一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及提高養(yǎng)豬效益的畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域，具體公開了一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，應(yīng)用體外基因轉(zhuǎn)移新技術(shù)，通過在懷孕母豬肌肉組織高效表達(dá)GHRH，提高GH的水平，使母乳中初乳中乳蛋白、IgG、IL-6的含量明顯增加，其中乳蛋白的含量提高了約12.9%，IL-6的含量提高了約112%，常乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量也明顯增加，其中乳蛋白的含量提高了約20%，IgG的含量提高了約366%，IL-2的含量提高了約22.9%，IL-6的含量提高了約27.35%。
【專利說明】一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及提高養(yǎng)豬效益的畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域，更具體地，涉及一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]母乳是豬繁殖過程中的基本要素，是新生仔豬唯一的營(yíng)養(yǎng)來源。母豬乳中除水分外，還含有乳脂(三酯酰甘油、二酯酰甘油、一酯酰甘油、磷脂、腦昔脂類、神經(jīng)節(jié)營(yíng)脂、固醇和固醇酯及其衍生物、游離脂肪酸等)、乳蛋白(酪蛋白和乳清蛋白)、乳糖、維生素、礦物質(zhì)等。乳中含有免疫物質(zhì)，如乳清中的蛋白組分包括血清白蛋白(SA)、免疫球蛋白(Igs)、α-乳白蛋白(α-LA)、β_乳球蛋白(β-LG)、乳鐵蛋白(LF)等對(duì)仔豬具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0003]母豬的泌乳力是哺乳母豬生產(chǎn)性能的直接體現(xiàn)，母豬泌乳量的多少，直接影響哺乳仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響仔豬的斷奶窩重。而仔豬的斷奶窩重是一個(gè)非常重要的選種指標(biāo)，它與豬的產(chǎn)仔數(shù)、初生重、哺育率、哺乳期增重和斷奶個(gè)體重等主要繁殖性狀均呈正相關(guān)。因此，母豬的泌乳力是影響?zhàn)B豬業(yè)效益的關(guān)鍵因素。
[0004]影響母豬泌乳能力的因素有很多，如品種、營(yíng)養(yǎng)、管理、環(huán)境等因素。因母豬在哺乳期代謝非常旺盛，營(yíng)養(yǎng)需求較高，所以營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)泌乳極為重要。若母豬攝取的飼料養(yǎng)分達(dá)不到泌乳需要，則會(huì)動(dòng)用體內(nèi)已貯存的營(yíng)養(yǎng)用來泌乳，母豬體況下降，泌乳力降低。母豬營(yíng)養(yǎng)缺乏有兩種情況:一是飼糧營(yíng)養(yǎng) 水平較低。母豬即使有足夠的采食量，仍然滿足不了泌乳的營(yíng)養(yǎng)需要；二是母豬采食量少。盡管飼糧營(yíng)養(yǎng)水平較高，能夠達(dá)到哺乳母豬的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，但由于采食量少，母豬攝取的營(yíng)養(yǎng)成分就少，不能滿足泌乳需要，因此母豬泌乳量就會(huì)下降。環(huán)境因素也可以影響母豬的泌乳能力。夏季的高溫會(huì)造成哺乳母豬熱應(yīng)激，導(dǎo)致哺乳母豬生產(chǎn)力下降。高溫時(shí)母豬采食量下降、體重減輕，母豬產(chǎn)奶量降低。另外高溫易造成母豬內(nèi)分泌失調(diào)，增加患產(chǎn)后綜合癥(乳房炎-子宮炎-無(wú)乳綜合癥)的可能性，造成無(wú)乳或少乳。同時(shí)低溫也會(huì)增加維持體溫的能量消耗，從而降低泌乳能力。另外，豬舍的有害氣體和噪音、胎次等因素也造成了泌乳力的降低。
[0005]提高母豬泌乳能力的方法目前多從品種選育、母豬群體結(jié)構(gòu)的控制、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等方面出發(fā)，但由于效果有限，所以由于母豬泌乳力不高引起的生產(chǎn)水平較低的問題十分突出。因此尋求新的提高母豬泌乳能力的方法具有有重要的實(shí)際價(jià)值和應(yīng)用意義。
[0006]生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)是調(diào)解動(dòng)物和人生長(zhǎng)的主要激素，具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高瘦肉率、抑制脂肪合成和提高免疫力的作用，在畜牧業(yè)上有著重要的應(yīng)用價(jià)值。GH的水平高低主要受正性調(diào)控因子生長(zhǎng)激素釋放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)和負(fù)性調(diào)控因子即生長(zhǎng)激素釋放抑制激素(somatostatin，SS，簡(jiǎn)稱生長(zhǎng)抑素)的調(diào)控。其中，GHRH控制著GH的脈沖式分泌，SS控制著基礎(chǔ)分泌，且SS對(duì)GHRH有拮抗作用，影響GHRH基因的表達(dá)。GHRH于上世紀(jì)80年代首次由人的胰腺異位腫瘤中分離到，后證實(shí)在下丘腦的弓狀核可分泌GHRH，并由門脈系統(tǒng)進(jìn)入血液，后作用于腦垂體,使細(xì)胞內(nèi)的cAMP和Ca2+濃度升高，從而促進(jìn)GH的合成與釋放，提高血中GH的濃度。但GHRH對(duì)母豬泌乳的影響還不清楚，特別是具體在提高母豬乳營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量方面尚未見報(bào)道。
[0007]肌肉組織可以表達(dá)外源的基因，但表達(dá)效率很低，難于達(dá)到明顯的作用。所以，采用提高肌肉組織表達(dá)效率的措施十分重要。MSP啟動(dòng)子是根據(jù)骨骼肌α-actin啟動(dòng)子能在肌肉組織中特異性啟動(dòng)外源基因表達(dá)的這一特性，將骨骼肌a -actin啟動(dòng)子加以改造，將E-box，MEF-2，TEF-1和SRE序列隨意組合所構(gòu)建的合成啟動(dòng)子重組庫(kù)中篩選出的一種人工合成啟動(dòng)子，其在肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然肌肉特異啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子。電穿孔介導(dǎo)轉(zhuǎn)移外源基因的方法是依據(jù)細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等理論，采用微電子及計(jì)算機(jī)技術(shù)，通過設(shè)計(jì)特定的控制電路產(chǎn)生合適的脈沖電流，瞬間改變靶細(xì)胞的通透性，促進(jìn)DNA、RNA等核酸及蛋白、化學(xué)小分子物質(zhì)快速進(jìn)入細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)染率、增強(qiáng)藥物作用、增加表達(dá)量的效果。使用電穿孔技術(shù)增強(qiáng)了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，從而可以使注射部位的肌肉成為一個(gè)生物反應(yīng)器，用來持久產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)到血液循環(huán)系統(tǒng)中。在一次注射后電穿孔轉(zhuǎn)移，相比于用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，這種方法可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)水平量增加至少2-3個(gè)以上數(shù)量級(jí)，并有可能達(dá)到生理所需的水平。通過啟動(dòng)子的優(yōu)化及電轉(zhuǎn)移的方法，可以使外源基因在肌肉組織中的表達(dá)效率大大提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中母豬泌乳能力有限、母豬生產(chǎn)水平較低的缺陷，提供了一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法。 [0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供pMSP-GHRH質(zhì)粒在提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，即將PMSP-GHRH質(zhì)粒注射入懷孕母豬的肌肉組織中，經(jīng)基因轉(zhuǎn)移后，測(cè)定母豬產(chǎn)仔后乳中乳成分和分子指標(biāo)成分的變化；
所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:采用化學(xué)合成的方法，合成肌肉特異表達(dá)的啟動(dòng)子MSP，經(jīng)過酶切及連接，將MSP序列克隆到TOC-57質(zhì)粒，再經(jīng)過酶切、連接，將MSP序列插入GHRH表達(dá)質(zhì)粒中，得到肌肉特異表達(dá)的質(zhì)粒pMSP-GHRH ；
所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的注射劑量為2~10mg。
[0011]具體地，所述PMSP-GHRH質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:采用化學(xué)合成的方法，合成肌肉特異表達(dá)的啟動(dòng)子MSP ;所述啟動(dòng)子的序列如圖1所示，序列長(zhǎng)度為292bp，兩端設(shè)計(jì)治w I和Hind III的粘性末端，將roC-17質(zhì)粒用IU的命I熱Hind III 37°C酶切l(wèi)h，再與合成的MSP啟動(dòng)子用IU T4連接酶16°C連接4h，取ImL連接物轉(zhuǎn)化到CaCl2致敏的JM109，利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，提到含MSP序列的PUC-57-MSP質(zhì)粒；用上述方法用Kpnl和Hindlll分別對(duì)PUC-57-MSP和GHRH表達(dá)質(zhì)粒pCMV_GRF進(jìn)行酶切，1%瓊脂糖電泳分離純化酶切片段，用T4連接酶連接，將MSP序列插入GHRH表達(dá)質(zhì)粒中，得到肌肉特異表達(dá)的質(zhì)粒pMSP-GHRH，上述采用的分子克隆的方法均為公開成熟的DNA操作技術(shù)。
[0012]MSP啟動(dòng)子在肌肉組織中的轉(zhuǎn)錄能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然肌肉特異啟動(dòng)子和病毒啟動(dòng)子，為使GHRH在肌肉組織中高效表達(dá)，發(fā)明人構(gòu)建了 pMSP-GHRH質(zhì)粒。
[0013]所述pMSP-GHRH質(zhì)粒能使母豬乳中營(yíng)養(yǎng)和免疫物質(zhì)的含量明顯增加。
[0014]現(xiàn)有技術(shù)中記載GH在畜牧業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值，母豬在泌乳期，GH的升高不僅能使體脂降解，還有利于乳腺發(fā)育及泌乳，而GH的水平高低又受GHRH的調(diào)控，因此，提高GHRH在母豬體內(nèi)的表達(dá)量有助于提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫物質(zhì)的含量。
[0015]本發(fā)明通過啟動(dòng)子的優(yōu)化及電轉(zhuǎn)移的方法，使GHRH外源基因在肌肉組織中的表達(dá)大大提聞。
[0016]優(yōu)選地，所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的注射劑量為2mg。
[0017]優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)移利用體外基因轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行，基因轉(zhuǎn)移的電壓為30~50V，脈沖頻率為3~8HZ、脈沖脈寬為20~80ms。
[0018]使用電轉(zhuǎn)移技術(shù)增強(qiáng)了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，從而可以使注射部位的肌肉成為一個(gè)生物反應(yīng)器，用來持久產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì)到血液循環(huán)系統(tǒng)中。在一次注射后電轉(zhuǎn)移，相比于用腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，這種方法可以使蛋白質(zhì)的表達(dá)水平量增加至少2~3個(gè)以上數(shù)量級(jí)，并有可能達(dá)到生理所需的水平。
[0019]更優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)移的電壓為36V，脈沖頻率為5HZ，脈沖脈寬為50ms。
[0020]優(yōu)選地，所述懷孕母豬為懷孕80~100天的母豬。
[0021]選擇懷孕80~10 0天的母豬作為對(duì)象的原因在于:母豬分娩的時(shí)間為113~115天，通過提前注射，可以使外源表達(dá)的GHRH對(duì)乳腺的泌乳有充分的調(diào)控時(shí)間。更優(yōu)選地，所述懷孕母豬為懷孕90天的母豬。
[0022]作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法包括以下步驟:
51.將懷孕80~100天的長(zhǎng)白母豬后肢肌肉注射pMSP-GHRH質(zhì)粒，注射劑量為2~1mg ；
52.經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，基因轉(zhuǎn)移的電壓為30~50V，脈沖頻率3~8 HZ、脈沖脈寬 20 ~80ms ；
53.于妊娠母豬產(chǎn)仔后3天內(nèi)，采集母豬初乳；產(chǎn)仔15天時(shí)，采集母豬常乳，測(cè)定初乳和常乳中乳成分和分子指標(biāo)成分的變化。
[0023]作為一種更優(yōu)選方式，本發(fā)明所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法包括以下步驟:
51.將懷孕90天的長(zhǎng)白母豬后肢肌肉注射pMSP-GHRH質(zhì)粒，注射劑量為2mg；
52.經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，基因轉(zhuǎn)移的電壓為36V，脈沖頻率5 HZ、脈沖脈寬50 ms ；
53.于妊娠母豬產(chǎn)仔后3天內(nèi)，采集母豬初乳；產(chǎn)仔15天時(shí)，采集母豬常乳，測(cè)定初乳和常乳中乳成分和分子指標(biāo)成分的變化。
[0024]8.pMSP-GHRH質(zhì)粒在提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量中的應(yīng)用。
[0025]特別地，在收集初乳和常乳后，部分用于檢測(cè)初乳及常乳中干物質(zhì)、乳蛋白、乳脂、乳糖等乳成分濃度變化，部分乳樣3000r/min離心20min，取乳上清液，檢測(cè)乳上清液中IgG, IL-2、IL-6等分子指標(biāo)成分變化。
[0026]本發(fā)明還提供了所述pMSP-GHRH質(zhì)粒在提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量中的應(yīng)用。[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明利用肌肉特異性表達(dá)的pMSP-GHRH質(zhì)粒，并通過注射特定劑量的質(zhì)粒和特定條件下的體外基因轉(zhuǎn)移，使pMSP-GHRH質(zhì)粒在母豬肌肉組織中高效表達(dá)，GHRH的升高使得GH水平的升高，從而使母豬乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫物質(zhì)含量的升高，經(jīng)檢測(cè):初乳中乳蛋白、IgG、IL-6的含量明顯增加，其中乳蛋白的含量提高了約12.9%, IL-6的含量提高了約112%，常乳中乳蛋白、186、幾-2、11^6的含量明顯增加，其中乳蛋白的含量提高了約20%，186的含量提高了約366%，IL-2的含量提高了約22.9%，IL-6的含量提高了約27.35%。
[0028]本發(fā)明應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移新技術(shù)，提高了母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)的含量，從而改善仔豬的營(yíng)養(yǎng)，最終達(dá)到提高養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的目的，具有巨大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為設(shè)計(jì)的肌肉特異表達(dá)啟動(dòng)子的序列；
圖2為質(zhì)粒構(gòu)建流程圖；
圖3為肌肉特異性表達(dá)質(zhì)粒；
圖4為pMSP-GHRH陽(yáng)性克隆歷/?d III和治I雙酶切鑒定；M =Marker DL2000 ;1_4:酶切后產(chǎn)物；
圖 5 為 pMSP-GHRH PCR 鑒定；M.DL2000 Marker ；1~2:陰性對(duì)照；3_8:pMSP_GHRH?！揪唧w實(shí)施方式】
[0030]下面通過說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步具體描述。下述所使用的實(shí)驗(yàn)方法若無(wú)特殊說明，均為本【技術(shù)領(lǐng)域】現(xiàn)有常規(guī)的方法，所使用的配料或材料，如無(wú)特殊說明，均為通過商業(yè)途徑可得到的配料或材料。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]實(shí)施例1
一、pMSP-GHRH質(zhì)粒的構(gòu)建
采用化學(xué)合成的方法，合成肌肉特異表達(dá)的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子的序列如圖1所示，序列長(zhǎng)度為292bp，兩端設(shè)計(jì)治w I熱Hind III的粘性末端，將I3UC-H質(zhì)粒用IU的治w I熱Hind III 37°C酶切l(wèi)h，再與合成的MSP啟動(dòng)子用IU T4連接酶16°C連接4h，取ImL連接物轉(zhuǎn)化到CaCl2致敏的JM109，利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，提到含MSP序列的PUC-57-MSP質(zhì)粒；用上述方法用命/?1和歷fli/III分別對(duì)PUC-57-MSP和GHRH表達(dá)質(zhì)粒pCMV-GRF進(jìn)行酶切，1%瓊脂糖電泳分離純化酶切片段，用T4連接酶連接，將MSP序列插入GHRH表達(dá)質(zhì)粒中，得到肌肉特異表達(dá)的質(zhì)粒pMSP-GHRH，所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的構(gòu)建流程如圖2。上述采用的分子克隆的方法均為公開成熟的DNA操作技術(shù)。
[0032]二、pMSP-GHRH 質(zhì)粒的提取
根據(jù)Birnboim和Doly菌體裂解方法，稱取_72°C保存的菌體4g，重懸于40mL溶液N (50mmol/L Tris, 1mmoI/L EDTA, RNaseA 40 Lg/mL, ρΗ8.1)中。然后添加 80mL 溶液 O (0.12mol/L NaOH, 1%十二烷基磺酸鈉(SDS))，于室溫下對(duì)菌體裂解5~lOmin。使用40mL 3mol/L的醋酸鉀溶液，于4°C中和裂解液30min。然后將裂解液以6724r/min(8000g)離心15min，取上清液；將上清液經(jīng)過0.145/0.122Lm囊式過濾器過濾。部分過濾澄清液體直接進(jìn)行色譜純化，部分澄清液體加入1/20體積含20%的Triton溶液(750mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris,20% Triton X-1OO或Triton X-114，pH7.10)，稍作攪拌混合后，于4°C靜止lh，然后進(jìn)行色
譜純化。
[0033]將裝填好的510mL離子交換色譜柱(215cmX 116cm)接入B1logic色譜系統(tǒng)。用
0.13mol/L NaOH 清洗色譜柱,用 5 倍柱體積含 SOOmmol /T, NaCl, SOmmoI /T, Tris, 15% (體積分?jǐn)?shù))異丙醇和0.115% (體積分?jǐn)?shù))非離子表面活性劑的緩沖液(pH7.10)平衡色譜柱，將處理好的樣品置于冰水浴中(O~4°C )用蠕動(dòng)泵進(jìn)行上樣，保持溫度為10~13°C。然后用含625mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris和15%異丙醇的緩沖液(pH7.10)淋洗色譜柱至基線平穩(wěn)。接著用1.125mol/L NaCl, 50mmol/LTris和15%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇緩沖液(ρΗ8.15)進(jìn)行洗脫，線性流速為120cm/h，按照254nm紫外吸收曲線分峰收集。對(duì)照組樣品不進(jìn)行非離子表面活性劑處理，而且用于平衡色譜柱的緩沖液中不添加非離子表面活性劑，其他條件同實(shí)驗(yàn)組一樣。將洗脫液收集入離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀質(zhì)粒。
[0034]三、pMSP-GHRH質(zhì)粒的滅菌
將異丙醇沉淀獲得的質(zhì)粒用75%乙醇浸泡30min滅菌，無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，再用無(wú)菌生理鹽水懸浮。
[0035]四、pMSP-GHRH質(zhì)粒的注射及電轉(zhuǎn)移
將胎次在2~3胎的20頭懷孕90天的母豬(長(zhǎng)白豬)隨機(jī)分成2組，第一組注射生理鹽水lmL，第二組注射濃度為2mg/mL的質(zhì)粒lmL，注射部位為后肢肌肉。后經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，轉(zhuǎn)移電壓為36V，脈沖頻率5HZ，脈沖脈寬50ms ;于妊娠母豬產(chǎn)仔后3天內(nèi)，采集母豬初乳；產(chǎn)仔15天時(shí)，采集母豬常乳，部分用于檢測(cè)初乳及常乳中干物質(zhì)、乳蛋白、乳脂、乳糖等乳成分濃度變化；部分乳樣3000r/min離心20min，取乳上清液，檢測(cè)乳上清液中IgG，IL-2，IL-6等分子指標(biāo)成分變化。
[0036]其中，乳清IgG的測(cè)定方法為:
Cl)配制標(biāo)準(zhǔn)品:0,0.58,2.34,9.38,37.5、150mg/mL，所述標(biāo)準(zhǔn)品為豬乳IgG凍干品；
(2)根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白卡建議做復(fù)孔；每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來決定，能使用復(fù)孔的盡量使用復(fù)孔；
(3)加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔(用前稀釋500倍)；每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50μL ;設(shè)置一個(gè)空白孔不加任何液體；
(4)每孔加入酶結(jié)合物50μL(空白孔不加)，輕輕震蕩混勻，覆上新的板貼，37°C溫育
40h ；
(5)棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液(將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋25倍備用)，靜置2min后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；
(6)顯色:每孔底物溶液90μL，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15~30min；
(7)終止:每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色)；
(8)測(cè)定:以空白調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的吸光度(0D值)；測(cè)定應(yīng)在加入終止液后10分鐘內(nèi)進(jìn)行；
(9)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。[0037]其中，乳清IL-2的測(cè)定方法為:
(1)配制標(biāo)準(zhǔn)品:0U5.6,31.2,62.5、125、250、500、1000pg/mL,所述標(biāo)準(zhǔn)品為豬乳IL-2凍干品；
(2)根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白卡建議做復(fù)孔；每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來決定，能使用復(fù)孔的盡量使用復(fù)孔；
(3)加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔；每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37°C溫育2h ；
(4)棄去液體，甩干，不用洗滌；
(5)每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液(臨用前按100倍稀釋)100μL，覆上新的板貼，37°C溫育Ih ；
(6)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液(將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋25倍備用)，靜置2min后棄去，如此重復(fù)3次，拍干；
(7)每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)工作液(臨用前按100倍稀釋)100μL，覆上新的板貼， 37°C溫育Ih ；
(8)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液(將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋25倍備用)，靜置2min后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；
(9)顯色:每孔底物溶液90μL，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15~30min；
(10)終止:每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色)；
(11)測(cè)定:以空白調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的吸光度(0D值);測(cè)定應(yīng)加入終止液后1min內(nèi)進(jìn)行；
(12)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。
[0038]其中，乳清IL-6的測(cè)定方法為:
Cl)配制標(biāo)準(zhǔn)品:0U.25,2.5、5、10、20、40、80pg/mL，所述標(biāo)準(zhǔn)品為豬乳IL-6凍干品；
(2)根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白卡建議做復(fù)孔；每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來決定，能使用復(fù)孔的盡量使用復(fù)孔；
(3)加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔；每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37°C溫育2h ；
(4)棄去液體，甩干，不用洗滌；
(5)每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液(臨用前按100倍稀釋)100μL，覆上新的板貼，37°C溫育Ih ；
(6)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液(將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋25倍備用)，靜置2min后棄去，如此重復(fù)3次，拍干；
(7)每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)工作液(臨用前按100倍稀釋)100μL，覆上新的板貼，37°C溫育Ih ；
(8)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液(將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋25倍備用)，靜置2h后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；
(9)顯色:每孔底物溶液90μL，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15~30min；
(10)終止:每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色)；(11)測(cè)定:以空白調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的吸光度(OD值);測(cè)定應(yīng)加入終止液后1min內(nèi)進(jìn)行；
(12)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。
[0039]經(jīng)檢測(cè)，母豬初乳中乳蛋白、IgG、IL_6的含量明顯增加，其中乳蛋白的含量提高了約12.9%，IL-6的含量提高了約112%，常乳中乳蛋白、IgG、IL-2、IL-6的含量明顯增加，其中乳蛋白的含量提高了約20%，IgG的含量提高了約366%，IL-2的含量提高了約22.9%，IL-6的含量提高了約27.35%。具體結(jié)果見表1。
[0040]表1 2mg GHRH表達(dá)質(zhì)粒對(duì)母豬乳成分的影響
【權(quán)利要求】
1.一種提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，將PMSP-GHRH質(zhì)粒注射入懷孕母豬的肌肉組織中，經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移后，測(cè)定母豬產(chǎn)仔后乳中乳成分和分子指標(biāo)成分的變化； 所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的構(gòu)建方法為:采用化學(xué)合成的方法，合成肌肉特異表達(dá)的啟動(dòng)子MSP，經(jīng)過酶切及連接，將MSP序列克隆到TOC-57質(zhì)粒，再經(jīng)過酶切、連接，將MSP序列插入GHRH表達(dá)質(zhì)粒中，得到肌肉特異表達(dá)的質(zhì)粒pMSP-GHRH ； 所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的注射劑量為2~10mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述pMSP-GHRH質(zhì)粒的注射劑量為2mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述基因轉(zhuǎn)移利用體外基因轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行，基因轉(zhuǎn)移的電壓為30~50V，脈沖頻率為3~8HZ、脈沖脈寬為20~80ms。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述基因轉(zhuǎn)移利用體外基因轉(zhuǎn)移儀進(jìn)行，基因轉(zhuǎn)移的電壓為36V，脈沖頻率為5HZ、脈沖脈寬為50ms ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，所述懷孕母豬為懷孕80~100天的母豬。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，包括以下 步驟: 。 51.將懷孕80~100天的長(zhǎng)白母豬后肢肌肉注射pMSP-GHRH質(zhì)粒，注射劑量為2~1mg ；。 52.經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，基因轉(zhuǎn)移的電壓為30~50V，脈沖頻率3~8 HZ、脈沖脈寬 20 ~80ms ；。 53.于妊娠母豬產(chǎn)仔后3天內(nèi)，采集母豬初乳；產(chǎn)仔15天時(shí)，采集母豬常乳，測(cè)定初乳和常乳中乳成分和分子指標(biāo)成分的變化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量的方法，其特征在于，包括以下步驟: 。51.將懷孕90天的長(zhǎng)白母豬后肢肌肉注射pMSP-GHRH質(zhì)粒，注射劑量為2mg； 。52.經(jīng)體外基因轉(zhuǎn)移儀處理，基因轉(zhuǎn)移的電壓為36V，脈沖頻率5 HZ、脈沖脈寬50 ms ； 。 53.于妊娠母豬產(chǎn)仔后3天內(nèi)，采集母豬初乳；產(chǎn)仔15天時(shí)，采集母豬常乳，測(cè)定初乳和常乳中乳成分和分子指標(biāo)成分的變化。
8.pMSP-GHRH質(zhì)粒在提高母豬乳中營(yíng)養(yǎng)及免疫物質(zhì)含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104031930SQ201410236696
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】張永亮, 汪飛, 習(xí)欠云 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)