一種降低煙葉中鉛含量的方法
【專利摘要】一種降低煙葉鉛含量的方法，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來(lái)降低煙草重金屬鉛殘留。所述方法的具體步驟如下:（1）用納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4·7H2O，在1升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅10mg；（2）將活化后的印度梨形孢（Piriformospora?indica）接種于步驟（1）所述的液體Kafer培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，接著澆灌于煙苗根部，灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部；（3）經(jīng)印度梨形孢定殖后煙苗移栽到大田，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使煙草正常生長(zhǎng)。本方法可以改善煙草生長(zhǎng)狀況，降低重金屬鉛從根系向煙草地上部分的遷移，降低煙葉重金屬鉛殘留，而且易于掌握、成本較低、簡(jiǎn)單實(shí)用，綠色環(huán)保，不會(huì)引起二次污染。
【專利說(shuō)明】一種降低煙葉中鉛含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物資源的利用和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種降低煙葉中鉛含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著化肥、農(nóng)藥的大量施用和工業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染日益嚴(yán)重。鉛是一種有毒的重金屬，也是主要的環(huán)境污染物之一。煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，我國(guó)煙草的種植面積、烤煙產(chǎn)量和生產(chǎn)量均居世界首位。近年來(lái)，常有煙草重金屬超標(biāo)等質(zhì)量安全問(wèn)題的報(bào)道，其中鎘、鉻、鉛對(duì)煙草生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響較為嚴(yán)重。土壤中的鉛能抑制煙草生長(zhǎng)，使煙草形態(tài)、生理生化及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；降低煙葉香氣物質(zhì)的含量，不利于香味的形成(李春明，馬新明，袁祖麗，等.鎘和鉛污染對(duì)烤煙根區(qū)土壤微生物及煙葉品質(zhì)的影響.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2005, 16(11):2182-2186 ;馬新明，李春明，袁祖麗，等.鉛污染對(duì)烤煙光合特性，產(chǎn)量及其品質(zhì)的影響.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，30 (3):472-478);鉛脅迫對(duì)煙草活性氧清除系統(tǒng)影響明顯，使系統(tǒng)中酶的活性和比例失調(diào)，降低了活性氧清除功能，造成細(xì)胞膜的功能紊亂(嚴(yán)重玲，洪業(yè)湯，付舜珍.Cd，Pb脅迫對(duì)煙草葉片中活性氧清除系統(tǒng)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào)，1997，17 (5):488-492 ;袁祖_，吳中紅.鎘脅迫對(duì)煙草根抗氧化能力和激素含量的影響.生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30 (15):4109-4118) ;土壤中的鉛含量升高，煙葉中葉綠素的含量隨之降低，凈光合速率下降(馬新明，李春明，田志強(qiáng)，等.鎘污染對(duì)烤煙光合特性，產(chǎn)量及其品質(zhì)的影響.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006, 26 (12):4039-4044.;高家合，王樹(shù)會(huì).鎘脅迫對(duì)烤煙生長(zhǎng)及生理特性的影響.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25 (5):1167-1170)。土壤中的鉛污染能降低種子活力，降低煙草中總氮、煙堿、可溶性總糖和還原糖的含量，嚴(yán)重影響了煙葉的品質(zhì)(史宏志，劉國(guó)順，常思敏，等.煙草重金屬研究現(xiàn)狀及農(nóng)業(yè)減害對(duì)策.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2011，17(3):89-94)。煙葉中重金屬鉛含量超標(biāo)嚴(yán)重影響了煙葉的品質(zhì)，因此，如何減少煙葉中鉛積累已經(jīng)成為煙草行業(yè)中的重要任務(wù)。
[0003]煙草中重金屬主要來(lái)自植煙土壤，同時(shí)肥料和農(nóng)藥的不規(guī)范也會(huì)導(dǎo)致煙草的重金屬含量過(guò)高。治理植煙土壤重金屬污染的主要措施有工程措施、物理化學(xué)修復(fù)、植物修復(fù)和根際微生物修復(fù)等方法，但上述方法對(duì)土壤重金屬污染修復(fù)的可操作性、有效性、廣譜性與安全性都有待完善與提高。目前，最常用降低煙草重金屬殘留的措施是施用各種改良劑，如石灰、鈣鎂磷肥、粘土礦物等無(wú)機(jī)改良劑，以及畜禽糞便等各種有機(jī)肥等(胡鐘勝，章鋼婭，王廣志，等.修復(fù)劑對(duì)煙草吸收污染土壤中砷的改良.土壤，2006，38 (2):200-205 ;周澤慶，招啟柏，朱衛(wèi)星，等.重金屬污 染植煙土壤改良劑原位修復(fù)研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(11):5100-5102.)。中國(guó)發(fā)明專利(CN1017M405A)發(fā)明了一種降低農(nóng)作物鎘、鉛污染的土壤改良劑，主要包含Ca(0H)2、Na2SiO7等無(wú)機(jī)組分以及稻草秸桿、山毛豆脫落物等有機(jī)組分。由于種種原因，這些改良劑的大面積施用往往受到限制，如石灰、粘土礦物對(duì)土壤性狀的影響較大，而鈣鎂磷肥、畜禽糞便中往往含有重金屬。因此，提出一種更經(jīng)濟(jì)實(shí)用的技術(shù)措施用于有效降低煙草重金屬殘留就顯得非常必要。[0004]中國(guó)專利申請(qǐng)201310104049.7公開(kāi)了里氏木霉聯(lián)合伴礦景天在鎘污染農(nóng)田土壤修復(fù)中的應(yīng)用，菌劑使用方法是在伴礦景天幼苗根際施加里氏木霉FSlO-C發(fā)酵液或微生物制劑；中國(guó)專利申請(qǐng)201210137704公開(kāi)了一種利用叢枝菌根修復(fù)重金屬污染土壤的方法，菌種使用方法是將叢枝菌根接種于稗草根部。上述兩項(xiàng)專利是用生物菌種來(lái)提高寄主吸收土壤中重金屬的能力，隨后移除寄主植物，完成重金屬污染土壤的修復(fù)。這類方法能夠降低土壤中的重金屬含量，但同時(shí)也降低了耕地的復(fù)種指數(shù)，且如何處理寄主植物也是生產(chǎn)實(shí)際中的難題。中國(guó)專利申請(qǐng)20121007120和201010525189均公開(kāi)了一種利用叢枝菌根真菌降低煙草重金屬殘留的方法，叢枝菌根真菌和煙草形成叢枝菌根共生體，促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，降低煙草重金屬殘留。然而叢枝菌根真菌不能在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不利于該菌的大面積使用。
[0005]印度梨形抱是一種根部?jī)?nèi)生真菌，具有廣泛的寄主范圍，能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提聞寄主對(duì)生物和非生物脅迫的抗性，并能在合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為該菌在農(nóng)業(yè)和園藝業(yè)的大面積應(yīng)用提供了可能(樓兵干，孫超，蔡大廣.印度梨形孢的多種功能及其應(yīng)用前景.植物保護(hù)學(xué)報(bào).2007, 34(6):653-656).因此，通過(guò)開(kāi)發(fā)利用印度梨形孢，在不影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的前提下降低煙葉中重金屬含量，尤其是鉛的含量，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種降低煙葉中鉛含量的方法，利用生物方法降低煙葉中重金屬鉛殘留。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]一種降低煙葉中鉛含量的方法，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來(lái)降低煙草重金屬鉛殘留。
[0009]進(jìn)一步的，所述降低煙葉鉛含量的方法具體包括以下步驟:
[0010](I)印度梨形孢培養(yǎng)基的配制:
[0011]用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7Η20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg,所述新配置的Kafer培養(yǎng)基中每升含有:2.0Og蛋白胨，1.0Og 酵母提取物，Ig 水解酪蛋白，0.6gNaN03，0.52gKCl，0.52gMgS04.7H20,1.52gKH2P04，IOmgZnO, IOmgH3BO3, 5mgMnS04.H2O, 1.6mgCoCl.5H20,1.6mgCuS04.5H20,1.1mg(NH4)6MO7O24,1.3mgFeS04,1.8mgEDTA, 0.1mg 硫胺素,0.04mg 甘氨酸，0.01mg 煙酸和 0.01mg 吡卩多醇；
[0012](2)印度梨形孢菌絲液灌根處理煙苗根部
[0013]將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，澆灌于煙苗根部，進(jìn)行灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部；
[0014](3)煙草苗的移栽和后期的管理
[0015]經(jīng)印度梨形孢定殖后的煙草苗進(jìn)行移栽，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使煙苗正常生長(zhǎng)。
[0016]進(jìn)一步的，所述步驟(2)中印度梨形孢的培養(yǎng)條件為25V -28°CU00rpm-120rpm搖床避光培養(yǎng)，5-7d后過(guò)濾,收集菌絲體,用蒸懼水配成濃度為2g/L-4g/L的菌絲液。
[0017]進(jìn)一步的，步驟(2)中印度梨形孢菌絲液處理煙草苗的方式為:將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部；或?qū)⒂《壤嫘捂呔z液加入煙草育苗器對(duì)煙草進(jìn)行育苗；或用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草種子進(jìn)行種子包衣，還可以用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草苗進(jìn)行沾根處理。
[0018]進(jìn)一步的，步驟(2)中用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部時(shí)每棵苗澆灌的印度梨形孢菌絲液量為50mL。
[0019]進(jìn)一步的，步驟(2)中煙苗為4葉期時(shí)用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部。
[0020]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
[0021]1、與現(xiàn)有技術(shù)中叢枝菌根真菌相比，本發(fā)明的印度梨形孢可在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，應(yīng)用方便；且能夠改善煙草的營(yíng)養(yǎng)狀況，具有生物肥料的功能，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，減少化肥的使用。
[0022]2、本發(fā)明采用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7H20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅10mg，在含納米材料ZnO (30nm) 0.01mg/L的Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢，其在煙草根部的定殖率顯著提高，由原來(lái)的80.0%提高到95.0%，能顯著地提高煙草生物量，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，降低重金屬?gòu)母迪驘煵莸厣喜糠值倪w移，從而降低煙草重金屬鉛殘留。試驗(yàn)證實(shí)使用本發(fā)明方法能顯著的降低成熟煙葉中鉛含量，使水培、盆栽和大田成熟煙葉中鉛的含量分別下降22.5-61.2%,28.0-38.6%、
11.8-33.0%。
[0023]3、本發(fā)明降低煙草中重金屬殘留的方法易于掌握、成本較低、簡(jiǎn)單實(shí)用，綠色環(huán)保，不會(huì)引起二次污染；它不僅適用于重金屬污染土壤中煙草的種植，對(duì)于非污染土壤也可使用。
`[0024]4、本發(fā)明中印度梨形孢菌絲液的使用方法多樣，可以將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部，還可以加入煙草育苗器對(duì)煙草進(jìn)行育苗，還可以用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草種子進(jìn)行種子包衣，還可以對(duì)煙草苗進(jìn)行沾根處理。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述:
[0026]一種降低煙葉中鉛含量的方法，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來(lái)降低煙草重金屬鉛殘留，本發(fā)明印度梨形孢由印度愛(ài)德大學(xué)AjitVarma教授惠贈(zèng)。
[0027]進(jìn)一步的，所述降低煙葉鉛含量的方法具體包括以下步驟:
[0028]( I)印度梨形孢培養(yǎng)基的配制:
[0029]用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7Η20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg,所述新配置的Kafer培養(yǎng)基中每升含有:2.0Og蛋白胨，1.0Og 酵母提取物，Ig 水解酪蛋白，0.6gNaN03，0.52gKCl，0.52gMgS04.7H20,1.52gKH2P04，IOmgZnO, IOmgH3BO3, 5mgMnS04.H2O, 1.6mgCoCl.5H20,1.6mgCuS04.5H20,1.1mg(NH4)6MO7O24,
1.3mgFeS04,1.8mgEDTA, 0.1mg 硫胺素,0.04mg 甘氨酸，0.01mg 煙酸和 0.01mg 吡卩多醇；
[0030](2)印度梨形孢菌絲液灌根處理煙苗根部
[0031]將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，澆灌于煙苗根部，進(jìn)行灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部；[0032](3)煙草苗的移栽和后期的管理
[0033]經(jīng)印度梨形孢定殖后的煙草苗進(jìn)行移栽，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使煙苗正常生長(zhǎng)。
[0034]進(jìn)一步的，所述步驟(2)中印度梨形孢的培養(yǎng)條件為25V -28°CU00rpm-120rpm搖床避光培養(yǎng)，5-7d后過(guò)濾,收集菌絲體,用蒸懼水配成濃度為2g/L-4g/L的菌絲液。
[0035]進(jìn)一步的，步驟(2)中印度梨形孢菌絲液處理煙草苗的方式為:將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部；或?qū)⒂《壤嫘捂呔z液加入煙草育苗器對(duì)煙草進(jìn)行育苗；或用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草種子進(jìn)行種子包衣，還可以用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草苗進(jìn)行沾根處理。
[0036]進(jìn)一步的，步驟(2)中用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部時(shí)每棵苗澆灌的印度梨形孢菌絲液量為50mL。
[0037]進(jìn)一步的，步驟(2)中煙苗為4葉期時(shí)用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部。
[0038]實(shí)施例1
[0039]利用印度梨形孢降低水培煙草重金屬鉛殘留，包括如下步驟:
[0040]菌種的活化:將保存在冰箱里的印度梨形孢菌種接種于Kafer培養(yǎng)基(KM)平板上，置于28°C恒溫箱里避光培養(yǎng)7天。用直徑為5mm的打孔器在活化好的印度梨形孢菌落邊緣打孔。
[0041 ] 菌液的培 養(yǎng):配制液體Kafer培養(yǎng)基和含納米材料ZnO (30nm) 0.0I g/L的液體Kafer培養(yǎng)基(即以粒徑為30nm的納米材料ZnO代替ZnS04)，用250mL三角錐形瓶分裝，每瓶裝150mL培養(yǎng)基，滅菌備用。在無(wú)菌條件下，將印度梨形孢菌絲塊加入裝有上述培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，每瓶6塊菌絲塊；置于恒溫?fù)u床120rpm、28°C避光振蕩培養(yǎng)5_7天。
[0042]菌絲體的收集:錐形瓶中菌絲置于250mL離心瓶中，8000rpm離心20min，去上清，收集菌絲體，置于4°C保存，備用；
[0043]煙苗的準(zhǔn)備:將煙草種子消毒后播撒在孔穴育苗盤(pán)中，待種子出苗后間苗，每孔留苗I棵，進(jìn)行正常水肥管理。
[0044]菌絲液澆灌到秧苗根部:用水將印度梨形孢菌絲配成含菌絲濃度為4g/L的菌絲液，將菌絲液澆灌于4葉期煙苗根部，設(shè)2個(gè)處理與I個(gè)對(duì)照。處理I為含納米材料ZnO (30nm)的液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲液，處理2為普通液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲液，對(duì)照澆灌相同體積的水。
[0045]菌絲液澆灌后15天，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色顯微鏡下觀察檢測(cè)印度梨形孢在煙苗根部的定殖情況，結(jié)果顯示處理I的定殖率為95%，處理2的定殖率為80%，結(jié)果表明含納米材料Zn0(30nm)的液體Kafer培養(yǎng)基培養(yǎng)的印度梨形孢菌絲在煙苗根部的定殖率明顯提高。
[0046](I)將煙苗移至塑料桶中進(jìn)行水培:挑選處理I和對(duì)照中長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗移栽至塑料桶(容積為4L)中，桶內(nèi)裝有鉛濃度為含5.0mg/L的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液4L，每桶培養(yǎng)煙苗4株，對(duì)照和處理各3桶。
[0047]測(cè)定煙葉中的鉛含量:水培后2周取樣(最大葉)，測(cè)定鉛元素含量，結(jié)果是處理組煙葉鉛含量比對(duì)照降低了 50.1% (表1)。
[0048]表1鉛處理2周接種與未接種印度梨形孢的水培煙葉中鉛含量
【權(quán)利要求】
1.一種降低煙葉中鉛含量的方法，其特征在于，利用在煙草根部寄生印度梨形孢來(lái)降低煙草重金屬鉛殘留。
2.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述降低煙葉鉛含量的方法具體包括以下步驟: (O印度梨形孢培養(yǎng)基的配制: 用粒徑為30nm的納米材料氧化鋅代替原Kafer培養(yǎng)基中的ZnSO4.7H20，在I升培養(yǎng)基中加入納米材料氧化鋅IOmg,所述新配置的Kafer培養(yǎng)基中每升含有:2.0Og蛋白胨，1.0Og 酵母提取物，Ig 水解酪蛋白，0.6gNaN03，0.52gKCl，0.52gMgS04.7H20，1.52gKH2P04，IOmgZnO, IOmgH3BO3, 5mgMnS04.H2O, 1.6mgCoCl.5H20,1.6mgCuS04.5H20,1.1mg(NH4)6MO7O24,1.3mgFeS04,1.8mgEDTA, 0.1mg 硫胺素,0.04mg 甘氨酸，0.01mg 煙酸和 0.01mg 吡卩多醇； (2)印度梨形孢菌絲液灌根處理煙苗根部 將活化后的印度梨形孢接種于步驟(1)所述的液體Kafer培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，然后收集菌絲體，制備印度梨形孢菌絲液，澆灌于煙苗根部，進(jìn)行灌根處理，使印度梨形孢定殖于煙苗根部； (3)煙草苗的移栽和后期的管理 經(jīng)印度梨形孢定殖后的煙草苗進(jìn)行移栽，之后進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，使煙苗正常生長(zhǎng)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中印度梨形孢的培養(yǎng)條件為25°C -28°C、100rpm-120rpm搖床避光培養(yǎng),5_7d后過(guò)濾,收集菌絲體，用蒸懼水配成濃度為2g/L-4g/L的菌絲液。
4.如權(quán)利 要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中印度梨形孢菌絲液處理煙草苗的方式為:將印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部；或?qū)⒂《壤嫘捂呔z液加入煙草育苗器對(duì)煙草進(jìn)行育苗；或用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草種子進(jìn)行種子包衣，或用印度梨形孢菌絲液對(duì)煙草苗進(jìn)行沾根處理。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部時(shí)每棵苗澆灌的印度梨形孢菌絲液量為50mL。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)中煙苗為4葉期時(shí)用印度梨形孢菌絲液澆灌于煙草苗根部。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103858685SQ201410093085
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】聶長(zhǎng)春, 劉劍, 劉孜, 王玉平, 毛寒冰, 萬(wàn)強(qiáng), 樓兵干, 惠非瓊, 劉曉曦, 高其康, 林福呈 申請(qǐng)人:貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司