一種含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶gpx1突變體及其制備方法
【專利摘要】一種含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體及其制備方法，屬于生物【技術領域】。先用基因突變或合成法獲得突變體基因，再通過營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)或營養(yǎng)缺陷型和SPP低溫聯(lián)合表達系統(tǒng)，將兩個或多個GPX的催化基團SeCys引入到突變體的底物結(jié)合部位，結(jié)果賦予其高的GPX活性；或者先將靶基因連同SeCys插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上，再將SeCys插入序列結(jié)合蛋白2組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉(zhuǎn)染同一哺乳細胞株，在亞硒酸鈉存在下用哺乳細胞合成GPX。本發(fā)明方法簡單，突變體活力和產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好，避免包涵體復性造成的產(chǎn)率下降和失活，從而解決天然GPX來源有限和性質(zhì)不穩(wěn)定問題。
【專利說明】一種含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPX1突變體及其制備方法
[0001]本專利申請是中國專利“高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體及其制備方法”的分案申請，原申請的申請日為:2013-07-18，原申請的申請?zhí)枮?201310302778.3，原申請的公布號為:CN103320406A。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體及其制備方法。
【背景技術】
[0003]含硒的谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基團是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物體內(nèi)，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)—起構(gòu)成了機體抗氧化防御體系。GPX在該體系中發(fā)揮著重要的作用，它以底物GSH為還原劑，分解體內(nèi)的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內(nèi)活性氧(R0S)，防止脂質(zhì)過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、白內(nèi)障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，還能降解脂質(zhì)過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨特的保護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然GPX的來源相當有限、穩(wěn)定性差，致使它的人工產(chǎn)物及其模擬物的研究備受關注。
[0004]小分子模擬物主要有PZ51 (ebSelen)、AL3823A、BXT系列產(chǎn)品，它們的弱點是活力低，僅為天然GPX的千分之一左右。大分子的模擬物主要有抗體酶(中國專利94102481.4和96112628.0)和以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)為蛋白模板制備的GPX模擬酶，其活力顯著高于小分子模擬物。顯然，以具有谷胱甘肽(GSH)結(jié)合部位的蛋白為模板制備的大分子GPX模擬酶收到了更好的效果，因此開發(fā)制備這些高活力的GPX模擬酶制備技術就成了學術界的研究熱點，對于分子生物學、生物工程學及醫(yī)學等領域具有廣闊的應用前景。迄今已成功開發(fā)的方法有:用化學法(中國專利94102481.4,96112628.0)或營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)(中國專利200810050556.6)在非GPX類模板蛋白中引入GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)。
[0005]中國專利94102481.4,96112628.0,99104234.4,200810050556.6 公開的各類含
硒抗體酶的制備方法就是應用化學突變(修飾)法在抗體類模板蛋白中引入GPX的催化基團SeCys，有以下缺點:(I)在制備過程中，僅化學突變(修飾)這一步就會損失20_40%的酶蛋白，導致模擬酶產(chǎn)率顯著下降；(2)制備模擬酶的周期長，操作繁瑣，時間長；(3)在化學突變過程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，這些物質(zhì)為有毒性的物質(zhì)；(4)缺乏靶向性，對于大的蛋白分子而言，一次化學反應常在不同位點引入多個非特異性催化基團，因此化學突變引入催化基團無法達到基因突變法那樣的專一性。
[0006]中國專利200810050556.6也公開了人源單鏈含硒抗體酶的另一種制備方法是用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)(大腸桿菌)和基因突變法引入催化基團，但其僅限于人源單鏈含硒抗體酶的制備，不包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)突變體及其它GPX模擬酶的制備方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的制備方法(Yu，H.J.，Liu，J.Q.，Bock,A.，Li, J.，Luo, G.M.，and Shen, J.C.J.Biol.Chem.2005，280，11930-11935)亦見報道，這種方法雖然也采用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)和基因突變法引入催化基團，但其僅限于以GST為模板蛋白制備GPX模擬酶，不包括以天然GPX為模板制備GPX突變體。用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)在非GPX類模板蛋白中引入催化基團制備模擬酶的方法是將催化基團引入到與GPX有相同底物GSH結(jié)合部位的它種蛋白中使其產(chǎn)生GPX活力。
[0007]然而由于這些模板蛋白不具備天然GPX自身的催化基團，因此很難找到理想而準確的催化基團的位置；同時由于這些模板蛋白中也沒有象天然GPX那樣理想的催化三聯(lián)體，因此這類模擬酶的催化效率不高。如果以天然GPX為模板用基因工程方法來制備GPX突變體則可克服這些缺點。由于編碼GPX的催化基團SeCys的密碼子UGA是終止密碼子，在普通原核表達系統(tǒng)中，需在GPX基因的開放閱讀框內(nèi)、緊鄰SeCys的密碼子UGA下游引入頸環(huán)結(jié)構(gòu)才能將UGA翻譯成SeCys而不是終止密碼子，而開放閱讀框內(nèi)頸環(huán)的引入必然會引起GPX空間構(gòu)象的改變，進而影響酶活性。因此普通原核表達系統(tǒng)不適于直接表達具有GPX活性的含硒蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體及其制備方法。
[0009]應用基因工程技術、細胞培養(yǎng)技術、營養(yǎng)缺陷型原核表達技術和SPP (Singleprotein production,單一蛋白生產(chǎn))系統(tǒng)低溫表達技術制備具有極高GPX活力的GPXl突變體。是用基因工程技術在哺乳動物細胞株或營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)及其SPP低溫表達系統(tǒng)中直接表達具有高酶活性的GPXl突變體蛋白的方法。本方法不需化學修飾即可制備具有極高GPX活力的新型人工酶。本發(fā)明方法在生物制藥方面具有廣闊的應用前景。
[0010]本發(fā)明以人GPXl (參見NCBI，NM_000581.2)為模板，通過計算機模擬和定點突變，得到一種新型的高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體，其由203個氨基酸組成，與人GPXl相比較，其不含有半胱氨酸，具有更高的GPX活力和更好的穩(wěn)定性，其是將GPXl中所有半胱氨酸突變成絲氨酸，但第49位仍然是硒代半胱氨酸(SeCys，單字母縮寫為U，序列表中寫成Xaa)。所述的GPXl突變體的氨基酸序列(SEQ ID No:1)如下所示:
[0011]MSAARLAAAAAAAQSVYAFSARPLAGGEPVSLGSLRGKVLLIENVASLUGTTVRDYTQMN ELQRRLGPRGLVVLGFPSNQFGHQENAKNEEILNSLKYVRPGGGFEPNFMLFEKSEVNGAGAHP LFAFLREALPAPSDDATALMTDPKLITWSPVSRNDVAWNFEKFLVGPDGVPLRRYSRRFQTIDIEP DIEALLSQGPSSA
[0012]進一步，所述的GPXl突變體的具體氨基酸序列還包括，將上述氨基酸序列中任何一個或多個丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)所形成的任何一個新型GPXl突變體。比如將87位丙氨酸(Ala)突變?yōu)榻z氨酸(Ser)，所形成的序列為SEQ ID No:2 (實施例9)。
[0013]進一步，所述的GPXl突變體的具體氨基酸序列還包括，將上述氨基酸序列中第2、78、115、156、202位5個絲氨酸的任何一個或多個被硒代半胱氨酸取代后所形成的任何一個新型GPXl突變體。比如第2位絲氨酸被硒代半胱氨酸(序列表中寫成Xaa)取代后所形成的序列SEQ ID No:3 (實施例10)。[0014]進一步，所述的GPXl突變體的具體氨基酸序列還包括，由于使用了便于靶蛋白純化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表達載體而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個新型GPXl突變體。比如在序列SEQ ID No:USEQ ID No:2和SEQ ID No: 3的氨基端引入pCo IdKTAKARA公司)原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子Xa切割位點的氨基酸后所形成的序列SEQ ID No:4, SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 (實施例 11)。
[0015]本發(fā)明的制備高活力谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體的方法，具體包括如下方法:
[0016]方法1:
[0017]先合成靶基因并組裝到分泌型原核表達載體上或先將GPXl基因組裝到分泌型原核表達載體上，用基因突變(或氨基酸替換)法獲取靶基因，再通過營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)或通過營養(yǎng)缺陷型原核和SPP低溫聯(lián)合表達系統(tǒng)，將GPX的催化基團硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPXl突變體的底物結(jié)合部位，因而在該蛋白上既有GPX的底物結(jié)合部位，又有GPX的催化基團和催化三聯(lián)體，結(jié)果賦予其極高的GPX的活性，就產(chǎn)生了高活力的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體。方法2:[0018]或先將編碼GPXl突變體的基因連同硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上，再將硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2)組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上，將兩種載體共轉(zhuǎn)染同一哺乳類細胞株，然后用篩選得到的同時含有GPXl突變體和SBP2兩種基因的陽性細胞株制備GPXl突變體蛋白，就在體外產(chǎn)生了高活力的基因工程谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體，從而解決天然GPX來源有限的問題。
[0019]本發(fā)明的具體制備步驟:
[0020]本發(fā)明的第一種方法是先在生物公司用DNA合成儀人工合成能夠表達本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白的基因，確?；蛑胁缓珹CA序列，再用單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)聯(lián)合制備GPXl突變體蛋白。
[0021]I)、表達載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明所述GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達GPXl突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的49位硒代半胱氨酸(SeCys)的編碼序列替換為半胱氨酸(Cys)的密碼子(可以是TGC等)，且基因全長不含有ACA序列；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子，并根據(jù)密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將基因中所有的ACA序列全部替換為非ACA序列所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達GPXl突變體蛋白，且全長不含有ACA序列的編碼基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點的GPXl突變體基因和分泌型原核表達載體(如PCold系列等)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而GPXl突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；[0022]2)、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達與純化:
[0023]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPXl突變體基因的表達載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內(nèi)切酶MazF的pMazF (TAKARA, Cat#3367)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG低溫4-25°C誘導表達，營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達；先小量培養(yǎng)篩選高表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得GPXl突變體蛋白純品。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定目標蛋白。[0024]該方法通過低溫下誘導營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)在GPXl突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團，因而產(chǎn)生高活力的GPXl突變體。
[0025]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0026]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0027]本發(fā)明的第二種方法是先擴增GPXl基因，然后以其為模板，用基因突變法獲得能表達本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白的基因，并在保證其氨基酸序列不變的前提下突變掉基因中的ACA序列，獲得不含ACA的GPXl突變體基因，再用單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)聯(lián)合制備GPXl突變體蛋白。
[0028]I)、表達載體的構(gòu)建:
[0029]根據(jù)基因文庫中公開的GPXl的基因序列(參見NCBI，NM_000581.2)設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保第2和202位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl基因組裝到分泌型原核表達載體上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榘腚装彼岬?9位硒代半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構(gòu)建在原核表達載體上的GPXl基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變成半胱氨酸的密碼子；同理，用上述定點突變的方法在確保不引入ACA序列的前提下，將GPXl基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子，再根據(jù)密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，將GPXl基因中所有ACA序列突變掉；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0030]2)陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及突變體蛋白的表達與純化
[0031]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPXl突變體基因的表達載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受態(tài)細胞，涂含半胱氨酸的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將表達核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF轉(zhuǎn)化陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有硒代半胱氨酸、必需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷低溫4-25°C誘導表達，營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3) Cys能用半胱氨酸的密碼子合成硒代半胱氨酸，直接表達出在底物谷胱甘肽的結(jié)合部位含有硒代半胱氨酸的重組GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達；先小量培養(yǎng)篩選高表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得含GPXl突變體的上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPX，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0032]該方法通過低溫下誘導營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)聯(lián)合SPP單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)在GPXl突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團，因而產(chǎn)生高活力的GPXl突變體蛋白。
[0033]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0034]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0035]本發(fā)明的第三種方法是先在生物公司用DNA合成儀人工合成能夠表達本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白基因，再用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備GPXl突變體蛋白。
[0036]1)、表達載體的構(gòu)建:
[0037]根據(jù)本發(fā)明所述GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達GPXl突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)，3,端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的49位硒代半胱氨酸(SeCys)的編碼序列替換為半胱氨酸(Cys)的密碼子(可以是TGC等)；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達GPXl突變體蛋白的編碼基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點的GPXl突變體基因和分泌型原核表達載體(如PCold系列等)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有而GPXl突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0038]2)、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達與純化:
[0039]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPXl突變體基因的表達載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導，營養(yǎng)缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPXl突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得GPXl突變體蛋白純品。
[0040]該方法通過基因突變和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)在GPXl突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團，因而產(chǎn)生高活力的GPXl突變體蛋白。
[0041]所述的用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0042]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000_12000g離心15_30min。
[0043]本發(fā)明的第四種方法是先擴增GPXl基因，然后以其為模板，用基因突變法獲得能表達本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白的基因，再用營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備GPXl突變體蛋白。
[0044]I)、表達載體的構(gòu)建:
[0045]根據(jù)基因文庫中公開的GPXl的基因序列(參見NCBI，NM_000581.2)設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保第2和202位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和靶基因后，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl基因組裝到分泌型原核表達載體上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榘腚装彼?Cys)的49位SeCys和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp ;用定點突變引物和快速定點突變試劑盒(InvitiOgen公司，按試劑盒說明書操作)，將構(gòu)建在原核表達載體上的GPXl基因中的SeCys的編碼序列突變成Cys的密碼子(比如TGC);同理，用上述定點突變的方法將GPXl基因中的其它半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0046]2)、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達與純化:
[0047]用步驟I)中構(gòu)建的含有GPXl突變體基因的表達載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)誘導，營養(yǎng)缺陷型菌株_BL21(DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，最后直接表達出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPXl突變體蛋白，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質(zhì)腔里；先小量培養(yǎng)篩選高表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得GPXl突變體蛋白純品。
[0048]該方法通過基因突變和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)在GPXl突變體的底物結(jié)合部位引入了催化基團，因而產(chǎn)生高活力的GPXl突變體蛋白。
[0049]所述的 用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，是用pH7.5,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0050]所述的將液體低溫離心，可以在4°C，8000-12000g離心15_30min。
[0051]第五種方法:用合成的靶基因和哺乳細胞表達系統(tǒng)制備GPXl突變體蛋白[0052]I)、表達載體的構(gòu)建:
[0053]根據(jù)本發(fā)明所述的GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成GPXl突變體的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼GPXl突變體蛋白的基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)，但靶基因的3'端必須含有GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點的GPXl突變體基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl突變體基因連同其3'端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0054]2)、陽性細胞株的篩選:
[0055]用含有SBP2和GPXl突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導下共轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)陽性克隆，最終獲得同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPXl突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0056]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0057]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細胞表達GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0058]所述的檢測GPXl突變體蛋白的表達量，可以用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測；
[0059]所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPXl突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0060]本發(fā)明的第六種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPXl突變體基因的載體轉(zhuǎn)染同一哺乳類細胞。
[0061]1)、表達載體的構(gòu)建:
[0062]根據(jù)本發(fā)明所述的GPXl突變體的氨基酸序列在生物公司用DNA合成儀人工合成GPXl突變體的編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點；具體的基因序列可以是將GPXl基因(參見NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子所得到的編碼基因，也可以是其它任何一種編碼GPXl突變體蛋白的基因(由于密碼子的簡并性，同一氨基酸序列可以有多種不同的編碼基因)，但靶基因的3'端必須含有GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS);用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點的GPXl突變體基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司),再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl突變體基因連同其3'端非翻譯區(qū)或硒代半胱氨酸插入序列組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，3'端含有終止密碼子和特定的酶切位點，用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0063]2)、陽性細胞株的篩選:
[0064]先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達SBP2的細胞株。再用含有GPXl突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPXl突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0065]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0066]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細胞表達GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0067]在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，也可先轉(zhuǎn)染GPXl突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株。所述的檢測GPXl突變體蛋白的表達量，可以用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。
[0068]所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPXl突變體，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0069]第七 種方法:用擴增的靶基因和哺乳細胞表達系統(tǒng)制備GPXl突變體蛋白
[0070]I)、表達載體的構(gòu)建:
[0071]根據(jù)基因文庫中GPXl基因序列(參見NCBI，NM_000581.2)設計引物擴增GPXl的編碼基因及其3'端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI, NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構(gòu)建在真核表達載體上的GPXl基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白。根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；
[0072]2)、陽性細胞株的篩選:[0073]用含有SBP2和GPXl突變體基因的載體在轉(zhuǎn)染試劑的介導下共轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，用兩個載體上的抗性基因通過抗生素濃度從高到低逐級遞減法篩選兼具兩種抗性的陽性細胞克隆，再用多孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)陽性克隆，最終獲得同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽性細胞株；檢測GPXl突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0074]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0075]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細胞表達GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里，用谷胱甘肽(GSH)親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0076]所述的檢測GPXl突變體蛋白的表達量，可以用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測；
[0077]所述的用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPXl突變體蛋白，是用pH7.5，50mmol/LTris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0078]本發(fā)明的第八種方法是分步用含有SBP2基因的載體和含有GPXl突變體基因的載體轉(zhuǎn)染同一哺乳類細胞。
[0079]I)、表達載體的構(gòu)建:
[0080]根據(jù)基因文庫中GPXl基因序列(參見NCBI, NM_000581.2)設計引物擴增GPXl的編碼基因及其3'端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，靶基因的3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI, NM_000581.2)或硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和特定的酶切位點，確保第2位Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點的靶基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構(gòu)建在真核表達載體上的GPXl基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能夠編碼本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白。根據(jù)基因文庫中硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，見NCBI，NM_024077.3)羧基端的343-854位的512個氨基酸的基因序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和特定的酶切位點，端含有終止密碼子和特定的酶切位點；同樣經(jīng)酶切連接后用特定的酶切位點將SBP2基因組裝到胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體上(如pcDNA3.1/myc-His A等，Invitrogen公司)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而靶基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基組成的DNA序列；[0081]2)、陽性細胞株的篩選:
[0082]先用含有SBP2基因的載體轉(zhuǎn)染哺乳類細胞，通過該載體上的抗性基因篩選穩(wěn)定表達SBP2的細胞株；再用含有GPXl突變體基因的載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達SBP2的細胞株，用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株；檢測GPXl突變體蛋白的表達量并篩選靶蛋白表達量高的細胞株；
[0083]3)、靶蛋白的表達與純化:
[0084]在搖瓶中將同時表達兩種外源蛋白的細胞株放大培養(yǎng)，在含有亞硒酸鈉的培養(yǎng)基里用哺乳類細胞表達GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式分泌到培養(yǎng)基里；用谷胱甘肽親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得酶蛋白純品。
[0085]在陽性細胞株的篩選中，所述的陽性細胞株的篩選，也可先轉(zhuǎn)染GPXl突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因，再用兩個載體上的抗性基因篩選同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株。所述的檢測GPXl突變體蛋白的表達量，可以用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA或GPX活力測定技術進行檢測。
[0086]所述的用谷胱甘肽親和層析純化GPXl突變體，是用ρΗ7.5，50mmol/L Tris-Cl平衡并洗脫雜蛋白，用含lOmmol/L GSH的緩沖液洗脫目的蛋白。
[0087]本發(fā)明的第九種方法與第一種方法完全相同，只是合成GPXl突變體的編碼基因時將第87位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子，最后獲得的GPXl突變體蛋白的第87位是絲氨酸(SEQ ID No:2)，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列與第一種方法完全相同。
[0088]本發(fā)明的第十種方法與第一種方法完全相同，只是合成GPXl突變體的編碼基因時將第二位絲氨酸的編碼序列替換為半胱氨酸的密碼子，最后獲得的GPXl突變體蛋白的第二位是硒代半胱氨酸(SEQ ID No: 3)，而不是絲氨酸，其它氨基酸序列與第一種方法完全相同。
[0089]本發(fā)明的第十一種方法與第一種方法完全相同，只是由于使用了便于靶蛋白純化的pColdl (TAKARA公司)等分泌型原核或真核表達載體而在靶蛋白的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個新型GPXl突變體。比如在序列 SEQ ID No: K SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 的氨基端引入 pColdl (TAKARA 公司)原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子Xa切割位點的氨基酸后所形成的序列SEQ IDNo:4, SEQ ID No:5, SEQ ID No:6。本發(fā)明具有以下特點:
[0090]⑴本發(fā)明使用簡單的基因合成或擴增、基因突變和表達等基因工程技術，制備方法簡單。
[0091]⑵本發(fā)明方法制備的GPXl突變體蛋白活力高，已超過天然GPX活力的一個數(shù)量級，細胞生物學實驗已證實對過氧化氫損傷的心肌細胞有更強的保護作用。
[0092]⑶本發(fā)明所述的GPXl突變體蛋白具有超強的穩(wěn)定性，不易失活，這一特性彌補了天然GPX的缺陷。
[0093]⑷本發(fā)明使用的分泌型表達載體，能將GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達并分泌到大腸桿菌的周質(zhì)腔或哺乳類細胞的體外，引導蛋白分泌表達的前導信號肽由菌體或細胞自動切除，所表達的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構(gòu)象和更高的活性，不需復性，可避免包涵體復性過程造成的產(chǎn)率下降和失活，因而生產(chǎn)周期短。[0094](5)本發(fā)明使用的SPP低溫表達系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有活力高、產(chǎn)率高的雙重優(yōu)勢。
[0095](6)本發(fā)明所用的真核表達直接使用GPX自身的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)，不需另外引入SECIS進入表達載體，因而操作簡單且可用常規(guī)真核表達載體實施。
[0096]這些優(yōu)點均有利于大規(guī)模生產(chǎn)，為今后的實際應用打下了堅實的基礎，解決了天然GPX來源不足、性質(zhì)不穩(wěn)定和活力低的問題，在生物制藥方面有廣闊的應用前景。
[0097]說明書附圖
[0098]圖1:純化得到的GPXl突變體蛋白的SDS-PAGE (上)和Western blot (下)結(jié)果:其中M是蛋白分子量Marker，1-11泳道是實施例1~11制備的靶蛋白。
【具體實施方式】
[0099]實施例1:用合成的基因聯(lián)合SPP和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0100]根據(jù)本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，確保GPXl突變體基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，
端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，GPXl突變體基因的第49號SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC)，且基因全長不含有ACA序列；具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見NCBI，NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)，并將基因中第168、537、561和573號堿基C全部替換為T所得到的不含有ACA序列的GPXl突變體基因，確保該基因能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白，且靶基因的5/端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3/端含有終止密碼子和Hind III酶切位點；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III (TAKARA，Cat.#3369)載體上。
[0101]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株。再將表達核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mL Kana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50μg/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。用0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第I泳道。其GPX活力為21786U/ym0l，超過天然GPX 一個數(shù)量級。
[0102]本實施例使用的SPP低溫表達系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢。
[0103]實施例2:用基因擴增及突變法和SPP聯(lián)合營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0104]用mRNA 小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應)將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫中公開的人GPXl的基因(參見NCBI，NM_000581.2)序列設計引物擴增其編碼基因，確保基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，并將第2和202號Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；具體的5'端引物是5’ -GGAATTCCATATGAGTGCTGCT CGGC-3 ’，3 '端引物是 5 ’ -CCCAAGCTTCTAGGCACTGCTGGGC-3 ’。用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，用DNA連接酶連接到同樣酶切的pCold III(TAKARA, Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)49號SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長25-50bp，以49號SeCys的密碼子(TGA)為中心，正義引物的序列是5’ -GAATGTGGCGTCCCTCTGCGGCACCACGGTCCGGGAC-3’。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒(InvitiOgen公司，按試劑盒說明書操作)，將構(gòu)建在原核表達載體pCold III上的GPXl基因的第49號SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生。用同樣方法將人GPXl基因中其它所有Cys的密碼子突變成Ser的密碼子；對應的正義引物分別是:C78S5’ -GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGITTGGGC-3’，C115S5’ -CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3’，C156S5’ -CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCAACGATGTTGC-3’。最后在保持GPXl突變體氨基酸序列不變的前提下突變掉基因中所有ACA序列，即將第168、537、561和573號堿基C全部突變?yōu)門，共用3條引物，其正義序列分別是5’-CACGGTCCGGGACTATACCCAGATGAACGAG-3’，5’-CCCCTACGCAGGTATAGCCGCCGCTTCC-3’，5’-CGCTTCCAGACCATTGATATCGAGCCTGATATCGAAGCCCTGCTGTC-3’;通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列I (Seql)所述的GPXl突變體蛋白。
[0105]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株。再將表達核酸內(nèi)切酶MazF的質(zhì)粒pMazF (TAKARA, Cat.#3369)轉(zhuǎn)化到該陽性菌株中。將菌液均勻涂布在含100 μ g/mLAmp>25 μ g/mL Kana和25 μ g/mL的M9-CAA固體培養(yǎng)基中篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.5。將菌液置于_20°C冰箱中5min，使菌液迅速冷卻，之后將菌液置于15°C中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)45min。15°C 5000rpm離心5min,棄上清。0.9%NaCl重懸菌體沉淀，15°C 5000rpm離心5min,棄上清，重復該步驟。然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸菌體，加入終濃度為lmmol/L IPTG和終濃度為200 μ g/mL SeCys, 15°C振蕩培養(yǎng)16-72h，使GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達在菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達。收集菌體(6000rpm，IOmin)并用等體積的 bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第2泳道。其GPX活力為21560U/ymOl，超過天然GPX 一個數(shù)量級。
[0106]本實施例使用的SPP低溫表達系統(tǒng)能利用MazF蛋白酶特異性識別并切割含有ACA序列的mRNA的特性，使菌體只能合成編碼基因中無ACA序列的蛋白質(zhì)，因此新合成的蛋白主要是外源重組 蛋白，從而提高產(chǎn)率和Cys向SeCys的轉(zhuǎn)化率，因此具有高活高產(chǎn)雙重優(yōu)勢。
[0107]實施例3:用合成的基因和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0108]根據(jù)本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列，在生物公司用DNA合成儀人工合成能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，確保GPXl突變體基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，GPXl突變體基因的第49號SeCys的編碼序列TGA替換為Cys的密碼子(TGC);具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見NCBI, NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)，第49位硒代半胱氨酸的密碼子替換為半胱氨酸的編碼序列(TGC)所得到的能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突變體蛋白的基因，且靶基因的5'端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點；用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和HindIII雙酶切后，連接到同樣酶切的pCold III(TAKARA, Cat.#3369)載體上。
[0109]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養(yǎng)至0D600約為0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養(yǎng)液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1.2L，然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養(yǎng)基中補充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續(xù)培養(yǎng)2_12h，使GPXl以可溶性形式表達在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體(6000rpm, IOmin)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第3泳道。其GPX活力為5320υ/μ mol，達到天然GPX的數(shù)量級水平。
[0110]營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3) Cys來源于題目為“Structure of theCathelicidin Motif of Protegrin_3Precursor: Structural Insights into theActivation Mechanism of an Antimicrobial Protein，，的文章，2002年發(fā)表在Structure第10卷，1363 - 1370頁。該菌種的獲取可以由文章作者或August Bock教授贈予。
[0111]實施例4:用基因擴增及突變法和營養(yǎng)缺陷型原核表達系統(tǒng)制備基因工程人GPXl突變體蛋白
[0112] 用mRNA 小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN_10)從人 H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應)將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫中公開的人GPXl的基因(參見NCBI，NM_000581.2)序列設計引物擴增其編碼基因，確?；虻? '端含有起始密碼子(ATG)和Nde I酶切位點，3'端含有終止密碼子和Hind III酶切位點，并將第2和202號Cys的密碼子替換成Ser的密碼子，其它氨基酸序列不變；具體的5'端引物是5’ -GGAATTCCATATGAGTGCTGCTCGGC-3 ’，3 '端引物是 5 ’ -CCCAAGCTTCTAGGCACTGCTGGGC-3，。用限制性核酸內(nèi)切酶Nde I和Hind III雙酶切后，用DNA連接酶連接到同樣酶切的pColdIII (TAKARA，Cat.#3369)載體上。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據(jù)49號SeCys比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長25_50bp，以49號SeCys的密碼子(TGA)為中心。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒(Invitrogen公司，按試劑盒說明書操作)，將構(gòu)建在原核表達載體pCold III上的GPXl基因的第49號SeCys的編碼序列TGA突變成Cys的密碼子(TGC)，通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，用同樣方法將人GPXl基因中其它所有Cys的編碼序列突變成Ser的密碼子，將87位Ala的編碼序列突變?yōu)镾er的密碼子(TCC)，對應的正義引物分別是:C78S5，-GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGTTTGGGC-3，，C115S5，-CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3’，C156S5’ -CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCAACGATGTTGC-3’ 和 A87S5’ -GTTTGGGCATCAGGAGAACTCCAAGAACGAAGAGATTC-3’。通過DNA測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列2 (SEQ ID No:2)所述的GPXl突變體蛋白。
[0113]用裝有GPXl突變體基因的載體(pCold II1-GPXl突)轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌BL21 (DE3)Cys，涂含有Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將陽性轉(zhuǎn)化子接種于1.2L M9缺陷表達培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素、50 μ g/ml Cys和除了 Cys之外的19種氨基酸各100 μ g/ml)中至0D600為0.1，培養(yǎng)至0D600約為0.3-1，加入終濃度0.1-1mM的IPTG，IOmin后加入終濃度10 μ g/ml的氯霉素。加入氯霉素五分鐘后培養(yǎng)液離心，低溫6000rpm離心5分鐘，用冰浴的生理鹽溶液洗兩次，每次用1.2L，然后用生產(chǎn)培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中加入除了 Cys之外的19種氨基酸各50-400 μ g/ml)重懸，并向培養(yǎng)基中補充終濃度400 μ g的利福平和600 μ M SeCys。繼續(xù)培養(yǎng)2_12h，使GPXl以可溶性形式表達在菌體的周質(zhì)腔里。收集菌體(6000rpm, IOmin)并用等體積的bufferT (50mM Tris buffer, ρΗ7.5,含 ImM EDTA)洗漆兩次。用 BufferT 重懸菌體沉淀，加入終濃度ImM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4°C，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理GSH親合柱，應用緩沖液(50mmol/L Tris，pH7.5)平衡，將上清液加入GSH親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用lOmmol/L GSH洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第4泳道。其GPX活力為5130υ/μ mol，達到天然GPX的數(shù)量級水平。(本方法也可用于制備87位Ala不突變?yōu)榻z氨酸即具有序列I (SEQ ID No:l)的氨基酸序列的GPXl突變體，具體方法除省去將87位Ala的編碼序列突變?yōu)镾er的密碼子這一步外，其它與本法完全相同。)
[0114]實施例5:用合成的基因和哺乳細胞表達系統(tǒng)一步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0115]1.人GPXl突變體蛋白表達載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列在生物試劑公司用DNA合成儀人工合成GPXl突變體基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，3'端在人GPXl突變體基因終止密碼子下游GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點；具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)所得到的能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI,NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/BamHI酶切位點將GPXl突變體基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根據(jù)基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343_854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A(Invitrogen公司)上。[0116]2.人GPXl突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到IXlO6Ail的密度時，用含有SBP2和GPXl突變體基因的表達載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下共轉(zhuǎn)染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液，篩選具有兩種抗性即同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。用抗GPXl多克隆抗體和ELISA技術檢測GPXl突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養(yǎng)和凍存。
[0117]3.人GPXl突變體蛋白的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養(yǎng)基中擴培養(yǎng)2中篩選獲得的同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體蛋白，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第5泳道。其GPX活力為22689υ/μπι01，超過天然GPX—個數(shù)量級。
[0118]實施例6:用合成的基因和哺乳細胞表達系統(tǒng)分步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0119]1.人GPXl突變體蛋白表達載體的構(gòu)建:根據(jù)本發(fā)明序列1(SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體的氨基酸序列在生物試劑公司用DNA合成儀人工合成GPXl突變體基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，3'端在人GPXl突變體基因終止密碼子下游GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，ΝΜ_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點；具體的靶基因序列是將GPXl基因(參見NCBI,NM_000581.2)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的密碼子替換為絲氨酸的編碼序列(依次是:AGT、AGC、AGC、AGT、AGT)所得到的能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:1)所述的GPXl突變體蛋白的基因，且靶基因的3'端含有GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI,NM_000581.2)，并在GPXl基因的多聚寡核苷酸A前一個堿基后插入BamHI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/BamHI酶切位點將GPXl突變體基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；同理根據(jù)基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2，NCBI，NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列在生物公司用DNA合成儀人工合成其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343_854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen公司)上。
[0120]2.人GPXl突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到IXlO6Ail的密度時，用含有SBP2基因的表達載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉(zhuǎn)染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418的培養(yǎng)液，篩選具有G418抗性即穩(wěn)定表達SBP2的陽性細胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。再用含有GPXl突變體基因的表達載體在lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達SBP2的293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液篩選具有兩種抗性即同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml,Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將具有兩種抗性的陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA技術檢測GPXl突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養(yǎng)和凍存。
[0121]上述方法也可以先轉(zhuǎn)染GPXl突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因。
[0122]3.人GPXl突變體的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養(yǎng)基中擴培養(yǎng)2中篩選獲得的同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293F細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體以可溶性形式表達并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體，收集含有GPXl突變體的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第6泳道。其GPX活力為21968υ/μπι01，超過天然GPX —個數(shù)量級。 [0123]實施例7:用擴增的靶基因和和哺乳細胞表達系統(tǒng)一步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0124]1.人GPXl突變體蛋白表達載體的構(gòu)建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN-10)從人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應)將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫中公開的人GPXl的基因序列(參見NCBI，NM_000581.2)設計引物擴增GPXl的編碼基因及其3'端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，第2位Cys的密碼子替換為Ser的編碼序列，其它氨基酸序列不變，3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)和Hind III酶切位點；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點的祀基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；具體的5'端引物是5’ -CCCAAGCTTCATATGAGTGCTGCTCGGC-3’，3'端引物是5’-CGGGATCCAGT GGGGAAACTCG-3’。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/BamHI酶切位點將GPXl基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構(gòu)建在原核表達載體上的人GPXl基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；具體的正義引物分別是:C78S5’ -GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGTTTGGGC-3’，Cl15S5，-CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3，,C156S5，-CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCMCGATGTTGC-3’ 和 C202S5’ -GTCTCAAGGGCCCAGCTCTGCCTAGGGCGCCCCTC-3’ ；通過 DNA 測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列I (SEQ ID No:l)所述的GPXl突變體蛋白。根據(jù)基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2 (SBP2,NCBI, NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，設計引物擴增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點；具體的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’ -CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。
[0125]2.人GPXl突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到IXlO6Ail的密度時，用含有SBP2和GPXl突變體基因的表達載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下共轉(zhuǎn)染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液，篩選具有兩種抗性即同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418和Zeocin濃度分別從800-200 μ g/ml和400-100 μ g/ml逐步遞減,每次分別減200 μ g/ml和100 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽性細胞克隆 用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。用抗GPXl多克隆抗體和ELISA技術檢測GPXl突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養(yǎng)和凍存。
[0126]3.人GPXl突變體蛋白的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養(yǎng)基中擴培養(yǎng)2中篩選獲得的同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體蛋白以可溶性形式表達并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體蛋白，收集含有GPX4的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第7泳道。其GPX活力為22689υ/μπι01，超過天然GPX—個數(shù)量級。
[0127]實施例8:用擴增的靶基因和和哺乳細胞表達系統(tǒng)分步轉(zhuǎn)染制備人GPXl突變體蛋白
[0128]1.人GPXl突變體蛋白表達載體的構(gòu)建:用mRNA小量提取試劑盒(Sigma, Cat#MRN-10)從人H印G_2 (DSMZ#ACC180)肝癌細胞中提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT, Promega, Cat#M5101)和oligo(dT)存在下，通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應)將其轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因文庫中公開的人GPXl的基因序列(參見NCBI，NM_000581.2)設計引物擴增GPXl的編碼基因及其3'端非翻譯區(qū)的堿基序列，在設計引物時，確保靶基因的 端含有起始密碼子(ATG)和Hind III酶切位點，第2位Cys的密碼子替換為Ser的編碼序列，其它氨基酸序列不變，3'端在終止密碼子下游引入GPXl基因的3'端非翻譯區(qū)的全部堿基序列(從GPXl基因的終止密碼子后第一個堿基到多聚寡核苷酸A前一個堿基，具體序列參見NCBI，NM_000581.2)和Hind III酶切位點；用相同的限性核酸內(nèi)切酶切割兩端有特定酶切位點的祀基因和哺乳類細胞表達載體(如pSecTag2A等，Invitrogen公司)，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl基因連同其3'端非翻譯區(qū)組裝到分泌型哺乳類細胞表達載體上；具體的5'端引物是5’ -CCCAAGCTTCATATGAGTGCTGCTCGGC-3’，3'端引物是5’ -CG GGA TCCAGT GGGGAAACTCG-3’。用先酶切后連接的方法，通過Hind III/BamHI酶切位點將GPXl基因連同硒代半胱氨酸插入序列連接到同樣酶切的哺乳類細胞表達載體pSecTag2A (Invitrogen公司)上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下,根據(jù)GPXl中要突變?yōu)榻z氨酸的半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以突變氨基酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構(gòu)建在原核表達載體上的人GPXl基因中的全部半胱氨酸的編碼序列突變成絲氨酸的密碼子；具體的正義引物分別是:C78S5’ -GTGCTCGGCTTCCCGAGCAACCAGTTTGGGC-3’，Cl15S5’-CATGCTCTTCGAGAAGAGCGAGGTGAACGGTGC-3，,C156S5，-CACCTGGTCTCCGGTGAGTCGCAACGATGTTGC-3’ 和 C202S5’ -GTCTCAAGGGCCCAGCTCTGCCTAGGGCGCCCCTC-3’ ；通過 DNA 測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發(fā)生，確保突變后的基因能編碼本發(fā)明序列I (SEQID No:1)所述的GPXl突變體蛋白。根據(jù)基因文庫中人硒代半胱氨酸插入序列結(jié)合蛋白2(SBP2,NCBI,NM_024077.3)羧基端343-854位的512個氨基酸的基因序列，設計引物擴增其編碼基因，確?；虻?'端含有起始密碼子(ATG)和XbaI酶切位點，3'端含有終止密碼子和EcoRI酶切位點；具體的Y端引物是5 ’ -GCTCTAGAATGGAAGCTTTATCTTC-3 ’，3 ^端引物是5’-CGGAATTCTAAATTCAAATTC-3’。用先酶切后連接的方法，通過Xbal/EcoRI酶切位點將SBP2的羧基端(343-854aa)基因組裝到同樣酶切的胞內(nèi)型哺乳類細胞表達載體pcDNA3.1/myc-His A (Invitrogen 公司)上。
[0129]2.人GPXl突變體基因陽性細胞株的篩選:當細胞生長到IXlO6Ail的密度時，用含有SBP2基因的表達載體在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉(zhuǎn)染293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418的培養(yǎng)液，篩選具有G418抗性即穩(wěn)定表達SBP2的陽性細胞克隆，期間G418濃度從800 μ g/ml逐步遞減到200 μ g/ml，每次減200 μ g/ml，每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。再用含有GPXl突變體基因的表達載體在lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,按說明書使用)介導下轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達SBP2的293F細胞(Invitrogen，R79007)，轉(zhuǎn)染后72小時將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中開始貼壁培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)48 (通常2-50)小時后換含有G418和Zeocin的培養(yǎng)液篩選具有兩種抗性即同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的陽性細胞克隆，期間G418濃度維持在200 μ g/ml,Zeocin濃度從400 μ g/ml逐步遞減到100 μ g/ml,每次減100 μ g/ml,每個濃度使用5天，2-3天換一次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)20天后將具有兩種抗性的陽性細胞克隆用96、48、24、12和6孔培養(yǎng)板逐級放大培養(yǎng)。用抗GPXl的多克隆抗體和ELISA技術檢測GPXl突變體蛋白的表達量，挑選靶蛋白表達量高的細胞株用于擴培養(yǎng)和凍存。
[0130]上述方法也可以先轉(zhuǎn)染GPXl突變體基因，后轉(zhuǎn)染SBP2基因。
[0131]3.人GPXl突變體的表達與純化:在大容量含有1-10 μ M亞硒酸鈉的293F表達培養(yǎng)基中擴培養(yǎng)2中篩選獲得的同時穩(wěn)定表達SBP2和GPXl突變體兩種外源蛋白的細胞株。在SBP2、SECIS和293F細胞中其它蛋白因子的共同參與下，GPXl突變體以可溶性形式表達并分泌于培養(yǎng)基中，每48小時收集一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)液經(jīng)IOKDa分子量超濾膜濃縮20倍后，用GSH親和層析柱純化GPXl突變體，收集含有GPXl突變體的洗脫液，透析除去小分子物質(zhì)，凍干即得人GPXl突變體蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western blot)鑒定靶蛋白，其分子量為24.2kDa，且與抗GPXl抗體特異性結(jié)合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第8泳道。其GPX活力為20968U/μ mol，超過天然GPX —個數(shù)量級。
[0132]實施例9:
[0133]與實施例1制備方法完全相同，只是合成GPXl突變體的編碼基因時將第87位丙氨酸的編碼序列替換為絲氨酸的密碼子(TCC)，最后獲得的GPXl突變體蛋白的第87位是絲氨酸，而不是丙氨酸，其它氨基酸序列與第一種方法完全相同，即本發(fā)明序列2 (SEQ IDNo:2)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體分子量僅有微小的變化，在SDS-PAGE和WesternBlot結(jié)果上沒有區(qū)別，見圖1的第9泳道。但其GPX活力為23619υ/μπι01，高于實施例1，超過天然GPX —個數(shù)量級。
[0134]實施例10:
[0135]與實施例1制備方法完全相同，只是合成GPXl突變體的編碼基因時將第2位絲氨酸的編碼序列替換為半胱氨酸的密碼子，最后獲得的GPXl突變體蛋白的第二位是硒代半胱氨酸，而不是絲氨酸，其它氨基酸序列與第一種方法完全相同，即本發(fā)明序列3 (SEQ IDNo:3)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體分子量僅有微小的變化，在SDS-PAGE和WesternBlot結(jié)果上沒有區(qū)別，見圖1的第10泳道。但其GPX活力為15358U/ymol，低于實施例1，但仍然超過天然GPX —個數(shù)量級。
[0136] 實施例11:[0137] 除將實施例1所用的表達載體pCold III (TAKARA，Cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的PCold I (TAKARA, Cat.#3367)，其余與實施例1完全相同，即最終將獲得本發(fā)明序列4 (SEQ ID No:4)所述的GPXl突變體蛋白。該突變體在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸在內(nèi)的16個外源氨基酸，因此分子量有所增加，在SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果上可以看到，見圖1的第11泳 道，其優(yōu)點是也可以用鎳親和層系純化靶蛋白。其GPX活力為20532U/ymol，略低于實施例1，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力超過天然GPX —個數(shù)量級。
【權利要求】
1.一種含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
2.一種含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
3.權利要求1所述的含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體的制備方法，其步驟如下: 1)、表達載體的構(gòu)建: 根據(jù)氨基酸序列SEQ ID No: 1，用DNA合成儀人工合成能在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達GPXl突變體蛋白的基因，確保靶基因的5'端含有起始密碼子ATG，3'端含有終止密碼子，且兩端都含有特定的酶切位點，確保靶基因的49位硒代半胱氨酸SeCys的編碼序列替換為半胱氨酸Cys的密碼子，第二位絲氨酸的編碼序列替換為半胱氨酸的密碼子，且基因全長不含有ACA序列；然后用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割兩端含特定酶切位點的GPXl突變體基因和分泌型原核表達載體，再用DNA連接酶通過特定的酶切位點將GPXl突變體基因組裝到分泌型原核表達載體上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而GPXl突變體基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內(nèi)切酶識別的喊基組成的DNA序列； 2)、陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及蛋白的表達與純化: 用步驟I)中構(gòu)建的含有GPXl突變體基因的表達載體轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys的感受態(tài)細胞，涂含Cys的營養(yǎng)瓊脂平板，篩選陽性菌株；再將含有表達核酸內(nèi)切酶MazF的pMazF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 陽性菌株，用含雙抗性的M9固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將陽性轉(zhuǎn)化子擴培養(yǎng)后，在含有SeCys、必需生長因子和營養(yǎng)素的培養(yǎng)基里，經(jīng)IPTG低溫4_25°C誘導表達，營養(yǎng)缺陷型菌株-BL21 (DE3)Cys能用Cys的密碼子合成SeCys，直接表達出在底物GSH的結(jié)合部位含有SeCys的GPXl突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質(zhì)腔里，而MazF能通過識別并切斷單鏈RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白質(zhì)的表達；先小量培養(yǎng)篩選高表達株，再擴大培養(yǎng)和誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽GSH親和層析純化GPXl突變體蛋白，透析凍干后即得GPXl突變體蛋白純品，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和蛋白印跡Western blot鑒定目標蛋白。
4.權利要求2所述的含有兩個以上催化基團的谷胱甘肽過氧化物酶GPXl突變體的制備方法，其特征在于:是在序列SEQ ID No:3的氨基端引入pColdl原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子Xa切割位點的氨基酸后所形成序列SEQ ID No:6。
【文檔編號】C12N15/70GK103898074SQ201410138374
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權日:2013年7月18日
【發(fā)明者】魏景艷, 郭笑, 宋健 申請人:吉林大學