血清中的microRNA作為肝癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了microRNA——miR-3126-5p作為肝癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用。本發(fā)明利用高通量芯片檢測不同進(jìn)展期肝癌細(xì)胞和臨床肝癌血清標(biāo)本中microRNA的表達(dá)，從中篩選出候選microRNA，隨后通過檢測大樣本血清中候選microRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-3126-5p對于診斷肝癌具有較好的靈敏度和特異性，尤其在診斷早期肝癌、AFP低表達(dá)的肝癌中具有較好的診斷價值。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明開發(fā)了檢測miR-3126-5p的引物、試劑盒及檢測方法，具有較好的開發(fā)前景和臨床應(yīng)用價值。引物序列如SEQ?ID?NO.2所示，試劑盒由microRNA抽提試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、特異性擴(kuò)增引物以及PCR擴(kuò)增所需試劑組成。
【專利說明】血清中的microRNA作為肝癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種血清中的microRNA-miR-3126_5p作為肝癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)
用，屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，男性肝癌患者年新增病例以及死亡率都高居前五位，女性肝癌患者死亡率在第七位。肝細(xì)胞性肝癌是肝癌最主要的病理類型，占原發(fā)性肝癌的80%左右，在我國占到了 90%。其死亡率高預(yù)后差的主要原因之一是其具有高轉(zhuǎn)移性。
[0003]肝癌的診斷主要依靠影像學(xué)檢查、血清甲胎蛋白(alpha fetal protein, AFP)進(jìn)行篩查。肝癌發(fā)生早期，影像學(xué)檢查不到；而AFP敏感性又較低。早期診斷治療延誤，使得超過三分之二的肝癌患者在晚期才得到治療?；趯Ω伟┮约捌渌[瘤的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)microRNA在肝癌組織中異常表達(dá)，可能參與了肝細(xì)胞癌變與肝癌轉(zhuǎn)移的病理過程。MicroRNA是一類高度保守的非編碼小RNA，通過調(diào)控基因表達(dá)參與多種生物學(xué)信號通路的調(diào)節(jié)。外周血液循環(huán)中的microRNA穩(wěn)定存在，且與多種癌癥密切相關(guān)。如果能夠開發(fā)血清microRNA作為腫瘤診斷標(biāo)志物將大大提高診斷效率。目前血清miRNA已在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中作為診斷標(biāo)志物被研究。
[0004]成熟的microRNA由microRNA前體,一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈，經(jīng)dicer等酶切割成為長度在2 1-24nt的小核苷酸片段。在哺乳動物中，成熟miRNA通過與相關(guān)蛋白質(zhì)一起組成RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，與靶mRNA分子的3'端非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，抑制翻譯或者引起mRNA降解。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測分析，單獨一個microRNA就可以調(diào)節(jié)上百個基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖分化凋亡等等多個過程發(fā)揮重要作用。而異常的microRNA表達(dá)可能與包括腫瘤在內(nèi)人類許多疾病密切相關(guān)。
[0005]現(xiàn)已有眾多報道證明腫瘤組織中microRNA的表達(dá)譜與其發(fā)病預(yù)后密切相關(guān)，但是，直接檢測組織中microRNA對患者來說創(chuàng)傷較大,技術(shù)也相對復(fù)雜，難以真正用于診斷。而外周血血清microRNA則較易獲得，對患者損傷較小,常規(guī)的臨床抽血檢查即可獲得血清標(biāo)本。并且由于microRNA的結(jié)構(gòu)特點，microRNA耐RNA酶水解，對熱、低溫、酸、堿都具有抗性，耐反復(fù)凍融，在血清中能夠長期穩(wěn)定地存在。長期低溫下保存的血清中，mictoRNA的理化性質(zhì)不會改變。因此，血清microRNA是一種理想的用于肝癌檢測的指標(biāo)。
[0006]關(guān)于血清中microRNA的來源,現(xiàn)在還沒有明確的理論依據(jù),普遍被認(rèn)同的是來源于組織細(xì)胞的主動分泌過程。在細(xì)胞內(nèi)，成熟的microRNA被脂質(zhì)或脂蛋白包裹，成為外分泌體(exosome)，分泌至胞外并進(jìn)入血液；細(xì)胞通過內(nèi)吞作用接受外分泌體并將其去包被化，釋放出的microRNA即在受體細(xì)胞內(nèi)行使其生物學(xué)功能。這種由外分泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間的microRNA的交換常常作為細(xì)胞間通訊的新渠道，對于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。
[0007]檢測血清microRNA對于腫瘤的診斷和預(yù)后判斷往往能夠提高檢測的靈敏度和特異性；而單獨的一種microRNA的表達(dá)異常往往不具有代表性或作為腫瘤標(biāo)志物特異性不高，選擇多個microRNA，或者與其他肝癌標(biāo)志物結(jié)合使用可以提高診斷的準(zhǔn)確性。近年來，有三個研究報道了 HCC患者中的血清microRNA。Qu等(Qu，KZ.etal (2011) J ClinGastroentero 145:355-60)研究了血清 hsa-miR-16、hsa-miR-195 以及 hsa_miR-196a 在283個樣本中的診斷價值，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-16具有最好的診斷效能，靈敏度和特異性分別為72.1 %和 88.8%。Xu 等(Xu, J.et al (2011)Molecular Carcinogenesis50:136-42)發(fā)現(xiàn)了血清中hsa-miR-21、hsa-miR-122和hsaniR-223是區(qū)分HCC和健康個體的潛在標(biāo)志物。Li 等(Li, LM.et al (2010) Cancer Res70,9798-807)報道了血清 microRNA 顯著的診斷價值，hsa-miR-375的靈敏度和特異性分別為96%和100%，hsaiiR-375、hsa-miR-25以及hsa-let-7f聯(lián)合應(yīng)用后，靈敏度和特異性分別為97.9%和99.1%。以上結(jié)果提示，血清microRNA診斷HCC是可行的,但是這些研究存在諸多缺陷,如用于篩選microRNA的方式和候選基因的數(shù)目有限，沒有對不同時期肝癌的診斷進(jìn)行檢測、樣本量小、缺乏早期肝癌的診斷標(biāo)志物或缺少獨立的驗證。因此，仍然有必要在HCC患者的血漿或血清中發(fā)現(xiàn)有診斷價值的microRNA生物標(biāo)志物,尤其是對于早期肝癌的診斷標(biāo)志物。通過比較多個microRNA的診斷效率，以及多個microRNA生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，可以確定能夠快速、準(zhǔn)確、低成本地對早期肝癌患者進(jìn)行診斷的miCToRNA標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過研究，發(fā)現(xiàn)了一個新的可以作為肝癌診斷標(biāo)志物的mici^RNA。本發(fā)明利用體外肝癌細(xì)胞模型結(jié)合臨床病例對肝癌中異常表達(dá)的microRNA進(jìn)行了表達(dá)分析，并分析了其對肝癌診斷的臨床意義。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的: [0010]本發(fā)明通過分析臨床肝癌血清樣本和體外肝癌細(xì)胞模型，從中篩選出了六個在肝癌血清中異常表達(dá)的 microRNA (miR-16-2_3p、miR-17_5p、miR-92a_3p、miR-107、miR-1246和miR-3126_5p),并通過realtime PCR驗證、單因素和多因素Logistic模型檢測以及ROC分析，最終明確miR-92a-3p、miR-107和miR-3126_5p對肝癌的診斷有意義，而miR-3126-5p具有最高的診斷效能。
[0011]本發(fā)明重點分析了血清microRNA-miR-3126_5p的成熟體(其序列為
UGAGGGACAGAUGCCAGAAGCA，如 SEQ ID N0.1 所示)的表達(dá)情況，首次發(fā)現(xiàn)血清 miR-3126_5p對于診斷肝癌，尤其是診斷早期肝癌和甲胎蛋白陰性的肝癌具有較高的靈敏度和特異性，因此，microRNA——miR-3126_5p可以作為肝癌診斷標(biāo)志物進(jìn)行應(yīng)用，用于診斷診斷早期原發(fā)性肝癌、低甲胎蛋白分泌的原發(fā)性肝癌(低甲胎蛋白分泌為血清甲胎蛋白含量小于200ng/mL的原發(fā)性肝癌)。具體應(yīng)用時，檢測待診斷患者外周血血清中miR-3126_5p的表達(dá)水平，對肝癌進(jìn)行診斷:若Realtime PCR檢測miR-3126_5p的相對表達(dá)量低于2.497，則該檢測者診斷為肝癌；若Realtime PCR檢測miR-3126_5p的相對表達(dá)量高于2.497，則該檢測者不診斷為肝癌。判斷的依據(jù)是基于ROC曲線對肝癌/非肝癌這一二分類變量的判斷，AUC(曲線下的面積)反映了診斷效率。經(jīng)分析顯示，miR-3126-5p對肝癌的總體診斷效率為0.881，略高于AFP (0.848) ；miR-3126-5p對BCLCO期的早期肝癌的診斷效率為0.97，遠(yuǎn)高于AFP (0.698);而對于低AFP患者(AFP〈200ng/mL)的診斷效率為0.927，遠(yuǎn)高于AFP(0.726)。[0012]所述早期原發(fā)性肝癌是BCLC (0+A)級的原發(fā)性肝癌，是按照巴塞羅那臨床肝癌標(biāo)準(zhǔn)(barcolona clinic liver cancer, BCLC)0+A 級的肝癌。
[0013]所述低甲胎蛋白分泌的原發(fā)性肝癌(低AFP分泌肝癌)是指一種適應(yīng)癥，其是一種肝癌，但其AFP表達(dá)較低(AFP〈200ng/mL)。AFP是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的肝癌標(biāo)志物，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，當(dāng)AFP界值為200ng/mL時，AFP診斷肝癌的靈敏度僅為55~60%，產(chǎn)生約40%的假陰性率。這部分AFP陰性肝癌病人在臨床上難以診斷，難以評估其治療效果和疾病進(jìn)程。并且，AFP不是肝癌的特異性指標(biāo)，一部分肝炎、肝硬化、結(jié)腸炎和結(jié)腸癌患者也會出現(xiàn)AFP的異常增高，造成了臨床應(yīng)用AFP進(jìn)行診斷的干擾。由此，AFP并不是診斷肝癌的理想標(biāo)記物，目前臨床迫切需要新的指標(biāo)用于提高肝癌的診斷率。
[0014]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種用于檢測血清miR-3126_5p成熟體的特異性擴(kuò)增的方法，概述如下:首先進(jìn)行血清microRNA的抽提，然后在poly (A)聚合酶在其3’末端加polyA尾，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并進(jìn)行RealtimePCR擴(kuò)增。其中特異性的前向引物序列為:TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQ ID N0.2所示；逆向引物序列為通用的適配子引物。
[0015]本發(fā)明還提供了一種用于檢測miR-3126_5p的試劑盒(用于診斷肝癌的試劑盒)，試劑盒由上述特異性擴(kuò)增引物以及PCR擴(kuò)增所需試劑(核酸抽提試劑、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑等，為常規(guī)試劑)組成。進(jìn)一步地，試劑盒的組成如下(表1):
[0016]表1試劑盒 組成
[0017]
【權(quán)利要求】
1.microRNA——miR-3126_5p作為肝癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用，所述miR-3126_5p的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
2.一種用于檢測血清miR-3126-5p的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于:序列為:TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如 SEQ ID N0.2 所示。
3.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒由特異性擴(kuò)增引物以及PCR擴(kuò)增所需試劑組成，其中，特異性擴(kuò)增引物序列為:TGAGGGACAGATGCCAGAAGCA,如SEQ IDN0.2所示，其特異性擴(kuò)增的目標(biāo)序列為miR-3126-5p。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的組成下表所示:.序U組成量
5.權(quán)利要求3或4所述的用于診斷肝癌的試劑盒在診斷早期肝癌、AFP低表達(dá)的肝癌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103924002SQ201410184082
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】韓麗輝, 李濤, 張穎, 賈曉青, 趙偉, 邱馭旻, 康佳, 姜艷艷, 懷婉婉, 郭蓬勃 申請人:山東大學(xué)