專利名稱:性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育持續(xù)生產(chǎn)全雄黃顙魚方法
技術(shù)領(lǐng)域：
性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育持續(xù)生產(chǎn)全雄黃顙魚方法屬于魚類細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，特別涉及人工性別控制技術(shù)。
背景技術(shù)：
正如本申請文件實(shí)質(zhì)審查請求書所提交的附件參考資料[15]所提出的生產(chǎn)單性雄魚有幾種方法可供選擇如人工選擇、雄性激素直接誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)、雄核發(fā)育、種間雜交、人工誘導(dǎo)三倍體以及遺傳學(xué)方法等。但因人工挑選的勞動(dòng)強(qiáng)度大，而且不能準(zhǔn)確區(qū)分雌雄魚；用性激素直接誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)，有性激素殘留的危險(xiǎn)，許多國家早已禁用。雄核發(fā)育則存在誘導(dǎo)率、成活率低以及YY♀生理雌魚生育力極低等嚴(yán)重的技術(shù)障礙，只停留在實(shí)驗(yàn)階段，尚無成功例子。人工誘導(dǎo)三倍體只適用于雄性配子同型的魚類，而且許多種類難于在商業(yè)上應(yīng)用。只有羅非魚種間雜交與遺傳學(xué)方法取得成功，在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。但種間雜交只限于羅非魚屬的幾個(gè)雜交組合，產(chǎn)卵率較低以及繁殖群體混雜。只有稱為GMT的遺傳學(xué)技術(shù)，適用于雄性配子異型的魚類，方法可靠、穩(wěn)定，而且對環(huán)境無任何不良的影響，可以大量生產(chǎn)全雄魚。早在上世紀(jì)五、六十年代，日本Yamamoto研究青鳉性別決定與伴性遺傳時(shí)(請閱參考資料17、18、19)，利用雌性激素將XY♂雄魚逆轉(zhuǎn)成XY♀生理雌魚，并與XY♂雄魚交配，首次獲得YY♂超雄魚，證明YY♂超雄魚是可以存活的，而且還可以雌性化，成為YY♀生理雌魚，YY♀與YY♂交配便可大量產(chǎn)生YY♂超雄魚。1980年，我國楊永銓等(請閱參考資料6)應(yīng)用三系配套途徑生產(chǎn)遺傳上全雄莫桑比克羅非魚獲得成功，基本就是利用性激素性逆轉(zhuǎn)與后代測交的方法，獲得YY♂超雄魚。1989年，Varadaraj等(請閱參考資料22)也提出類似的方法獲得YY♂，超雄莫桑比克羅非魚；與此同時(shí)，Mair等1988年、Baroiller and Jalabert1989年、Scott等1989年(請閱參考資料20、21、8)也相繼發(fā)表有關(guān)研究論文提出相同的方法，獲得YY♂超雄尼羅羅非魚，在這些工作的基礎(chǔ)上，Mair等(請閱參考資料的16)1997年發(fā)表了規(guī)模生產(chǎn)全雄尼羅羅非魚的育種計(jì)劃，報(bào)道了他們的研究成果，也就是所謂的全雄魚遺傳操作技術(shù)(GMT)。這個(gè)所謂GMT育種技術(shù)是通過五代半的激素性逆轉(zhuǎn)和后代測交最后獲得YY♂超雄魚和YY♀生理雌魚，并由YY♂超雄魚和XX♀正常雌魚生產(chǎn)XY♂全雄魚。采用這種技術(shù)的育種時(shí)間較長，而且逐代測交的試驗(yàn)魚必須嚴(yán)格管理，防止混雜，才能最后取得成功?？梢姡瑢τ谑来芷谳^長的魚類而言，就未必是首選的方法，必須采用其他較為有效的技術(shù)手段。1989年，Varadaraj等(請閱參考資料22)報(bào)道了激素性逆轉(zhuǎn)結(jié)合雌核發(fā)育技術(shù)產(chǎn)生超雄莫桑比克羅非魚，這種技術(shù)據(jù)稱可將YY♂超雄魚的產(chǎn)出從25％提高到50％，并可縮短22～8個(gè)月的育種時(shí)間，還提出商業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)全雄魚的方案，但未見在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的報(bào)道。至于黃顙魚的性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育以及YY♂超雄魚、XY♂全雄魚均未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容如前所述，目前成功應(yīng)用于尼羅羅非魚全雄性種群的生產(chǎn)技術(shù)，只有種間雜交或遺傳學(xué)方法，前者只限于羅非魚中天然存在的幾個(gè)雜交組合，不可能應(yīng)用于其它養(yǎng)殖魚類，而遺傳學(xué)方法育種時(shí)間過太長(五代半)，不適用于世代周期較長的魚類，至于印度學(xué)者提出激素性逆轉(zhuǎn)結(jié)合雌核發(fā)育技術(shù)，持續(xù)生產(chǎn)全雄性莫桑鼻給羅非魚的技術(shù)路線不僅縮短了育種時(shí)間22～8個(gè)月，并且提高超雄魚(YY♂)的產(chǎn)出，這是技術(shù)上很大的進(jìn)步，但仍有進(jìn)一步提高、改進(jìn)的余地。發(fā)明人認(rèn)為上述技術(shù)方案及其技術(shù)參數(shù)是不適用于黃顙魚的，必須另行設(shè)計(jì)。
黃顙魚是淡水養(yǎng)殖的重要魚類。在相同的養(yǎng)殖條件下，雄性黃顙魚比同胞雌魚的生長速度快30％以上，因此，如能采用適當(dāng)?shù)男詣e控制技術(shù)，在生產(chǎn)上養(yǎng)殖黃顙魚雄性群體，用以提高漁產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，具有重大的經(jīng)濟(jì)意義與技術(shù)價(jià)值。發(fā)明人分析國內(nèi)外魚類性別控制的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，提出采用雌核發(fā)育結(jié)合激素性逆轉(zhuǎn)的集成技術(shù)，這就是本發(fā)明所要解決的技術(shù)，以此達(dá)到建立超雄黃顙魚和全雄魚黃顙魚的繁育體系的目的。
為此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下(1)人工催產(chǎn)選擇體表無傷、腹部膨大柔軟、性腺發(fā)育良好的雌魚及性成熟的雄魚用絨毛膜促性腺激素和魚用促排卵素進(jìn)行人工催產(chǎn)，在每條魚胸鰭基部一次性注射，催產(chǎn)劑的使用劑量雌魚為絨毛膜促性腺激素800IU，魚用排卵素10μg，雄魚為絨毛膜促性激素400IU，魚用排卵素5μg；置于水溫26℃中，24小時(shí)后從雄魚體中擠出精液或剖腹取精，從雌魚擠出成熟的卵子進(jìn)行人工授精；對長吻鮠雄魚劑量加倍；
(2)激素性逆轉(zhuǎn)用鹵蟲幼體作為激素載體，預(yù)先在50～300μg/L的乙炔基雌二醇浸泡一個(gè)小時(shí)，然后抽濾取出鹵蟲作為活餌料投喂開口攝食4天的黃顙魚正常魚苗XX♀；XY♂，每天早、中、晚上各投喂一次，投喂量以30分鐘內(nèi)吃完為準(zhǔn)，連續(xù)喂養(yǎng)40天；(3)性逆轉(zhuǎn)的XY♀生理雌魚的雌核發(fā)育(3.1)精子滅活，選用長吻鮠雄魚精子激活黃顙魚卵雌核發(fā)育，從激素催情后的長吻鮠雄魚剖腹取出精巢，用剪刀剪碎，加6-8倍的Hank’s液稀釋過濾至Φ9cm的培養(yǎng)皿中，精液厚度2-3mm，然后置于轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分的冰浴搖床上搖動(dòng)。用一支波長253730W紫外燈管照射，照距35cm，照射強(qiáng)度為1×764μw/cm2，并隨時(shí)取少量精液在解剖鏡下觀察精子活動(dòng)情況，一般照射30分鐘即可。當(dāng)精子被水激活后大部分還能緩慢泳動(dòng)時(shí)，即可停止照射；(3.2)雌核二倍體獲得，將XY♀黃顙魚生理雌魚人工催產(chǎn)獲得的成熟魚卵，與長吻鮠滅活的精子進(jìn)行人工授精，授精后1-10分鐘內(nèi)，用0-5℃冰水處理5～20分鐘，阻斷減數(shù)分裂第二極體排出，恢復(fù)雌核二倍體，取出置于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵化，便可獲得候選的YY♂超雄黃顙魚和XX♀雌魚。
(4)候選YY♂超雄黃顙魚的后代測交，從后代雌雄性比推斷候選雄魚的基因型是YY或XX，取性成熟候選YY♂超雄黃顙魚與XX♀正常雌魚測交，按Mair等制定的尼羅羅非魚標(biāo)準(zhǔn)，用K.Pearson氏X2檢驗(yàn)法，測定其后代性比的觀察值和理論值的符合度；當(dāng)符合幾率P＞0.05時(shí)，則為XY型；當(dāng)P＜0.001時(shí)，則為YY或XX型；以推斷經(jīng)后代性比測交的供試魚基因型為XY或YY或XX，從而挑選出確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚；(5)全雄黃顙魚持續(xù)生產(chǎn)，將經(jīng)后代測交確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚與正常XX♀雌魚交配，即得XY♂全雄黃顙魚；將經(jīng)后代測交確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚與性逆轉(zhuǎn)超雄生理雌魚交配，即得全YY♂超雄黃顙魚。
本發(fā)明的有益效果是(1)由于性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育相結(jié)合集成技術(shù)的創(chuàng)建，形成了持續(xù)生產(chǎn)YY♂超雄黃顙魚與XY♂全雄黃顙魚的繁育體系，并為黃顙魚及其他雄性配子異型的魚類性別控制提供一條新的技術(shù)途徑。
(2)縮短了育種時(shí)間，與遺傳學(xué)技術(shù)(GMT)相比較，可以縮短兩代，即24個(gè)月，比Varadaraj等技術(shù)縮短了半代，即6個(gè)月，提高了工效。三種技術(shù)路線比較如附表所示。
(3)有明顯的經(jīng)濟(jì)與社會效益，實(shí)驗(yàn)證明本技術(shù)實(shí)施方案成活率和性逆轉(zhuǎn)的比例以及超雄魚的產(chǎn)出均達(dá)到了設(shè)計(jì)指標(biāo)；基本上解決了全雄性黃顙魚的單性種群的生產(chǎn)問題，在不增加人工、飼料成本的情況下，可以提高單產(chǎn)25％以上；全雄性黃顙魚種苗價(jià)格與混性種苗相比較可提高25～30％。
圖1性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育持續(xù)生產(chǎn)全雄黃顙魚方法技術(shù)原理圖。
圖2性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育持續(xù)生產(chǎn)全雄黃顙魚方法流程圖。
附表三種技術(shù)方案工藝過程比較。
具體實(shí)施方式實(shí)施本發(fā)明的方式可參照圖2進(jìn)行。其具體工藝流程如下(1)人工催產(chǎn)，可按常規(guī)進(jìn)行，即選擇體表無傷、腹部膨大柔軟、性腺發(fā)育良好的雌魚及性成熟的雄魚用絨毛膜促性腺激素和魚用促排卵素進(jìn)行人工催產(chǎn)，在每條魚胸鰭基部一次性注射，催產(chǎn)劑的使用劑量雌魚為絨毛膜促性腺激素800IU，魚用排卵素2號10μg。雄魚劑量減半。即400IU、5μg絨毛膜促性腺激素和魚用排卵素2號為杭州動(dòng)物藥品廠和蕭山第一獸藥制造有限公司聯(lián)合生產(chǎn)的產(chǎn)品。將之置于水溫26℃中，24小時(shí)后從雄魚體中擠出精液或剖腹取精，從雌魚擠出成熟的卵子進(jìn)行人工授精。對于長吻鮠雄魚劑量加倍。
(2)激素性逆轉(zhuǎn)，用鹵蟲幼體作為激素載體，將之置于50～300μg/L的17-乙炔基雌二醇(EE2)中浸泡1小時(shí)，然后抽濾取出鹵蟲作為活餌料投喂開口攝食4天的黃顙魚正常魚苖(XX♀；XY♂)，每天早、中、晚各投喂一次，投喂量以30分鐘內(nèi)吃完為準(zhǔn)，連續(xù)喂養(yǎng)40天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明成活率在60％以上，轉(zhuǎn)化率在95％以上，XY♀生理雌魚約50％。
(3)性逆轉(zhuǎn)的XY♀生理雌魚雌核發(fā)育，本工藝過程包括以下兩個(gè)步驟第一，精子滅活，選用長吻鮠雄魚精子激活黃顙魚卵雌核發(fā)育，從激素催情后的長吻鮠雄魚剖腹取出精巢，用剪刀剪碎。加6-8倍的Hank’s液稀釋過濾至φ9cm的培養(yǎng)皿中，精液厚度2-3mm，然后置于轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分的冰浴搖床上搖動(dòng)。再用一支波長253730W紫外燈管照射，照距35cm，照射強(qiáng)度為1×764μw/cm2，并隨時(shí)取少量精液在解剖鏡下觀察精子活動(dòng)情況，一般照射30分鐘即可。當(dāng)精子被水激活后大部分還能緩慢泳動(dòng)時(shí)，即可停止照射。
第二，雌核二倍體獲得，將XY♀黃顙魚生理雌魚人工催產(chǎn)獲得的成熟魚卵，與長吻鮠滅活的精子進(jìn)行人工授精，授精后1-10分鐘內(nèi)，用0-5℃冰水處理5～20分鐘，阻斷減數(shù)分裂第二極體排出，恢復(fù)雌核二倍體，取出置于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵化，便可獲得候選的YY♂超雄黃顙魚和XX♀雌魚。
(4)候選YY♂超雄黃顙魚的后代測交，從后代雌雄性比推斷候選雄魚的基因型是YY或XX。取性成熟候選YY♂超雄黃顙魚與XX♀正常雌魚測交，按Mair等制定的尼羅羅非魚標(biāo)準(zhǔn)，用K.Pearson氏X2檢驗(yàn)法(chi squaretest)測定其后代性比的觀察值和理論值的符合度，雄性配子異型的魚類(XY♂)其后代雌雄比各為50％，這是性比的理論值。當(dāng)觀察值與理論值越接近時(shí)，則X2值越??；反之，X2越大。而符合幾率P與X2值成反比，即X2越大，相符則觀察值與理論值不相符。反之X2越小，P值越高，觀察值越與理論值相符。當(dāng)P＞0.05時(shí)，則為XY型，當(dāng)P＜0.001時(shí)，則為YY或XX型，以推斷經(jīng)后代性比測交的供試魚基因型為XY或YY或XX，從而挑選出確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚；(5)全雄黃顙魚持續(xù)生產(chǎn)，將侯選的經(jīng)后代測交確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚與正常XX♀雌魚交配，即得XY♂全雄黃顙魚；將經(jīng)后代測交確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚與性逆轉(zhuǎn)超雄生理雌魚交配，經(jīng)驗(yàn)證即得YY♂超雄黃顙魚。
至此，即形成了持續(xù)生產(chǎn)全雄和超雄黃顙魚的生產(chǎn)過程以及它們的繁育體系。
權(quán)利要求
一種性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育持續(xù)生產(chǎn)全雄黃顙魚方法，它包括性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育，其特征是按以下工序進(jìn)行1人工催產(chǎn)選擇體表無傷、腹部膨大柔軟、性腺發(fā)育良好的雌魚及性成熟的雄魚用絨毛膜促性腺激素和魚用促排卵素進(jìn)行人工催產(chǎn)，在每條魚胸鰭基部一次性注射，催產(chǎn)劑使用劑量雌魚為絨毛膜促性腺激素800IU，魚用排卵素10μg，雄魚為絨毛膜促性激素400IU，魚用排卵素5μg；置于水溫26℃中，24小時(shí)后從雄魚體中擠出精液或剖腹取精，從雌魚擠出成熟的卵子進(jìn)行人工授精；對長吻鮠雄魚劑量加倍；
2激素性逆轉(zhuǎn)用鹵蟲幼體作為激素載體，預(yù)先在50～300μg/L的乙炔基雌二醇浸泡一個(gè)小時(shí)，然后抽濾取出鹵蟲作為活餌料投喂開口攝食4天的黃顙魚正常魚苗XX♀；XY♂，每天早、中、晚上各投喂一次，投喂量以30分鐘內(nèi)吃完為準(zhǔn)，連續(xù)喂養(yǎng)40天；
3性逆轉(zhuǎn)的XY♀生理雌魚的雌核發(fā)育3.1精子滅活，選用長吻鮠雄魚精子激活黃顙魚卵雌核發(fā)育，從激素催情后的長吻鮠雄魚剖腹取出精巢，用剪刀剪碎，加6-8倍的Hank’s液稀釋過濾至Φ9cm的培養(yǎng)皿中，精液厚度2-3mm，然后置于轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分的冰浴搖床上搖動(dòng)；用一支波長253730W紫外燈管照射，照距35cm，照射強(qiáng)度為1×764μw/cm2；并隨時(shí)取少量精液在解剖鏡下觀察精子活動(dòng)情況，一般照射30分鐘即可；當(dāng)精子被水激活后大部分還能緩慢泳動(dòng)時(shí)，即停止照射；3.2雌核二倍體獲得，將XY♀黃顙魚生理雌魚人工催產(chǎn)獲得的成熟魚卵，與長吻鮠滅活的精子進(jìn)行人工授精，授精后1-10分鐘內(nèi)，用0-5℃冰水處理5～20分鐘，阻斷減數(shù)分裂第二極體排出，恢復(fù)雌核二倍體，取出置于26℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵化，便可獲得候選的YY♂超雄黃顙魚和XX♀雌魚；
4候選YY♂超雄黃顙魚的后代測交，從后代雌雄性比推斷候選雄魚的基因型是YY或XX，取性成熟候選YY♂超雄黃顙魚與XX♀正常雌魚測交，按Mair等制定的尼羅羅非魚標(biāo)準(zhǔn)，用K.Pearson氏X2檢驗(yàn)法，測定其后代性比的觀察值和理論值的符合度；當(dāng)符合幾率P＞0.05時(shí)，則為XY型；當(dāng)P＜0.001時(shí)，則為YY或XX型；以推斷經(jīng)后代性比測交的供試魚基因型為XY或YY或XX，從而挑選出確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚；
5全雄黃顙魚持續(xù)生產(chǎn)，將經(jīng)后代測交確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚與正常XX♀雌魚交配，即得XY♂全雄黃顙魚；將經(jīng)后代測交確認(rèn)的YY♂超雄黃顙魚與性逆轉(zhuǎn)超雄生理雌魚交配，即得YY♂超雄黃顙魚。
專利摘要
性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育持續(xù)生產(chǎn)全雄黃顙魚方法屬魚類細(xì)胞工程育種，特別涉及人工性別控制技術(shù)。它需解決的技術(shù)問題是將雌核發(fā)育與激素性逆轉(zhuǎn)相結(jié)合用于黃顙魚性別的控制，使之成為全雄黃顙魚。技術(shù)方案如下人工催產(chǎn)對性成熟的雌魚及雄魚進(jìn)行人工催產(chǎn)；人工授精；激素性逆轉(zhuǎn)用含有激素的鹵蟲幼體喂養(yǎng)黃顙魚魚苗，使雄性轉(zhuǎn)化為生理雌魚；性逆轉(zhuǎn)生理雌魚的雌核發(fā)育它包括精子滅活和雌核二倍體獲得過程，產(chǎn)生候選超雄魚和正常雌魚；經(jīng)后代測交確認(rèn)的超雄魚與正常雌魚交配獲得全雄魚，超雄魚性逆轉(zhuǎn)生理雌魚再與超雄魚交配，得全超雄黃顙魚，從而構(gòu)成全雄魚和超雄魚生產(chǎn)工藝。形成全雄黃顙魚的繁育體系，適用于全雄黃顙魚的生產(chǎn)。
文檔編號A01K67/027GK1994072SQ200610166518
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發(fā)明者陳宏溪, 劉漢勤 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan