生物技術(shù)2-羥基異丁酸生產(chǎn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，用于生產(chǎn)2-羥基異丁酸的方法，包括在水性介質(zhì)中使氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌與包含氫氣和二氧化碳的混合氣體混合物接觸，以及氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌在2-羥基異丁酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】生物技術(shù)2-羥基異丁酸生產(chǎn)
[0001] 本發(fā)明涉及表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì)菌（knallgas bacterium)或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，用于生產(chǎn)2-羥基異丁酸的方法，包括在水性介質(zhì)中使氫氧細(xì)菌 或產(chǎn)乙酸細(xì)菌與包含氫氣和二氧化碳的混合氣體混合物接觸，以及氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌 在2-羥基異丁酸生產(chǎn)中的用途。
[0002] 日漸增長(zhǎng)的全球人口和全世界提高的生活標(biāo)準(zhǔn)不可避免地加強(qiáng)了人們一方面對(duì) 于商品和服務(wù)的需求和另一方面對(duì)可持續(xù)發(fā)展以及對(duì)自然和地球資源的慎重處置的需要 之間的沖突。未來(lái)不僅僅是化石碳源會(huì)變得有限，而且目前被處置和勘探的地點(diǎn)的可及性 也會(huì)越來(lái)越受到阻礙。已知的事故極大地證明了這種危險(xiǎn)，例如最近在墨西哥灣的石油災(zāi) 難。白色生物科技提供了一種優(yōu)雅的方式來(lái)提供替代物，這不僅僅是因?yàn)槲⑸锘蚣?xì)胞組 分的應(yīng)用，還因?yàn)閺V譜的新一代可再生基質(zhì)的應(yīng)用。
[0003] 很久以來(lái)，化學(xué)工業(yè)已在生物技術(shù)工藝中批量規(guī)模生產(chǎn)，例如醇類和有機(jī)酸，主要 是用作化學(xué)品，尤其是作為能源載體。其中生物乙醇是構(gòu)成現(xiàn)代機(jī)動(dòng)車輛燃料的近期要素， 并且生物丁醇也在考慮范圍內(nèi)?；谂恳?guī)模能源載體生產(chǎn)的知識(shí)，最近意圖設(shè)想將平臺(tái) 化學(xué)品延伸至更廣泛的應(yīng)用。特別嘗試合成化學(xué)品如1，3-丙二醇，琥珀酸鹽，葡萄糖酸或 檸檬酸。同樣地，2-羥基異丁酸（2-HIB)也很適合該方案，因?yàn)樗l(fā)展成為平臺(tái)化學(xué)品。 特別是，由于2-HIB可被用作甲基丙烯酸(一種重要產(chǎn)品如Plexiglas?的合成所需要的單 體化合物）的前體，并且可被用作涂層材料，涂料和粘合劑的重要組分。
[0004] 通常，傳統(tǒng)的生物技術(shù)工藝，例如用于生物乙醇生產(chǎn)的工藝，是基于所謂的第一代 的碳源，即直接來(lái)源于植物的碳水化合物如糖或淀粉。但事實(shí)證明，這種資源是有限的，它 們似乎更適合于生產(chǎn)食品而不是化工產(chǎn)品。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了 2-HIB生產(chǎn)的生物技術(shù)路線。例如，PCT/EP2009/055089教導(dǎo)了 已被基因修飾，以致于與其野生型相比能夠生產(chǎn)更多2-羥基異丁酸或更多含有2-羥基異 丁酸單體單元的聚羥基脂肪酸酯的細(xì)胞，其特征在于2-羥基異丁酸或含有2-羥基異丁 酸單體單元的聚羥基脂肪酸酯的生產(chǎn)以乙酰乙?；?輔酶A作為中間產(chǎn)物并以3-羥基 丁酰-輔酶A作為前體。但是，2-HIB的生產(chǎn)工藝考慮使用含碳水化合物的碳水化合物 (carbohydrate-containing carbohydrates)或其衍生物，例如葡萄糖酸鈉，從環(huán)境的角度 來(lái)說(shuō)這應(yīng)當(dāng)被避免。而且，在所述碳水化合物的生產(chǎn)中所消耗的二氧化碳的很大比例并不 被轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)物2-HIB，而是在通向2-HIB的過(guò)程中的各種代謝途徑中喪失了。
[0006] 因此，本發(fā)明所基于的問(wèn)題是發(fā)明一種生產(chǎn)2-HIB的工藝，其能在缺少高能有機(jī) 化合物的條件下進(jìn)行。而且，本發(fā)明所基于的問(wèn)題是發(fā)明一種2-HIB生產(chǎn)的生物技術(shù)路線。 而且，本發(fā)明所基于的問(wèn)題是發(fā)明一種用于2-HIB生產(chǎn)的生物技術(shù)方法，其與現(xiàn)有技術(shù)工 藝相比的優(yōu)越之處在于所獲得的2-HIB中有更多的碳原子來(lái)源于二氧化碳分子，S卩，來(lái)自 于二氧化碳，而不是來(lái)自于其它任何有機(jī)分子(例如醇類或碳水化合物）的碳原子的比例更 商。
[0007] 本發(fā)明所基于的問(wèn)題由所附權(quán)利要求的主題解決。
[0008] 在第一方面，本發(fā)明所基于的問(wèn)題由表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì) 菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌解決。
[0009] 在第一方面的第一實(shí)施方案中，細(xì)菌被基因修飾以使得它與各自的野生型菌株相 t匕，具有降低的合成聚羥基丁酸酯的能力。
[0010] 在第一方面的第二實(shí)施方案中，其也是第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)菌具有 聚羥基丁酸酯合成酶基因敲除。
[0011] 在第一方面的第三實(shí)施方案中，其也是第一至第二實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì) 菌不能合成聚羥基丁酸酯。
[0012] 在第一方面的第四實(shí)施方案中，其也是第一至第三實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方 案，細(xì)菌是選自包含甲燒細(xì)菌（ifeiAafloAacteritt?)、醋酸桿菌、 脫硫弧菌（ZfesWfbFiArio)、脫硫單胞菌、副球菌（Zkracoccw1S)、 無(wú)色桿菌 ier)、產(chǎn)喊桿菌 、假單胞菌 O01SeworOfflma1S)、 諾卡氏菌OVocart/ia)和貪銅菌（Copriariofe)的組的氫氧細(xì)菌，且優(yōu)選是貪銅菌 (Copriariofe)菌株，最優(yōu)選是鉤蟲貪銅菌（Copriariofe flecaior) H16,或者是選自 包含梭菌irit/ia?)、穆爾氏菌（IfooreBa)和厭氧醋菌OceioaflaeroAitt?)、醋 酸桿菌 、古球菌 、丁 酸桿菌（及/ijriAacteria?)、 Carboxydibrachium、CarboxydocelIa、一 氧化碳嗜熱菌（CkrAiorjOrO iAe/SMAs)、朽1 樣酸桿 菌（CYirc^acier)、脫硫腸狀菌（ZfesW/bioffiacWtt?)、真細(xì)菌甲燒八疊球 菌（IfeiAaflo 1Sarcifla)、甲燒嗜熱桿菌（IfeiAafloiAerffioAacier)、產(chǎn)醋桿菌（AroAacier)、 消化鏈球菌 Oc^iosire/?iOCOCC^AS)、紅假單胞菌 0?Ο￡/〇/75·<9?￡/6_/7<35·)、紅螺菌 {JihodospirilIum)、反反兔魯（Mubrivivax)、Thermincola、散豫魯 iThermococcus)、散石 妖麗（Jhermolithobacter)、蹲紙厭氧妖麗{Thermoanaerobacter、私 Thermosyntrophicum 的組的產(chǎn)乙酸細(xì)菌。
[0013] 在第一方面的第5實(shí)施方案中，其也是第一至第四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì) 菌表達(dá)包含SEQ ID NO 1的核酸或其變體或由所述核酸編碼的多肽或所述多肽的變體，并 且表達(dá)包含SEQ ID NO 2的核酸或其變體或由后一種核酸編碼的多肽或后一種多肽的變 體。
[0014] 在第一方面的第6實(shí)施方案中，其也是第一至第5實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)菌 除了表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶外，還表達(dá)MeaB蛋白，由SEQ ID NO 3編碼的多肽 或其變體。
[0015] 在第一方面的第7實(shí)施方案中，其也是第一至第6實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)菌 表達(dá)，細(xì)菌能夠合成3-羥基丁酰-輔酶A。
[0016] 在第一方面的第8實(shí)施方案中，其也是第一至第7實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)菌 表達(dá)，細(xì)菌表達(dá)β -酮硫酶和乙酰乙?；?CoA還原酶。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明所基于的問(wèn)題由2-羥基異丁酸的生產(chǎn)方法解決，該方法包括 a)在水性介質(zhì)中使根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌與包含氫氣和 二氧化碳的氣體混合物接觸。
[0018] 在第二方面的第一實(shí)施方案中，氣體混合物中氫氣的分壓為0. 1-100巴，更優(yōu)選 0. 2-10巴，最優(yōu)選0. 5-4巴，而二氧化碳分壓為0. 03-100巴，更優(yōu)選0, 05-1巴，最優(yōu)選 0. 05-0. 3 巴。
[0019] 在第二方面的第二實(shí)施方案中，其也是第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)菌耐受 氧的存在，且水溶液是有氧的。
[0020] 在第二方面的第三實(shí)施方案中，其也是第一至第二實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，細(xì) 菌耐受氧的存在，且氣體混合物除了氫氣和二氧化碳之外，還包含氧氣，并且氣體混合物中 氧氣的分壓優(yōu)選是〇. 03-10巴，更優(yōu)選0. 04-1巴，最優(yōu)選0. 04-0. 5巴。
[0021] 在第二方面的第四實(shí)施方案中，其也是第一至第三實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，水 性介質(zhì)不包含碳水化合物，或優(yōu)選不包含除二氧化碳之外的任何碳源。
[0022] 在第二方面的第5實(shí)施方案中，其也是第一至第四實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，步 驟a)在缺乏除碳以外的其它生長(zhǎng)限制營(yíng)養(yǎng)素的條件下進(jìn)行。
[0023] 在第二方面的第6實(shí)施方案中，其也是第一至第5實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案，步驟 a)在20-37 °C，更優(yōu)選25-35 °C，最優(yōu)選在28-32 °C進(jìn)行。
[0024] 在第三方面，本發(fā)明所基于的問(wèn)題由根據(jù)本發(fā)明的任意方面或?qū)嵤┓桨傅臍溲跫?xì) 菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌在生產(chǎn)2-羥基異丁酸中的用途解決。
[0025] 本發(fā)明是基于這樣的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧 細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌可被用于生產(chǎn)2-HIB。
[0026] 而且，本發(fā)明是基于這樣的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：可以通過(guò)這種方式增加這種工藝的 產(chǎn)量：對(duì)于2-HIB的生產(chǎn)，使用表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì) 菌，其與各自的野生型菌株相比，具有降低的合成聚羥基丁酸酯的能力。
[0027] 而且，本發(fā)明基于這樣的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：可以通過(guò)這種方式增加這種工藝的產(chǎn) 量：對(duì)于2-HIB的生產(chǎn)，使用表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌， 并經(jīng)受除了缺乏碳源之外的生長(zhǎng)限制條件。
[0028] 本發(fā)明集中于表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌的用 途。這些細(xì)菌通常具有代謝包含氫氣和二氧化碳的混合物以生成有機(jī)化合物的能力。
[0029] 本發(fā)明考慮野生型和基因修飾的產(chǎn)乙酸細(xì)菌或氫氧細(xì)菌的用途。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，本文使用的術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)乙酸細(xì)菌"指能夠利用Wood-Ljungdahl途徑，即將一氧化碳， 二氧化碳和氫氣轉(zhuǎn)化為乙酸鹽的途徑的細(xì)菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Wood-Ljungdahl途 徑中涉及的至少一種酶的活性相對(duì)于野生型細(xì)胞來(lái)說(shuō)被增強(qiáng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本 文使用的，術(shù)語(yǔ)"Wood-Ljungdahl途徑中涉及的酶"包含與所述途徑的一種底物，優(yōu)選一 氧化碳，二氧化碳或氫氣結(jié)合，或與隨著底物被轉(zhuǎn)化為乙酸鹽或其衍生物的過(guò)程，在由這 些底物中的任一種開始的途徑中形成的任何中間產(chǎn)物結(jié)合的，或者接受其為底物的任何 酶。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"Wood-Ljungdahl途徑中涉及的 酶"指來(lái)自包含CO脫氫酶和乙酰-CoA合成酶的組的酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)乙酸細(xì) 菌選自包含梭菌（C/osirii/itt?)、穆爾氏菌（IfooreBa)和厭氧醋菌、 醋酸桿菌 、古球菌 、丁 酸桿菌（及/ijriAacteria?)、 Carboxydibrachium、CarboxydocelIa、一 氧化碳嗜熱菌（CkrAiorjOrO iAe/SMAs)、朽1 樣 酸桿菌、脫硫腸狀菌、真細(xì)菌、 甲燒八疊球菌CifeiAaflo1Sarcifla)、甲燒嗜熱桿菌（IfeiAafloiAerffioAacier)、產(chǎn)醋桿菌 (AroAacier)、消化鏈球菌、紅假單胞菌 0?Ο￡/〇/75·<9?￡/6_9/7<35·)、 紅螺菌 紅長(zhǎng)命菌 Oft/AriKiFar)、?6?r?i/7co/a、熱球菌 {Thermococcus')、散石:舊（Jhermolithobacter)、蹲散厭梟紙舊（Jhermoanaerobacter) 和?<9r避的組。示例性的產(chǎn)乙酸細(xì)菌包括，但不限于潮濕厭氧醋菌 /?<9tera)、伍氏醋酸桿菌 r<9(9i/ii)、閃爍古球菌 iArchaeoglobus fulgidus)、食 ψ^~Χ豫妖儀 iButyribacterium methylotrophicuni)、食 ψ 基了驗(yàn)妖儀、Butyribacterium methyl trophicuni)，Carboxydibrachium pad ficus ^ Carboxydocella sporoproducens^ Carboxydocella thermoautotrophica、H -策也 碳嗜熱菌避as* AjWra沢/?<9/b_r艦/76* )、梓樣酸桿菌 179 (CY tro/?況 ter 6/7. 7_/6〇、醋酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、 自產(chǎn)乙醇梭菌，{Clostridium autoethanogenuni)、食一氧么敬敬儀{Clostridium ca_r/?(9uWirara/?6〇、楊氏梭菌（C/iOsirii/i? 、食一氧化碳脫硫腸狀 M {Desulfotomaculum carboxydivorans) Λ 庫(kù)氏脫硫腸狀菌 C^esi/J/bto應(yīng)ei/J· kuznetsovif)、紙 m傲漁、歇{Desulfotomacuhim thermobenzoicum subsp·)、 、粘液真桿菌的/如c 7i避λ^--)、食乙酸甲焼八疊球菌62? (Methanosarcina acetivorans CM)、E 氏 ψ 像J\疊豫舊（Methanosarcina barkerf)、 熱自養(yǎng)甲焼嗜熱桿菌CifeiAa/? 況ter iAa/舊扮"? <9 ir 、穆爾氏菌 CM9〇r<977a 、熱醋穆爾氏菌（M9〇r<977a 、熱自養(yǎng)穆爾氏菌 Cifoordh 、普氏產(chǎn)醋桿菌（flro如cter 、產(chǎn)生消化鏈球菌 iPeptostreptococcus productus) {Peptostreptococcus productus) ^ 沿\每怒麗P4 {Rhodopseudomonas palustris P4)、類忽^￡爆黨{Rhodospirillum rubrum) λ 1? ^ ^ ^ {Rubrivivax gelatinosus) Λ Thermincola carboxydiphiIaΛ 、熱球菌 、食一氧化碳熱石桿菌 (Jhermolithobacter carboxydivorans)私令久板鴻紙沃氧妖儀 ijhermoanaerobacter kivui). 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)乙酸細(xì)菌是通常被基因修飾以產(chǎn)乙酸的細(xì)菌，而相應(yīng) 的野生型菌株不產(chǎn)乙酸。在這種情況下，細(xì)菌可以是任何可進(jìn)行這種修飾的生物體，例如大 腸桿菌。
[0030] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"氫氧細(xì)菌"指任何能夠使用氧作為 最終電子受體來(lái)氧化氫，并能夠在好氧條件下固定二氧化碳的細(xì)菌。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，氫氧細(xì)菌選自包含甲焼細(xì)菌醋酸桿菌 脫硫弧菌（Zfes^//bKi/?ri(9)、脫硫單胞菌（Zfe6*〃7/bffi(9/?a6〇、副球菌（^_raec^〃6〇、無(wú)色 桿菌C^Arc?(9如eter)、產(chǎn)喊桿菌、假單胞菌、諾卡氏菌 和貪銅菌（i7w/7riaKii*6〇的組，并且優(yōu)選是貪銅菌（i7w/7riaKii*6〇菌株，更優(yōu) 選是鉤蟲貪銅菌H16。示例性的氫氧細(xì)菌包括，但不限于敏捷食 酸菌 raraz Z^i7i6〇、食酸菌 raraz 6/7.)、真養(yǎng)產(chǎn)喊桿菌 沢/?<96* )、慢生型大豆根瘤菌（Ara辦 japonicuni)、燒後'瘤舊{Bradyrhizobium sp.)、鉤蟲貪銅菌5?7 (Cupriavidus /?6^ior ZAW 5?7)、螺桿菌 〇76*7i(9^cter 6/λ )、產(chǎn)氧桿菌(你 --^6*/?(9如cter 6/λ )、嗜熱 產(chǎn)董奸舊 Qfydrogenobacter thermophiIus)、真氧董單觀舊 Qfydrogencmonas eutropha)、 泛氧氫單胞菌 氫單胞菌 6/7.)、敏捷 氫單胞菌 )、氫嗤胞菌 O^Fi/re^/76/7.)、海洋氫弧菌 Qiydrogenovibrio marinus) (MH-1W 株）、m舊 Qfydrogenovibrio sp、、氧集i'傲生A% {Oxyhydrogen microorganism) {Pseudomonas hydrogenothermophila) ^ 食氫假單胞菌AjWro沢/?(9rara)、假單胞菌6/7.)、真養(yǎng) 青枯菌 Ofehi、青枯菌6/7.)、大豆根瘤菌 、根瘤菌 6/7.)、混池紅球菌 (9/7況"6〇、紅球菌 6/7.)、嗤酸紅假單胞菌（/^(9^/(9/76^(3^(9/7^5* adW(9/7Ai7a)、生芽紅假單胞菌 {Rhodopseudomonas blasticd)、賽·怒{Rhodopseudomonas capsulatd)、沿釋 假單胞菌（7^(9^/(9/76^饑/6_9/?狀 7^(9^/(9/76^饑/6_9/?狀 iaroitfes*、綠硫紅假單胞 M {Rhodopseudomonas sulfoviridis) λ {Rhodopseudomonas viridis) Λ 紅假單胞菌5/7.)、深紅紅螺菌ττ/Δ/γ/ffi)、紅螺菌 {Rhodospirillum sp. {Thiocapsa roseopersicina) {Thiocapsus 6/7.)、爭(zhēng)論貪嗤菌（KarioraravT /7arai/(ara6〇、貪嗤菌（KarioraravT 6/7.)、黃色桿菌 {Xanthobacter sp.)、海洋嗜熱解氫桿菌沢/?<9iAa/皿as* 、真養(yǎng)青枯菌 (9"tn9/7Aa)、鉤蟲貪銅菌、真養(yǎng)產(chǎn)喊桿菌 <9"tro/7to6〇、爭(zhēng)論產(chǎn)喊桿菌（^7ca7i沢/7(96* /7arat/(〇?s〇、脫氮副球菌 、敏捷假單胞菌（/?^饑Z^i7i6〇、黃假單胞菌（/?^饑/c_9/?a6* /!Zara)、帕氏假單胞菌/7a77aro/?ii)、嗤糖假單胞菌 saccharophila)，取趙爲(wèi)黨{Rhodococcus sp·)(不透明諾卡氏菌（Nocardia opaca))、類 黃假單胞菌0--〃心?。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，氫氧細(xì)菌被基因修 飾成為氫氧細(xì)菌，而相應(yīng)的野生型菌株不是氫氧細(xì)菌。在這種情況下，細(xì)菌可以是任何可進(jìn) 行這種修飾的生物體，例如大腸桿菌。
[0031] 可用于解決本發(fā)明所基于問(wèn)題的許多細(xì)菌能夠合成聚羥基丁酸酯，一種被用于儲(chǔ) 存細(xì)胞攝取的碳的化合物。這種細(xì)菌利用一種或多種聚羥基丁酸酯合成酶。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"聚羥基丁酸酯合成酶"指能夠通過(guò)催化鏈長(zhǎng)度為3-14個(gè)碳原 子的中鏈?；?CoA，優(yōu)選羥基丁酸CoA的聚合來(lái)合成聚羥基脂肪酸酯的酶。
[0032] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所發(fā)明的細(xì)菌被基因修飾以使得它與各自的野生型菌株相 t匕，具有降低的合成聚羥基丁酸酯的能力，或者合成聚羥基丁酸酯的能力降低以使得細(xì)胞 不再能夠合成可檢測(cè)量的聚羥基丁酸酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼聚羥基丁酸酯合成酶 的至少一個(gè)基因，優(yōu)選所有基因被敲除，例如通過(guò)向閱讀框中引入終止子以達(dá)到表達(dá)不完 整的無(wú)活性的蛋白的效果。
[0033] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶"指能 夠催化形成2-羥基異丁酰-輔酶A的酶，優(yōu)選通過(guò)將3-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)化為2-羥基異 丁酰-輔酶A來(lái)實(shí)現(xiàn)：
【權(quán)利要求】
1. 表達(dá)2-羥基異丁酰-輔酶A變位酶的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌被基因修飾以使得其與各 自的野生型菌株相比，具有降低的合成聚羥基丁酸酯的能力。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌具有聚羥基丁酸酯合成酶 基因敲除。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌不能合成聚羥基 丁酸酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是選自包含甲 燒細(xì)菌（IfetAafloAac)、醋酸桿菌 )、脫硫弧菌FiArio)、 脫硫單胞菌、副球菌、無(wú)色桿菌 、產(chǎn) 喊桿菌、假單胞菌、諾卡氏菌（Abcart/ia)和貪銅菌 (Copriarit/ys)的組的氫氧細(xì)菌，且優(yōu)選是貪銅菌菌株，最優(yōu)選是鉤蟲貪銅菌 flecator) H16,或者是選自包含梭菌（C/iostrit/itt?)、穆爾氏菌（ifoore^a)和厭氧醋 菌 、醋酸桿菌 、古球菌 、丁 後第：魯 Q^utyribacterium')、Carboxydibrachium、Carboxydocella、一 氧化碳嗜熱菌 (CkrAiorj^/o 從<9/?皿5〇、朽1 樣酸桿菌（CYtroAacter)、脫硫腸狀菌、 真細(xì)菌、甲燒八疊球菌（Ifez^aflosarcifla)、甲燒嗜熱桿菌 (M9Z^a/7(9 從6?r?o辦aeter)、產(chǎn)醋桿菌（ftro辦aeter)、消化鏈球菌（/fe/^ostre/Voecieetts)、 紅假單胞菌 0?、紅螺菌、紅長(zhǎng)命菌 Oft/Ari Fi Far)、 ?<9r?i/7co/a、熱球菌（Serffiococc^s)、熱石桿菌、嗜熱厭氧桿菌 (?6?r?oa/7a6?ro辦acter)和?的組的產(chǎn)乙酸細(xì)菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表達(dá)包含SEQ ID NO 1的核酸或其變體或由所述核酸編碼的多肽或所述多肽的變體，并且表達(dá)包含SEQ ID NO 2的核酸或其變體或由后一種核酸編碼的多肽或后一種多肽的變體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表達(dá)，除了 2-羥 基異丁酰-輔酶A變位酶外，還有MeaB蛋白，優(yōu)選由SEQ ID NO 3編碼的多肽或其變體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌能夠合成3-羥基 丁酰-輔酶A。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表達(dá)￠-酮硫酶 和乙酰乙?；?CoA還原酶。
10. 生產(chǎn)2-羥基異丁酸的方法，包括 c)在水性介質(zhì)中使根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌與包含氫氣和 二氧化碳的氣體混合物接觸。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述氣體混合物中氫氣的分壓為〇. 1-100巴，更優(yōu) 選0. 2-10巴，最優(yōu)選0. 5-4巴，而二氧化碳分壓為0. 03-100巴，更優(yōu)選0. 05-1巴，最優(yōu)選 0. 05-0. 3 巴。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10-11任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌耐受氧的存在，且水溶液是有氧 的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌耐受氧的存在，且氣體混合物除 了氫氣和二氧化碳之外，還包含氧氣，并且氣體混合物中氧氣的分壓優(yōu)選是0. 03-10巴，更 優(yōu)選0. 04-1巴，最優(yōu)選0. 04-0. 5巴。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項(xiàng)的方法，其中所述水性介質(zhì)不包含碳水化合物，或優(yōu)選 不包含除二氧化碳之外的任何碳源。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10-14任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)在缺乏除碳以外的生長(zhǎng)限制營(yíng)養(yǎng) 素的條件下進(jìn)行。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10-15任一項(xiàng)的方法，其中步驟a)在20-37°C，更優(yōu)選25-35°C，最優(yōu) 選在28-32 °C進(jìn)行。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的氫氧細(xì)菌或產(chǎn)乙酸細(xì)菌在生產(chǎn)2-羥基異丁酸中的用 途。
【文檔編號(hào)】C12N9/90GK104364373SQ201380031378
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】T.哈斯, Y.席曼, D.普里拜爾斯基, T.羅維德爾, R.H.米勒, H.哈姆斯 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)工業(yè)集團(tuán)股份有限公司