一種鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法，提供一種具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、檢測(cè)成功率高、便于廣泛使用等優(yōu)點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，能夠快速準(zhǔn)確地鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚。根據(jù)遺傳純合度的差異，從14個(gè)SSR標(biāo)記中篩選出了5個(gè)在雌核發(fā)育群體與野生群體中擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性和遺傳純合度差異較大SSR。由于雌核發(fā)育群體中遺傳純合度大大提高，SSR在其體內(nèi)擴(kuò)增的等位基因數(shù)目也會(huì)減少。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)SSR在普通草魚體內(nèi)擴(kuò)增的實(shí)際等位基因數(shù)目為8-10個(gè)，而在雌核發(fā)育草魚體內(nèi)擴(kuò)增的等位基因數(shù)目為5-7個(gè)，通過比較等位基因數(shù)即可鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚，其準(zhǔn)確率的理論值可達(dá)99.92％。
【專利說明】一種鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚的分子標(biāo)記方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬于鯉形目、鯉科、草魚屬，又名鯇魚,是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一。草魚在我國分布廣泛，年產(chǎn)量約占我國淡水魚總產(chǎn)量的20%。近年來，草魚種質(zhì)資源退化嚴(yán)重，病害頻繁，給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。但草魚由于繁殖所需周期長(一般4-5年性成熟)，傳統(tǒng)方法進(jìn)行草魚的種質(zhì)改良與優(yōu)良品種的選育工作進(jìn)展緩慢。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)是快速建立純系、固定優(yōu)良性狀的有效手段。該方法不僅可以對(duì)研究草魚性別決定機(jī)制、染色體定位、草魚遺傳圖譜構(gòu)建等具有重要意義；而且,在生產(chǎn)應(yīng)用方面對(duì)實(shí)現(xiàn)草魚單性養(yǎng)殖及快速選育生長速度快、抗病能力強(qiáng)的優(yōu)良草魚新品系具有重要意義。但是雌核發(fā)育草魚在形態(tài)和生理上同普通草魚無法區(qū)分，在實(shí)際養(yǎng)殖和保種過程中極易混淆，運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記建立一種能區(qū)分雌核發(fā)育草魚與普通草魚的分子生物學(xué)方法無疑是 解決這一問題的有效途徑。
[0003]目前，在鑒別雌核發(fā)育草魚方面，已有學(xué)者采用同工酶、RAro標(biāo)記技術(shù)對(duì)雌核發(fā)育草魚的遺傳多樣性、純合度及多態(tài)位點(diǎn)丟失情況進(jìn)行了研究，然而，同工酶是基因表達(dá)產(chǎn)物，其檢測(cè)位點(diǎn)有限，對(duì)親緣關(guān)系較近或遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的品種不容易區(qū)分；RAro標(biāo)記穩(wěn)定性和重復(fù)性均較差，很難滿足實(shí)際需要。相比較而言，微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記技術(shù)，由于其共顯性遺傳，具有檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、穩(wěn)定遺傳和不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于動(dòng)植物品種鑒定等研究，采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒別長江水系雌核發(fā)育群體與普通群體的研究還未見報(bào)道。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有雌核發(fā)育草魚與普通草魚的鑒別方法所存在的不足，提供一種具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、檢測(cè)成功率高、便于廣泛使用等優(yōu)點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，能夠快速準(zhǔn)確地鑒別出雌核發(fā)育草魚與普通草魚。
[0005]本發(fā)明采取的技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明利用P0PGEN32軟件對(duì)雌核發(fā)育草魚群體和普通草魚群體的微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括等位基因數(shù)(numbers of allele，Ne)，觀測(cè)純合度(observed homozygosty, 0bs_Ho),觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity, 0bs_He),期望雜合度(expected heterozygosity, Exp_He)等,根據(jù)這兩個(gè)群體之間遺傳純合度的差異，從14個(gè)SSR標(biāo)記中篩選出了 5個(gè)在雌核發(fā)育草魚群體與普通草魚群體中擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性和遺傳純合度差異較大SSR。草魚為二倍體生物，這5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記可在草魚個(gè)體中擴(kuò)增的等位基因數(shù)目從5 —10個(gè)不等，由于雌核發(fā)育群體中遺傳純合度大大提高，在這個(gè)5個(gè)SSR上擴(kuò)增的等位基因數(shù)目也相應(yīng)減少。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，這5個(gè)SSR在每一尾普通草魚同體內(nèi)擴(kuò)增的實(shí)際等位基因數(shù)目從8-10個(gè)不等，而在每一尾雌核發(fā)育草魚體內(nèi)擴(kuò)增的實(shí)際等位基因數(shù)目從5-7個(gè)不等。因此，通過比較這5個(gè)SSR在草魚體內(nèi)擴(kuò)增的等位基因數(shù)即可鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚。根據(jù)本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(Jamieson A, Taylor S C.Comparisons of three peobability formulae for parentageexclusion[J].Animal Genetics, 1997,28(6):397 ~400)，計(jì)算得到本發(fā)明的鑒別理論概率為99.92%，準(zhǔn)確率較高。
[0007]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0008](I)取待測(cè)草魚尾鰭，利用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA ；
[0009](2)選取5對(duì)SSR引物，以步驟⑴中所提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物，其中這5對(duì)微衛(wèi) 星引物如下:
[0010]AAGGAACAGCATAAACCGAAAT GGAACCAAGCATCTGAAACTG[0011 ] TGTATCAGTAGTAGGCGGTTTA GTGTCGCTACCTCGCTAT
[0012]AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG ATTGAAACAGATGCCTGCTTG
[0013]CAGACGGATGGATGGATG CTTTCAAAATGTGGAGTCTTGC
[0014]AAAATCCCAGTGAGACAATC ATCCCATAATGCCTTGC ；
[0015](3)將步驟⑵的PCR產(chǎn)物用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，10V/cm電泳2h，用0.1%硝酸銀染色，氫氧化鈉顯色液顯色，拍照記錄電泳結(jié)果；
[0016](4)分析步驟(3)的電泳圖譜，若待測(cè)草魚在所述的5個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)上擴(kuò)增的等位基因數(shù)為5-7個(gè)，則待測(cè)草魚為雌核發(fā)育草魚，若測(cè)草魚在所述的5個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)上擴(kuò)增的等位基因數(shù)為8-10個(gè)，則待測(cè)草魚為普通草魚。
[0017]所述步驟(2)中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)總體積為20 μ L，含有10 X反應(yīng)緩沖液10 μ L,上下游引物各0.5 μ L，基因組DNA40ng，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μ L。
[0018]所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C 30s, 50-60°C 30s，72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸 7min。
[0019]其中，每IL步驟(3)中所述氫氧化鈉顯色液中含IOg NaOH, Ig無水NaC03，5ml37%的甲醛。
[0020]本實(shí)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0021]本發(fā)明從14個(gè)鯉魚和草魚的微衛(wèi)星中篩選出的5個(gè)SSR在雌核發(fā)育群體與野生群體中擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性和遺傳純合度差異較大，根據(jù)草魚在這5個(gè)SSR位點(diǎn)上擴(kuò)增的等位基因數(shù)快速、準(zhǔn)確地鑒定其為雌核發(fā)育草魚或普通草魚，其準(zhǔn)確鑒別理論概論達(dá)99.92%，具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、操作統(tǒng)計(jì)簡便等優(yōu)點(diǎn)。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0022]圖1為5個(gè)SSR在實(shí)施例1中的各個(gè)樣本中擴(kuò)增的等位基因數(shù)；
[0023]圖2為5個(gè)SSR在實(shí)施例2中的各個(gè)樣本中擴(kuò)增的等位基因數(shù)。
【【具體實(shí)施方式】】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明所包含范圍不限于此。
[0025]實(shí)施例1[0026](I)基因組DNA提取
[0027]自2010年5月一7月從湖北省和湖南省的3個(gè)四大家魚原種場(chǎng)采集一批長江水系草魚共102尾組成長江群體，采樣地點(diǎn)和數(shù)量見表1。以5尾興國紅鯉雄魚與30尾來自長江水系的草魚雌魚為父母本，冷休克抑制第二極體排出的方法建立草魚的異精雌核發(fā)育群體(平游魚苗約10萬尾)。以雌核發(fā)育的草魚子代Fl群體為檢測(cè)組(群體G)，來自長江水系的野生草魚群體為對(duì)照組(群體W)，2個(gè)群體隨機(jī)各選取48尾樣本，取尾鰭保存于95%的乙醇中備用。
[0028]表1長江水系草魚群體的米樣情況表
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法，其特征在于其具體步驟如下: (1)取待測(cè)草魚尾鰭，利用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA； (2)以步驟(1)中制得的基因組DNA溶液為模板，用5對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其中的5對(duì)微衛(wèi)星引物序列如下:
AAGGAACAGCATAAACCGAAAT GGAACCAAGCATCTGAAACTG
TGTATCAGTAGTAGGCGGTTTA GTGTCGCTACCTCGCTAT
AAGTGAGACTATGCTGATAAAACCG ATTGAAACAGATGCCTGCTTG
CAGACGGATGGATG GATG CTTTCAAAATGTGGAGTCTTGC
AAAATCCCAGTGAGACAATC ATCCCATAATGCCTTGC ； (3)將步驟(2)的PCR產(chǎn)物用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，lOV/cm電泳2h，用硝酸銀溶液染色，氫氧化鈉顯色液顯色，拍照記錄電泳結(jié)果； (4)根據(jù)步驟(3)的電泳圖譜得到所述5個(gè)SSR標(biāo)記在待測(cè)體內(nèi)擴(kuò)增的等位基因數(shù)，在5-7個(gè)之間則為雌核發(fā)育草魚，在8-10個(gè)之間則為普通草魚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別所述雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法，其特征在于所述步驟⑵中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)時(shí)，PCR反應(yīng)體系為:總體積為20 μ L，其中含有IOX反應(yīng)緩沖液10 μ L，上下游引物各0.5 μ L，基因組DNA40ng，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積至20 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別所述雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法，其特征在于所述步驟(2)中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?941:預(yù)變性51^11，941: 30s, 50-60°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)，72 °C再延伸7min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的鑒別所述雌核發(fā)育草魚與普通草魚的方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述硝酸銀溶液的濃度為0.1%，每I升所述氫氧化鈉顯色液中含IOgNaOH, Ig 無水 NaC03，5ml37% 的甲醛。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993081SQ201410209290
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】全迎春, 韓林強(qiáng), 白俊杰, 姜鵬, 于凌云, 樊佳佳, 馬冬梅, 李勝杰, 胡重江 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司