一種梨果實(shí)果梗長度主效qtl位點(diǎn)的snp分子標(biāo)記方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種與梨果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法及其應(yīng)用，屬于植物分子育種領(lǐng)域。梨果梗長度主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記為Pyb07_095（LOD值=9.19），位于scaffold278.0的第502462個(gè)堿基處。利用Pyb07_095開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果實(shí)果梗長度的特異標(biāo)記，該特異引物可對(duì)果梗長度進(jìn)行良好分型，即檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異。本發(fā)明提供的梨果實(shí)果梗長度主效QTL分子標(biāo)記可用于梨果實(shí)果梗長度性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種，對(duì)于加快梨品種的遺傳改良進(jìn)程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。
【專利說明】一種梨果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)的SNP分子標(biāo)記方法及
其應(yīng)用
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，提供了梨果實(shí)果梗長度的主效QTL位點(diǎn)及其SNP標(biāo)記方法，可用于梨果實(shí)果梗長度性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
[0002]二、【背景技術(shù)】
我國是世界梨屬L.)植物最主要的起源地之一，遺傳多樣性豐富。梨的栽培種分布廣泛，除了海南省和臺(tái)灣省，都有栽培。梨果實(shí)的營養(yǎng)價(jià)值高，香甜多汁，而深受消費(fèi)者喜愛。果梗長度是影響梨果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)的重要因素之一，果柄是水分和碳水化合物運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)內(nèi)的必經(jīng)之路，其長短與粗細(xì)也直接影響到物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)。梨低序位果果柄粗且短，有利于營養(yǎng)和水分的運(yùn)輸，因此一般留果都選擇留低序位的果。碳水化合物的運(yùn)輸可能因果柄的限制而運(yùn)輸速率降低，導(dǎo)致高序位果果實(shí)發(fā)育狀況較差或滯后，采收時(shí)果實(shí)較小。果梗長短在梨果實(shí)發(fā)育中起到重要作用，同時(shí)也是梨采后分級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)，果梗的完好通常是水果新鮮度的表征，果梗缺損會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)部水分流失，加上其干枯和腐爛，會(huì)進(jìn)一步影響到果實(shí)的品質(zhì)。因此，果梗長度是梨新品種選育時(shí)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。
[0003]由于絕大多數(shù)梨品種是自交不親和的，梨的遺傳組成表現(xiàn)高度雜合性；同時(shí)，由于多年生果樹的農(nóng)藝性狀多數(shù)表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳特征，有關(guān)梨的重要性狀遺傳規(guī)律研究相對(duì)滯后，也難以開展目標(biāo)性狀的遺傳改良。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善，使得數(shù)量性狀基因座(QTL)定位變成了現(xiàn)實(shí)，也為提高目標(biāo)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準(zhǔn)確性及預(yù)見性奠定了基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記定位數(shù)量性狀QTL，其實(shí)質(zhì)就是分析分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀QTL之間的連鎖關(guān)系，即利用已知座位的分子標(biāo)記來定位未知座位的QTL，通過計(jì)算分子標(biāo)記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置?；讷@得的標(biāo)記基因型分離與數(shù)量性狀表型之間的關(guān)系，可直接確定控制數(shù)量性狀位點(diǎn)，開發(fā)可應(yīng)`用于分子標(biāo)記輔助選擇育種的技術(shù)，這已在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應(yīng)用。
[0004]目前有關(guān)梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對(duì)一些病害或生長性狀，對(duì)梨果梗長度性狀的QTL定位及檢測QTL位點(diǎn)上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小差異的SNP分子標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用研究尚未有報(bào)道。因此，開展梨果梗長度性狀的QTL定位，基于相應(yīng)序列信息開發(fā)SNP分子標(biāo)記，并建立雜交后代早期輔助選擇技術(shù)體系，對(duì)于提高梨果實(shí)品質(zhì)，提高育種效率，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得尤為重要。
[0005]三、
【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)要求
本發(fā)明的目的是定位梨果實(shí)果梗長度主效QTL，根據(jù)貢獻(xiàn)位點(diǎn)Pyb07_095序列信息開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果實(shí)果梗長度的SNP特異標(biāo)記，檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異。通過該分子標(biāo)記可以預(yù)測梨果梗長度的大小，為實(shí)現(xiàn)果梗長度性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術(shù)支持。
[0006]技術(shù)方案一種與梨果實(shí)果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)緊密連鎖的SNP標(biāo)記引物，其特征在于:
正向引物 LFP-F 5，- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3，
反向引物 LFP-R 5，- GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3，
該引物用來檢測梨基因組序列scaffold278.0 (登錄號(hào)為AJSUOOOOOOOO)的第502462個(gè)堿基處是否存在一個(gè)與梨果實(shí)果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095，同時(shí)檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異，該SNP位點(diǎn)位于第7連鎖群的33.5 cM處，其解釋了遺傳變異的25.68%，L0D值為9.19。
[0007]所述引物用于檢測梨果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法，其特征在于:HRM 反應(yīng)體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的
說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行；
10 μ L反應(yīng)體系:含有2 ng.μ 1梨基因組DNA模板，1 X Master Mix, 2.0 mmol
?I71 MgCl2,0.2 mmol.I71權(quán)利要求1所述的引物；
擴(kuò)增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C預(yù)變性10 min，然后95 V變性10s、60~55 V (每循環(huán)下降0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在一個(gè)與梨果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095 ；
PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95 ° C 1 min, 40 ° C 1 min, 65 ° C 1 s，再從65 ° C連續(xù)升溫至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集熒光1次，最后降溫至40 ° C;
最后，在 Light Cycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，分別以已知梨果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095上表達(dá)的果梗長度大的品種和表達(dá)的果梗長度小的品種為對(duì)照，檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異。如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對(duì)照的顏色相同、線型相似，則表示在梨梗長度主效QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)的果梗長度大小和對(duì)照相似。
[0008]所述的已知與梨果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095上多態(tài)性表達(dá)的果梗長度大的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)的果梗長度小的品種為‘八月紅’。
[0009]所述引物和方法可以用在梨分子育種中檢測與梨果實(shí)縱徑主效QTL位點(diǎn)是否存在，同時(shí)檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異。
[0010]有益效果
(1)本發(fā)明首次對(duì)決定‘八月紅’和‘碭山酥梨’果實(shí)果梗長度的數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行了QTL定位，定位的QTL位點(diǎn)對(duì)該數(shù)量性狀的貢獻(xiàn)率較高，位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為25.68%。這為實(shí)現(xiàn)分子輔助育種多基因控制性狀遺傳改良奠定了重要的基礎(chǔ)和必要的前提。
[0011](2)目前普遍認(rèn)為可應(yīng)用于分子輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的距離需(5cM,本發(fā)明中果梗長度主效QTL定位直接定位到SNP標(biāo)記上，且L0D值為9.19，連鎖性和可靠性高，這對(duì)于提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性和效率具有重要意義。
[0012](3)本發(fā)明根據(jù)定位的梨果梗長度性狀主效QTL位點(diǎn)連鎖標(biāo)記Pyb07_095開發(fā)檢測梨果梗長度大小的SNP標(biāo)記引物，用于預(yù)測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小差異，為梨果實(shí)果梗長度大小的預(yù)先選擇提供了可靠的分子標(biāo)記來源。
[0013](4)利用開發(fā)的SNP標(biāo)記引物，對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’ 29株雜交群體進(jìn)行QTL位點(diǎn)Pyb07_095上多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小差異基因型檢測，可將雜交群體分為兩組，與果實(shí)實(shí)際測量的果梗長度大和小相符。群體試驗(yàn)表明，開發(fā)的SNP標(biāo)記特異引物可以對(duì)后代果梗長度進(jìn)行良好分型(圖2)，因此，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，可實(shí)現(xiàn)對(duì)梨果實(shí)果梗長度性狀的預(yù)先選擇和輔助育種。
[0014]四、【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為梨果梗長度主效QTL區(qū)間及SNP標(biāo)記位點(diǎn)Pyb07_095在第7連鎖群上的位置。LG7代表的是‘八月紅’和‘碭山酥梨’合并遺傳連鎖圖譜的第7連鎖群。SNP標(biāo)記名稱起始為‘Pyb’的代表來自‘八月紅’的SNP標(biāo)記，起始名稱為‘Pyd’的代表來自‘碭山酥梨’的SNP標(biāo)記。
[0015]連鎖群左側(cè)的數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位為cM。連鎖群右側(cè)的實(shí)心長方形指示QTL作圖區(qū)間。右邊的曲線圖為QTL的L0D分布圖，灰色線為3.0閾值。果實(shí)果梗長度QTL位點(diǎn)對(duì)應(yīng)連鎖群上的Pyb07_095標(biāo)記，其位于7連鎖群33.5 cM處，L0D值為9.19。
[0016]圖2為依據(jù)Pyb07_095開發(fā)的HRM特異標(biāo)記引物，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’后代29個(gè)個(gè)體中檢測的溶解曲線，可良好分型。熔解曲線:線型1—綠色曲線，16株個(gè)體，果梗長度平均值4.28 cm;線型2—藍(lán)色曲線，13株個(gè)體，果梗長度平均值3.36cm。兩組差值
0.92 cm，差異達(dá)到極顯著水平，(P小于0.01)。
[0017]五、【具體實(shí)施方式】實(shí)施例1:
梨果實(shí)果梗長度主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的:a)利用‘八月紅’和‘碭山酥梨’(品種為公知公用，見文獻(xiàn):張瑞萍等，梨AFLP標(biāo)記遺傳圖譜構(gòu)建及果實(shí)相關(guān) 性狀的QTL定位，園藝學(xué)報(bào)，2011，38 (10):1991 - 1998)雜交獲得其102株？1后代單株。
[0018]b)利用RADseq方法高通量測序，對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進(jìn)行分析，并統(tǒng)計(jì)分析多態(tài)性位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，利用X 2測驗(yàn)分析各標(biāo)記分離是否符合3:1或1:1的孟德爾遺傳分離比例。
[0019]c)用Joinmap4.0分析軟件構(gòu)建‘八月紅’和‘碭山酥梨’的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)按Joinmap4.0分析軟件中適于CP群體構(gòu)圖的格式導(dǎo)入Joinmap4.0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點(diǎn)和顯著偏分離的位點(diǎn)，卡方檢測的P值為0.05，選擇Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖。
[0020]d)對(duì)‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其匕群體單株的果實(shí)果梗長度進(jìn)行測定，測定方法采用游標(biāo)卡尺的方法。
[0021]e)將果梗長度的表型值和標(biāo)記信息的相關(guān)文件導(dǎo)入MapQTL5.0軟件，選擇區(qū)間作圖法，以L0D值> 3.0為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)梨的果梗長度進(jìn)行QTL分析和定位。結(jié)果表明，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’的第7連鎖群上檢測到果梗長度的主效QTL位點(diǎn)(圖1)，對(duì)該性狀的貢獻(xiàn)率為25.68%，其對(duì)應(yīng)的SNP標(biāo)記Pyb07_095在連鎖群上的遺傳距離為33.5 cM, L0D值為
9.19。
[0022]f)利用SNP標(biāo)記位點(diǎn)Pyb07_095開發(fā)HRM特異引物。
[0023]通過梨全基因組數(shù)據(jù)庫(http://peargenome.njau.edu.cn/),搜索出第7連鎖群上SNP標(biāo)記Pyb07_095的DNA序列，選取的該位點(diǎn)前后200 bp的序列，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，開發(fā)設(shè)計(jì)SNP標(biāo)記引物。正向引物序列LFP-F為‘5- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3’；反向引物L(fēng)FP-R為5 GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小249bp，利用設(shè)計(jì)的SNP標(biāo)記引物在‘八月紅’和‘碭山酥梨’的基因組DNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物均擴(kuò)增正常，PCR產(chǎn)物符合預(yù)測大小。因此，該引物可作為梨果梗長度性狀的檢測標(biāo)記。
[0024]g)利用HRM技術(shù)對(duì)梨果實(shí)果梗長度進(jìn)行分型。
[0025]HRM 反應(yīng)體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行。
[0026]10 μ L反應(yīng)體系:含有2 ng.μ L-1梨基因組DNA模板，1 X Master Mix,.2.0 mmol.L—1 MgCl2,0.2 mmol.L—1權(quán)利要求1所述的引物；擴(kuò)增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95 °C預(yù)變性 10 min,然后 95 °C 變性 10 s、60 ~55 °C (每循環(huán)下降.0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
[0027]PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95 ° Cl min, 40 ° C I min, 65 ° CI S，再從65 ° C連續(xù)升溫至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集熒光I次，最后降溫至40
° C。
[0028]最后，在LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線
利用g)步驟中得到的SNP標(biāo)記引物對(duì)‘八月紅’ X ‘碭山酥梨’的29個(gè)雜交后代群體進(jìn)行HRM分析(圖2)。
[0029]線型I一綠色曲線， 16個(gè)體線型相似，平均值4.28 cm，為果梗長度大；
線型2—藍(lán)色曲線，13個(gè)體線型相似，平均值3.36 cm，為果梗長度小。
[0030]統(tǒng)計(jì)分析表明，29個(gè)個(gè)體分型為兩種基因型，分離比例為16:13。根據(jù)QTL位點(diǎn)Pyb07_095上多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小差異基因分型結(jié)果將29個(gè)個(gè)體的果梗長度表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行顯著性測驗(yàn)，測驗(yàn)結(jié)果顯示兩類基因型的個(gè)體果梗長度差值為0.92 cm，差異極顯著(P=0.0002)。因此，通過對(duì)果梗長度性狀的表型測定結(jié)果與HRM分型結(jié)果的比較分析，證明該特異SNP標(biāo)記可檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異，對(duì)梨果實(shí)果梗長度良好分型。
【權(quán)利要求】
1.一種與梨果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)緊密連鎖的SNP標(biāo)記引物，其特征在于:正向引物 LFP-F 5，- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3，反向引物 LFP-R 5，- GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3，該引物用來檢測登錄號(hào)為AJSUOOOOOOOO的梨基因組序列scaffold278.0的第502462個(gè)堿基處是否存在一個(gè)與梨果實(shí)果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095，同時(shí)檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異，該位點(diǎn)位于第7連鎖群的33.5 cM處，其解釋了遺傳變異的25.68%，對(duì)應(yīng)的SNP標(biāo)記為Pyb07_095，LOD值為9.19。
2.權(quán)利要求1所述引物用于檢測梨果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記方法，其特征在于:HRM 反應(yīng)體系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler? 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行；10 μ L反應(yīng)體系:含有2 ng.μ l-1梨基因組DNA模板、1 X Master Mix,2.0 mmol?I71 MgCl2、0.2 mmol.I71權(quán)利要求1所述的引物；擴(kuò)增程序采用降落式PCR:95 °C預(yù)變性10 min，然后95 V變性10 s、60~55 °C，每循環(huán)下降0.5 °C，退火15 s、72 V延伸12 s的程序進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在 一個(gè)與梨果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095 ；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95 ° C 1 min, 40 ° C 1 min, 65 ° C 1 s，再從65 ° C連續(xù)升溫至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集熒光1次，最后降溫至40 ° C;最后，在 LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5 version 自動(dòng)生成擴(kuò)增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果實(shí)果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095上表達(dá)的果梗長度大的品種和表達(dá)的果梗長度小的品種為對(duì)照，檢測QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)果梗長度大小的差異，如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對(duì)照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果實(shí)果梗長度主效QTL位點(diǎn)Pyb07_095上的多態(tài)性表達(dá)的果梗長度大小和對(duì)照相似。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述的已知具有與梨果實(shí)果梗長度相關(guān)的QTL位點(diǎn)Pyb07_095上表達(dá)的果梗長度大的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)的果梗長度小的品種為‘八月紅，。
4.權(quán)利要求1所述引物在梨分子育種中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或3所述方法在梨分子育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103740828SQ201410014478
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】吳俊 , 張紹鈴, 李雷廷, 齊開杰, 劉倫, 謝智華, 陳惠
申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)