血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清外泌體(Exosomes)來源的長鏈非編碼RNA(long?no-coding?RNA，LncRNA)PRKAG2-AS1的應(yīng)用方法，即血清Exosomes來源的LncRNA?PRKAG2-AS1用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑。通過研究證實(shí)在膠質(zhì)瘤患者血清中分離Exosomes后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析發(fā)現(xiàn)LncRNA?PRKAG2-AS1表達(dá)水平下降。利用本發(fā)明的制劑對膠質(zhì)瘤早期診斷的特異性可達(dá)85.7％，靈敏度達(dá)到88.2％。通過檢測膠質(zhì)瘤患者血清Exosomes中LncRNA?PRKAG2-AS1的表達(dá)水平，從而對膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。
【專利說明】血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的應(yīng)用
方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及血清Exosomes來源的LncRNAPRKAG2-AS1在制備膠質(zhì)瘤患者預(yù)后試劑中應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】 [0002]膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)腫瘤的40.49%。腦腫瘤中膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)病率最高，大腦半球發(fā)生的膠質(zhì)瘤約占全部膠質(zhì)瘤的51.4%。由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長且與周圍腦組織邊界不清，即使是最現(xiàn)代的神經(jīng)外科技術(shù)也難以做到病理學(xué)上的全切除，因而膠質(zhì)瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率非常高，且隨著手術(shù)和復(fù)發(fā)次數(shù)的增加，其惡性程度有增加的趨勢。目前而言膠質(zhì)瘤的診斷和治療方法雖處于不斷改進(jìn)階段，但是膠質(zhì)瘤患者生存率并沒有明顯提高。膠質(zhì)瘤診斷仍然處于以臨床、病理學(xué)和影像學(xué)信息為基礎(chǔ)的經(jīng)驗(yàn)性階段，而且一經(jīng)診斷，絕大多數(shù)均為中晚期，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)對膠質(zhì)瘤進(jìn)行高危人群篩查和早期診斷的需求。因此，尋找無創(chuàng)傷性的膠質(zhì)瘤早期診斷標(biāo)志物對高危人群進(jìn)行篩查，以便對膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行早期診斷、早期治療，提高患者生存率，一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的主要任務(wù)。
[0003]Exosomes來源于多囊泡體，是由活細(xì)胞分泌而來的大小介于30_100nm的含有RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的微囊泡。Exosomes廣泛存在于血清，尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清，唾液等各種體液中，可在體液中來回穿梭，在細(xì)胞之間運(yùn)送遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在順鉬誘導(dǎo)急性腎損傷的大鼠模型的尿液Exosome中發(fā)現(xiàn)Fetuin-A表達(dá)上調(diào)，由此尿液Exosome中Fetuin-A的檢測可作為診斷標(biāo)志物；在膀胱癌患者尿液來源的Exosomes中還發(fā)現(xiàn)了PCA-3, TMPRSS2兩個生物標(biāo)志物；在黑色素瘤患者血漿Exosomes中腫瘤相關(guān)標(biāo)志物CAVl表達(dá)水平明顯增加，以此可診斷黑色素瘤；腫瘤細(xì)胞來源的Exosomes中miRNA的表達(dá)譜可作為卵巢癌的診斷標(biāo)記物。因此Exosomes可用于腫瘤的早期診斷，也可作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。Exosomes具有在血清中穩(wěn)定存在的特性，含有特異性的物質(zhì)且可保護(hù)RNA免受RNA酶的作用，克服了直接利用血液提取分子進(jìn)行腫瘤診斷的血液中非檢測物質(zhì)的影響，使檢驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)，精確。利用Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1來診斷腦膠質(zhì)瘤不僅減少了患者的痛苦和不便，而且提高了檢驗(yàn)結(jié)果的靈敏性，特異性。以上顯示出血清Exosomes來源的LncRNA PRKA G2-AS1在膠質(zhì)瘤早期診斷和篩查中的巨大潛力。
[0004]LncRNA PRKAG2-AS1(protein kinase, AMP-activated, gamma2non-catalyticsubu nit)定位于染色體7q36.1，GeneBank登錄號:NR_038926。有研究證實(shí)PRKAG2可在TP53的信號通路中發(fā)揮作用，并且PRKAG2與癌癥患者的存活率密切相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種血清Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1的應(yīng)用方法，尤其是一種能夠用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑的應(yīng)用方法。研究證實(shí)血清Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1可用于膠質(zhì)瘤患者的診斷，Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1表達(dá)下調(diào)與膠質(zhì)瘤組織驗(yàn)證結(jié)果具有一致性，且檢驗(yàn)結(jié)果的靈敏性高，特異性好。因此Exosomes可用于膠質(zhì)瘤高危人群的篩查和早期診斷和預(yù)后。
[0006]血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-ASI的應(yīng)用方法，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，該長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的序列見SEQ NO:1。
[0007]所述的用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑具體包括實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑。
[0008]所述的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑包括進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR的特異性引物:
[0009]LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5，-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3，，
[0010]LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5，-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3，。
[0011]所述的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒，
[0012]該試劑盒包括:(I)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA PRKAG2-AS1逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及LncRNA PRKAG2-AS1所用隨機(jī)引物；(3)將cDNA實(shí)時定量PCR所用試劑，包括LncRNAPRKAG2-AS1實(shí)時熒光定 量PCR特異性引物、U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物、實(shí)時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0013]LncRNA PRKAG2-AS1實(shí)時熒光定量PCR特異性引物:
[0014]正向引物:5’-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’，
[0015]反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。
[0016]U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物:
[0017]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0018]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0019] 申請人:通過癌癥基因圖集TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)Lnc RNA PRKAG2-AS1在正常人與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)存在明顯差異(P = 0.0156)(圖1)。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)Lnc RNA PRKAG2-AS1在52例膠質(zhì)瘤組織與12例正常人的腦組織中存在差異性表達(dá)(P =
0.0005)(圖2),且在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào),進(jìn)一步在血清中分離Exosomes用于LncRNAPRKAG2-ASI的檢測，發(fā)現(xiàn)LncRNA PRKAG2-ASI的表達(dá)與正常人的表達(dá)存在明顯的差異(P = 0.0306)(圖3)，且與組織中的檢測結(jié)果相一致。此方法可以檢測各人群中LncRNAPRKAG2-AS1的表達(dá)水平，從而預(yù)測膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險，篩查易感人群，并對膠質(zhì)瘤患者做出早期、快速的無創(chuàng)性診斷。本發(fā)明對膠質(zhì)瘤早期診斷特異性好(圖4)，可達(dá)85.7%，靈敏度可達(dá)88.2%，只需在Exosomes提取RNA即可檢測LncRNA PRKAG2-AS1的表達(dá)水平，操作簡單，穩(wěn)定性好。不僅可用于膠質(zhì)瘤的早期診斷而且可以用于膠質(zhì)瘤患者的大規(guī)模篩查和患病風(fēng)險的預(yù)測，為膠質(zhì)瘤的早期診斷和預(yù)測提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為癌癥基因圖集TCGA數(shù)據(jù)庫中LncRNA PRKAG2-AS1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與正常腦組織中的表達(dá)差異；
[0021 ] 圖2為實(shí)時熒光定量PCR分析LncRNA PRKAG2-AS1在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的表達(dá)差異；
[0022]圖3為實(shí)時熒光定量PCR分析Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1在膠質(zhì)瘤患者與正常人中的表達(dá)差異；
[0023]圖4為Roc分析Exosomes來源的LncRNA PRKAG2-AS1對膠質(zhì)瘤早期診斷的特異性，靈敏性。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0025]實(shí)施例1制備長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1用于膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的試劑盒(50次反應(yīng))
[0026]1.RNA 穩(wěn)定溶液 50ml
[0027]2.異丙醇 100mL
[0028]3.三氯甲烷 100mL
[0029]4.Trizol 50ml [0030]5.無酶水 IOml
[0031]6.1 μ M隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物50ul
[0032]7.5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液200ml
[0033]8.1OmM三磷酸堿基脫氧核苷酸IOOul
[0034]9.40U/ μ I RNA 酶抑制劑 500ul
[0035]10.200U/ μ I MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 50ul
[0036]11.Premix Ex Taq 50ul
[0037]12.10 μ M LncRNA PRKAG2-AS1 實(shí)時熒光定量 PCR 特異性引物 30ul
[0038]LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5，-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3，，
[0039]LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5，-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3，；
[0040]13.10 μ M U6SnRNA 特異性引物 3Oul
[0041]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
[0042]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0043]實(shí)施例2
[0044]LncRNA PRKAG2-AS1在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的表達(dá)差異的驗(yàn)證
[0045]1、收集待測膠質(zhì)瘤組織放入盛有RNA穩(wěn)定溶液的凍存管中，放至_80°C冰箱備用。
[0046]2、組織中RNA的抽提:取適量標(biāo)本于經(jīng)180°C烘烤6_8h后的研缽中加入液氮研磨標(biāo)本，研磨至粉末狀后于研缽中加入1ml Trizol研缽標(biāo)本,研磨成液體狀后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預(yù)冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻,_20°C冰箱靜置20min，4°C 12000g離心10min ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，40C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度計(jì)測RNA的濃度及質(zhì)量，0D260/280比值在1.8-2.0之間，_80°C保存。[0047]3、LncRNA PRKAG2-AS1逆轉(zhuǎn)錄:使用Thermo公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。20 μ L逆轉(zhuǎn)錄
反應(yīng)的體系如下:
[0048]
【權(quán)利要求】
1.血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的血清Exosomes來源的長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，該長鏈非編碼RNA PRKAG2-AS1的序列見SEQ NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的用于制備膠質(zhì)瘤高危人群的篩查、早期診斷或者膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑包括實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑包括進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR的特異性引物:
LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5’ -CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’， LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長鏈非編碼RNAPRKAG2-AS1的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒， 該試劑盒包括:(I)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA PRKAG2-AS1逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及LncRNA PRKAG2-ASI所用隨機(jī)引物；(3)將cDNA實(shí)時定量PCR所用試劑，包括LncRNAPRKAG2-ASl實(shí)時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物、實(shí)時熒光定量SYBR染料、無酶水； LncRNA PRKAG2-AS1實(shí)時熒光定量PCR特異性引物: LncRNA PRKAG2-AS1 正向引物:5’-CAGTTCTCATCAAATAGGGTGT-3’， LncRNA PRKAG2-AS1 反向引物:5’-TATTGTCCCACTGAATGCTC-3’。 U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物: 正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966337SQ201410225037
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】武明花, 劉長紅, 余志斌, 徐剛, 李桂源 申請人:中南大學(xué)