一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的哈茨木霉(Trichoderma?harzianum)JTM53，其保藏編號為CGMCC?No.8914。本發(fā)明還保護(hù)所述JTM53菌株的發(fā)酵物。JTM53菌株具有生存能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、不污染環(huán)境等屬性，作為生防菌具有廣闊的應(yīng)用前景。室內(nèi)對峙拮抗試驗表明，JTM53菌株對立枯絲核菌具有良好的抑菌效果。進(jìn)一步用JTM53菌株制備固體發(fā)酵物，然后用固體發(fā)酵物進(jìn)行盆栽防治實驗和大田防治試驗，對立枯絲核菌防治效果良好且穩(wěn)定。本發(fā)明對于草坪褐斑病的防控具有重大的應(yīng)用價值。
【專利說明】一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]草坪褐斑病是由立枯絲核菌引起的、發(fā)生在草坪上的一類重要的土傳真菌病害。該病害在國內(nèi)外冷暖季型草坪上普遍發(fā)生，對草坪的生長和發(fā)育危害嚴(yán)重，甚至有的年份對草坪造成毀滅性危害。該病害也可以導(dǎo)致不同地區(qū)的多種作物發(fā)病，引起大量的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]草坪禾草植物大多為多年生，這為立枯絲核菌的積累、草坪褐斑病的發(fā)生提供了適宜條件。草坪褐斑病典型的癥狀特征是草坪禾草被侵染后短期內(nèi)就可以導(dǎo)致根莖葉部組織腐爛或大量植株的死亡，到目前為止在生產(chǎn)中還未出現(xiàn)效果較好的抗病品種。
[0004]目前在對草坪褐斑病的防治中，化學(xué)防治占據(jù)重要的地位。化學(xué)防治不但成本高，且易污染環(huán)境，在防控病原菌的同時病原菌也易對化學(xué)藥劑產(chǎn)生耐藥性甚至抗藥性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株哈茨木霉及其在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum) JTM53,簡稱JTM53菌株，已于2014年03月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8914。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)所述JTM53菌株的發(fā)酵物。
[0008]所述發(fā)酵物的制備方法具體如下:
[0009](1)將JTM53菌株的孢子接種至種子培養(yǎng)基(初始濃度具體可為106CFU/mL)，進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；
[0010](2)將步驟⑴得到的種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵物。
[0011]步驟(1)中，所述培養(yǎng)的條件具體可為:溶解氧濃度20%、溫度28_30°C、攪拌速度200_250rpm(具體可為200rpm)、通氣量10_15L/min(具體可為15L/min),3天。所述種子培養(yǎng)基的具體如下:種子培養(yǎng)基(pH6.0-6.5):溶劑為水，含小麥麥麩2% (質(zhì)量比)、葡萄糖1.0% (質(zhì)量比)、硫酸鎂0.5% (質(zhì)量比)、磷酸二氫鉀0.3% (質(zhì)量比)、氯化鈣0.3%(質(zhì)量比)。
[0012]步驟(2)中，所述發(fā)酵的條件具體可為:溫度28-30°C、空氣相對濕度95-100%、培養(yǎng)基厚度5-7cm，培養(yǎng)5-7天(具體可為7天)，然后將培養(yǎng)物自然風(fēng)干至含水量為7% -10% (具體可為10% )。所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體如下:發(fā)酵培養(yǎng)基(pH6.5):將7質(zhì)量份小麥麥麩與3質(zhì)量份小麥麥稻粉末混合,加入水,使得培養(yǎng)基的含水量為70% (體積比)。
[0013]步驟(2)中，具體可將I體積份步驟(1)得到的培養(yǎng)物與9體積份發(fā)酵培養(yǎng)基混
入
口 ο
[0014]本發(fā)明還保護(hù)JTM53菌株或所述JTM53菌株的發(fā)酵物在抑制立枯絲核菌中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)JTM53菌株或所述JTM53菌株的發(fā)酵物在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明還保護(hù)JTM53菌株或所述JTM53菌株的發(fā)酵物在防控早熟禾發(fā)生草坪褐斑病中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明還保護(hù)一種用于抑制立枯絲核菌的制劑，包括JTM53菌株或所述JTM53菌株的發(fā)酵物。
[0018]本發(fā)明還保護(hù)一種防控草坪褐斑病的制劑，包括JTM53菌株或所述JTM53菌株的發(fā)酵物。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)一種防控早熟禾發(fā)生草坪褐斑病的制劑，，包括JTM53菌株或所述JTM53菌株的發(fā)酵物。
[0020]作為木霉菌，JTM53菌株具有生存能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、不污染環(huán)境等屬性，作為生防菌具有廣闊的應(yīng)用前景。室內(nèi)對峙拮抗試驗表明，JTM53菌株對立枯絲核菌具有良好的抑菌效果。進(jìn)一步用JTM53菌株制備固體發(fā)酵物，然后用固體發(fā)酵物進(jìn)行盆栽防治實驗和大田防治試驗，對立枯絲核菌防治效果良好且穩(wěn)定。本發(fā)明對于草坪褐斑病的防控具有重大的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為JTM53菌株在PDA培養(yǎng)基上20°C培養(yǎng)5d的菌落照片。
[0022]圖2為JTM53菌株的分生孢子梗及分生孢子的照片。
[0023]圖3為實施例2中的結(jié)果照片。
[0024]圖4為實施例3中的結(jié)果照片。
[0025]圖5為實施例5的步驟一中的結(jié)果照片。
[0026]圖6為實施例5的步驟二中的結(jié)果照片。
【具體實施方式】
[0027]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。70%甲基托布津可濕性粉劑:西安市臨潼區(qū)農(nóng)藥廠。早熟禾:北京國泰盛華科技發(fā)展有限公司。
[0028]立枯絲核菌(Rhizoctonia solani):參考文獻(xiàn):晁龍軍,單學(xué)敏,車少臣等.2000.草坪褐斑病病原菌鑒定、流行規(guī)律及其綜合控制技術(shù)的研究.中國草地，(4):4247.[0029]實施例1、菌株的獲得、鑒定和保藏
[0030]PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，121°C滅菌20min。
[0031]TSM 培養(yǎng)基=MgSO4.7Η200.2g、K2HPO40.9g、KC10.15g、NH4NO3L 0g、葡萄糖 3.0g、玫瑰紅0.15g、60%敵克松可濕性粉劑0.3g、PCNB0.2g、瓊脂20g、蒸餾水950ml，121°C滅菌20mino
[0032]一、JTM53菌株的獲得[0033]采樣時間:2008年2月。
[0034]采樣地點:北京高爾夫球場。
[0035]撥開3_5cm的表層土，然后將植物的根系挖出，連同根圍的土壤一起，裝到聚乙烯塑料袋里，帶回實驗室。將粘附有土壤的根系稍風(fēng)干，輕拍根系，使粘附在上面的土壤脫落，用無菌水梯度稀釋，分別吸取0.1mL稀釋液滴入TSM培養(yǎng)基平板上，用滅菌的L形涂布棒涂布均勻，置于25-28°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天。挑取形態(tài)似木霉菌的單菌落轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，鏡鑒初步認(rèn)定為木霉菌后編號，并保存到PDA培養(yǎng)基斜面上。
[0036]通過上述步驟，獲得若干純培養(yǎng)的菌株，將其中一株命名為JTM53菌株。
[0037]二、JTM53菌株的形態(tài)特征
[0038]在PDA培養(yǎng)基上20°C培養(yǎng)5d的菌落照片見圖1。直徑約9.0cm，生長速度很快，蛛絲狀至羊毛狀，白色，散生光下由于產(chǎn)孢表面呈綠色，背面無色，后期由于產(chǎn)孢量大使菌落呈稍綠色。
[0039]分生孢子梗及分生孢子的照片見圖2。多分枝的樹狀分生孢子梗形成相當(dāng)疏松的菌叢。主枝寬4-5μπι，側(cè)枝多，形成金字塔形。側(cè)生瓶?？蛇_(dá)5個，成擬輪狀排列或單個沿小側(cè)枝不規(guī)則排列。側(cè)生瓶?；柯钥O縮，中部膨大，向上漸狹成瓶梗，5-7Χ3-3.5μπι。頂生的和不典型的瓶梗相對長且纖細(xì)，13-18X2.5-3.5 μ m。瓶梗大多以大角度在其載體上著生，有時略彎向頂端。瓶 梗孢子呈球狀分生孢子頭，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，淡綠色,2.8-3.2X2.5-2.8 μ m。
[0040]三、JTM53菌株的分子鑒定
[0041]JTM53菌株的ITS區(qū)如序列表的序列I所示。
[0042]四、JTM53菌株的保藏
[0043]基于形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，JTM53菌株屬于哈茨木霉(Trichodermaharzianum)。哈茨木霉(Trichoderma harzianum) JTM53,簡稱 JTM53 菌株，已于 2014 年 03月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8914。
[0044]實施例2、JTM53菌株對病原菌的抑制作用
[0045]1、將JTM53菌株單菌落接種至PDA培養(yǎng)基平板，20°C培養(yǎng)5d。
[0046]2、取完成步驟I的PDA培養(yǎng)基平板，在菌落前沿用打孔器打取直徑為5mm的菌餅(生防菌餅)。
[0047]3、將立枯絲核菌單菌落接種至PDA培養(yǎng)基平板，20°C培養(yǎng)5d。
[0048]4、取完成步驟3的PDA培養(yǎng)基平板，在菌落前沿用打孔器打取直徑為5_的菌餅(致病菌餅)。
[0049]5、取新的PDA培養(yǎng)基平板，用打孔器打取直徑為5_，作為對照物。
[0050]6、分組處理
[0051]試驗組:取新的PDA培養(yǎng)基平板，在上面放置I個生防菌餅和I個致病菌餅，兩個菌餅中心的直線距離為3cm，25°C培養(yǎng)(12h光照/12h黑暗)；
[0052]對照組:取新的PDA培養(yǎng)基平板，在上面放置I個對照物和I個致病菌餅，兩者中心的直線距離為3cm，25°C培養(yǎng)(12h光照/12h黑暗)。
[0053]培養(yǎng)3天后測量致病菌的菌落直徑，計算抑制率。抑制率=(對照組致病菌的菌落直徑-試驗組致病菌的菌落直徑)+對照組致病菌的菌落直徑X 100%。JTM53菌株對立枯絲核菌的抑制率為68.7% (三次重復(fù)的平均值)。
[0054]培養(yǎng)6天后的照片見圖3 (左邊的為生防菌餅，右邊的為致病菌餅)，可以觀察到，立枯絲核菌已經(jīng)完全被JTM53菌株覆蓋。
[0055] 實施例3、JTM53菌株對病原菌的重寄生能力
[0056]1、將JTM53菌株單菌落接種至PDA培養(yǎng)基平板，20°C培養(yǎng)5d。
[0057]2、取完成步驟I的PDA培養(yǎng)基平板，在菌落前沿用打孔器打取直徑為5mm的菌餅(生防菌餅)。
[0058]3、將立枯絲核菌單菌落接種至PDA培養(yǎng)基平板，20°C培養(yǎng)5d。
[0059]4、取完成步驟3的PDA培養(yǎng)基平板，在菌落前沿用打孔器打取直徑為5_的菌餅(致病菌餅)。
[0060]5、取新的PDA培養(yǎng)基平板，在上面放置一個IcmX 3cm的玻璃紙條，然后在玻璃紙條長度的一端放置I個生防菌餅、另一端放置I個致病菌餅，25°c培養(yǎng)(12h光照/12h黑暗)。當(dāng)觀察致病菌和生防菌的菌絲接觸后(約培養(yǎng)2天)，在電鏡下觀察生防菌對致病菌菌絲的重寄生作用，結(jié)果見圖4，可以觀察到JTM53菌株以纏繞或平行生長等方式寄生于立枯絲核菌菌絲上，立枯絲核菌菌絲生長受到限制，菌絲變形和扭曲。培養(yǎng)I周后，JTM53菌株的菌落能完全覆蓋立枯絲核菌菌落，并大量產(chǎn)生綠色孢子。
[0061]實施例4、JTM53菌株的固體發(fā)酵物的制備和應(yīng)用
[0062]一、JTM53菌株的固體發(fā)酵物的制備
[0063]種子培養(yǎng)基(ρΗ6.0-6.5):溶劑為水，含小麥麥麩2% (質(zhì)量比)、葡萄糖1.0% (質(zhì)量比)、硫酸鎂0.5% (質(zhì)量比)、磷酸二氫鉀0.3% (質(zhì)量比)、氯化鈣0.3% (質(zhì)量比)；121°C 滅菌 30min。
[0064]發(fā)酵培養(yǎng)基(pH6.5):將7質(zhì)量份小麥麥麩與3質(zhì)量份小麥稻桿粉末混合,加入水，使得培養(yǎng)基的含水量為70% (體積比)；121°C滅菌30min。
[0065]1、將JTM53菌株的孢子接種至種子培養(yǎng)基(初始濃度為106CFU/mL)，保持溶解氧濃度20%、溫度28-30°C、攪拌速度200rpm(實際應(yīng)用中，200_250rpm均可)、通氣量15L/min (實際應(yīng)用中，10-15L/min均可)，培養(yǎng)3天。
[0066]2、將I體積份步驟I得到的培養(yǎng)物與9體積份固體培養(yǎng)基混合均勻，保持溫度28-30 0C、空氣相對濕度95-100 %、培養(yǎng)基厚度5_7cm，培養(yǎng)7天(實際應(yīng)用中，5-7天均可)，然后將培養(yǎng)物自然風(fēng)干至含水量為10 % (實際應(yīng)用中，7 % -10 %均可)，即為JTM53菌株的固體發(fā)酵物(又稱生防菌固體發(fā)酵物)。
[0067]二、立枯絲核菌的固體發(fā)酵物的制備
[0068]用立枯絲核菌代替JTM53菌株，其它同步驟一，得到立枯絲核菌的固體發(fā)酵物(又稱致病菌固體發(fā)酵物)。
[0069]三、生防菌固體發(fā)酵物的溫室生防效果(接種致病菌)
[0070]1、實驗第I天，將帶有4片真葉的早熟禾幼苗移栽到營養(yǎng)缽(每個營養(yǎng)缽裝有250g由7質(zhì)量份草炭和3質(zhì)量份蛭石混合得到的培養(yǎng)基質(zhì))，每個營養(yǎng)缽移栽10株幼苗。
[0071]2、分組處理
[0072]試驗組:實驗第8天,在營養(yǎng)缽中加入小麥麥麩粉末(小麥麥麩粉末的加入量為培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)量的1% ;目的是富集真菌群落及增加草坪褐斑病的發(fā)生壓力)，然后在營養(yǎng)缽中幼苗根部加入步驟一得到的生防菌固體發(fā)酵物(生防菌固體發(fā)酵物的加入量為培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)量的1%)和步驟二得到的致病菌固體發(fā)酵物(致病菌固體發(fā)酵物的加入量為培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)量的1% )，然后在表面覆蓋一層滅菌細(xì)土，澆水；
[0073]對照組:不加入生防菌固體發(fā)酵物，其它同試驗組。
[0074]3、實驗第33天，按如下方法調(diào)查草坪褐斑病的發(fā)病情況:把附著在幼苗根部的基質(zhì)沖洗干凈，然后調(diào)查根部的損害程度。
[0075]根部的損害程度的分級標(biāo)準(zhǔn):
[0076]O:根部腐爛程度〈1% ;1:根部腐爛程度1% -25% ；
[0077]2:根部腐爛程度26% -50% ；3:根部腐爛程度51% -75% ；
[0078]4:根部腐爛程度76% -89% ；5:根部腐爛程度>90%。
[0079]
【權(quán)利要求】
1.哈茨木霉(Trichodermaharzianum) JTM53，其保藏編號為 CGMCC N0.8914。
2.權(quán)利要求1所述哈茨木霉的發(fā)酵物。
3.如權(quán)利要求2所述的發(fā)酵物，其特征在于:所述發(fā)酵物的制備方法如下: (1)將權(quán)利要求1所述哈茨木霉的孢子接種至種子培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液； (2)將步驟(1)得到的種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基混合，進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵物。
4.權(quán)利要求1所述哈茨木霉、權(quán)利要求2所述發(fā)酵物或權(quán)利要求3所述發(fā)酵物在抑制立枯絲核菌中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述哈茨木霉、權(quán)利要求2所述發(fā)酵物或權(quán)利要求3所述發(fā)酵物在防控草坪褐斑病中的應(yīng)用。
6.一種用于抑制立枯絲核菌的制劑，包括權(quán)利要求1所述哈茨木霉、權(quán)利要求2所述發(fā)酵物或權(quán)利要求3所述發(fā)酵物。
7.—種防控草坪褐斑病的制劑，包括權(quán)利要求1所述哈茨木霉、權(quán)利要求2所述發(fā)酵物或權(quán)利要求3所述發(fā)酵物。
8.權(quán)利要求1所述哈茨木霉、權(quán)利要求2所述發(fā)酵物或權(quán)利要求3所述發(fā)酵物在防控早熟禾發(fā)生草坪褐斑病中的應(yīng)用。
9.一種防控早熟禾發(fā)生草坪褐斑病的制劑，包括權(quán)利要求1所述哈茨木霉、權(quán)利要求2所述發(fā)酵物或權(quán)利要求3所述發(fā)酵物。
【文檔編號】C12N1/14GK103952321SQ201410174328
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】姚彥坡, 王禹, 王洪瑛, 朱少倫, 王學(xué)民 申請人:唐山金土生物有機(jī)肥有限公司