(biāo)本核酸提取、加樣、PCR擴(kuò)增及信號檢測的全過程,從而可對每一份標(biāo)本實(shí)施監(jiān)控。
[0005]本發(fā)明成功建立的可同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR方法,采用LDHA作為內(nèi)質(zhì)控,可以有效監(jiān)控樣本中的PCR抑制因素以及由操作誤差所造成的假陰性結(jié)果。并且該方法除了具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測效率高及穩(wěn)定性的特點(diǎn)之外,其檢測所需要RNA量較少,且操作簡便快速,在副流感病毒的現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評價、臨床診斷等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。并有利于進(jìn)一步深入研究相關(guān)病原體感染的分子機(jī)理和免疫調(diào)節(jié)機(jī)理、開展有效的臨床治療等方面顯示出良好的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明是由國家“十二五”科技重大專項(xiàng)2012ZX10004206-002支持的。我們成功設(shè)計和合成了針對人的I型、II型及III型副流感病毒相應(yīng)HN基因特異性引物和探針。基于此引物和探針,我們建立了一步法含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR檢測方法。該方法通過對多種相關(guān)病毒的檢測、標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建、與商品化單重?zé)晒釸T-PCR診斷試劑盒比較、重復(fù)性試驗(yàn)等,說明該方法具有較高的特異性、靈敏度、高效性和穩(wěn)定性。
[0007]在本發(fā)明的第一方面,提供了一種針對人的I型、II型及III型副流感病毒HN基因的特異性引物和探針序列,如SEQ NO:1至12所示。
[0008]在本發(fā)明的第二方面,提供一種同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的試劑盒,該試劑盒中含有第一方面所述引物和探針。
[0009]在一個實(shí)施方案中,所述試劑盒包括以下成份:
[0010]a)反應(yīng)緩沖液,所述緩沖液為常規(guī)PCR反應(yīng)緩沖液; [0011]b)反應(yīng)酶,所述反應(yīng)酶為常規(guī)PCR反應(yīng)酶;
[0012]c) SEQ NO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物;
[0013]d)SEQN0:3、6、9、12 所示的探針;
[0014]e)無RNA酶的水。
[0015]其中如SEQNO:3所示的人I型副流感病毒的HN基因探針5’端由FAM標(biāo)記,3’端由BHQl標(biāo)記;如SEQ NO:6所示的人II型副流感病毒的HN基因探針5’端由JOE標(biāo)記,3’端由BHQl標(biāo)記;如SEQ NO:9所示的人III型副流感病毒的HN基因探針5’端由ROX標(biāo)記,3’端由BHQ2標(biāo)記;如SEQ NO:12所示的質(zhì)控基因LDHA基因探針5’端由CY5標(biāo)記,3’端由BHQ2標(biāo)記。
[0016]在一個具體實(shí)施方案中,所述方法為一步法多重?zé)晒釸T-PCR檢測試劑盒的具體應(yīng)用,并使用所述引物和探針作為檢測序列。
[0017]在本發(fā)明的第三方面,提供一種同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的PCR擴(kuò)增方法,該方法使用第二方面所述的試劑盒。
[0018]在一個實(shí)施方案中,所述方法包括以下步驟:
[0019]a)四個熒光通道的設(shè)置;
[0020]b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時間;
[0021]c)預(yù)熱的溫度與時間;
[0022]d)熱循環(huán)(預(yù)熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù));
[0023]e)以界定的Ct值來判定檢測結(jié)果。
[0024]在本發(fā)明的第四方面,提供第一方面所述引物和探針在制備人的I型、II型及III型副流感病毒的檢測試劑中的應(yīng)用?!緦@綀D】
【附圖說明】
[0025]圖1.人I型副流感病毒、人II型副流感病毒、人III型副流感病毒一步法含內(nèi)質(zhì)控的多重?zé)晒釸T-PCR檢測方法的特異性鑒定,其中:
[0026]圖1A為同時加入人I型副流感病毒、人II型副流感病毒、人III型副流感病毒陽性模板的熒光擴(kuò)增圖。
[0027]圖1B為加入其他7種呼吸道多病原的陽性模板的熒光擴(kuò)增圖(以甲型流感病毒為例)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明所述人的I型、II型及III型副流感病毒多重?zé)晒釸T-PCR檢測方法,是基于相應(yīng)型別HN基因保守區(qū)設(shè)計的特異性引物和探針。
[0029]本發(fā)明的技術(shù)途徑是首先利用Appl ied B1systems (ABI)公司開發(fā)的PrimerExpress3.0軟件、針對人的I型、II型及III型副流感病毒相應(yīng)HN基因的保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針序列,確定了最佳配制體系及上機(jī)擴(kuò)增程序,并且進(jìn)行特異性、靈敏度及穩(wěn)定性等驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),成功建立了人的I型、II型及III型副流感病毒一步法多重?zé)晒釸T-PCR快速檢測方法。下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件和方法,如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Sambrook, et al.New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)及實(shí)時熒光PCR技術(shù)(李金明,2007)中所述方法或試劑制造商提供的方法。 [0030]同時,需要指出的是,本發(fā)明所述的檢測方法和試劑盒不僅應(yīng)用于對患者(人、動物)的樣品進(jìn)行檢測,也包括對環(huán)境中的水樣品、食物樣品、空氣樣品、微生物樣品、動物細(xì)胞樣品等多種樣品的非診斷目的的檢測。其應(yīng)用也都是本領(lǐng)域技術(shù)的常用技術(shù)手段,并不需要進(jìn)行特別的、富有創(chuàng)造性的改變。
[0031]實(shí)施例1.人的I型、II型及III型副流感病毒各型別HN基因特異性引物和探針設(shè)計與合成
[0032]1.1人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的相應(yīng)靶基因HN的選擇及保守區(qū)的確定本研究所用的序列選自NCBI GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中,主要選擇依據(jù)為:(a)年代較近毒株;(b)具有全長序列及主體序列毒株;(c)同亞型序列比對后選取具有代表性的毒株。選取的人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的相應(yīng)HN基因的?目息見表1_1、1_2及1_3。
[0033]本研究分別將所選擇的人的I型、II型及III型副流感病毒代表株的相應(yīng)HN基因輸入到DNAssist軟件中進(jìn)行同源比對,確定了相應(yīng)亞型HN基因的序列保守區(qū),為引物和探針設(shè)計提供了靶區(qū)。
[0034]表1-1.選取人I型副流感病毒(PIVl)代表毒株的HN基因信息
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種同時檢測人的I型、II型及III型副流感病毒的方法,其特征在于是含內(nèi)質(zhì)控的一步法多重?zé)晒釸T-PCR,其特異性引物和探針序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物; 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于如SEQNO:3所示的人I型副流感病毒的HN基因探針5’端由FAM標(biāo)記,3’端由BHQl標(biāo)記;如SEQ NO:6所示的人II型副流感病毒的HN基因探針5’端由JOE標(biāo)記,3’端由BHQl標(biāo)記;如SEQ NO:9所示的人III型副流感病毒的HN基因探針5’端由ROX標(biāo)記,3’端由BHQ2標(biāo)記;如SEQ NO:12所示的內(nèi)質(zhì)控基因LDHA基因探針5’端由CY5標(biāo)記,3’端由BHQ2標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述多重?zé)晒釸T-PCR的反應(yīng)體系: a)反應(yīng)緩沖液; b)反應(yīng)酶; c)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物; d)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針 e)無RNA酶的水補(bǔ) 足體系要求的體積。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述多重?zé)晒釸T-PCR的反應(yīng)條件如下: a)四個熒光通道的設(shè)置; b)反轉(zhuǎn)錄的溫度與時間; c)預(yù)熱的溫度與時間; d)熱循環(huán)(預(yù)熱溫度與時間、退火溫度與時間、熒光收集溫度、循環(huán)數(shù)); e)以界定的Ct值來判定檢測結(jié)果。
5.如權(quán)利要求1所述方法在檢測食品及原料、環(huán)境樣本中I型、II型及III型副流感病毒中的用途。
6.權(quán)利要求1所述的引物和探針序列在制備I型、II型及III型副流感病毒的檢測試劑中的應(yīng)用。
7.一種同時檢測I型、II型及III型副流感病毒的試劑盒,其特征在于所述試劑盒中含有特異性引物和探針,其序列分別為: 1)SEQNO:1、2、4、5、7、8、10、11 所示的引物; 2)SEQ NO:3、6、9、12 所示的探針。
8.權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備I型、II型及III型副流感病毒的診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032035SQ201410275579
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】黃芳, 崔淑娟, 石偉先, 王海濱, 張玉松, 陳萌, 于霞麗, 李愛華 申請人:黃芳