生物防治的制作方法
【專利摘要】提供的是一種適于在節(jié)肢動物雄性生殖系中條件表達效應物基因的節(jié)肢動物雄性生殖系基因表達系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括第一表達單元，所述第一表達單元包含效應物基因和與其可操作連接的用于其的啟動子；和第二表達單元。所述第二單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列和可操作連接于其的上游調(diào)控元件，所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達單元中的啟動子上以驅(qū)動所述效應物基因的表達。所述上游調(diào)控元件包括轉(zhuǎn)錄因子的啟動子；和臨近轉(zhuǎn)錄因子編碼序列起始位點的5’UTR。上游調(diào)控元件驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子足量表達，從而轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)而在減數(shù)分裂前驅(qū)動效應物基因的轉(zhuǎn)錄。還提供的是所述系統(tǒng)例如在生物防治和質(zhì)量控制方法中的用途。
【專利說明】生物防治 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠在節(jié)肢動物，特別是昆蟲中提供不育的，但競爭性的精子的 表達系統(tǒng)，以及其在所述節(jié)肢動物的生物防治（群體控制），質(zhì)量控制和性選擇的方法中的 用途。
[0002] 引言
[0003] 經(jīng)濟重要的，對于世界的某些部分起初是本地的蟲害，現(xiàn)在通過國際貿(mào)易和人的 活動廣泛分布。此種害蟲發(fā)展為巨大的群體并且在世界范圍內(nèi)對水果和蔬菜產(chǎn)生破壞性侵 染?？赡艿目刂品椒ㄊ菑V泛的，包括誘餌噴灑，直接噴灑殺蟲劑，生物防治，病蟲害綜合治理 (IPM)方法和不育昆蟲技術（sterileinsecttechnique，SIT)(Malacrida等人，2007)。然 而，目前的防治方法，絕大多數(shù)依賴于化學殺蟲劑的使用。直接或誘餌噴灑二者都具有由于 蜜蜂的減少導致授粉減少的能力，和使動物或人中毒的能力。另一方面，SIT是環(huán)境友好， 物種特異的害蟲防治方法。其依賴于大量不育雄性的大量飼養(yǎng)、絕育和釋放，所述不育雄性 與野生的雌性交配，引起后代中野生群體的減少（Dyck等人，2005 ;Knipling，1955)。如果 將足夠的不育雄性釋放足量時間，目標群體將瓦解。
[0004] SIT依賴于輻射以絕育目標害蟲物種，但這對釋放的昆蟲具有負面影響（Alphey， 2002 ;Alphey，2007 ;Alphey等人，2007)。輻射影響昆蟲的所有細胞，不僅是配子，并且因此 對釋放的昆蟲一定程度的損害不可避免，可能對其性能具有負面影響（例如壽命或交配競 爭性）。輻射-絕育需要在發(fā)育晚期進行，限制了對釋放的選擇。而且，輻射儀器相對大和 昂貴（獲得或運行），并趨向于產(chǎn)生對于一些方案可能不利的集中程度。最后，由于有關這 些儀器中放射性同位素的大量存在的安全性考慮，已經(jīng)是SIT計劃至今的主要支柱的基于 同位素的輻射器變得越發(fā)不受歡迎。
[0005] 特別是對于蚊子，過去已經(jīng)嘗試了輻射的備選方案。這些包括化學絕育和通過 使用細胞質(zhì)不相容性（cytoplasmicincompatibility(CI，由沃爾巴克體（Wolbachia)誘 導））絕育，但這些各個具有其自身的缺點?；瘜W不育劑傾向于為毒性或誘變化合物，導致 對工人和環(huán)境安全的問題?；谖譅柊涂梭w（Wolbachia)的系統(tǒng)依賴于自然環(huán)境中缺乏任 何相當?shù)奈譅柊涂梭w（Wolbachia)感染的雌性（其可能不是這樣的），并且還需要不釋放此 種雌性；此種嚴格的雌雄分離可能難以實現(xiàn)。可以通過使用重組DNA方法克服這和其它與 目前的SIT相關的其它問題（Morrison等人，2010 ;Franz&Robinson，2011)。
[0006] 已經(jīng)建議了輻射-絕育的轉(zhuǎn)基因備選方案，稱為攜帶顯性致死因子昆蟲的釋放 (RIDL:(Alphey，2002 ;Alphey，2007;Alphey和Andeasen，2002;Alphey等人，2010;Alphey等人，2007 ;Alphey和Thomas, 1999 ;Thomas等人，2000)。在該系統(tǒng)中，改造昆蟲以攜帶顯 性可抑制致死基因或遺傳系統(tǒng)。將這些釋放到野外；野生昆蟲和經(jīng)遺傳獲得RIDL基因或構 建體拷貝的RIDL昆蟲之間交配的后代將傾向于死亡?？梢栽O計RIDL系統(tǒng)以殺滅經(jīng)遺傳獲 得它的所有后代或僅一個性別。還可以設計以殺滅發(fā)育的特定階段的受影響的昆蟲；在一 些物種，例如一些蚊子（Phuc等人，2007)中，這可以具有顯著的優(yōu)勢。已經(jīng)在很多害蟲物 種中構建了RIDL系統(tǒng)（例如Fu等人，2007 ;Gong等人，2005 ;Phuc等人，2007)?？梢栽赪0 01/39599中找到RIDL系統(tǒng)方面的進一步信息。
[0007] 我們的雌性致死RIDL技術（雌性-特異RIDL，fsRIDL)在分離性別方面高度有 效，甚至有時差不多1〇〇%有效，并且成功地在實驗室、溫室和半現(xiàn)場（semi-field)實驗中 測試。RIDL可由在有或無輻射的情況下使用以產(chǎn)生有效產(chǎn)物。
[0008] 盡管事實上該技術對于許多害蟲上的SIT實施提供相當大的優(yōu)勢，比如果蠅； 地中海果蠅（Ceratitiscapitata),橄欖果蠅（Bactroceraoleae)和墨西哥按實蠅 (Anastrephaludens),鱗翅目(Lepidoptera);紅鈴麥蛾（Pectinophoragossypiella) 和菜蛾（Plutellaxylostella)和蚊子；埃及伊蚊（Aedesaegypti)和白紋伊蚊（Aedes albopictus)，并且可以各自被使用，在某些市場中，輻射仍然可以是絕育方法。這是因為， 在至今描述的雌性-特異的RIDL株中，F(xiàn)1雄性是完全可存活的并且雌性在幼蟲期（即卵 孵化后）被消除。此外，通過提供遺傳絕育（或賦予遺傳絕育的特性）將顯著緩解常規(guī)途 徑和公眾接受度。雄性中的遺傳絕育會有利地增強我們目前的"雌性致死"（fs-RIDL)株。
[0009] 因此，在本領域中存在在雄性中提供類似于SIT方法中的輻射效果的遺傳絕育手 段，而無放射的個體中相關的健康降低的表達系統(tǒng)的需求。
[0010] Crisanti等人，（Catteruccia等人，2009;Windbichler等人，2007;Windbichler 等人，2008)已開發(fā)出核酸內(nèi)切酶（Ipp〇-l，也稱為I-Ppol)連接于組成型結(jié)構基因，0-2微 管蛋白的啟動子的表達系統(tǒng)。本文中描述的其中該系統(tǒng)的許多問題，尤其是在達到其目的 方面，實驗總體上不成功。然而，對遺傳絕育效果的時機能夠發(fā)揮一定程度的控制也將是特 別有用的。該控制在Crisanti系統(tǒng)中不存在。
[0011] 例如，人們可能想要允許在實驗室中飼養(yǎng)攜帶表達系統(tǒng)的個體，但還想要系統(tǒng)在 需要時，比如在釋放時或釋放前/后立即，激活或引發(fā)。換句話說，人們可能想要在特定點 抑制系統(tǒng)的效果和/或誘導它。
[0012] 簡言之，希望這種表達系統(tǒng)包括對表達系統(tǒng)的效果發(fā)揮控制的手段。此種控制常 被稱為"條件性，"從而包括該控制的系統(tǒng)為條件系統(tǒng)。條件表達系統(tǒng)例如在昆蟲中（但不 是在目前的遺傳絕育情況下）已知。在任何情況下，這些條件系統(tǒng)不適于雄性生殖系表達。 事實上，為了利用存在的條件系統(tǒng)，比如雙重tet系統(tǒng)，人們不能簡單地將它們包括在更大 的雄性生殖系表達系統(tǒng)中。在雄性生殖系如此操作，對效應物（設計在所述生殖系實現(xiàn)遺 傳絕育）的控制表達無用。其原因復雜，但集中于由減數(shù)分裂引起的獨特條件。
[0013] 盡管這樣，我們意外地開發(fā)了用于在雄性生殖系中表達的合適系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠 提供就所述系統(tǒng)在生殖系中的表達產(chǎn)生不能形成可成活受精卵的精子這方面而言的遺傳 絕育。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以利用條件系統(tǒng)比如tet的使用，但需要整個表達系統(tǒng)的顯著全面 檢查。我們發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)巧妙地重復了SIT方法中的輻射效果，這是極為有利的。實質(zhì)上，其 允許產(chǎn)生雄性不育昆蟲，而不采取使動物虛弱的輻射的使用。
[0014] 因此，我們展示了一種節(jié)肢動物表達系統(tǒng)，其包含通過可以使能夠誘導條件遺傳 絕育，本文有時稱為"精子致死性"的其它調(diào)節(jié)區(qū)域用于條件系統(tǒng)的合適效應物。然而，將 理解優(yōu)選的目的不是殺死精子本身或甚至阻止其生產(chǎn)，反而是產(chǎn)生不能傳遞其遺傳信息的 精子。然而，相反地，所述精子能夠與野生型精子競爭或使受精卵不可成活（即阻止可成活 受精卵的形成）。
[0015] 這通過提供條件的，和優(yōu)選可抑制的，雄性不育解決上述問題，其通過允許產(chǎn)生從 不能使卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵或胚胎（其能夠發(fā)展為不育成體）的意義上是缺陷的， 但仍然能夠進入或與卵接觸以這種方式來排斥其它精子的精子起作用。
[0016] 可以在GB2404382A，GB2355459A，JP2008067678A，W02009/016627A， W02008/134068A，WCBlack等人（TrendsinParasitology，362-370,第 27 卷，2011)，C Barreau等人（Development，1897-1902,第 135 卷，2008)，GFu等人（ProcNatlAcadSci USA，4550-4554,第 107 卷，2010)和TAnt等人（BMCBiology，51，第 10 卷，2012)中找到進 一步技術背景信息。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 因此，在第一個方面，本發(fā)明提供一種適于在節(jié)肢動物雄性生殖系中條件表達效 應物基因的節(jié)肢動物雄性生殖系基因表達系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：
[0019] -第一表達單元，所述第一表達單元包含效應物基因和可操作連接于其的用于其 的啟動子；
[0020] -第二表達單元，所述第二表達單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列和可操作連接于其 的上游調(diào)控元件，所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達單元中的啟動子以驅(qū)動效應物基因的 表達，所述上游調(diào)控元件包括：
[0021] -轉(zhuǎn)錄因子的啟動子；和
[0022] -臨近轉(zhuǎn)錄因子編碼序列翻譯起始位點的5'UTR;
[0023] 所述上游調(diào)控元件驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子的足量表達，從而所述轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)而在減數(shù) 分裂前驅(qū)動效應物基因的轉(zhuǎn)錄。
[0024] 所述轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為轉(zhuǎn)錄激活劑，比如tTA，GAL4或其變體。所述效應物優(yōu)選為核 酸內(nèi)切酶，最優(yōu)選為3-鋅指核酸酶。第一表達單元的啟動子優(yōu)選為最小啟動子。第二表達 單元中上游調(diào)控元件的啟動子最優(yōu)選自topi，aly或0-2微管蛋白（B2T)或其同源物。所 述同源物優(yōu)選為在所述系統(tǒng)要表達于其中在目標節(jié)肢動物中發(fā)現(xiàn)的同源物。該啟動子是雄 性生殖系啟動子，即其在雄性生殖系中作用于或激活轉(zhuǎn)錄。第二表達單元的上游調(diào)控元件 中的5'UTR優(yōu)選為來自hsp83,優(yōu)選來自地中海果蠅（Medfly)或hsp83的同源物的5'UTR， 特別是來自在目標節(jié)肢動物中發(fā)現(xiàn)的hsp83同源物（即所述系統(tǒng)要表達于其中的同源物） 的5'UTR。備選地，所述5'UTR可以是來自B2T或其同源物的5'UTR，條件是所述5'UTR 被修改以去除或改善野生型中包含的轉(zhuǎn)錄延遲信號的效果，特別是如果與B2T啟動子組合 使用時。
[0025] 所述第一或第二表達單元還可以包含增強子。第一和第二表達單元啟動子之一或 二者，尤其是最小啟動子，可以考慮進一步包括增強子。
[0026] 可以在相同構建體內(nèi)分開或一起提供所述表達單元。如果分開，那么所述表達系 統(tǒng)可以包含分開的多個構建體。所述一個構建體或多個構建體優(yōu)選為質(zhì)粒。所述質(zhì)粒可以 包含轉(zhuǎn)座子。所述轉(zhuǎn)座子可以轉(zhuǎn)而包含轉(zhuǎn)座元件。轉(zhuǎn)座子的實例可以包括piggyBac轉(zhuǎn)座 子。
[0027] 表達效應物基因的條件性質(zhì)是其可以由使用者控制或否則受外界因素影響。此種 因素可以是環(huán)境因素比如溫度（例如在使用Gal4_UAS系統(tǒng)的情況中），但最優(yōu)選為化學實 體，比如四環(huán)素或其類似物?？梢栽趯嶒炇铱刂茰囟龋⑶铱梢栽O想可以利用日或季節(jié)進程 中的溫度改變。然而，在一些實施方案中，這不是優(yōu)選的，因為人們可能希望獲得更精細程 度的控制。在此種情況下，特別優(yōu)選所述系統(tǒng)從為誘導型的和最優(yōu)選為可抑制的意義上是 條件性的。
[0028] 誘導型系統(tǒng)是已知的，例如可以使用GAL4-UAS設置，其中轉(zhuǎn)錄因子是GAL4并且第 一表達包含（效應物基因編碼序列外）GAL4結(jié)合的UAS區(qū)域（CGG-Nn-CCG，其中N可以是 任何堿基），或優(yōu)選為其寡聚物。如果第二表達單元中的上游調(diào)控元件包含合適啟動子和 5'UTR，那么Gal4轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄可以通過提供例如作用于Gal4轉(zhuǎn)錄因子的啟動子（直接 或間接，即引起轉(zhuǎn)錄被誘導）的肽或激素被誘導。
[0029] 在另一個優(yōu)選的實例中，所述系統(tǒng)可以是誘導型系統(tǒng)，其中誘導通過提供化學實 體，如四環(huán)素或包括多西環(huán)素的其類似物中一種發(fā)生。在此種情況下，可以使用rtTA("反組 tTA"）作為轉(zhuǎn)錄因子，例如，從而rtTA僅在四環(huán)素類似物比如多西環(huán)素的在在下結(jié)合DNA。 rtTA描述于W0 2001/059088等中。在此情況下，提供四環(huán)素（即在飲食中）或類似物比如 多西環(huán)素將允許rtTA轉(zhuǎn)錄因子在本系統(tǒng)中作用于第一表達單元并以此誘導本效應物基因 的表達。
[0030] 然而，優(yōu)選所述系統(tǒng)是可抑制的。一個優(yōu)選的實例是第二表達單元中的轉(zhuǎn)錄因子 是tTA或其變體（tTAV，tTAV2,tTAV3等）。這些結(jié)合DNA除非四環(huán)素(Tc)，或適當類似物 存在。四環(huán)素將阻斷tTA的DNA-結(jié)合，從而在tTA和第一表達單元的增強子之間不存在相 互作用，因此，效應物基因不轉(zhuǎn)錄。因此，如公知的（參見例如本文提及的我們的RIDL發(fā) 表），可以將四環(huán)素提供在飲食中直到需要去抑制（即去除或緩解抑制）表達效應物基因的 時候。在缺失四環(huán)素（或類似物比如多西環(huán)素）的情況下，比如野外釋放后或在切換實驗 室中飲食時，效應物基因表達。
[0031] 因此，在一些實施方案中，優(yōu)選所述系統(tǒng)為誘導型，但在其它特別優(yōu)選的實施方案 中，所述系統(tǒng)是可抑制的。
[0032] 兩個表達單元優(yōu)選為雙重（條件的）表達系統(tǒng)的兩個部分中的一個。優(yōu)選的實例 包括GAL4 :UAS和各種tet系統(tǒng)。在第一種情況中，第二表達單元的轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為Gal4， 同時所述第一表達單元優(yōu)選包含用于GAL-4結(jié)合的UAS序列。還預想GAL4的合適變體，t匕 如GAL4-VP16。
[0033] -般而言，表達單元之一或二者可以包含增強子。然而，特別優(yōu)選所述第一表達單 元包含增強子。優(yōu)選第二表達單元的轉(zhuǎn)錄因子是tTA或變體（即當本表達系統(tǒng)使用tet系 統(tǒng)提供條件性）。當是這種情況時，那么第一表達單元優(yōu)選包括tet操縱子（tetO)otetO-微 型啟動子（tRE)元件是特別優(yōu)選的。其一起提供第二表達單元上游調(diào)控元件的啟動子和增 強子元件。426-bpTRE啟動子含有七個融合于微型巨細胞病毒（mini-CMV)啟動子tetO18 聚體（參見例如M.Ghosh等人，Mol.CellBiol. 2004, 24 (23) 10193)。
[0034] 盡管雙重系統(tǒng)是優(yōu)選的，其中以分開的構建體提供第一和第二表達單元，所述第 一表達單元和第二表達單元也可以提供在相同構建體或質(zhì)粒上。從而，本系統(tǒng)優(yōu)選為一個 質(zhì)?；蛴蓛蓚€質(zhì)粒組成。最優(yōu)選所述兩個表達單元作為單個質(zhì)?；蜉d體轉(zhuǎn)化，從而它們插 入在基因組的相同位點。
[0035] 所述節(jié)肢動物優(yōu)選為如下文進一步描述的昆蟲。雄性生殖系將被理解為包括精 子，從而所述系統(tǒng)能夠在精子中表達所述效應物基因。
[0036] 在至少一些情況下，所述效應物賦予或給予父本效應致死性，即是"父本效應致 死"遺傳系統(tǒng)，或是"父本效應致死"遺傳系統(tǒng)的部分。在此種系統(tǒng)中，后代（這里采用從精 子進入卵的階段，其在昆蟲中可以不與膜融合同時）的死亡依賴于父本的基因型而不是受 精卵（或可能的受精卵）的基因型。因此，例如，在顯性父本效應致死系統(tǒng)中，來自雜合雄性 與（純合）野生型雌性交配的野生型后代中的至少一些將受影響。另外的合子效果當然是 可能，并且預期在本發(fā)明內(nèi)。對于此效應物，一些可能的作用模式是可能的和設想到的。例 如，在一些實施方案中，所述效應物是或包含核酸酶。從而，通過我們稱為"父本效應致死" 實現(xiàn)不育。這里，將效應物表達（以提供功能核酸酶蛋白）于精子中。這可以導致精子中 DNA受影響，從而受精的胚胎具有降低的存活幾率；實質(zhì)上，這是父本效應致死性可以實現(xiàn) 所通過的機制的優(yōu)選實例。還可能所述效應物蛋白進入卵，其中DNA切割也可以發(fā)生。然 而，還預想到至少一些效應物轉(zhuǎn)錄本也可以從精子進入卵并且在卵中翻譯。在這兩種情況 中，核酸酶效應物可以從而在卵以及精子中發(fā)揮其作用
[0037]所述系統(tǒng)適于表達效應物，但將理解這還可以優(yōu)選被稱為'能夠如此表達'或'適 應于在雄性生殖系中表達效應物'。
[0038]所述效應物基因?qū)⒃谙挛倪M一步描述，但其優(yōu)選為報道分子，比如標記，例如熒光 蛋白比如GFP，YFP等等。然而，所述效應物基因更優(yōu)選為核酸酶，其合適實例在下文提供。 其最優(yōu)選為既是核酸酶又是報道分子，例如核酸酶_熒光蛋白融合（其優(yōu)選的實例包括公 知的綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白）。
[0039]本文中述及'是'報道分子或核酸酶的基因，例如，將理解所述基因包括編碼具有 那種陳述的功能的蛋白的DNA或RNA。
[0040]所述第一表達單元包含效應物基因。它還包含用于其的啟動子并且所述啟動子可 操作連接于其。所述啟動子因此適于驅(qū)動效應物基因的轉(zhuǎn)錄。如上文提到的，所述第一表 達單元還可以包含增強子，或至少第二表達單元的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域或序列（即由所述 轉(zhuǎn)錄因子識別）。
[0041]所述第二表達單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列。其還包含上游調(diào)控元件。這轉(zhuǎn)而可 操作連接于轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列，以致它可以驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄。
[0042]所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達單元中的啟動子以驅(qū)動效應物基因的表達，盡 管這當然可以通過增強子，即所述轉(zhuǎn)錄因子可以不直接作用在啟動子上，而取而代之的是 通過增強子。當然預想到其它調(diào)控元件比如對于5'帽，5'UTR，3'UTR和多聚腺苷酸尾的那 些。
[0043]為了驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，第二表達單元的上游調(diào)控元件包含啟動子和5'UTR。這 兩種都需要仔細選擇以提供效應物的足量表達。從而，第二表達單元（即在上游調(diào)控元件 中）的啟動子優(yōu)選為來自0-2微管蛋白（B2T)的啟動子。備選地，并且所述啟動子更優(yōu)選 來自topi或aly。第二表達單元（即上游調(diào)控元件中）中的5'UTR優(yōu)選為來自hsp83,例 如來自地中海果蠅（Medfly)的5'UTR，但其也可以來自B2T。如果5'UTR和啟動子二者都 來自B2T，則一個或另一個必需被修改為翻譯延遲信號被去除或改善。當然述及這些基因時 包括其同源物。
[0044] 本文將5'UTR定義為與翻譯起始位點（即最低限度地，翻譯的ATG起始位點）5' 相鄰（即上游）的序列。其在真核生物中具有約150個堿基的中值長度并且優(yōu)選延伸直到 啟動子，例如在ATG起始位點上游約50-500個堿基處。
[0045] 盡管第二表達單元中框架的主體可以來自B2T，即使B2T0RF以轉(zhuǎn)錄因子0RF替 代，將理解第二表達單元的啟動子和其5'UTR二者不能都是來自B2T的那些：至少需要將它 們之一改變以在減數(shù)分裂發(fā)生前提供效應物轉(zhuǎn)錄本的足夠積累。如果要使用B2T啟動子， 那么B2T5'UTR必需是上文描述的修改/改善的形式，或其可以是來自hsp83的5'UTR。
[0046] 備選地，如果使用B2T5'UTR，那么所述啟動子必需是其它早期作用啟動子。所需 要的是對于第二表達元件的5'UTR和啟動子的選擇必須一起作用以在減數(shù)分裂發(fā)生前允 許效應物轉(zhuǎn)錄本的足量積累。
[0047] 備選啟動子的優(yōu)選實例是topi和aly啟動子?？梢耘c一些5'UTR使用這些啟動 子。其序列的實例在下文提供。
[0048] 當對特定遺傳元件比如啟動子，增強子，5'UTR或甚至'來自'某命名的基因的0RF 進行引用時，將理解它實際上不意為將所述元件從引用的基因去除，其僅意為這是元件的 來源。描述它的其它方式會是'源自'。優(yōu)選基因的物種來源與目標物種的來源相同。換句 話說，在想要在地中海果蠅（Medfly)中表達本效應物的情況下，優(yōu)選所述元件源自提到的 基因的地中海果蠅（Medfly)同源物。然而，如果不這樣，貝U果蠅（Drosophila)版本是優(yōu)選 的。
[0049] 事實上，優(yōu)選偏好的遞降次序是：
[0050]_(最優(yōu)選）來自目標物種（其中效應物的表達是預想到的）；
[0051]-來自目標屬（即來自相同屬內(nèi)的其它物種）；和最后
[0052] _ (最不優(yōu)選）來自目標科。
[0053] 原因是，優(yōu)選的啟動子的作用至少可以是跨物種非常良好保守的。例如，果蠅 (Drosophila)啟動子可以在地中海果蠅（Medfly)中不工作，因此來自相同基因的地中海 果蠅（Medfly)同源物的啟動子是優(yōu)選的。然而，因為編碼序列是良好保守的，（例如）在給 定節(jié)肢動物中鑒定3-2-微管蛋白基因和因此通過常規(guī)方法鑒定地中海果蠅（Medfly)版 本的合適啟動子片段相對簡單。
[0054] 通常在mRNA的轉(zhuǎn)錄起始上游1至2kb內(nèi)鑒定合適啟動子。盡管在本發(fā)明中該范 圍是優(yōu)選的，一些雄性生殖系啟動子可以短并且100_200bp的一段序列也是優(yōu)選的，或者 在mRNA的轉(zhuǎn)錄上游l-2kb窗內(nèi)，或甚至mRNA的轉(zhuǎn)錄起始上游的100-200bp的一段序列。
[0055] 就序列保守性而言，關于5'UTR，應用類似的考慮，其中最初序列保守性低。因此， 優(yōu)選5'UTR來自與目標節(jié)肢動物相同的物種（例如按照上文實例），如果目標是地中海果 蠅（Medfly)，那么5'UTR優(yōu)選為來自相同基因的地中海果蠅（Medfly)同源物的5'UTR(可 如上文討論的通過參考更高度保守的0RF鑒定）。鑒定和限定5'UTR的一種方式是其（作 為RNA)與編碼相應0RF，例如3 -2微管蛋白的序列的5'端連接。
[0056] 在5'UTR和啟動子二者的情況下，將很容易被鑒定用于本表達的序列是否不足 量，因為將無轉(zhuǎn)錄因子表達，其可以通過通常方式測定，或通過提供將轉(zhuǎn)錄因子0RF連接于 熒光蛋白來測試。
[0057] 優(yōu)選地，第二表達單元的上游調(diào)控元件中的啟動子是0-2-微管蛋白啟動子。與 本文描述的hsp83 5'UTR組合使用（第二表達單元的上游調(diào)控元件中）是最優(yōu)選的。
[0058] 還優(yōu)選上游調(diào)控元件中的啟動子是topi啟動子。為了幫助鑒定topi的同源物， 我們在此提供topi0RF(參見下文）。進一步指導在Perzgasga等人（2004)中提供，例如， 其通過引用并入本文并且描述了來自黑腹果蠅Orosophilamelanogaster)，Drosophila pseudoobscura和岡比亞按蚊（Anophelesgambiae)的topi同源物，后者是特別優(yōu)選的。
[0059] 備選地，優(yōu)選上游調(diào)控元件中的啟動子是aly啟動子。Aly比topi表示更近的基 因復制，因此不以如topi-樣寬范圍的物種中的雄性生殖系特異基因存在。盡管如此，在 它存在的情況下，可以通過參考保守的0RF以與對于topi相同的方式容易地鑒定。aly0RF 在下文提供。
[0060] 第二表達單元的轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為tTA或其變體并且第一表達單元包含tet操縱子 (tetO)。tTA，tTAV，tTAV2和tTAV3的氨基酸序列在下文給出。
[0061] 因此優(yōu)選第二表達單元的轉(zhuǎn)錄因子包含編碼tTA或其變體，例如上文給出的那些 的氨基酸序列中任一個的多核苷酸。如上文描述的，還優(yōu)選所述轉(zhuǎn)錄因子是GAL4或其變體 并且所述第一表達單元包含GAL4的UAS位點。
[0062] 對于tTA和Gal4二者，這優(yōu)選包括與所述SEQIDN0S(包括所述變體）中的一個 在至少50個殘基上具有（或編碼）至少70%，至少90%或至少95%氨基酸序列'同一性' 或甚至更不嚴格的'相似性'的任何序列。
[0063] 將理解轉(zhuǎn)錄因子識別序列（DNA，例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的序列）的放置，不許在第一 表達單元內(nèi)并且不在0RF內(nèi)。例如，以tetO和UAS二者，插入在例如ATG起始位點上游幾 千堿基內(nèi)。它們通常置于啟動子的幾百個堿基內(nèi)，但可以作用在幾kb外。
[0064] 在任何情況中，優(yōu)選所述啟動子是最小啟動子。為簡單起見，與增強子一起，可以 將{增強子+最小啟動子}僅稱為啟動子。然后，增強子（轉(zhuǎn)錄激活劑結(jié)合位點，例如tetO 或UAS)是定義的啟動子的一部分。
[0065] 附圖簡述
[0066] 現(xiàn)在將參考以下附圖描述本發(fā)明的某些實施方案，其中：
[0067] 圖1是表示卵孵化率測定的設計的示意圖；
[0068] 圖2顯示開和關四環(huán)素時0X4282-0X4104雄性不育的百分數(shù)；
[0069] 圖3顯示開和關四環(huán)素時0X4282-0X4458雄性不育的百分數(shù)；
[0070] 圖4顯示開和關四環(huán)素時0X4353雄性不育的百分數(shù)；
[0071] 圖5顯示開和關四環(huán)素時0X4353雌性不育的百分數(shù)；
[0072] 圖6顯示在0X4718- 〇 1系中可抑制的雄性特異不育；
[0073] 圖7顯示開和關四環(huán)素時0X4705橄欖果蠅（Olivefly)雄性不育的百分數(shù)；
[0074] 圖8顯示開和關四環(huán)素時0X4705雌性不育的百分數(shù)；
[0075] 圖9顯示0X4466株孵化率測定；
[0076] 圖10顯示0X4467-E1株孵化率測定；
[0077] 圖11顯示既攜帶topi-tTAV也攜帶tet〇-Dm-魚精蛋白-FokI等位基因的埃及伊 蚊（Aedesaegypti)系的孵化率測定；
[0078] 圖12顯示既攜帶0 2-微管蛋白-tTAV也攜帶tet〇-Ae-魚精蛋白-FokI等位基 因的埃及伊蚊（Aedesaegypti)系的孵化率測定；
[0079] 圖13顯示與兩株主要RIDL雌性致死系（0X3864A和0X3647Q)雜交的0X4353株；
[0080] 圖14是0X3866的質(zhì)粒圖；
[0081] 圖15是0X3867的質(zhì)粒圖；
[0082] 圖16是0X3671的質(zhì)粒圖；
[0083] 圖17是0X4112的質(zhì)粒圖；
[0084] 圖18是0X4103的質(zhì)粒圖；
[0085] 圖19是0X4104的質(zhì)粒圖；
[0086] 圖20是0X3831的質(zhì)粒圖；
[0087] 圖21是0X4458的質(zhì)粒圖；
[0088] 圖22是0X4391的質(zhì)粒圖；
[0089] 圖23是0X4286的質(zhì)粒圖；
[0090] 圖24是0X3978的質(zhì)粒圖；
[0091] 圖25是0X4275的質(zhì)粒圖；
[0092] 圖26是0X4254的質(zhì)粒圖；
[0093] 圖27是0X4371的質(zhì)粒圖。
[0094] 發(fā)明詳述
[0095] 術語'編碼序列'和0RF可以在本文中相互替換使用。
[0096] 如上文解釋的，在一個優(yōu)選的實施方案中，精子不死亡（如術語'精子致死性'可 能意味著一些）。作為替代，精子中的某物殺死受精卵。當我們使用核酸酶時，這可能對精 子DNA遺傳損害，但也可能由精子攜帶的RNA或蛋白在受精后具有其效果（實質(zhì)上，Burt/ Crisanti已經(jīng)提示這點以解釋岡比亞按蚊（An.gambiae)中來自其X-shredder的雌性以及 雄性胚胎的死亡，參見Windbichler等人2008,在前）。
[0097] 現(xiàn)有技術教導應該使用B2T基因（啟動子和0RF)并用目的基因代替0RF。然而， 我們發(fā)現(xiàn)這并不導致本文描述類型的條件系統(tǒng)。如果將系統(tǒng)做成條件的，我們發(fā)現(xiàn)必須對 該設置進行顯著改變。一個問題是一旦細胞進入減數(shù)分裂，轉(zhuǎn)錄關閉。盡管翻譯仍然能夠 在減數(shù)分裂后的細胞中發(fā)生，進一步的轉(zhuǎn)錄不能發(fā)生（近期由Barreau等人（2008)描述 了一些例外基因的減數(shù)分裂后的轉(zhuǎn)錄，但一般意義上是對的）。因此，如果想要表達目的蛋 白（從所述目的基因），比如效應物蛋白，那么必須在減數(shù)分裂前有效應物基因的足量表達 (以提供相應的效應物RNA)。由"效應物RNA"，其意為RNA，例如mRNA，編碼（其當翻譯和 任選地翻譯后修飾時，（如果是融合蛋白）切割，和/或折疊）以提供作為效應物蛋白行使 功能的氨基酸序列。
[0098] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，"足夠"提供轉(zhuǎn)錄本或蛋白涉及與所述轉(zhuǎn)錄本或蛋白的數(shù)量和 時機二者。因此，當應用于效應物基因時，其意為本系統(tǒng)確保至少效應物蛋白的轉(zhuǎn)錄本在減 數(shù)分裂（時機）前產(chǎn)生和由此提供足量的所述轉(zhuǎn)錄本以實現(xiàn)所需蛋白功能。將理解這包括 蛋白表達中的所有臨時事件，比如轉(zhuǎn)錄本的任選加工，翻譯轉(zhuǎn)錄本為具有初級結(jié)構和其任 選修飾的氨基酸序列，和提供二級、三級和甚至四級結(jié)構（例如在二聚體的情況中）。
[0099] 然而，當使用條件系統(tǒng)時，現(xiàn)有技術系統(tǒng)不能提供要有效的足夠功能效應物蛋白。 這主要被認為是由于此種條件系統(tǒng)不僅需要轉(zhuǎn)錄和翻譯效應物蛋白，而且還需要轉(zhuǎn)錄和翻 譯用作對效應物蛋白的轉(zhuǎn)錄因子（調(diào)控單元）的控制因子蛋白。在減數(shù)分裂前，完全沒有 進行轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白功能，然后進一步轉(zhuǎn)錄的完整周期的所有步驟另外需要的時間。換 句話說，如果，如這里的情況，所述條件系統(tǒng)使用轉(zhuǎn)錄因子，那么該轉(zhuǎn)錄因子自身需要被轉(zhuǎn) 錄和翻譯以提供功能轉(zhuǎn)錄因子蛋白。該轉(zhuǎn)錄因子蛋白必須隨后轉(zhuǎn)而作用于效應物基因（編 碼效應物蛋白）的調(diào)控元件，從而在減數(shù)分裂之前在各細胞中存在效應物轉(zhuǎn)錄本的足夠積 累，以在減數(shù)分裂之后在各細胞中及時允許效應物轉(zhuǎn)錄本翻譯。
[0100] 我們發(fā)現(xiàn)的是僅以編碼轉(zhuǎn)錄因子的0RF代替現(xiàn)有技術系統(tǒng)中的0RF是全然不夠 的。作為替代，本領域中的B2T啟動子區(qū)域也必須被修改或完全替代，從而所述系統(tǒng)可以在 減數(shù)分裂前產(chǎn)生足夠的效應物轉(zhuǎn)錄本以在減數(shù)分裂后具有功能（翻譯的）蛋白。因此，在 我們的新條件系統(tǒng)中，需要新上游調(diào)控元件（比如啟動子和/或5'UTR)以驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子 0RF的表達。所述新上游調(diào)控元件必須在精子自然發(fā)生中足夠早地作用以產(chǎn)生足夠的轉(zhuǎn)錄 因子功能蛋白，以轉(zhuǎn)而作用于調(diào)控元件，控制效應物的表達并從而在減數(shù)分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)錄 關閉前產(chǎn)生足夠的效應物轉(zhuǎn)錄本。在條件系統(tǒng)的情況下能夠?qū)崿F(xiàn)它是本發(fā)明的特定優(yōu)勢。
[0101] 效應物蛋白（即由效應物基因編碼的功能蛋白）最優(yōu)選在減數(shù)分裂后對精子使卵 受精以產(chǎn)生可成活受精卵的能力具有有害效果。
[0102] 所述系統(tǒng)優(yōu)選從其在精子中引起的不育是顯性的意義上為顯性的。這是父本效應 致死性的概念的引入點，進一步參見下文。由優(yōu)選的效應物比如核酸酶引起的遺傳不育優(yōu) 選為在雄性中顯性，從而所有來自雜合雄性的精子都受影響。將理解這不是關鍵的，因為我 們預期釋放純合雄性，但是是優(yōu)選的。這與如常規(guī)RIDL的情況中的受精卵中顯性是相反 的。在這些現(xiàn)有技術系統(tǒng)中，一個拷貝（與精子一起繼承）足以殺死受精卵，當然，由攜帶 野生型等位基因的精子（來自雜合雄性）受精的卵不受影響。
[0103]節(jié)肢動物優(yōu)選為昆蟲并且在本文對昆蟲和非昆蟲節(jié)肢動物二者都提供合適實例。 然而，節(jié)肢動物特別優(yōu)選為蚊子，特別是能夠傳染瘧疾或登革熱的物種的，或農(nóng)業(yè)害蟲，t匕 如果蠅。
[0104]本系統(tǒng)表達于其中的節(jié)肢動物是雄性節(jié)肢動物并且表達發(fā)生在其雄性生殖系細 胞，特別是性腺，即精巢，精子在那里自然發(fā)生。此外，或備選地，表達可以在精子自身中發(fā) 生。優(yōu)選，所述表達發(fā)生在大多數(shù)所述細胞（即至少50%的所述細胞）中，但它可以更高， 例如至少80%，至少90%，至少95%或最優(yōu)選99-100%的所述細胞。
[0105] 因此，所述表達系統(tǒng)能夠適應于或適于在節(jié)肢動物的雄性生殖系中表達基因。這 里由"基因"，主要意為蛋白。換句話說，該表達系統(tǒng)的功能是在節(jié)肢動物雄性生殖系（生殖 系細胞）中表達蛋白。該表達的時機是關鍵的并且在別處進一步討論，但它必須足以使精 子不能讓卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵。理想地，所述表達系統(tǒng)自身是，或包含在，即通過轉(zhuǎn) 化，能夠在節(jié)肢動物雄性生殖系中表達的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)座子或其它轉(zhuǎn)座遺傳元件。因此，所述表 達系統(tǒng)優(yōu)選為多核苷酸表達系統(tǒng)，優(yōu)選DNA，RNA或二者的混合物。
[0106] 從所述系統(tǒng)表達優(yōu)選為有條件的。盡管它可以是誘導型的，特別優(yōu)選所述條件性 是可抑制的，從而表達僅在缺少抑制物的情況下發(fā)生。在誘導型系統(tǒng)中，表達將僅在誘導 物的存在下發(fā)生。包括在本表達系統(tǒng)中的特別優(yōu)選的可抑制系統(tǒng)是tet(四環(huán)素）系統(tǒng)或 GAL4/UAS系統(tǒng)，二者都在本文進一步描述。
[0107]將理解所述啟動子能夠節(jié)肢動物的雄性生殖系細胞中表達，即能夠在其中起始轉(zhuǎn) 錄。還將理解，所述啟動子可操作連接于本系統(tǒng)的調(diào)控元件和編碼序列。
[0108]其可以是，所述系統(tǒng)包含單條編碼序列或多于一條編碼序列。所述一條或更多條 編碼序列可以以融合連接或分開提供。進一步編碼序列的合適實例為標記或報道分子比如 熒光蛋白（例如GFP，EFP，YFP，等），但進一步效應物也是優(yōu)選的，以提供更好特異性。
[0109] 除具體描述的第二表達單元的上游調(diào)控元件之外，本系統(tǒng)還可以適當包括進一步 調(diào)控元件。這些促進，即使能夠，在節(jié)肢動物的雄性生殖系細胞中表達。此外，如下文描述 的，所述進一步調(diào)控元件促進RNA的有絲分裂前加工和翻譯。因此，所述進一步調(diào)控元件不 是啟動子的部分，但優(yōu)選包括第一表達單元中的5' UTR和/或第一和第二表達單元二者中 的3'UTR。因此，這些進一步調(diào)控元件可以被認為是非翻譯序列，如以第二表達單元的指定 5' UTR的情況。它們都優(yōu)選包括至少5' UTR或3' UTR的實質(zhì)部分，但是最優(yōu)選完全5' UTR 或完全3' UTR。最優(yōu)選，提供5' UTR和3' UTR的至少實質(zhì)部分（并且優(yōu)選二者都是完全 的）。所述調(diào)控元件因此可以包括5'UTR的全部或部分，包括各種調(diào)控序列，其與使RNA序 列（例如最近從DNA轉(zhuǎn)錄的RNA)能夠翻譯的5' UTR內(nèi)關聯(lián)或在其中發(fā)現(xiàn)。
[0110] 所有本文描述的啟動子應該優(yōu)選包括特征比如轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶結(jié)合位點。 這些是啟動子元件（典型地），不是UTR元件（盡管可以存在重疊）。5'UTR-般具有一些 翻譯起始信號，可能還有RNA穩(wěn)定性，定位，翻譯控制和內(nèi)含子序列（盡管不是必要的）。
[0111] 對于可以包括5'帽和/或多聚腺苷酸尾的其它進一步調(diào)控元件同樣適用。換句話 說，理想地，所有這些元件存在于至少實質(zhì)部分，即足以提供其必要的調(diào)控功能的那個。技 術人員將能夠評估這些調(diào)控元件的全部或部分存在或缺失的情況下是否提供編碼序列的 足量表達，因為基本要求是精子的下游功能性。技術人員能夠評估精子是否能夠競爭，這是 有利的。他也能夠容易地鑒定精子是否產(chǎn)生可成活受精卵，這是不利的。如果精子不競爭， 和/或如果它們確實產(chǎn)生可成活受精卵，那么效應物的表達水平將需要修正。在本發(fā)明中， 精子（其意為轉(zhuǎn)化的或GM(遺傳修飾的，即攜帶轉(zhuǎn)基因/本表達系統(tǒng)））優(yōu)選能夠與野生型 精子競爭但是不產(chǎn)生可成活受精卵。因此，如果這些中的一個未實現(xiàn)，尤其是如果產(chǎn)生可成 活受精卵，那么所述系統(tǒng)需要修正。
[0112] 然而，必須銘記在心的是將效應物0RF/編碼序列的RNA加工為所述效應物轉(zhuǎn)錄本 在減數(shù)分裂前發(fā)生并且以足夠水平積累，從而之后翻譯的和功能性蛋白對精子使卵受精產(chǎn) 生可成活受精卵的能力具有所需效果。這點另外進一步詳細討論。
[0113] 效應物編碼優(yōu)選的核酸酶的情況下，例如，這是有害效果。這在任何點發(fā)生（盡管 明顯在效應物轉(zhuǎn)錄本被加工和翻譯等等為功能蛋白之后）?；拘枨笫窃跍p數(shù)分裂前必須 存在足夠的效應物轉(zhuǎn)錄本，因為轉(zhuǎn)錄在那一點關閉。然而，可以設想所述效應物蛋白可以是 有絲分裂后（但是當然是減數(shù)分裂后的）功能性的。
[0114] 優(yōu)選地，所有調(diào)控元件是彼此同源的，即源自相同基因。特別優(yōu)選，為了精細調(diào)節(jié) 表達水平，所述調(diào)控元件彼此異源，從而例如，3 ' UTR可以源自相對選擇的5 ' UTR的不同基 因。優(yōu)選所述5'帽和多聚腺苷酸尾與啟動子同源，即來自與啟動子相同的基因。
[0115] 因為效應物基因是通常不表達于雄性節(jié)肢動物的生殖系細胞中的基因，還將理解 調(diào)控元件與所述基因異源（即與編碼序列異源）。在所有這些中，將理解異源指遺傳元件比 如啟動子，5' UTR(或其它調(diào)控元件）或編碼序列的來源，從而它們可以來自相同生物的不 同基因；來自不同生物的保守基因；或甚至來自不同生物的不同（不相關）基因。換句話 說，所述元件可以來自（從源自的意義上，盡管修飾是可預想的）單個生物內(nèi)的一系列不同 基因或不同生物的一系列不同基因，具有限制條件是，它們足以在節(jié)肢動物雄性生殖系，即 在其性腺或精子中提供必要的表達水平。尤其，所述編碼序列可以根本不必須來自節(jié)肢動 物，而如果有助于從編碼序列的蛋白表達的適當程度和時機，特別是有關減數(shù)分裂前翻譯， 例如所述調(diào)控元件還可以優(yōu)選源自細菌或病毒。
[0116] 所述編碼序列編碼效應物蛋白。如上文提到的，所述編碼序列優(yōu)選為與表達系 統(tǒng)中的其它元件比如啟動子和/或調(diào)控元件異源。同時，表達系統(tǒng)中的編碼序列將是多 核苷酸，其能夠被轉(zhuǎn)錄為合適的信使RNA(mRNA)，其足以隨后被翻譯為功能蛋白。設想了 RNA的可變剪接，其由內(nèi)含子（剪接控制）序列與剪接體合作調(diào)節(jié)。提供或控制可變剪接 的優(yōu)勢是其添加調(diào)節(jié)蛋白表達的另外水平。對此的進一步指導提供在我們之前的公開W0 2007/091099 中。
[0117] 效應物蛋白表達的時機和定位對于本發(fā)明是關鍵的并在下文進一步討論。然而， 將理解效應物的功能優(yōu)選對精子使卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵的能力具有有害效果。
[0118] 如本文描述的，雌性感覺好像她已經(jīng)恰當?shù)厥芫?，否則她將尋找進一步交配或，實 質(zhì)上，已經(jīng)可以存在本精子需要競爭的其它野生型精子是重要的。然而，如果其一般功能被 顯著損害，比如其"游泳"的能力，精子將不能競爭。
[0119] 優(yōu)選的效應物對精子使卵受精以產(chǎn)生可成活受精卵的能力具有有害效果。優(yōu)選， 其誘導或直接引起DNA損害。這個的特定優(yōu)選實例為核酸酶，特別是核酸內(nèi)切酶。這些的 進一步實例在下文提供。
[0120] 啟動子驅(qū)動，即能夠或適應于起始，效應物編碼序列以及其周圍的調(diào)控元件轉(zhuǎn)錄 為RNA。這個時機是關鍵的并且另外強調(diào)。效應物的翻譯可以在減數(shù)分裂之前或之后發(fā)生。
[0121] 效應物蛋白具有有害效果，尤其是在減數(shù)分裂后（減數(shù)分裂后）。精子通過精子自 然發(fā)生從攜帶本表達系統(tǒng)的雄性生殖系細胞產(chǎn)生。所述精子因此優(yōu)選攜帶或包含至少一個 拷貝的效應物蛋白，但是優(yōu)選顯著多于一個拷貝。該有害效果降低精子使卵受精的能力。因 此，本系統(tǒng)在如Horn和Schetelig(Horn，C.，Wimmer，A.E. 2003,Schetelig，M.F.，Handler， M.A. 2012)中公開的胚胎特異系統(tǒng)中誘導致死性之前作用良好。強烈優(yōu)選效應物使精子具 有足夠的運動性，從而它們能夠在急于到達卵的過程中與普通（即野生型或未轉(zhuǎn)化的）精 子競爭。同樣，值得注意的是，精子攜帶一個拷貝的DNA(編碼效應物的基因是關鍵的。 實質(zhì)上，這是優(yōu)選的并且是與合子活化的RIDL系統(tǒng)的關鍵差異，因為本系統(tǒng)可以：
[0122] _保證不存在卵孵化；
[0123] _與遺傳性別鑒定組合使用；
[0124]-提供條件性；和
[0125] _純種，合子致死性和抗性。
[0126] 一般而言，受精在雌性生殖道中。在交配過程中雄性將精子轉(zhuǎn)移，雌性保存它。從 雌性生殖道傳下的成熟卵暴露于該精子并受精。對于一些物種（地中海果蠅（Medfly)，埃 及伊蚊（Aedesaegypti))，雌性典型地僅交配一次并使用儲存的精子用于其所有卵。一些 其它昆蟲，例如一些蛾，交配更頻繁。
[0127] 然而，特別優(yōu)選效應物引起足夠的DNA損害，可成活受精卵不可能形成，例如因為 由精子提供的單倍體遺傳信息被損害。例如，優(yōu)選精子的DNA在其中具有雙鏈損傷。由使 用核酸內(nèi)切酶導致的該優(yōu)選的實施方案，其實例在本文提供。因此，本發(fā)明已開始就阻止可 成活受精卵的形成，而不是在一旦形成的受精卵中進一步表達蛋白。這是超過現(xiàn)有技術，t匕 如RIDL技術（其中功能受精卵形成并且隨后表達效應物以殺死受精卵）的重要區(qū)別。在 本發(fā)明中，無可成活受精卵曾經(jīng)形成。
[0128] 因此，優(yōu)選所述受精卵可以從不超過單細胞階段。早期昆蟲胚胎，例如，在無細胞 分裂的情況下分開其核，隨后細胞化，因此一步從1細胞到> 1000。然而，還優(yōu)選的胚胎僅 未能孵化為幼蟲（其是野外所需的特征）。因此，最小需求是，優(yōu)選個體未能發(fā)展為可成活 成體。
[0129] 因此，可以看出，作為現(xiàn)有技術的問題的解決方案，本發(fā)明提供精子自然發(fā)生過程 中減數(shù)分裂之前，異源效應物蛋白（優(yōu)選核酸內(nèi)切酶）的轉(zhuǎn)錄本的減數(shù)分裂前積累的微妙 平衡作用，從而，減數(shù)分裂后，產(chǎn)生的精子攜帶翻譯的效應物序列拷貝，其可以隨后在精子 中產(chǎn)生效果。該效果在受精前發(fā)生，因此有效使精子不育，從而精子是不育的活性精子。這 是本文描述的"精子致死"效果。
[0130] 在減數(shù)分裂時，似乎不存在對于DNA完整性的強烈檢驗點。因此減數(shù)分裂前對DNA 的損害通常是耐受的。實質(zhì)上，這可能是輻射所做的：輻射導致各種精子頭部尺寸，同時頭 部尺寸與DNA含量成比例。該不同DNA含量可以因此源自由于由在減數(shù)分裂前細胞中輻射 引起的DNA損害導致的減數(shù)分裂時DNA的不均勻分離。然而，在有絲分裂（通常）中存在強 烈的檢驗點，因此生殖系干細胞（GSCs)或精子發(fā)生細胞中的DNA損害可能阻止功能性（從 使卵受精能力的意義上）精子的發(fā)育。
[0131] 根據(jù)本發(fā)明的一個進一步方面，提供在性腺或精子中表達效應物蛋白的方法。優(yōu) 選地，所述方法包含用本表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化性腺。這方面還涉及轉(zhuǎn)化方法。
[0132] 還提供的是群體控制方法，包括在雄性節(jié)肢動物的性腺中通過本表達系統(tǒng)表達所 述蛋白。本文描述優(yōu)選的節(jié)肢動物。
[0133] 本發(fā)明還提供抗性管理的方法?；旧蠈τ谌魏魏献踊钚訰IDL系統(tǒng)，包括胚胎活 性的合子活性RIDL系統(tǒng)，存在受精卵的基因組中的某物（例如從其母本遺傳獲得的遺傳物 質(zhì)）可以阻止或降低想要的致死效果的可能性。關于RIDL，這將是遺傳的抗性因子。為了 說明，抗性因子可以是降低致死效應物表達水平，或降低致死效應物的目標對那個效應物 的敏感度的某物。然而，對于本發(fā)明，當使用核酸內(nèi)切酶時，難以預想那可能怎樣發(fā)生。損 害已經(jīng)完成-使用核酸酶作為實例，精子DNA受損害并且難以預見在卵中這可能怎樣糾正， 因此使損害成為永久性的。
[0134] 關于抗性管理，可以預見如果我們使用雌性特異的RIDL并且在野外看到抗性產(chǎn) 生的情形。我們可以加入根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)，保持fsRIDL雌雄分離并保持本發(fā)明不育。備 選地，我們可以僅切換本系統(tǒng)，然而雌雄分離在一些物種中對SIT有明顯益處。
[0135] 該抗性管理不是完全全面的-行為抗性仍然可能（如果雌性可以區(qū)別可育和不育 雄性，對于優(yōu)先交配可育雄性的那些，將存在強烈的選擇，從而避免暴露于受本發(fā)明影響的 精子。已經(jīng)在基于輻射的SIT計劃中觀察到此種行為抗性，但是僅非常少（我們相信僅知 道存在一個好的實例）。該爭論與輻射-絕育的支持者使用的那個非常類似，為了上文概述 的原因爭論精子中的輻射損害對合子（RIDL)致死的優(yōu)越性。
[0136] 在本方法中，優(yōu)選所述條件系統(tǒng)，優(yōu)選本文描述的tet系統(tǒng)，用以提供進一步程度 的控制。這允許，例如，在實驗室條件下，即在抑制物，比如四環(huán)素的存在下飼養(yǎng)。當釋放， 或去除四環(huán)素時，系統(tǒng)的抑制被去除并且效應物蛋白從而被表達。
[0137] 在目前的情況下，雄性不育既用于農(nóng)業(yè)，以例如阻止卵孵化，以及也用于疾病控 制，例如控制疾病載體比如蚊子（例如造成瘧疾和登革熱傳播的那些）。因此，本發(fā)明還提 供生物節(jié)制（biocontainment)的方法，所述方法包括在群體中表達所述系統(tǒng)或向野外釋 放雄性（攜帶所述系統(tǒng)）。優(yōu)選的，以可抑制系統(tǒng)，所述株變得依賴于抑制物且不能在野外 建立。
[0138] 本發(fā)明還提供質(zhì)量控制方法，例如，通過包括報道分子比如熒光蛋白，優(yōu)選綠色熒 光蛋白（GFP)或本領域已知的任何其它顏色熒光蛋白。這可以是效應物蛋白本身，其以轉(zhuǎn) 化標記起作用。用作轉(zhuǎn)化標記的熒光蛋白的其它實例包括DsRed，DsRed2和AmCyan。
[0139] 還可以使用分開的轉(zhuǎn)化標記，包括使用這里描述的那些。這些轉(zhuǎn)化標記的轉(zhuǎn)錄可 以在對于第一或第二表達單元的那個的分開的啟動子的控制下。此種啟動子的實例包括肌 肉肌動蛋白啟動子,3xP3,hrIE和hr5IEl。
[0140] 然而，更優(yōu)選地，所述熒光蛋白可以連接于本系統(tǒng)的效應物蛋白，從而該報道蛋白 和其表達將允許評估將轉(zhuǎn)基因或其它效應物包括在群體中的程度。這具有以下優(yōu)點中的至 少一些：
[0141] (1)如任何此種標記，其鑒定轉(zhuǎn)基因的存在，從而可以按照遺傳。標記與研究的特 征（例如致死系統(tǒng)）連接越緊密，失活一個但不失活另一個的突變發(fā)生的可能性越低。盡管 在實踐中，如果它們（標記和轉(zhuǎn)基因）在同樣的DNA片段上，這在任何情況下都極不可能；
[0142] (2)如果從融合的意義上連接，標記顯示效應物蛋白的表達。這將允許人審視實 際表達。例如，在核酸酶的tet-可抑制表達的優(yōu)選的例子中，核酸酶融合于熒光報道分子 會允許人核實要釋放的昆蟲表達所述核酸酶。熒光標記的存在將告訴你（i)雄性具有至少 一個拷貝的轉(zhuǎn)基因；（ii)所述表達系統(tǒng)從在抑制物缺失的情況下產(chǎn)生效應物的表達的意 義上正確行使功能；（iii)昆蟲表達核酸酶-FP融合（并且因此例如，不是在存在抑制物的 情況下無意飼養(yǎng)）；[(iv)假定雄性特異的表達，是雄性];(v)通過推理它們實質(zhì)上不育。 在質(zhì)量控制（QC)條款中，這使你比僅知道雄性具有一個拷貝的轉(zhuǎn)基因更確定'他們'不 育'，其是你從使用連接的（遺傳連鎖的，例如相鄰基因）熒光標記所獲得的；
[0143] (3)用高功率的顯微鏡，你可以看到表達何時開始和蛋白定位在細胞內(nèi)的哪里。這 是有用的研發(fā)工具并且也用于例如在進行的QC中，而且在精子精子間表達的一致性的情 況下，監(jiān)控一致性，以建立系統(tǒng)今天是否進行，它昨天/去年做了什么；和
[0144] (4)就熒光精子而言的進一步優(yōu)勢，在下文討論。
[0145] 對于核酸酶，存在對切割DNA的明確的功能關聯(lián)，因此如果其不是在核中，就不可 能具有想要的DNA-切割效果。從而，因此還優(yōu)選提供核定位信號以保證核酸酶定位于核。
[0146] 在進一步的方面，在此提供質(zhì)量控制的方法，所述方法包括在目標組個體中誘導 或去抑制本表達系統(tǒng)的表達并確定這些個體是否滿足預期的標準比如尺寸、數(shù)量、發(fā)育階 段或定位。例如，如果所述系統(tǒng)包括表達報道分子比如熒光蛋白為效應物或為例如融合蛋 白的部分之一的工具，那么其中從所述系統(tǒng)表達被誘導或去抑制的個體將變得在合適波長 的光下可見。
[0147] 優(yōu)選本系統(tǒng)包括至少一個間隔區(qū)。此間隔區(qū)可以有利地位于所述系統(tǒng)的任何本元 件之間。例如，可以在啟動子和調(diào)控元件之間和/或調(diào)控元件和編碼序列之間提供間隔區(qū)， 從而在這些元件之間提供"緩沖"以保證其正確功能性。因此，所述間隔區(qū)除了分開這些元 件之外，不具有基因表達的功能，盡管它可以任選地包括許多限制性位點，如果這被認為是 有用的。理想地，它應該不包括任何轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子位點等，因為這些可能干擾效應物的表 達。
[0148] 還優(yōu)選所述效應物可以是融合序列或蛋白的形式，從而，例如，核酸酶融合于標記 以致效應物的轉(zhuǎn)錄和翻譯也導致標記的轉(zhuǎn)錄和翻譯。這具有顯示將精子暴露于核酸酶的優(yōu) 點，熒光蛋白的存在表示核酸酶被表達?？梢栽跓晒怙@微鏡下使用適于特定熒光蛋白的激 發(fā)濾光片觀察熒光蛋白。這些的實例是我們的株LA4466或LA4467 (LA4466 =PB-hr5IEl-DsRed-A印rot-tGFP-EcoRI和LA4467 =PB-hr5IEl-DsRed-A印rot-tGFP-FokICD)。應該注 意，更早期的株隨發(fā)明人LukeAlphey標記"LA"，但是從那以后，我們隨 申請人:Oxitec采 用了前綴"0X"。因此，對于個體株，前綴LA和0X可以相互替換使用。LA4466/0X4466和 LA4467/0X4467二者都是成功融合于熒光表達的核酸酶功能的實例。
[0149] 還可預見，本系統(tǒng)和方法可以用于產(chǎn)生熒光精子。例如，可以將報道分子比如上文 提到的那些連接于啟動子或，實際上，在分開的啟動子下，比如tetO啟動子增強子系統(tǒng)，如 果效應物是tTA或其變體的任一種。熒光精子對于精子或性腺的可視分離，特別是在解剖 或性選擇方法中會是有優(yōu)勢的。尤其，它推斷出確定雌性與哪個雄性個體交配，在野外釋放 程序的情況下哪個有用的能力。此方法可能包括，提供（例如誘捕）野生雌性；解剖它們； 尋找儲存的精子并看此精子是否攜帶本系統(tǒng)，即是熒光的。這將非?？焖俚馗嬖V你雌性是 否：
[0150] (i)是未交配的（尚未交配）；
[0151] (ii)與野生型雄性交配（因為它顯示非熒光精子）；
[0152] (iii)與攜帶本系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因雄性交配（其會顯示熒光精子；或
[0153] (iv)與兩種類型的雄性都交配（通過熒光和非熒光精子的存在顯示）。
[0154] 因為'雌性與誰交配？'是評估和控制SIT-類型計劃的關鍵問題，這是有用的優(yōu) 點。存在一些提議這點的文章，例如Malacrida等人2007文章已經(jīng)被引用，但是不在我們 這里提供的上下文中。
[0155] 本理念的實例是構建體（0X3878)，設計其以熒光標記精子頭，尤其在埃及伊蚊 (Aedesaegypti)中。該構建體使用埃及伊蚊（Aedesaegypti)tGFP_標簽標記的魚精蛋 白和其調(diào)控序列，以精子-特異的方式表達熒光融合蛋白。在完整的解剖的精巢和在從 0X3878雄性蚊子分離的精子中都檢測到強烈的綠色熒光。這顯示，熒光蛋白的表達可以由 本系統(tǒng)驅(qū)動以產(chǎn)生熒光精子并且，此外所述熒光可以有用地被檢測到。
[0156] 因此，在進一步的方面，本發(fā)明提供確定雌性節(jié)肢動物的交配狀況的方法，所述方 法包括在轉(zhuǎn)基因雄性（即釋放的）群體中使用根據(jù)本發(fā)明系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包含標記比 如熒光報道蛋白；并且在存在精子時，測定雌性中所述標記的存在；標記的存在表示雌性 已與攜帶所述系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因雄性交配。不攜帶標記的精子的存在表示雌性與野生型（不是 轉(zhuǎn)基因）個體交配。精子不存在的情況，其表示雌性尚未，或剛交配。在一些實施方案中，所 述方法包括釋放攜帶本系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因的雄性并且允許它們與雌性（即野生型雌性）交配。
[0157] 將理解，在本發(fā)明中，所述系統(tǒng)的表達必須被引發(fā)或被允許發(fā)生。換句話說，遵循 誘導效應物表達（和如果分開，任選標記的比如報道分子）所需的條件。在可抑制tet系 統(tǒng)的情況下，例如，這意為從轉(zhuǎn)基因雄性的飲食中去除四環(huán)素。
[0158] 本發(fā)明的首要目的是提供雄性不育。然而，我們還顯示的是可能提供不育精子，其 仍然能夠與野生型精子競爭。這是有優(yōu)越性的，因為其導致更高程度的群體控制，因為如果 野生型精子輕易能夠競爭掉轉(zhuǎn)化的精子，并且雌性可能與兩種類型的雄性都交配，那么將 在下一代中僅存在群體的少量減少。即使雌性典型地僅交配一次，在此種情況下，對于增加 的再交配可以存在強烈的選擇性。
[0159] 泛素融合蛋白還可以有利地包括在本系統(tǒng)中。這具有以融合產(chǎn)生兩種蛋白的表 達，即單個多肽，但是（共翻譯）切割為兩個分開的蛋白的優(yōu)點。如果所述蛋白之一不容許 融合（例如，tTA，趨于以N-末端融合不行使功能），這是有用的。你仍然具有緊密結(jié)合形 式的共表達，然而你失去了使用標簽（例如熒光蛋白，F(xiàn)P)以確定融合蛋白的亞細胞定位的 能力，因為其不保持與它融合。
[0160] 值得重申，本啟動子是"早期作用"生殖系啟動子，因此在減數(shù)分裂前提供必要水 平的轉(zhuǎn)錄。所述啟動子在下文進一步定義，但是同樣值得銘記于心的是，啟動子應該優(yōu)選在 有絲分裂之后不在早于topi啟動子作用，尤其是，不在干細胞中作用（至少其中效應物不 損害此種細胞類型，即其中效應物不是核酸酶）。
[0161] 所述啟動子應該具有生殖系效果，并且優(yōu)選所述系統(tǒng)的表達是有條件的。理想地， 在看到效應物表達的任何負效應之前，精子自然發(fā)生應該基本上完成。優(yōu)選不存在對精子 功能的可辨效果，直到卵進入后。同時可能看到DNA損害為'負效應，'人們可以僅將精子 中的DNA視為"貨物"，因為在精子中無轉(zhuǎn)錄。由效應物引起的任何DNA損害必須足以阻止 可成活子代的產(chǎn)生。
[0162] 因此，本發(fā)明優(yōu)選提供條件生殖系特異性（就表達而言）。
[0163] 在一個優(yōu)選的實例中，第二表達單元的'框架'尤其基于來自Dm或目標節(jié)肢動物 的B2T野生型基因。將編碼序列用轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列替代，并且也將啟動子和/或5'UTR 序列改變。實質(zhì)上，甚至可以插入異源增強子或使用異源3'UTR。顯然，如果進行所有這些 改變，將存在很少殘留的原序列，因此將理解這是建立第二表達單元的一種方式。
[0164] 關于調(diào)控元件，特別是第二表達單元中的上游調(diào)控元件啟動子和/或5'UTR，對于 本轉(zhuǎn)錄因子不存在延遲的翻譯效果是重要的。實現(xiàn)這點的一種途徑是使用來自已知在減數(shù) 分裂前以足夠，優(yōu)選強烈水平轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因的調(diào)控元件。合適的實例會包括分子伴侶 基因，優(yōu)選HSP家族的基因，尤其是hsp83。在一個其它的優(yōu)選實施方案中，3'UTR可以源自 病毒，比如SV40。
[0165] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本系統(tǒng)的第二表達單元包含來自@2微管蛋白 (B2T)的啟動子，連同修改的B2T5'UTR或來自hsp83的5'UTR。任選地，可以使用來自 SV40的3'UTR。啟動子和5'UTR之一或二者可以來自topi。topi指果蠅（Drosophila) 基因matotopetli。然而，本發(fā)明包括功能同源物和來自其它物種的旁系同源物。這些可以 通過參考如上文描述的保守0RF鑒定。在5'UTR來自topi的情況下，所述啟動子也可以 來自topi，盡管可預見其可以來自本文公開的任何其它啟動子，例如B2T。同樣，當使用來 自topi的啟動子和/或使用來自的topi5'UTR時，3'UTR優(yōu)選為也來自topi，剩余的調(diào) 控元件比如5'帽和多聚腺苷酸尾也是一樣。這一點的原因是topi在精子自然發(fā)生中具有 "早期"表達形式，從而其能夠在有絲分裂后但在減數(shù)分裂前驅(qū)動合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
[0166] 在B2T，同時啟動子有用的情況下，我們發(fā)現(xiàn)的確似乎存在與來自B2T的5'UTR密 切相關的延遲信號，阻礙早期翻譯。由于該原因：B2T的5'UTR可以由來自例如，分子伴侶 比如hsp83的5'UTR替代。因此，將看出，在一些情況下啟動子和調(diào)控元件彼此同源，或至 少優(yōu)選來自不同物種的保守同源物的同時，在一些情況下，使用彼此異源的啟動子和調(diào)控 元件以精細調(diào)控本發(fā)明所需的表達模式可以是必要的。如在實施例中看到的，我們提供每 個方案的實施例。
[0167] 在其它方面，本發(fā)明還提供用本系統(tǒng)或通過本方法轉(zhuǎn)化的節(jié)肢動物（在本文提供 其優(yōu)選實例）。換句話說，本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化子或遺傳改進的節(jié)肢動物，優(yōu)選如本文進一步 限定的。將理解所述節(jié)肢動物是雄性，優(yōu)選其性腺攜帶本系統(tǒng)，從而在精子自然發(fā)生過程中 效應物的表達發(fā)生。
[0168]啟動子和調(diào)控元件以協(xié)同方式一起作用以提供所需表達模式是本發(fā)明的優(yōu)點。
[0169] 如上文提到的，所述啟動子優(yōu)選來自精巢-特異的基因或至少足以在精子自然發(fā) 生過程中提供"早期"表達的基因。備選方案包括更為組成型的啟動子，比如結(jié)構啟動子， 例如，微管蛋白家族，特別是0微管蛋白和最優(yōu)選0 2微管蛋白啟動子，和其同源物。當使 用它時，有必要使用不具有至少在0 2微管蛋白的上游調(diào)控元件的一些情況下看到的翻譯 延遲信號的上游調(diào)控元件。使用B2T啟動子的優(yōu)點是B2T基因編碼序列高度保守并且它和 合適的啟動子片段可以由技術人員從給定節(jié)肢動物物種中容易地鑒定和分離。
[0170]B2T啟動子序列的實例在下文給出。
[0171] 改善的B2T啟動子序列的實例在下文給出。
[0172] 來自B2T的5'UTR的實例在下文給出。如果來自其它物種的B2T啟動子用于本發(fā) 明，那么技術人員將能夠基于其來自上述SEQIDN0的保守性質(zhì)容易鑒定5'UTR。他們將 隨后能夠用其它5'UTR替代它。制備的實例包括來自分子伴侶，特別是hsp家族，特別是 hsp83的5'UTR。來自hsp83的5'UTR的合適實例在下文給出。
[0173] 已經(jīng)成功用于本發(fā)明實施方案的3'UTR的合適實例是來自SV40的3'UTR。該 3'UTR在下文給出。
[0174]topi編碼序列在蚊子比如埃及伊蚊（Aedesaegypti)和地中海果蠅（Medfly) (C.capitata)間大部分保守。如對于B2T，人們可以通過序列相似性（很多方法，包括分 子和基于序列的方法）克隆topi(或其部分）編碼區(qū)域，然后轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)錄起始的5'并獲取其 5'DNA的大部分作為你的啟動子。有多少不總是立即清楚；保守地轉(zhuǎn)向5'，直到你到達下一 個轉(zhuǎn)錄的區(qū)域并獲取其全部，但是實踐中雄性生殖系啟動子趨向于非常短（幾百個堿基）， 因此轉(zhuǎn)錄起始5'lkb應該足夠，如果你感覺謹慎，獲取2-5。這里的試驗和錯誤測試也顯而 易見：將啟動子連接至FP，制備轉(zhuǎn)基因，觀察表達模式。
[0175]topi是有用的，因為它具有早期表達并且與精子自然發(fā)生相關。其也是有利的，因 為它是相對"緊湊的"系統(tǒng)，即由相對少的多核苷酸組成。同樣，它是精巢特異的并且，實質(zhì) 上，它早于B2T表達。與B2T啟動子相比，表達可能弱點，但是如果表達水平需要被改善，這 在某些方面可以是有利的。Topi是轉(zhuǎn)錄因子的實例并且因此來自在精巢表達并且優(yōu)選精 巢-特異的（即僅在精巢表達）的其它轉(zhuǎn)錄因子的啟動子和/或調(diào)控元件在此是優(yōu)選的。
[0176] 我們發(fā)現(xiàn)，在雜交中更強的完全絕育效果，其中與特別是埃及伊蚊（Aedes aegypti)中的B2-微管蛋白相比，核酸酶表達由Topi啟動子驅(qū)動。盡管如此，在兩種情況 下都觀察到顯著的雄性不育，在蚊子，尤其是埃及伊蚊（Aedesaegypti)中"父性致死性效 應"既賦予topi也賦予B2-微管蛋白合適啟動子的改變形式。
[0177] 其產(chǎn)物（例如編碼的蛋白）僅在減數(shù)分裂時或減數(shù)分裂后需要的基因可能僅在減 數(shù)分裂前或后被短暫翻譯，即使更早被轉(zhuǎn)錄。相反，需要驅(qū)動此基因表達的轉(zhuǎn)錄因子必須足 夠早被表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯），使得其蛋白產(chǎn)物足夠積累以驅(qū)動在減數(shù)分裂前的轉(zhuǎn)錄停止之 前目標基因的足夠表達。因此，在需要在雄性生殖系中表達轉(zhuǎn)錄激活劑比如tTA的情況下， 雄性生殖系轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控元件可以以最小改進相適合。
[0178] 下文更詳細描述合適的核酸內(nèi)切酶。然而，優(yōu)選的實施方案包括例如在LA4104看 到的鋅指核酸內(nèi)切酶。其它備選方案包括IppOl，也稱為I-Pp〇I，如由Crisanti等人使用的 (Catteruccia等人，2009;Windbichler等人，2011;Windbichler等人，2007;Windbichler 等人，2008)。這具有某些優(yōu)點，比如它具有非常長的識別序列，相應地，其在隨機序列中罕 見。然而，其相對于一些限制性內(nèi)切酶不具有高特異性，例如，因為它將容許（即仍然切割） 具有與典型識別序列一定程度差異的序列。Windbichler等人2007展示岡比亞按蚊（An. gambiae)組織培養(yǎng)細胞中的生長抑制，其是合理的證據(jù)（如他們也推斷的），表達會是有毒 的，但是他們不直接顯示它。
[0179] 不同結(jié)果來自Windbichler等人2008,其中I-Ppol的表達-他們認為其應該只 切割岡比亞按蚊（An.gambiae)中的X染色體，因為在此物種中，其在rDNA中目標位點似乎 僅在X染色體上-給出完全不育的雄性，而不是其預期（由于對源自父系的X染色體的損 害而無可成活雌性后代，但有可成活雄性后代）。他們提議的解釋（對其他們提供了一些 支持數(shù)據(jù)）為精子中I-Pp〇I自身被轉(zhuǎn)移至受精卵中，在那里它也切割源自盤羞的X染色體 (他們似乎假定為蛋白，但是可能與為mRNA相當）。這是持久的問題，其與蛋白（或mRNA) 穩(wěn)定性相關.
[0180] 替代的優(yōu)選核酸內(nèi)切酶是Fok-1魚精蛋白融合核酸內(nèi)切酶。進一步優(yōu)選的備選方 案包括EcoRI魚精蛋白融合核酸內(nèi)切酶。魚精蛋白是DNA結(jié)合蛋白并起具有一般非常低的 序列特異性。這與Fok-1，類型IIS切割結(jié)構域聯(lián)合。該切割結(jié)構域必須二聚化以切割其 靶。這是有用的，因為所述位點需要一起足夠近，從而產(chǎn)生非線性濃度效應。以單體作用的 效應物被預期具有與其濃度成比例的其效果（這里，DNA切割）。對于很多應用，人們將偏 好非線性劑量反應曲線，以致效果接近零直到某點，但是隨后相對快速超過那個點增加至 完全有效，這點的限制是雙重'閾值'效果。核酸酶比如魚精蛋白-FokI被預期具有一定 程度的此種非線性。但是魚精蛋白結(jié)合DNA具有很少或不具有序列特異性。因此，在低濃 度（例如每個核中的分子）魚精蛋白-FokI蛋白將趨向于在染色質(zhì)周圍隨機分散，很少以 足夠緊密的接近度/定位二聚化并切割染色體。
[0181] 然而，隨濃度增加，此接近度的幾率大大增加，導致濃度和切割之間的非線性關 系。這促進啟動子的選擇（和特異轉(zhuǎn)基因插入），因為所述系統(tǒng)相對惰性，甚至具有低-但 是非零水平的脫靶（基底）表達，同時在更高表達時仍然具有所要的效果（在預期的表達 結(jié)構域，在可抑制表達系統(tǒng)的情況下去抑制）。在結(jié)合于DNA之前效應物必須二聚化（或 形成更大復合體，例如四聚體）的情況下，可以獲得類似的效果。在想要更線性的效果的情 況下，這可以通過使用不需要二聚化的核酸酶結(jié)構域，或其中以單個多肽（例如FokI結(jié)構 域的兩個拷貝而不是一個）提供必要的亞單位，容易地在本發(fā)明的方法內(nèi)完成?？梢允褂?更好或更差的序列特異性的核酸酶實現(xiàn)所述系統(tǒng)另外的操作，因為可獲得得蛋白分子將通 過DNA結(jié)合結(jié)構域?qū)Ω罅炕蚋倭课稽c的特異性和親和力'集中'，導致在那些位點更 大或更小程度的濃度。
[0182] 優(yōu)選所述魚精蛋白基因（或蛋白編碼序列）獲自與目標物種的那個相同的物種。 優(yōu)選所述魚精蛋白基因源自黑腹果蠅0).melanogaster)。還優(yōu)選所述魚精蛋白基因源自埃 及伊蚊（Aedesaegypti)。
[0183] 設計與組成型表達的構建體0X4466和0X4467相關的實例以分別研究效應物蛋 白Aeprotamin-EcoRl和Aeprotamin-Fokl的功能性。這些實例顯示，這兩種效應物蛋 白當用于精子致死系統(tǒng)，即在早期作用啟動子（第二表達單元）的控制下時都應該確定 工作。事實上，我們還繼續(xù)對Aeprotamin-Fokl二元構建體繼續(xù)顯示這點。證明了兩種 效應物蛋白的功能性之后，我們開發(fā)和注射Aeprotamin-Fokl二元構建體（參見實施例 "0X4282-0X4627Topi-tTAV-驅(qū)動表達tet〇-Ae-魚精蛋白-Fokl-CD"），其證實了 之前的 (組成型表達的）系統(tǒng)的陽性結(jié)果。因此，完全有理由預期EcoRl系統(tǒng)在精子致死環(huán)境中也 將產(chǎn)生效果。因此，效應物基因優(yōu)選為Aeprotamin-EcoRl或Aeprotamin-Fokl。這些對于 在蚊子和尤其伊蚊（Aedes)，尤其是埃及伊蚊（Aedesaegypti)中使用是最優(yōu)選的。
[0184] 其它類型II核酸內(nèi)切酶包括例如Ec〇32I，BfiI，和MboII。這些核酸內(nèi)切酶是同源 二聚的。一般而言，二聚核酸內(nèi)切酶是有利的。他們是二聚的，因為他們僅當二聚化時才切 割DNA。當它們適當?shù)囟刍瘯r，它們導致雙鏈DNA破壞。
[0185] 其它核酸內(nèi)切酶可以包括HEG's(歸巢核酸內(nèi)切酶（HomingEndonucleases)。這 些HEG's可以是單體或二聚體，但是一般具有低特異性（從它們不需要與其（非常長）識 別序列完全匹配，但是它們確定不僅切割隨機序列的意義上）。其它備選方案包括來自細菌 的限制型核酸內(nèi)切酶。這些也具有低特異性。
[0186] 因此，技術人員可以選擇所需特異性的水平。將理解對于給定的識別序列，低特異 性核酸內(nèi)切酶將比高特異性核酸內(nèi)切酶以更大量的機會破壞或損害DNA。HEGs具有非常長 的識別序列，其將以常小于一次/基因組的頻率偶然發(fā)生。因此盡管對于該序列有其不完 美的特異性，它們可以根本不切割（例如Windbichler等人，2011中的I-Scel僅切割設計 的位點，不切割基因組的剩余部分-至少不以足夠高以引起他們的實驗中的明顯問題的頻 率）。
[0187] 因此，通過適當選擇核酸內(nèi)切酶為效應物的進一步精細調(diào)節(jié)水平是可能的。已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述核酸酶效應物融合蛋白在至今測試的三種不同雙翅目物種，即地中海果蠅 (C.capita),橄欖果蠅（B.oleae)和埃及伊蚊（Aedesaegypti)中是完全形式功能的。這 些物種是特別優(yōu)選的，如相同屬中其它物種一樣。
[0188] 特別優(yōu)選所述節(jié)肢動物（本系統(tǒng)表達所在的宿主生物）是昆蟲，優(yōu)選實蠅 (Tephritid)。尤其，優(yōu)選所述昆蟲來自雙翅目（OrderDiptera)，尤其是高級雙翅目 并且特別它是實蠅，優(yōu)選地中海果蠅（Medfly)(地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata)))，優(yōu)選墨西哥果蠅（Mexfly)(墨西哥按實蠅（Anastrephaludens))，優(yōu)選東方 果妮（Orientalfruitfly)(Bactroceradorsalis)，撤攬果妮（Bactroceraoleae)，瓜 實妮（Melonfly)(瓜實妮（Bactroceracucurbitae))，納塔爾果妮（Natalfruitfly) (納塔耳小條實蠅（Ceratitisrosa))，搜桃果蠅（搜桃繞實蠅（Rhagoletiscerasi))，昆 士蘭果蠅（Bactroceratyroni)，桃果蠅（Bactrocerazonata)加勒比果蠅（加勒比按實 蠅（Anastrephasuspensa))或西印度群島果蠅（Anastrephaobliqua)。還特別優(yōu)選的所 述宿主生物是蚊子，優(yōu)選來自覆蚊亞屬（Stegomyia),伊蚊屬（Aedes),按蚊屬（Anopheles) 或庫蚊屬（Culex)。特別優(yōu)選是Stegomyiaaegyptae，也稱為埃及伊蚊（Aedesaegypti)，Stegomyiaalbopicta(也稱為白紋伊蚊（Aedesalbopictus))，史氏按蚊（Anopheles stephensi)，白魔按蚊（Anophelesalbimanus)和網(wǎng)比亞按蚊（Anophelesgambiae)。
[0189] 在雙翅目內(nèi)，其它優(yōu)選的群是麗蠅科（Calliphoridae)，特別是新世界旋蠅 (NewWorldscrewworm)(嗜人維妮（Cochliomyiahominivorax))，舊世界旋妮（Old Worldscrewworm)(蛆癥金妮（Chrysomyabezziana))和澳大利亞羊_妮（Australian sheepblowfly)(銅綠妮（Luciliacuprina))。鱗翅目（Lepidoptera)和鞘翅目 (Coleoptera)也是優(yōu)選的，尤其是蛾，包括蘋果蠹蛾（codlingmoth)(Cydiapomonella), 和香（家香（Bombyxmori))，棉紅鈴蟲（thepinkbollworm)(紅鈴麥蛾（Pectinophora gossypiella))，小菜蛾（thediamondbackmoth)(菜蛾（Plutellaxylostella))，舞 毒蛾（Gypsymoth)(Lymantriadispar)，胳澄懦蟲（theNavelOrangeWorm)(胳澄螟 (Amyeloistransitella))，桃芽蛾（PeachTwigBorer，桃條麥蛾（Anarsialineatella)) 和水稻螟蟲（ricestemborer)(三化螟（Tryporyzaincertulas))，還有夜蛾，尤其是實 夜蛾亞科（Heliothinae)。鞘翅目（Coleoptera)中，日本甲蟲（日本金龜子（(Popilla japonica))，白流蘇甲蟲（White-fringedbeetle)(白緣象（Graphognatusspp.))，棉 籽象鼻蟲（Bollweevil)(墨西哥棉鈴象（Anthonomousgrandis))，玉米根蟲（葉甲屬 (Diabroticaspp))和Colorado馬鈴薯甲蟲（馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsadecemlineata)) 是特別優(yōu)選的。
[0190] 然而，如我們在實施例中顯示的，本系統(tǒng)和方法可以跨雙翅目實施，包括高級和低 級雙翅目。高級雙翅目因此是優(yōu)選的。低級雙翅目也是優(yōu)選的。
[0191] 在一些實施方案中，優(yōu)選所述昆蟲不是果蠅（Drosphilid)。因此，在一些實施方案 中，在果蠅Orosophilid)，尤其是黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster)中的表達是被排 除的。
[0192] 優(yōu)選效應物蛋白的表達導致生物中表型的后果，即不育。特別優(yōu)選地，功能蛋白可 以與可視標記（包括熒光）關聯(lián)。
[0193] 在對特定核苷酸或蛋白序列進行參考的情況下，將理解這包括對與其具有基本上 相當?shù)蒙飳W活性的其任何突變體或變體的參考。優(yōu)選地，所述突變體或變體與參考序列 具有至少85 %，優(yōu)選至少90 %，優(yōu)選至少95 %，優(yōu)選至少99 %，優(yōu)選至少99. 9 %，和最優(yōu)選 至少99. 99 %的序列同一1丨生。
[0194] 我們預期：
[0195]a)本不育是顯性的，從而雜合雄性的所有精子將受影響（不必要都是缺陷的，因 為所述系統(tǒng)可能對于一些類型的精子有選擇性，或?qū)撌苡绊懙哪切┚佑猩儆?00% 的有效性）；并且
[0196]b)所述機制不依賴于由通過這些精子的顯性致死基因的受精卵導致的遺傳
[0197] 因此，本系統(tǒng)不是RIDL系統(tǒng)，因為a)和b)都區(qū)別于RIDL。
[0198] 輻射的一個可能優(yōu)點是，難以看到野生目標群體中可遺傳的或遺傳改變能夠克服 輻射的絕育效果。因此難以想象在野生群體中對于基于輻射的SIT的這方面產(chǎn)生的抗性 (然而其它類型的抗性，比如行為抗性例如選型交配（Dhillon等人，2005)，可能產(chǎn)生）。相 反，可以想象，賦予對RIDL基因的殺滅或失能作用的抗性的基因或等位基因可能產(chǎn)生。類 似地，盡管CI的精確生物化學基礎未知，以沃爾巴克氏體（Wolbachia)的合適株感染的胚 胎能夠反轉(zhuǎn)CI誘導的雄性不育，因此對CI誘導的不育的生物化學/遺傳抗性似乎是可以 想象的。
[0199] 本發(fā)明克服這些困難。設計絕育機制以在合子基因表達前作用，從而可遺傳抗性 的可能性嚴格受限。例如，考慮使用在精子自然發(fā)生中表達的核酸酶。在限制性條件（對 于繁殖力，容許表達核酸酶）下，這將傾向于與輻射幾乎相同的方式損害DNA，例如誘導雙 鏈破壞。因此同樣難以想象野生目標群體如何能夠發(fā)展出對此種不育或父本效應致死性的 抗性。其可以是，人工大量飼養(yǎng)的群體可能發(fā)展出抗性，然而使用合適的條件表達系統(tǒng)，從 而在容許的（對于繁殖力）條件下幾乎對精子（或其它細胞或組織）不進行損害，將最小 化對于此種等位基因的選擇壓力。盡管從這方面與輻射類似，但本發(fā)明的方法具有一些優(yōu) 點。絕育效果限制于性腺或配子，并且這樣較小可能降低昆蟲的性能。通過選擇合適的可 抑制表達系統(tǒng)，可以僅通過去除抑制物就實現(xiàn)不育。從這方面，所述系統(tǒng)還提供生物節(jié)制， 因為釋放到野外的昆蟲（故意或無意）為不育的，或它們的后代中的部分或全部是不育的。
[0200] 我們打算將雌性致死（或不能飛）RIDL技術與本"精子致死"發(fā)明組合以開發(fā)適 于在SIT計劃中實施的昆蟲產(chǎn)品。我們在實施例中顯示本"精子致死"系統(tǒng)與RIDL技術的 聯(lián)合是可行的。當然，還將存在不需要雌雄分離的物種，和需要雌雄分離但可以通過其他手 段實現(xiàn)的物種（例如基于物理尺寸的雌雄分離，如適于埃及伊蚊（Aedesaegypti)的）。因 此，優(yōu)選地，本表達系統(tǒng)還可以與存在的雌性致死（或不能飛）技術聯(lián)合以進一步開發(fā)適于 在SIT-類型計劃中實施的節(jié)肢動物，并特別是昆蟲產(chǎn)品。對于SIT，對于很多物種，僅釋放 雄性被認為是所需的，例如成體雌性即使不育實質(zhì)上或可能是有害的（例如蚊子，通過叮 咬，或地中海果蠅（Medfly)，通過產(chǎn)卵于未成熟水果），同樣對于地中海果蠅（Medfly)，共 釋放不育雌性似乎'干擾'不育雄性找到野生雌性（Rend6n等人，2004)。
[0201] 合適雌雄分離系統(tǒng)包括基于兩性異形的分離（例如埃及伊蚊（Aedesaegypti)的 尺寸，舌蠅（tsetsefly)的蛹化時間）；誘導的兩性異形（例如Catteruccia等人，2005)。 備選地，可以通過使用致死遺傳雌雄鑒別系統(tǒng)排除一個性別；此種系統(tǒng)已經(jīng)通過經(jīng)典遺傳 學（例如Franz，2005 ;Klassen和Curtis，2005)和還通過包括RIDL的實施方案的重組DNA 方法（(Fu等人，2007 ;Thomas等人，2000)構建。兩種條件表達系統(tǒng)都可以使用相同條件， 從而協(xié)調(diào)控制兩種表型中每個的控制。因此，例如，如果各個系統(tǒng)被四環(huán)素（或其合適的類 似物，比如氯四環(huán)素）抑制，在合適濃度的四環(huán)素的存在下飼養(yǎng)會讓所述株生長到足夠數(shù) 量。在釋放前的最后一代中，在無四環(huán)素的條件下飼養(yǎng)會導致雌性-特異的致死系統(tǒng)和建 議的精子致死系統(tǒng)二者去抑制。因此，雌性將死亡并且剩余的雄性將是不育的。
[0202] 兩個tet-可抑制系統(tǒng)之間一定程度的對話（cross-talk)是可以預期的，從而兩 種效應物將由兩個系統(tǒng)都表達。雌性中精子致死效應物的表達不可能具有任何不想要的后 果，因為意圖是這些雌性死亡。以其它方式對話，即在精子自然發(fā)生中表達雌性-致死效應 物可能有困難，其依賴于雌性-致死效應物的性質(zhì)和其對精子自然發(fā)生的影響。如果認為 不需要，此種對話可以容易被避免，以對雌性限制雌性-致死效應物的表達，例如通過使用 型別特異的可變剪接調(diào)節(jié)功能效應物的產(chǎn)生（Fu等人，2007)。
[0203] 可以以兩種方式實現(xiàn)所述組合技術：
[0204] -可以將提議的發(fā)明通過轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)化分開插入昆蟲的基因組。仔細分析產(chǎn) 生的株將引起具有所需特征的候選株。可以將這些回交以導致雌性致死（優(yōu)選fs-RIDL) 株產(chǎn)生雙純合子用于兩次插入。
[0205] 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可以將兩個系統(tǒng)與條件雌性-特異的致死構建體 組合在單個DNA構建體上。該構建體將因此既提供遺傳雌雄鑒別也提供雄性不育。
[0206] 精子自然發(fā)生是細胞分化的高度專化的過程，其導致用于成功繁殖的功能精子的 形成。理論上，精子自然發(fā)生的過程在所有有性繁殖的生物中是良好保守的，盡管成熟精 子的大小和形狀在不同物種間十分不同。很多細節(jié)在哺乳動物和果蠅（Drosophila)之間 是類似的，使得果蠅成為研究生育缺陷的非常好的模型系統(tǒng)。像哺乳動物的生殖細胞，果蠅 (Drosophila)生殖細胞，在胚胎發(fā)育的早期被預留出來并通過后腸原基遷移入胚胎內(nèi)部， 在那里，它們加入胚胎性腺的體部（Zhao和Garbers, 2002)。在第三幼蟲齡的最后和蛹化 的開始，第一生殖細胞進入減數(shù)分裂。精子自然發(fā)生是成熟階段過程中的連續(xù)過程并且，因 此，成體精巢含有從干細胞到成熟精子的所有階段。
[0207] -般而言，對于精子自然發(fā)生中的雄性（昆蟲）生殖系細胞，轉(zhuǎn)錄在減數(shù)分裂前短 暫關閉（Fuller, 1993)?？梢杂幸恍┲筠D(zhuǎn)錄的基因（Barreau等人，2008)，但是這些是例 外的。一般而言，但在減數(shù)分裂時或減數(shù)分裂后需要其產(chǎn)品的基因在減數(shù)分裂前轉(zhuǎn)錄；之 后儲存和翻譯mRNA，即當需要時，例如轉(zhuǎn)錄后。之后在翻譯后典型地mRNA降解。很多基因 遵循此模式；實例包括3 2-微管蛋白和魚精蛋白，還有減數(shù)分裂調(diào)節(jié)劑twine。這些當中， twine蛋白是進入減數(shù)分裂所需的，3 2-微管蛋白是減數(shù)分裂紡錘體和減數(shù)分裂后鞭毛所 需的；魚精蛋白嚴格是減數(shù)分裂后所需的。因此，可以提供時機的適當控制。
[0208] 理論上通過影響（例如殺死）精子自然發(fā)生所需的精巢中的體細胞（例如包囊細 胞），或通過在雄性中影響激素產(chǎn)生等或（稍微更有希望）表達或消除精液中的因子破壞 精子產(chǎn)生應該是可能的。然而，此種方法將至多確定產(chǎn)生至多無精子雄性，或明顯異常的精 子。為了此原因，我們試圖集中于雄性生殖系表達。
[0209] 牛葙系啟動子序列
[0210] 因此，可以容易制備單基因表達構建體，其將在雄性生殖系中表達研究的基因 ("效應物"）。已經(jīng)在果蠅Orosophila)中鑒定了很多基因，其在精子自然發(fā)生過程中 表達并且這些中的很多是生殖系，或雄性生殖系特異的。此種表達數(shù)據(jù)可容易直接從文獻 獲得；還有大規(guī)模的項目（Chintapalli等人，2007)和http://www.flyatlas.org/)對果 蠅（Drosophila)基因組中的很多基因進行表達分析（例如FlyAtlas(Chintapalli等人， 2007)和http://www.flyatlas.org/，果妮（Drosophila)精巢表達數(shù)據(jù)庫（www.fly-ted. org)和在FlyBase上整理的數(shù)據(jù)，例如http://flybase.bio.indiana.edu/)。因此可以如 下制備表達構建體：
[0211] (1)鑒定合適的精巢-表達的基因，例如@2-微管蛋白，其編碼微管蛋白的雄 性-生殖系-特異的同種型（Nielsen等人，2001)(近期的報道（Jattani等人，2009)，表 明32-微管蛋白的表達和功能可以不嚴格限制于果蠅（Drosophila)中的雄性生殖系，然 而來自R比亞按蚊（An.gambiae) 0 2-微管蛋白的啟動子片段用于表達有效的核酸酶，已 知其切割岡比亞按蚊（An.gambiae)基因組中的序列，除了在雄性生殖系和在由來自此種 雄性的精子受精的胚胎中之外無明顯影響）；
[0212] (2)分離基因的野生型拷貝；
[0213] (3)用效應物基因替代基因的編碼區(qū)域；和
[0214] 4)使轉(zhuǎn)基因昆蟲攜帶該基因。
[0215] 通過該方法在果蠅（Drosophila)中使用一系列參與精子自然發(fā)生的基因比如 魚精蛋白，例如donjuan和sneaky,實現(xiàn)突光蛋白報道分子的雄性-生殖系-特異表達 (Raja和Renkawitz-Pohl，2005;Santel等人，1997;Wilson等人，2006)。0 2-微管蛋白 是良好的保守基因，因此對此方法的延伸，在步驟2中從研究的物種（或相關物種，比如岡 比亞按蚊（Anophelesgambiae)分離適當基因用于在史氏按蚊（Anophelesstephensi) 中使用（Catteruccia等人，2005))，將允許在任意選擇的節(jié)肢動物物種中使用。該方法已 經(jīng)實質(zhì)上成功用于在包括地中海果蠅（Malacrida等人，2007)，埃及伊蚊（Aedesaegypti) (Maynard-Smith等人，2007)和網(wǎng)比亞按蚊（Anophelesgambiae)(Catteruccia等人， 2005)的一些物種中雄性-生殖系-特異表達熒光蛋白報道分子，它們所有都使用來自 目標物種的0 2-微管蛋白的啟動子片段，除了Catteruccia等人使用來自網(wǎng)比亞按蚊 (Anophelesgambiae) 0 2-微管蛋白的啟動子片段在史氏按蚊（Anophelesstephensi)中 驅(qū)動精子自然發(fā)生-特異表達熒光蛋白。
[0216] 將"精子致死性"與條件表達系統(tǒng)聯(lián)合使用以通過在容許的條件下生殖保證轉(zhuǎn)換。 該條件可以是溫度，例如通過溫度-敏感蛋白效應物產(chǎn)生效果。然而，基于溫度的條件系統(tǒng) 傾向于例如"有滲漏"。TSL雌雄鑒別地中海果蠅（Medfly)株（Casares，2002)，基于外部施 加分子（例如RU486/米非司酮（mifepristone) (Osterwalder等人，2001))的存在/缺失 的系統(tǒng)可以使備選的。然而，其不適于二元表達系統(tǒng)（Brand等人，1994 ;Brand和Perrimon， 1993 ;Fussenegger，2001;Fussenegger等人，2000;Gossen和Bujard，1992;Gossen和 Bujard,2002;Victorinovd和Wimmer,2007)。
[0217] 另一方面，Tet-關或Tet-開系統(tǒng)是選擇的方案（Gossen和Bujard, 1992;Gossen 和Bujard，2002)。該系統(tǒng)依賴于條件地驅(qū)動合適基因（效應物）的表達的轉(zhuǎn)錄因子的表 達。在tet系統(tǒng)中，合成的轉(zhuǎn)錄因子tTA(或其變體，包括rtTA)的結(jié)合受四環(huán)素和/或相 關化合物比如氯四環(huán)素或多西環(huán)素濃度影響。在tet-關表達系統(tǒng)中，tTA對tetO的結(jié)合 被四環(huán)素抑制，因此效應物的表達被四環(huán)素抑制，從而"Tet-關"。由鏈陽菌素調(diào)控的類似 的表達系統(tǒng)也是已知的（Fussenegger等人，2000)。然而，在0 2-微管蛋白的控制下的tTA 的表達，例如，將不導致效應物的顯著表達，甚至在缺少四環(huán)素的情況下。這是因為tTA的 表達將基本上在減數(shù)分裂后（更確切地，基本上在減數(shù)分裂前的轉(zhuǎn)錄關閉之后），并且因此 太遲以不能驅(qū)動效應物的表達，甚至在缺少四環(huán)素的情況下。
[0218] 關鍵是理解在節(jié)肢動物并且尤其是在昆蟲精子自然發(fā)生種基因表達的時機。在減 數(shù)分裂起始后基本上無基因表達。因此，為了使用二元表達系統(tǒng)比如tet-關（或tet-開）， 序列-特異轉(zhuǎn)錄因子（tTA)的轉(zhuǎn)錄必須在減數(shù)分裂之前足夠遠以允許在減數(shù)分裂之前積累 tTAmRNA，翻譯tTA蛋白和tTA-依賴地轉(zhuǎn)錄效應物。在精子自然發(fā)生過程中表達的大多數(shù) 基因在精母細胞中（即在減數(shù)分裂前）轉(zhuǎn)錄，但然后當實際需要蛋白產(chǎn)物時翻譯。對于參 與精子分化或功能的多數(shù)蛋白（和因此多數(shù)精子蛋白），這意為在減數(shù)分裂后翻譯。因此， 為了我們的目的的合適的表達意為tTA的早期轉(zhuǎn)錄和早期翻譯。這不是被廣泛認可的，并 且也不易實現(xiàn)。因此，我們第一個發(fā)現(xiàn)這里存在問題。
[0219] 可以使用異源序列，而不是源自精巢-表達的基因的序列構建合適3'UTR，例如也 可以保留精巢-表達的基因的編碼區(qū)域的全部或部分。雄性-生殖系-特異地表達熒光蛋 白報道分子已經(jīng)通過該方法在果蠅Orosophila)中使用一系列參與精子自然發(fā)生的基因 比如魚精蛋白，例如donjuan和sneaky實現(xiàn)（Raja和Renkawitz_Pohl，2005;Santel等 人，1997 ;Wilson等人，2006)。類似地，5'UTR可以用異源序列替代以避免在減數(shù)分裂后 翻譯。五個主要的非翻譯區(qū)（5'UTR)，可以包含用于通過例如調(diào)控元件的方式控制基因表 達的序列。已經(jīng)將啟動或抑制翻譯起始或5'UTRs內(nèi)的內(nèi)含子的序列基因表達和mRNA輸 出的調(diào)控相關聯(lián)（Cenic等人，2011)。其在轉(zhuǎn)錄起始位點開始并且在編碼區(qū)域的起始密碼 子（通常AUG)之前一個核苷酸（nt)終止。
[0220] 為了獲得tTAV和效應物基因各自的足夠表達，換句話說，為了獲得"精子致死 性，"我們用來自hsp83(Theodoraki&Mintzas，2006)和SV40(猴空泡形成病毒（Simian vacuolatingvirus) 40 或猴病毒（Simianvirus) 40)(Cheng等人，2009)的相應序列分別 替代（在第二表達單元的上游調(diào)控元件中）0 2-微管蛋白基因的5'UTR，和在一些情況下 3'UTR，參見本文的討論和本實例。
[0221] 換句話說，優(yōu)選的5'UTR來自hsp83。這優(yōu)選來自地中海果蠅（Medfly)，因為它 是我們在具體實例中使用的，但是來自其它物種的同源物也是優(yōu)選的。優(yōu)選的3'UTR來自 SV40,但是也可以來自hsp83(如上文對于5'UTR的物種）。然而，我們發(fā)現(xiàn)5'UTR的選擇 比3'UTR的選擇更重要。
[0222] 反式激活子（這里以tTA為例）的更早表達，也可以通過以下方法中的任一個實 現(xiàn)。一個實例是通過鑒定在精子自然發(fā)生中更早作用的啟動子。這意為啟動子作用從而在 該啟動子控制下表達的轉(zhuǎn)錄因子，例如tTA將能夠驅(qū)動tTA-響應性效應物構建體的表達。 我們偏愛這不是在生殖系干細胞中基本上活化的啟動子，因為此種基因（例如vasa)在未 成熟階段表達；這將傾向于導致效應物的表達（在誘導的或去抑制的條件下）在發(fā)育的很 早期表達，可能導致對生殖系的損害或生殖系的喪失并且因此不產(chǎn)生或產(chǎn)生更少的配子。 如果所述表達系統(tǒng)在發(fā)育中晚些誘導（或去抑制），精子自然發(fā)生的時間過程，即干細胞分 裂和成熟精子的產(chǎn)生之間（在果蠅（Drosophila)中為幾天），會導致對誘導（或去抑制） 的緩慢反應（例如不育）；該效果由雄性儲存精子的能力復合。
[0223] 我們因此偏愛使用來自在精原細胞或初級精母細胞中表達的基因的啟動子元件。 如上文討論的，很多在初級精母細胞中表達的基因參與之后的功能并且在減數(shù)分裂后翻 譯，因此我們偏愛具有減數(shù)分裂前功能的基因（和來自基因的啟動子）。特別優(yōu)選的基因類 型是編碼轉(zhuǎn)錄因子，或轉(zhuǎn)錄復合體的組分的那些，其參與精子自然發(fā)生基因（例如之后作 用的基因）的表達。偏愛此種基因的關鍵原因是，幾乎通過限定，在精子自然發(fā)生中足夠早 表達（以蛋白水平），從而能夠驅(qū)動其它基因的減數(shù)分裂前表達（當然此種復合體的負調(diào)控 元件也是優(yōu)選的，重要的是表達的時機，而不是翻譯的蛋白的特異功能）。
[0224] 已知此種基因的一些類型。然而，如下文討論的，不是所有都是合適的并且一些相 對其它的是優(yōu)選的。類型包括can-類型的減數(shù)分裂停止基因。該類型包括can，mia，sa， nht和rye;這些編碼廣泛表達的TATA-結(jié)合蛋白相關因子（TAFs)精巢特異的旁系同源物 (Hiller等人，2004)。其它類型是減數(shù)分裂停止基因的aly-類型。這些包括aly，comr, achi/vis,topi和tomb,其編碼序列特異的DNA結(jié)合蛋白和與稱為dREAM或Myb-MuvB的廣 泛表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合體旁系同源的相關因子的復合體的組分（Beall等人，2007;Jiang 等人，2007 ;Jiang和White-Cooper，2003 ;White_Cooper等人，2000)。這些基因中的大多 數(shù)似乎通過保守的'體'基因（例如在體系或生殖系中都行使功能的祖先TAFs或Myb-MuvB 組分）的復制而呈現(xiàn)，然后?；@些版本為生殖系-或雄性生殖系特異的表達和作用。這 些復制中的一些似乎在進化中相對近期發(fā)生，意味著生殖系-特異的種內(nèi)同源基因以可 變的，并且在一些情況下非常有限，種系發(fā)生的/分類學范圍存在。我們偏愛使用從果蠅 (Drosophila)到研究的物種都保守的基因的啟動子，并且特別偏愛橫跨寬種系發(fā)生/分類 學范圍保守的基因的啟動子；該保守使鑒定同源物更容易，并且使特異基因更普遍有用。
[0225] 可以以以下兩種方式中的一種鑒定此種（保守早期作用）基因：
[0226] Li甬丄寸與侈il々口來自果也黽（Drosophila)的已知基因同源，以具有合適表汰模式矛口 水平。
[0227] 這通過在序列數(shù)據(jù)庫中同源性檢索獲得。然而，一些精子自然發(fā)生基因正 在快速進化，并且特異同源物不能容易地橫跨寬的種系發(fā)生范圍而被鑒定。例如， bag-of-marbles(bam)滿足上文的早期表達的標準-bam在精原細胞中表達（并且也在卵 子發(fā)生中表達）并且早期行使功能-其參與調(diào)節(jié)精原細胞的有絲分裂數(shù)量（Gonczy等人， 1997 ;Kawase等人，2004)。此外，bam啟動子的片段已經(jīng)成功用于果蠅（Drosophila)的 精子自然發(fā)生（并且也在卵子發(fā)生）的二元表達系統(tǒng)（GAL4/UAS) (Jiang等人，2007)。然 而，bam僅在果蠅（Drosophilid)中可被識別。具有類似表達模式的其它基因（其基因產(chǎn) 物被認為與bam的產(chǎn)物相互作用）是良性性母細胞腫瘤（benigngonialcellneoplasm, bgcn)。不幸的是，該基因也不是跨昆蟲良好保守的；兩種基因都顯示正選擇和快速進化的 信號（BauerDuMont等人，2007)。
[0228] 對于can-類型和aly-類型減數(shù)分裂停止基因的一些成員也產(chǎn)生困難。他們中的 很多似乎源自據(jù)推測既用于體細胞也用于生殖系細胞的祖先基因的復本。所述生殖系版本 傾向于快速進化，從而體旁系同源物比生殖系旁系同源物更容易被鑒定。此外，導致果蠅 (Drosophila)中這些體/生殖系基因?qū)Φ膹捅鞠盗兴坪醢l(fā)生在雙翅目從其它目昆蟲的趨 異之后，因此大多數(shù)這些基因的生殖系-特異的種內(nèi)同源基因不存在于雙翅目之外，并且 它們中的一些僅存在于高等雙翅目中。
[0229] 然而，例外的確存在；這些容易通過與來自其它目的昆蟲（例如意蜂（Apis mellifera)，赤擬谷盜（Triboliumcastaneum)，家香（Bombyxmori)-基因組的大部分已經(jīng) 被測序的昆蟲的列表快速增加并且容易由本領域技術人員評估）序列比較而鑒定。此種基 因的一個實例是matotopetli(topi) (aly-類型基因），其編碼在雙雜篩選中鑒定為結(jié)合其 它aly-類型蛋白（Comr)的，推定的序列-特異DNA結(jié)合蛋白并且因此據(jù)推測是精巢-特異 的Myb-MuvB復合體的組分。在果蠅（Drosophila)和網(wǎng)比亞按蚊（Anophelesgambiae)中 鑒定了Topi同源物（Perezgasga等人，2004);通過公共序列數(shù)據(jù)庫的序列相似性檢索，我 們也在一些其它目的昆蟲，包括鞘翅目（Coleoptera)(赤擬谷盜（Triboliumcastaneum)， NW_001092862. 1)，膜翅目（Hymenoptera)(意蜂（Apismellifera)，NW_001253507. 1)中鑒 定了同源物。因此Topi是具有合適表達模式的良好保守基因的實例（基于（i)FlyAtlas上 和別處的定量rtPCR數(shù)據(jù)；（ii)在初級精母細胞中，尤其是早期初級精母細胞中由RNA原 位雜交顯示的發(fā)育表達模式（Perezgasga等人，2004) ;(iii)預測的作為雄性生殖系-特 異轉(zhuǎn)錄復合體的部分的功能（Beall等人，2007 ;Perezgasga等人，2004) ;(iv)通過突變體 表型分析的實際功能影響許多其它精子自然發(fā)生基因的表達（Perezgasga等人，2004))。
[0230] 也可以通過以下方法鑒定具有早期作用啟動子的基因：
[0231] 2.從目標物種詵擇的某閔的同源物鑒定
[0232] 來自與研究的物種具有更大或更小種系發(fā)生距離的物種的相關序列的比對將鑒 定可能在目標物種的研究的基因中保守的區(qū)域。優(yōu)選，為了富集研究的基因并避免內(nèi)含子 的問題，將使用來自提取自雄性的RNA的cDNA，最優(yōu)選來自解剖的精巢。合適的啟動子片段 可以從所研究基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的克隆片段獲得。
[0233] 合適啟動子片段的候選物在轉(zhuǎn)錄起始的5'包含至少50個核苷酸堿基的基因組 DNA，并且優(yōu)選，轉(zhuǎn)錄由自身起始并且轉(zhuǎn)錄區(qū)域的至少1個核苷酸。這將包含啟動子片段和 報道分子的開放閱讀框。其還可以包含5'和3'UTR序列，或者來自與啟動子片段相同的基 因，或者來自其它區(qū)域。如果基因被正確地鑒定為在精子自然發(fā)生中是活化的，來自相同基 因的那些可能在精子自然發(fā)生中行使功能，然而他們也可以包含信號，例如用于延遲的翻 譯，這對于必須在減數(shù)分裂前行使功能的蛋白（比如tTA)的表達將是不希望的。來自與啟 動子片段相同的基因的調(diào)控序列因此對于功能已知或被認為是（例如通過同源性）減數(shù)分 裂前的（例如topi)的基因是優(yōu)選的，但是異源調(diào)控序列對于功能已知或被認為減數(shù)分裂 的或減數(shù)分裂后的基因是優(yōu)選的。
[0234] 為了我們工作的目的，本實施例中，我們分離并測試了具有不同效應物蛋白的，來 自地中海果蠅（C.capitata)和埃及伊蚊（A.aegypti)的topi啟動子序列。
[0235] 產(chǎn)生后期精子表型的蛋白效應物
[0236] '后期'這里意為在需要精子功能的點（例如轉(zhuǎn)移至雌性或進入卵）之后。目的 是產(chǎn)生轉(zhuǎn)移至雌性的精子并且將誘導雌性中對再交配的不應態(tài)，并且如果雌性的確再交配 將在精子競爭方面做好。當雌性與多于一個雄性交配時，精子競爭發(fā)生，或能夠發(fā)生；在 此情況下，哪個雄性生育，雌性胚胎的比率是什么的問題產(chǎn)生?？赡懿晦D(zhuǎn)移精子的雄性在 此種情況下將做得不好。由于對于使用無精子，或具有不能轉(zhuǎn)移至雌性的精子，或具有轉(zhuǎn) 移至雌性后不能與其它精子競爭的精子的雄性的進化反應的可能（likelihood)或概率 (possibility)，為了生物控制的目的，需要設計的確產(chǎn)生精子，這些精子能夠轉(zhuǎn)移至雌性 并在轉(zhuǎn)移至雌性后能夠與其它精子競爭的不育雄性。
[0237] 父本效應致死
[0238] 我們的途徑，我們青睞的實現(xiàn)"不育"的方法是構建父本效應致死，其中精子進入 卵，但是無可成活受精卵（能夠發(fā)育為可育成體）形成。優(yōu)選地，該效果由具有單拷貝的父 本效應致死的雄性產(chǎn)生，盡管使用多拷貝也是可預見的。將雄性純合釋放到環(huán)境中用于條 件父本效應致死是特別是優(yōu)選的，這樣在飼養(yǎng)過程中株基本上穩(wěn)定。本發(fā)明的父本效應致 死（Pals)典型地影響由攜帶至少一個拷貝Pal的雄性產(chǎn)生的精子中的全部或大多數(shù)。尤 其，所述受精卵可以受不利影響，例如基于親本的基因型被殺死，被絕育或其發(fā)育（例如性 別表型被改變。這與RIDL相反，其中對受精卵的影響基于胚胎基因型。因此，對于在單個 位置的RIDL構建體，野生型雌性和雄性雜合之間交配的后代將典型地產(chǎn)生?50%正常后 代和經(jīng)遺傳獲得RIDL構建體并可以受其影響的?50%。相反，對于Pal，雄性雜合的所有 后代都可以受影響。
[0239] -些類型的基于蛋白的效應物是可預見的。蛋白或RNA效應物可以隨精子被傳輸 以影響卵或發(fā)育的受精卵。這些可以在精子表面（例如如果蠅（Drosophila)性肽，SP)， 或在其內(nèi)部產(chǎn)生和儲存。精子自然發(fā)生的其它階段的精子和細胞，對一些類型的蛋白，例如 促凋亡蛋白有顯著抗性，據(jù)推測因為凋亡途徑被指定于精子自然發(fā)生中的其它目的（Arama 等人，2003 ;Cagan，2003)。
[0240] 優(yōu)選所述效應物對精子具有直接的生物化學效果，而不是僅使用精子作為通過其 進入卵的載體（并隨后在那里具有效果）。這是由于考慮到可能的抗性。在SIT-類型計劃 中，在人工飼養(yǎng)設施中產(chǎn)生釋放的雄性，從而它們和它們的基因型在一定程度上在控制下， 或與可能從相同物種的野生群體被鑒定或排除相比，至少變異可以可能更容易被鑒定或排 除。作用于卵（或發(fā)育中的受精卵）的生物化學效果可以可能通過那個卵中的改變被改變 或緩和；如果這些可遺傳，那么至少存在可能的對產(chǎn)生該生物化學效果的毒素的可遺傳抗 性的基礎。相反，在其進入卵之前（或在其進入雌性之前），難以看到母系或合子基因型怎 樣能夠補償已經(jīng)對精子進行的至少一些類型的損害。此種損害的一個實例是對精子包含 的遺傳信息的損害，其它實例（盡管可能關于母系/合子基因組補償能力具有較弱的確定 性），包括早期過程的關鍵組分的喪失或損害比如例如精子膜破裂或精子核去凝縮，或中心 體功能。
[0241] 父本效應致死的一種優(yōu)選類型是核酸酶。盡管精子對受精卵貢獻很多東西，一個 關鍵的東西是遺傳信息。如果該遺傳信息被損害到部分或（優(yōu)選）基本上所有受精卵不可 成活的程度，那么這形成通過父本效應致死性的不育的合適形式的基礎。如例如在常規(guī)不 育昆蟲技術中使用的輻射-絕育是條件（在通過輻射可誘導的情況下）父本效應致死性的 實例；用化學不育劑，例如噻替派（thiotepa)的絕育是另一個。這些方法中的每個通過損 壞精子中DNA，從而降解攜帶至很多受精卵死亡的點的遺傳信息，而產(chǎn)生效果（Robinson， 2005)?；瘜W不育劑比如噻替派（thiotepa)和bisazir，例如，可以留下毒性殘留并且通常 認為對于廣泛使用是不可接受的。
[0242] 在精子中，或在精子自然發(fā)生過程中合適核酸酶的合適表達，將具有破壞配子的 遺傳信息，或產(chǎn)生配子而不類似地破壞雄性體細胞的遺傳信息的效果。這將降低與絕育過 程相關聯(lián)的使雄性失能的程度。相反，使用輻射或化學不育劑典型地大致相等地將所有細 胞暴露于絕育劑。
[0243] 合適的核酸酶是切割DNA，優(yōu)選產(chǎn)生雙鏈損傷的那個。影響遺傳信息的儲存或解 釋，或例如通過細胞DNA修復機制導致直接切割或修飾DNA的DNA-修飾酶，在此也歸類為 核酸酶；將理解對'切割'DNA的引用，例如，因此適當包括'修飾'DNA。
[0244] 合適的表達是條件表達，從而在限制性條件（對于可育性，顯然這些是表達核酸 酶的容許條件）下，來自攜帶至少一個拷貝的包含核酸酶父本效應致死系統(tǒng)的雄性（'PAL 雄性'）的至少30%，優(yōu)選多于50%和最優(yōu)選> 90%的精子不能使卵受精以形成能夠存活 以在典型地飼養(yǎng)條件，例如如在野外建立的條件，或近似于野外建立的條件的實驗室條件 下產(chǎn)生可育成體的可成活受精卵。相反，在容許條件下（對于可育性），相當?shù)腜AL雄性應 該比限制性條件顯著產(chǎn)生更多的可成活受精卵；優(yōu)選至少50%的受精卵應該存活。
[0245] 優(yōu)選地，在雄性表達中核酸酶基本上受限于生殖系。在這可以意為表達基本上限 制于雄性生殖系的同時，這不是關鍵的。對于一些應用，排除雌性是所需的（例如SIT中的 遺傳雌雄鑒別（Alphey，2007 ;Franz，2005))。在雌性被排除掉的情況下，在雌性中表達核 酸酶可以不是不可取的。實質(zhì)上，如果用于排除，或幫助排除雌性，其可以是所需的。這會 是可能的'雙重用途'的實例-使用核酸酶既作為PAL也作為（合子）顯性致死以殺死一 些或全部雌性。已知很多核酸酶。相關類型包括限制性核酸內(nèi)切酶和鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激 活劑樣效應物（TALE)核酸酶（Hockemeyer等人，2011 ;Mahfouz等人，2011 ;Miller等人， 2011)和歸巢核酸內(nèi)切酶。不同類型和一類中的不同成員在或接近它們切割的位點處顯示 不同水平的序列特異性。理論上，具有很高程度序列特異性的酶將在每個基因組的相對小 量的位點切割，可能僅有一個。這不是優(yōu)選的，因為其允許通過目標位點的突變或改變導致 的抗性的可能性。在特異序列重復很多次的情況下，從而盡管對于相對長的識別序列有相 對高程度的特異性，在基因組中存在多個位點，這是更可接受的。然而，我們偏愛核酸酶在 每個基因組具有多個目標位點。這意為識別對于名義上的目標序列不完全特異性的，然而 以多個拷貝存在于基因組中的相對長的序列或相對短的識別序列或目標序列內(nèi)顯著程度 的冗余，或?qū)嵸|(zhì)上具有很小或根本無序列特異性的核酸酶。I-Ppol是這種類型，具有長的識 別序列，但是其在rDNA的高度保守區(qū)域內(nèi)，其存在于每個基因組的多個拷貝中。I-Ppol另 外進一步討論。
[0246] 已經(jīng)描述了鋅指核酸酶（ZFNs)，其中各個鋅指提供對短核苷酸序列，例如3核苷 酸的序列-特異性結(jié)合。因此通過將多個此種鋅指組合在單個蛋白中可以提供更高的親和 力和更大的序列特異性。如果將這與核酸酶，例如限制性核酸內(nèi)切酶FokI的核酸酶結(jié)構域 組合，人工的序列-特異性核酸酶可以被構建，其具有任意的序列特異性（Kim等人，1996)。 此種合成的鋅指核酸酶已經(jīng)被開發(fā)用于基因治療的目的，例如（Urnov等人，2005)。相當 大的嘗試已經(jīng)轉(zhuǎn)向例如改善其特異性，以減少對基因組中單個位點的切割，（Miller等人， 2007)。在果蠅（Drosophila)的實例中，鋅指核酸酶當在轉(zhuǎn)基因果蠅中表達時產(chǎn)生，特異損 害目標位點，例如yellow和之后還有rosy和bw位點（Beumer等人，2006 ;Bibikova等人， 2002)。觀察到不想要的副作用，其是使用的一些ZFN的高水平表達有毒性。進一步顯示該 毒性依賴于核酸酶，而不是毒性ZFN的DNA結(jié)合活性（Beumer等人，2006)。盡管不是基因 靶向所需，該更廣泛的特異性對于我們在一些或很多位點產(chǎn)生損害的目的是有吸引力的。
[0247] 使用歸巢核酸內(nèi)切酶（HEGs)通常不是優(yōu)選的，因為它們傾向于識別相對長的 (15_40bp，盡管常接受對普通目標序列的一些錯配）核苷酸序列，其因此在很多昆蟲基因 組中即使真的有也很少發(fā)生。可接受識別/切割位點的最小數(shù)量是每個二倍體基因組一 個；每個單倍體基因組一個是優(yōu)選的并且每個單倍體基因組識別/切割多個位點是特別優(yōu) 選的。可能不適當?shù)腍EG的實例是I-Scel。最初分離自酵母（釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))線粒體的I-Scel已經(jīng)作為允許或促進靶向的同源重組的系統(tǒng)的部分用于果 蠅（Drosophila)(Gong和Golic，2003;Rong和Golic，2000 ;2001;Rong等人，2002)。對于 那個同源重組系統(tǒng)的I-Scel的一個有吸引力的特征恰恰是I-Scel不容易切割黑腹果蠅 (Drosophilamelanogaster)基因組中的任何內(nèi)源序列，并且將因此傾向于在轉(zhuǎn)基因上插 入物的設計的位點處特異切割。盡管一些其它昆蟲基因組可以偶然具有一個以上被I-Scel 識別的位點，該酶對于本發(fā)明中的使用通常不是優(yōu)選的。每個基因組切割多個位點的歸巢 核酸內(nèi)切酶的一個實例是Ppol。盡管它具有相當特異的，長識別位點，其對應于rDNA基因 中高度保守的序列。因為在所有真核基因組中存在該rDNA基因的多個拷貝，多個目標位點 可用。存在可能的借以'有抗性'，即對Ppol-介導的切割有抗性的機制，比如基因轉(zhuǎn)變，此 種基因的突變可以通過rDNA序列散布，然而存在足夠拷貝的此種抗性基因組的風險（其 中這些位點全部或幾乎全部變得有抗性）似乎相當?shù)偷牡男蛄?。已?jīng)顯示I-Scel和Ppol 在蚊子（R比亞按蚊（Anophelesgambiae))組織培養(yǎng)細胞中都行使功能（Windbichler等 人，2007);因為研究者可以預期Ppol的表達對細胞有害，導致細胞增殖停止，然而I-Scel 是相對無害的。歸巢核酸內(nèi)切酶一種類型的自私DNA元件，其可以通過真菌群體（它們從 中被鑒定）擴散。在動物中無已知的歸巢核酸內(nèi)切酶，但是有人建議它們的異常性質(zhì)（切 割同源的不攜帶HEG的染色體并且通過細胞的DNA修復機制復制于其中（Burt和Trivers， 2006))可以用于構建'基因驅(qū)動'系統(tǒng)（Burt，2003);已經(jīng)使用I-Scel和人工目標位點完 成了原理驗證（Windbichler等人，2011)?；蝌?qū)動系統(tǒng)是通過其中要擴散的基因不賦予 簡單的選擇優(yōu)勢的目標群體例如野生群體擴散基因的系統(tǒng)（例如Alphey等人，2002)。
[0248] 除了 '常規(guī)'使用HEG作為基因驅(qū)動系統(tǒng)（其類似它們的天然擴散系統(tǒng)并包括將 HEG復制入切割的DNA)外，有人還建議特異切割X染色體的位于Y染色體上的HEG可能產(chǎn) 生雄性，其中僅可成活配子是攜帶Y的（Deredec等人，2008)。
[0249] HEGs典型地識別15_40bp的目標位點。ZFNs每個鋅指識別大致3bp。在典型的情 況中，ZFNs需要二聚化以切割DNA;這意為18bp的有效識別序列。特異的18nt序列將典 型地在418核苷酸（其是約7xl01(l核苷酸或7000Mb)中出現(xiàn)一次。為了比較，昆蟲基因組典 型地是數(shù)百Mbp，并且人基因組為約3000Mbp，因此此種序列將典型地出現(xiàn)0-1次/基因組。 當然這是簡化的計算，并且忽略了GC含量，重復DNA等的影響，但是基本點仍然保持，即此 種長識別序列的特異性對于需要特異性的目的，比如基因治療和基因靶向是所需的，但是 具有更短識別序列的分子對于兩次以上切割基因組的目的通常是優(yōu)選的。
[0250] 一個此種類型的酶是限制性核酸內(nèi)切酶。這些典型地具有4-10bp的識別位點， 其將典型地切割真核基因組很多次（41(1為大致lxlO6)。一些限制性核酸內(nèi)切酶對底物DNA 的甲基化狀態(tài)敏感；對甲基化不敏感或切割以目標基因組的原因特征修飾的DNA酶是優(yōu)選 的。例如，黑腹果蠅Orosophilamelanogaster)基因組DNA基本上是非甲基化的，因此酶 比如Dpnl(其僅切割腺甲基化的DNA)不是優(yōu)選的。相反，為了切割相同的序列（GATC)，備 選酶比如DpnII，MboI或Sau3AI將是優(yōu)選的。對甲基化不敏感的和已知核酸酶結(jié)構域在一 系列細胞類型以及體外行使功能的FokI，是特別優(yōu)選的。
[0251] 核酸酶需要部具有任何實質(zhì)的序列特異性。核酸酶的其它優(yōu)選類型是其中例如來 自FokI的核酸酶結(jié)構域，與DNA結(jié)合結(jié)構域（所述DNA結(jié)合結(jié)構域具有很少或不具有序列 特異性）組合的類型（盡管對于一些類型DNA相對于其它的一般偏好，例如對于富GC或富 AT區(qū)域或序列，是可接受的）。此種類型效應物的特別優(yōu)選的實例是魚精蛋白-核酸酶和 組蛋白-核酸酶融合。魚精蛋白-核酸酶融合的一些優(yōu)點在上文描述。兩種類型的核酸酶 結(jié)構域是可預見的。第一，需要結(jié)合至少一個其它蛋白（與其自身（同源二聚體）或與至 少一個不同蛋白（異源二聚體'二聚化'；將理解對于形成更大復合體，例如三聚體，四 聚體等的需要包括在本項中）以切割DNA的類型；第二，不需要這樣二聚化的類型。
[0252] 這些兩種類型之間的關鍵差異是它們的濃度/功能關系。不需要二聚化的酶將與 其濃度成比例而廣泛地行使功能。因此很低濃度將產(chǎn)生一些DNA損害或修飾；更高濃度將 產(chǎn)生更多。當條件表達系統(tǒng)產(chǎn)生相對少量的效應物時，這是有利的。精子自然發(fā)生的時間 過程可能產(chǎn)生效應物至少一些小時以作用，并可能更長。相反，的確需要二聚化的酶將典型 地具有非線性劑量反應的功能。特別是對于可以在基因組中很多位點結(jié)合的酶，在低濃度 不可能兩個酶分子將以如此種能夠切割的方式接觸。在更高濃度，可能遠超成比例的（典 型地對于同源二聚體以濃度的平方增加，對于同源三聚體以濃度的立方增加，等）。在例如， 所述條件表達系統(tǒng)有點滲漏，在除了在預期細胞中（例如除了在雄性生殖系，或作為其它 實例在其中預期的表達僅在精原細胞中或在精子自然發(fā)生的后期階段的雄性生殖系細胞 中之外）之外的至少一些細胞中產(chǎn)生低、非零水平的效應物的情況下，這可以是有利的。然 后該低'基本'表達應該相對無害，或至少在非目標細胞中在其活性方面相對其在目標中的 活性顯示超過線性的不同。
[0253] 其它相關類型的滲漏活性涉及條件表達系統(tǒng)的條件性-不可能應該是'關'的條 件將事實上產(chǎn)生零表達，因此擴大'開'和'關'狀態(tài)的表型差異的另外的系統(tǒng)，比如該系統(tǒng) 是所需的。注意，這些放大和可能的好處應用于其它類型的效應物。在核酸酶效應物內(nèi)，它 們應用于鋅指核酸酶以及應用于魚精蛋白-核酸酶等。尤其，F(xiàn)okI核酸酶結(jié)構域需要二聚 化以切割DNA。通常這通過同源二聚化。然而，已知改變這點的變體。所述兩種核酸酶結(jié)構 域可以包括在相同蛋白中，通過合適接頭連接，從而不需要二聚化（即分子內(nèi)，而不是分子 間的二聚化足以）。同樣，已知FokI的突變體，其中需要異源二聚化（Miller等人，2007)。 注意，不需要兩個二聚化結(jié)構域中的每個都具有核酸酶活性。這允許獲得更好特異性的其 它方法。需要異源二聚化的兩個（或更多）蛋白可以在分開的控制（例如轉(zhuǎn)錄控制，而且還 有例如翻譯或降解控制）下表達。僅兩種結(jié)構域都表達的細胞將具有顯著活性。因此，也 不容許其它蛋白的滲漏表達的細胞中一個蛋白的滲漏表達將具有很少的或不具有負作用。 實施例
[0254] 實施例1 :生殖系特異的啟動子
[0255] 為了測試分離的啟動子區(qū)域的適用性，熒光蛋白可以用作報道分子，并且特別是 四環(huán)素響應性轉(zhuǎn)錄激活劑（tTA)和熒光蛋白間的融合。這允許既允許蛋白表達的直接可視 化，而且還允許進一步測試由為了以在精子自然發(fā)生中行使功能的條件二元表達系統(tǒng)的部 分使用的特定目的的候選的合適啟動子片段引導的表達的時機和水平的適用性。來自此插 入物的報道分子的表達說明候選的合適啟動子片段的活性。評估一些此種插入品系允許確 定啟動子片段可能的適用性。由于'位置效應'，一些插入品系應該被檢測；插入基因表達憑 借的公知的現(xiàn)象是受其插入的染色質(zhì)環(huán)境影響（Wilson等人，1990)。
[0256] 如上測試所述候選的合適啟動子片段在雄性生殖系作為可以條件表達系統(tǒng)的部 分行使功能的實際能力，但是包括例如編碼tTA或相關序列合適的表達系統(tǒng)，或其相關組 分。在上文的報道分子測試中使用tTA-熒光蛋白（tTA-FP)融合允許使用用于兩種測試 的相同的插入品系，或插入品系組。容許從所述表達系統(tǒng)表達的條件下橫跨合適的品系， 例如tRE-X(其中X可以是效應物或報道分子），將允許確定所述表達系統(tǒng)（啟動子-tTA， tRE-X)在精子自然發(fā)生中是否行使功能和，例如通過對解剖的精巢的熒光顯微，確定X和/ 或tTA-FP在哪表達、何時表達和表達多少。抑制表達條件下的類似實驗將允許確定表達系 統(tǒng)是否是條件的。
[0257] 如果表達研究表明，候選的合適啟動子片段事實上不合適，研究者可以采用來自 相同基因的不同啟動子片段。此種改變的片段典型更長，因為原片段可以被刪除一些重要 的調(diào)控元件，然而在表達是特異的但在發(fā)育中太晚（例如減數(shù)分裂后）的情況下，即使啟動 子片段源自的基因被認為（例如基于RNA原位數(shù)據(jù)）足夠早期被轉(zhuǎn)錄，刪除一些元件，尤其 是UTR元件，以去除翻譯延遲信號可以是所需的。測試更長或更短的片段以鑒定對基因表 達水平和暫時的和組織特異性是必要的或影響基因表達水平和暫時的和組織特異性的啟 動子區(qū)域也可以是所需的；該方法已經(jīng)被廣泛用于分析啟動子并且可以簡單地用原候選啟 動子片段的變體通過重復上述過程實現(xiàn)。
[0258] RNA原位雜交實驗表明地中海果蠅（Medfly) 0 2-微管蛋白轉(zhuǎn)錄在地中海果蠅 (Medfly)精子自然發(fā)生的早期至晚期階段。假設地中海果蠅（Medfly) 0 2-微管蛋白轉(zhuǎn)錄 本與Dm3 2-微管蛋白類似的階段起始，其在減數(shù)分裂前并且從晚第三齡幼蟲期合成，之前 在發(fā)育的精巢中存在顯著減數(shù)分裂。已經(jīng)開發(fā)使用該基因啟動子的精子標記系統(tǒng)用于蚊 子史氏按蚊（Anophelesstephensi) (Catteruccia，Benton等人 2005)和埃及伊蚊（Ae. Aegypti) (Smith,Walter等人2007)，在我們針對精子致死性的研究時期過程中用于地中 海果蠅（Medfly) (Scolari，Schetelig等人2008)和之后用于加勒比果蠅，加勒比按實蠅 (Anastrephasuspensa) (Zimowska，Nirmala等人，2009)。據(jù)此，我們使用以下引物從地中 海果蠅（Medfly)基因組擴增了 0 2-微管蛋白啟動子：
[0259] 正向：CTCCCGTGCGATATCCTAGGCCCCATGTTACAAGGCTG(SEQIDN0 :53)
[0260] 反向：
[0261] AGCCATTTTGGTTAATTGAAATCCCTAAAATAAATGTAATTCATTTTTCG(SEQIDNO：54)
[0262] 構建體0X3671 (圖16)含有融合于DsRed2序列的地中海果蠅（Medfly) @ 2-微 管蛋白啟動子（1556bp啟動子片段擴增自地中海果蠅（Medfly)基因組DNA)。大多數(shù) Cc3 2-微管蛋白3'-UTR序列被刪除或由通常使用的3' -UTR-SV40(已知在多個物種中表 達）替代。表達轉(zhuǎn)基因應該導致在適當激發(fā)濾光片下精子發(fā)紅色熒光。DsRed2表達在獲得 的所有三個品系中的轉(zhuǎn)基因雄性腹部是明顯可見的，其中兩個區(qū)域具有更強的熒光，看似 精巢（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0263] 為了進一步評估DsRed2標記在精子中是否表達，解剖性成熟轉(zhuǎn)化的雄性的精巢。 結(jié)果表明，與來自野生型雄性的精子相比，成熟精子呈現(xiàn)強烈的DsRed2表達。在與B2-微 管蛋白表達模式的比對中，早期精母細胞不呈現(xiàn)熒光，其在精子自然發(fā)生的精細胞階段開 始明顯可見。
[0264] 為了測試使用二元"tet-關系統(tǒng)"我們是否會獲得類似的熒光表達模式，建立兩個 熒光報道分子構建體；〇X3866(圖14) (tet〇-微型啟動子-DsRed2-mls)和0X3867(圖15) (與DsRed2融合的tet〇-微型啟動子-魚精蛋白）。tet〇-微型啟動子元件公認為tRE并 且是優(yōu)選的。在〇X3866(圖14)中，DsRed2報道分子融合于膜定位信號（mls)，預測其導致 表達后任何表達的熒光蛋白為膜結(jié)合或相關的，然而在0X3867 (圖15)中，DsRed2融合于 果蠅（Drosophila)魚精蛋白。以驅(qū)動體細胞中tTAV表達的啟動子測試兩種報道分子基因 并且發(fā)現(xiàn)是有功能的。
[0265] 按照P2-微管蛋白啟動子驅(qū)動精子中DsRed2表達的研究結(jié)果，盡管對于我們的 目的來說太晚，以驅(qū)動tTAV-熒光融合基因的地中海果蠅（Medfly) 0 2-微管蛋白啟動子設 計構建體0X3831 (圖20)并從0X3671 (圖16)修飾。在該構建體中，在tTAV蛋白將隨后在精 子自然發(fā)生過程中更早期表達的推測下，果蠅（Dr〇S〇phila)aly5'UTR區(qū)域替代了 02-微 管蛋白啟動子的5'UTR區(qū)域。因為TurboGFP序列與tTAV融合，0X3831 (圖20)轉(zhuǎn)基因雄 性的精子應該在適當?shù)募ぐl(fā)濾光片下呈現(xiàn)綠色熒光。為了測試這點，解剖來自七個轉(zhuǎn)基因 品系的成體雄性并在熒光顯微鏡下觀察。盡管熒光表達在未解剖的雄性的精巢中不容易看 至IJ，但在解剖的0X3831 (圖20)成體雄性的精巢中，熒光表達在精細胞束中可見。一些品系 比其它品系表達更強熒光，但是0X3831 (圖20)株中的所有精細胞呈現(xiàn)熒光精巢-特異的 精子標記表達。
[0266] 0X3831-雜合蠅與 0X3866-和 0X3867-雜合蠅（分別為圖 14 和 15) (tet〇-DsRed2 株）雜交。將多于20只以無四環(huán)素食物飼養(yǎng)的（即tet〇-DSRed2表達的容許條件），以不 同雜交和在不同時間的成體雄性后代解剖并在高倍熒光顯微鏡下觀察。僅一個雄性顯示強 烈的DsRed2表達，其在一些精細胞束中可見。在其它雄性中，在任何精細胞束中都未檢測 到DsRed2表達。僅一個雄性呈現(xiàn)強烈的DsRed2表達的可能原因是由Cc3 2-微管蛋白啟動 子驅(qū)動的tTAV-熒光的后期轉(zhuǎn)錄和翻譯。該后期表達可以意為對于tTAV有足夠的時間以 結(jié)合tetO序列和在減數(shù)分裂前進一步誘導足夠的DsRed2轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)我們的結(jié)果，僅是 偶然，一些雄性中的精母細胞中的一些具有足夠的在減數(shù)分裂前積累的DsRed2轉(zhuǎn)錄本并 且DsRed2熒光可以在精細胞束中被檢測。使用tTAV特異引物對0X3831 (圖20)雄性的分 離的精巢和尸體的反轉(zhuǎn)錄酶PCR分析，表明5'UTR-alyCcP2-微管蛋白啟動子的精巢-特 異性。
[0267] 在這個階段，顯然tTAV的甚至更早表達是必要的以允許在雄性生殖系中足夠表 達報道分子基因。為此，我們開發(fā)和測試了構建體0X4282,其含有Hsp83基因的5'UTR。 Hsp83在地中海果蠅地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata))的生殖系和體細 胞中都強烈表達并且不認為包含任何延遲翻譯信號。在構建體0X4282中，報道分子基因； TurboGFP，不融合于tTAV序列，但是與tetO序列相鄰設置。此外，在嘗試中將tetO-報道 分子和啟動子-tTAV組分組合于單個質(zhì)粒中從而以更直接的方式評估Hsp83 5'UTR。tTAV 應該被表達在轉(zhuǎn)化個體的雄性生殖系中并且，在缺失四環(huán)素的情況下，通過結(jié)合tetO應該 誘導相鄰TurboGFP標記基因的表達。換句話說，當關四環(huán)素飼養(yǎng)時，攜帶該構建體的那些 株的雄性精巢應該顯示TurboGFP表達，并且表達應該被四環(huán)素抑制。精巢解剖在缺少四環(huán) 素的情況下飼養(yǎng)的成體雄性，揭示6個測試的品系的三個中存在強烈的綠色（turboGFP)熒 光。
[0268] 在其它品系中未觀察到TurboGFP表達的事實可能由于轉(zhuǎn)基因插入物的位置效 應。在呈現(xiàn)TurboGFP熒光關四環(huán)素的品系中，表達由四環(huán)素完全抑制（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0269] 將0X4282雄性與0X3867 (tetO-魚精蛋白-DsRed2)(圖15)雌性在各籠中雜 交以進一步檢測啟動子驅(qū)動報道分子基因足夠表達的能力；在此種情況下DsRed2使用 "tet-關"二元條件系統(tǒng)。
[0270] 可以在精子自然發(fā)生的不同階段（在延長的精細胞和精母細胞二者中）檢測 TurboGFP表達，盡管紅色熒光僅在延長的精細胞但是未在早期精母細胞中檢測到（圖3)。 在精細胞的精子頭（核定位處）和尾都檢測TurboGFP表達。
[0271] 上述結(jié)果表明，與tTAV表達相比，存在報道分子基因（本實驗中為DsRed2)表達 的稍微延遲；因為這由觀察到的綠色熒光的量估計。考慮到紅色熒光在精子自然發(fā)生的后 期（延長的精細胞）明顯，可能報道分子在減數(shù)分裂前轉(zhuǎn)錄但是在減數(shù)分裂后翻譯。
[0272] Dmtopi是精巢-特異的基因，其編碼生理上與Comr相互作用的精巢-特異的鋅 指蛋白（Perezgasga，Jiang等人2004)。Dmtopi對于Aly或Comr的核定位不是所需的，但 對于其在染色質(zhì)上的積累是所需的。在果蠅Orosophila)中，盡管對于表達依賴于aly或 comr的所有基因也依賴于achi/vis和/或topi,但存在一些基因，其轉(zhuǎn)錄依賴于achi/vis 和topi,但是不依賴于aly或comr(Perezgasga，Jiang等人2004)。可能更顯著的是，很多 aly-類型基因似乎產(chǎn)生自基因復制。復制之后，一對中的一個承擔體作用并且另一個承擔 生殖系作用。就使用這些基因作為寬范圍的昆蟲中雄性生殖系啟動子的來源而言，這具有 兩個限制。
[0273] 第一，所述兩個基因可以非常類似，使得相對難以鑒定生殖系-特異的版本。第 二，和更加顯著的是，很多這些復制似乎都非常近期。多數(shù)昆蟲可以因此具有祖先版本（其 是既執(zhí)行生殖系功能也執(zhí)行體功能的單個基因），并且因此無分開的生殖系基因和啟動子。 topi在這方面是不尋常的，因為它不具有明顯的體替代物，并且它還似乎比aly-類型復制 中的大多數(shù)更古老。因此可能比其它aly-類型基因在更寬范圍的昆蟲中提供可能的生殖 系-特異的啟動子。對這點的一個注意事項是，topi序列保守性是明確的，但是功能保守 型，和尤其是topi在其它昆蟲中的表達模式，通常未知。然而，該保留意見也適用于其它雄 性-生殖系基因。由于這些不同原因，選擇topi用于雄性-生殖系啟動子來源的進一步研 究。
[0274] 在地中海果蠅（Medfly)中開發(fā)基于topi的構建體之前，首先在蚊子埃及伊蚊 (Ae.Aegypti)中測試topi的表達模式的保守性；基因組序列的可用性意為topi同源物和 推定的啟動子片段可以快速被分離。RISH(RNA原位雜交）結(jié)果顯示埃及伊蚊（Ae.Aegypti) topi(Aetopt)基因轉(zhuǎn)錄從初級精母細胞階段開始；表達譜類似果蠅（Drosophila)精巢中 Dmtopi的表達譜（Perezgasga，Jiang等人2004)。開發(fā)了埃及伊蚊（Ae.Aegypti)轉(zhuǎn)基因 株（0X4286,圖23)，具有由1233-bp序列（包括1168bp的Aetopi啟動子和65bpAetopi 5'-UTR)驅(qū)動的tTA表達。將3個獨立的0X4286 (圖23)系與tet〇-報道分子株（0X3978， tet0AehSp70微型啟動子-Amcyan，圖24)雜交后，在以無TET飲食飼養(yǎng)的全部三個雜交 中的精巢和精子自然發(fā)生細胞中都看到明顯的Amcyan表達（數(shù)據(jù)未顯示）。表達是四環(huán) 素-可抑制的。
[0275] 在顯示埃及伊蚊（Ae.Aegypti)topi啟動子誘導tTAV的精巢-特異表達和后續(xù)的 報道分子基因的表達之后，分析地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata))topi的 表達模式。在地中海果蠅（Medfly)中使用該基因核苷酸序列，設計因無以驗證Cctopi在 地中海果蠅（Medfly)中是精巢-特異的基因。將解剖自十只野生型雄性的十對精巢用于 提取RNA(解剖詳情見2. 6. 4. 3部分）。從生育的尸體提取RNA以提供非精巢對照。使用引 物TopitestFl' ：和'TopitestR'的反轉(zhuǎn)錄酶分析用于這些PCR。結(jié)果確認Cctopi表達是 精巢-特異的。RISH也證明Cctopi在地中海果蠅（Medfly)精巢中轉(zhuǎn)錄（數(shù)據(jù)未顯示）。 因此選擇此基因啟動子在用于開發(fā)轉(zhuǎn)基因株中精巢-特異表達的新構建體中使用。
[0276] TopitestFl引物：GTAACTCCCGTTCCTGAGACAACA(SEQIDN0 :55)
[0277] TopitestR引物：CGATATGGAGTGGGTGAAACCTCA(SEQIDNO:56)
[0278] 構建體0X4275 (圖25)包含來自Cctopi的驅(qū)動DsRed2的推定啟動子片段 (1178bp) (SV403'UTR)。來自以該構建體獲得的所有株的成體雄性的解剖的精巢不顯露 DsRed2表達的任何信號（數(shù)據(jù)未顯示）。為了進一步測試Cctopi啟動子，開發(fā)了具有相 同啟動子序列的驅(qū)動tTAV表達的構建體（0X4254,圖26)。將0X4254-雜合蠅與異性的 0X3867(tet0-DsRed2)(圖15)雜合蠅（tet〇-DsRed2株）雜交并且將這些雜交的成體雄性 后代解剖并評估紅色熒光。在那些雄性精巢的任何精細胞束中都未檢測到DsRed2表達。
[0279] 因為0X4275 (圖25)和0X4254 (圖26)中推定的Cctopi啟動子的長度短可以導 致顯見功能的缺失，基于以下改進制備了新構建體-0X4371 (圖27)。該構建體含有來自推 定的Cctopi編碼區(qū)域的1708-bp序列，比之前的包括484bp可能的編碼序列和編碼區(qū)域 的保留的部分的55bp內(nèi)含子的構建體多出超過530bp。因為在其N末端與其它蛋白融合 后tTAV通常不彳丁使功能，在Cctopi編碼區(qū)域和tTAV之間使用228bp泛素基因序列（基于 果蠅（Drosophila)泛素的但是優(yōu)化用于在一系列昆蟲表達的序列，由GeneartLtd合成） 以在翻譯后通過泛素蛋白酶的切割分開兩個基因產(chǎn)物（Varshavsky2005)。該構建體既含 有新設計的驅(qū)動tTAV的Cctopi啟動子也還有tet〇-Dmhsp70微型啟動子-TurboGFP報道 分子。因此，應該通過在其幼蟲飲食中無四環(huán)素的情況下飼養(yǎng)的雄性的精巢中的熒光檢測 tTAV的表達。在來自兩個測試的品系中的一個中關四環(huán)素飼養(yǎng)的0X4371 (圖27)雄性成體 的解剖的精巢中檢測到精子自然發(fā)生細胞中的弱TurboGFP表達。在開四環(huán)素條件下飼養(yǎng) 的任何雄性的解剖的精巢中未檢測到TurboGFP表達，表明可抑制的表達。
[0280] 產(chǎn)生和分析以0X4371 (圖27)，0X4391 (圖22)株操作的并發(fā)事件。
[0281] 0X4391 (圖 22)在一個方面不同于 0X4371 (圖 27) :0X4371(圖 27)中的tTAV的 SV40 3'UTR由0X4391中的Cctopi內(nèi)源3'UTR替代（圖22)。如之前提到的，3'-UTR可以 影響特定mRNA的命運，例如轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性或翻譯水平（Mazumder，Seshadri等人2003)?？?慮到已經(jīng)顯示3'UTR在mRNA加工中發(fā)揮重要作用，我們假想來自Cctopi的內(nèi)源3'UTR可 以將基因的所需的表達模式賦予我們的tTAV轉(zhuǎn)基因。使用反轉(zhuǎn)錄PCR擴增Cctopi3' -UTR。 將來自6個0X4391 (圖22)株的在關四環(huán)素下飼養(yǎng)的2-3日齡的雄性成體的精巢解剖。3 株顯示在雄性生殖系細胞中強烈的TurboGFP表達。在其它三株中檢測到弱熒光。
[0282] 為了進一步測試新設計的topi啟動子序列，我們將0X4391(圖22)雄性（以無四 環(huán)素飲食飼養(yǎng)）與野生型雌性雜交并且評估解剖的納精囊中熒光的存在。在熒光顯微鏡下 檢查儲存在納精囊中的精子證明TurboGFP實際上是可檢測的。
[0283] 上述結(jié)果表明我們的分離的topi啟動子序列（如上文描述的）在雄性生殖系中 表達并且足夠驅(qū)動精巢中tetO報道分子基因的表達。與包含tet〇-核酸酶轉(zhuǎn)基因的蠅的 雜受在之后討論。
[0284] 實施例2效應物蛋白
[0285] 本工作的目的是產(chǎn)生轉(zhuǎn)移至雌性的精子并且將導致低的或?qū)嵸|(zhì)上無胚胎（否則 雌性會產(chǎn)生的）存活。相同的精子應該誘導足夠的對雌性中再交配的不應態(tài)，同時如果雌 性的確再交配將在精子競爭方面表現(xiàn)良好。對此，我們的方法是構建父本效應致死，借此， 精子可以進入卵，但是無可成活受精卵（能夠發(fā)育為可育成體）形成。理想地，該效果由具 有單拷貝父本效應致死的雄性產(chǎn)生，盡管多拷貝的使用也是可預見的。還優(yōu)選效應物對精 子具有直接的生物化學效果，而不是僅使用精子作為進入卵（并隨后在那里具有效果）所 通過的載體。這是由于對可能的抗性的考慮。核酸酶是對于本發(fā)明的目的的優(yōu)選的選擇。 理論上，如果由精子攜帶的遺傳信息被損害至一些或（優(yōu)選）基本上全部受精卵不可成活 的程度，那么這形成形成通過父本效應致死性的不育的合適形式的基礎。在嘗試中已經(jīng)探 索不同類型的核酸酶誘導精子特異的損害。作為"tet-關"二元條件系統(tǒng)的部分測試所有 核酸酶；其連接于tetO序列。該方式允許與不同生殖系特異的啟動子序列組合評估各種效 應物蛋白，而無產(chǎn)生新轉(zhuǎn)化子株的負擔。此外，其就未來應用而言提供更現(xiàn)實的狀況。
[0286] 已經(jīng)描述了鋅指核酸酶（ZFNs)，其中各個鋅指提供對短核苷酸序列，例如3個核 苷酸的序列-特異的結(jié)合?？梢酝ㄟ^將多個此種鋅指組合于單個蛋白提供更高的親和力和 更好的序列特異性。如果將這與核酸酶，例如限制性核酸內(nèi)切酶FokI的核酸酶結(jié)構域組 合，可以以任意的序列特異性構建人工序列-特異的核酸酶。我們已經(jīng)通過將這些品系與 不同雄性生殖系特異的啟動子雜交測試ZFNs可以在延長的精細胞中產(chǎn)生DNA破壞的假想。 設計和測試了兩個（0X4103)(圖18)和三個（0X4104,圖19)鋅指核酸酶構建體。之前的通 過與在體組織中表達的啟動子-tTAV品系雜交的評估，表明3-鋅指核酸酶呈現(xiàn)更好的"致 死"效果并且因此將這些品系中最強的用于本工作的目的。該核酸酶因此是優(yōu)選的。
[0287] 歸巢核酸內(nèi)切酶是典型地由內(nèi)含子編碼的一種類型的限制性內(nèi)切酶的。它們作用 于合成它們的細胞的細胞DNA并且它們傾向于識別相對長的（15_40bp，盡管經(jīng)常接受對正 常目標序列的一些錯配）核苷酸序列，其因此在任何給定昆蟲基因組中就算真的有也很少 發(fā)生。可接受識別/切割位點的最小數(shù)量是每二倍體基因組一個；每單倍體基因組一個是 優(yōu)選的并且每個單倍體基因組識別/切割多個位點是特別優(yōu)選的。每基因組切割多個位 點的歸巢核酸內(nèi)切酶的一個實例是Ippol。盡管這具有相當特異的，長識別位點，其對應于 rDNA基因中的高度保守序列。因為該rDNA基因的多個拷貝存在于所有真核基因組中，多個 目標位點是可用的。設計和測試了tet0-IPP01(0X4112,圖17)構建體。
[0288] 限制性核酸內(nèi)切酶具有4-10bp的識別位點，其將典型地切割真核基因組很多次。 此種核酸酶不具有實質(zhì)的序列特異性。FokI(其對甲基化不敏感并且對于其，已知核酸酶結(jié) 構域在在一系列細胞類型中以及體外行使功能）對于我們的目的是特別優(yōu)選的。與具有很 少或無序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構域組合的FokI核酸酶結(jié)構域是特別感興趣的。類型效 應物的優(yōu)選的實例是魚精蛋白-核酸酶融合。魚精蛋白-核酸酶融合的優(yōu)點是需要與其自 身（同源二聚體）或與至少一種不同蛋白（異源二聚體）二聚化（或多聚化）以切割DNA。 的確需要二聚化的酶將典型地具有非線性劑量響應的功能。特別是對于可以結(jié)合在基因組 中很多位點的酶，在低濃度可能兩個酶分子將以此種能夠被切割的方式相遇。條件表達系 統(tǒng)滲漏-通過啟動子或通過條件系統(tǒng)自身之一，除了在預期的細胞（例如除了在雄性生殖 系中之外）之外在至少一些細胞產(chǎn)生低的，非零水平的效應物，可以是有利的。已經(jīng)設計和 測試了tetO-魚精蛋白-FokI構建體（0X4458,圖21)。
[0289] 在之前提到的二元系統(tǒng)中評估雄性不育被稱為"卵孵化率測定或?qū)嶒?。設計的圖 示在圖1中說明。啟動子品系驅(qū)動雄性生殖系中tTAV的表達，優(yōu)選在別處具有很少或無表 達，同時效應物品系連結(jié)于tetO序列，其表達與tTAV相關，_者是時間和空間上的。啟動 子和效應物品系中的轉(zhuǎn)化標記使用不同熒光基因用于精確評估結(jié)果，即在適當激發(fā)濾光片 下啟動子品系發(fā)綠色熒光，同時效應物系發(fā)紅色熒光。效應物（E)和啟動子（P)品系在無 四環(huán)素，即容許（表達）條件下雜交。收集來自這些雜交的卵并分為容許條件（無四環(huán)素） 或抑制條件（有四環(huán)素）并從而飼養(yǎng)。對于品系特異的熒光標記的表達篩選蛹并且收集雙 雜合子-兩種標記都具有。Ecclosion之后將這些對核實相等的雄雌比和雄性與野生型雌 性雜交-同樣開或關tet。雙雜合子雌性與野生型雄性雜交用于測試任何觀察到的效果是 否是性別特異的。野生型控制被包括為卵孵化率的參考點。收集和計數(shù)來自雜交的卵。三 天后重復計數(shù)并且評估未孵化卵的數(shù)量。
[0290] 圖1.:卵孵化率測定的設計。
[0291] 許多這些雜交的結(jié)果在下文顯示。這里提供的所有雜交遵循上文描述的基本設 計。
[0292] 0X4282 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋 白-hsp83-tTAV-SV40)x0X4104(PB-YAFN-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)(圖 19)
[0293] 圖2.開和關四環(huán)素下0X4282-0X4104雄性不育。將三個獨立的，攜帶由來自地中 海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata))基因（I，L，G)的0 2-微管蛋白啟動子的四 環(huán)素可抑制反式激活子（tTAV)的0X4282轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系與攜帶tetO-3鋅指 效應物的品系0X4014。以有（100iig/ml;tet+)或無四環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖這 些雜交的后代。將攜帶驅(qū)動物和效應物等位基因二者的雄性與野生型雌性雜交并且計算獲 自這些雜交的卵的孵化率（孵化的產(chǎn)的卵的百分數(shù)）。對于每個雜交使用每組100-150個 卵的兩組不同的卵收集物。使用在存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌性雜交的野生型 雄性作為對照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交（卡方檢驗，*表示P< 〇. 01，**表示P < 0. 001)用星號標記。
[0294] 將三株0X4282品系與之前當與兩個遺傳啟動子（Hsp83和0P)雜交時顯示有希望 的結(jié)果的3個鋅指品系（0X4104,圖19)。對于含有兩種質(zhì)粒的蠅未記錄到負效應，表明效 應物在體組織中的基礎表達不足夠_以顯不負效應。從品系L和從品系I僅觀察到14%和 27%卵孵化。從品系G在卵孵化方面也無顯著降低。品系L和I包含單拷貝的轉(zhuǎn)基因，與 含有兩個（或更多個）拷貝的品系G相反。結(jié)果明確表明5'Hsp83UTR-Cc微管蛋白-SV40 3'UTR啟動子驅(qū)動雄性生殖系中tTAV的足夠表達以誘導精子不育，如由從這些雄性產(chǎn)生的 后代孵化的幼蟲的減少表明的。另外，未觀察到雌性可育性的降低，表明啟動子以雄性-生 殖系特異的方式作用（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，一個0X4282品系的后代無顯著減少的事實指 向影響表型的位置效應。
[0295] 0X4282 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋 白-hsp83-tTAV-SV40)x0X4112 (PB-IPP0-l-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)
[0296] 將相同的0X4282品系與I-Ppol品系雜交，其證明在體細胞中活化的兩個啟動子 (Hsp83和0pie2)雜交時的致死性。與野生型和四環(huán)素對照相比，使用該效應物，觀察到高 達50%不育（數(shù)據(jù)未顯示）。結(jié)果表明在此測定中看到的不育是通過tTAV激活核酸酶表達 和之后的精子DNA切割的結(jié)果。不育水平表明不足夠的外顯率。當其與遺傳啟動子品系雜 交時，相同品系呈現(xiàn)強烈的致死效果的事實可以提示，在雄性生殖系中產(chǎn)生不足夠的此種 蛋白分子以引起想要的效果。對于強烈效果發(fā)生，可能蛋白需要超過某閾值，其也增加影響 性能的轉(zhuǎn)基因的位置效應的可能性。這與含有在該測定過程中觀察的兩種轉(zhuǎn)基因的蛹的降 低的數(shù)量一起，使I-Pp〇l成為對于開發(fā)精子致死性不適當?shù)?，并且因此不?yōu)選的候選物。
[0297] 0X4282 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋 白-hsp83-tTAV-SV40)x
[0298] 0X4458 (PB-AttP-Hr5-IEl-DsRed2-SV40-teto21-Dm魚精蛋白-核酸酶）
[0299] 圖3.開和關四環(huán)素下的0X4282-0X4458雄性不育-轉(zhuǎn)基因地中海果蠅中可抑制 的雄性特異的不育。
[0300] 將四個獨立的，攜帶tet〇-魚精蛋白-FokI效應物（Bl，Dl，D2,F2)的0X4458(圖 21)轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系與攜帶來自地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata)) 02-微管蛋白基因的啟動子驅(qū)動的四環(huán)素可抑制反式激活子（tTAV)的 0X4282L驅(qū)動物品系雜交。將這些雜交的后代以有（lOOiig/ml;tet+)或無四環(huán)素（tet_) 的飲食之一飼養(yǎng)和繁殖。既攜帶驅(qū)動物等位基因也攜帶效應物等位基因的雄性與野生型 雌性雜交并且計算獲自這些雜交的卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。200-500個卵每 組的四組不同卵收集物用于各個雜交。野生型和0X4282L雄性與野生型雌性在存在或缺 少四環(huán)素的情況下的雜交用作對照。將觀察到的高度顯著雄性不育的雜交（卡方檢驗，P < 0. 0001)用星號標記。
[0301 ] 0X4458 (圖21)構建體含有在單端的源自piggyBac的載體中的tetO操縱 子的轉(zhuǎn)錄控制下的融合于果蠅（Drosophila)魚精蛋白的單個FokI切割結(jié)構域，以hr5-IEl-DsRed2作為轉(zhuǎn)化標記。0X4458(圖21)構建體應該自身不發(fā)揮任何效果。當 0X4458 (圖21)品系與合適的表達tTAV的品系雜交時，在具有兩個等位基因的雙雜合子后 代中，并且在容許條件（無tTAV抑制物-四環(huán)素）下，效應物融合蛋白的表達發(fā)生。
[0302] 將具有單個，常染色體轉(zhuǎn)基因插入的四個品系與表達tTAV的品系-0X4282L(其在 之前的實驗中呈現(xiàn)更高的啟動子活性（參見上文））雜交。在所有的四個雙雜合子組合中， 觀察到來自與轉(zhuǎn)基因雄性交配的雌性的卵的孵化率的劇烈降低。使用與野生型雄性雜交的 攜帶兩種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雌性驗證觀察到的效果的性別特異性（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0303] 根據(jù)上文顯示的結(jié)果，"改變的"微管蛋白啟動子和果蠅（Drosophila)魚精蛋 白-FokI效應物的組合，似乎產(chǎn)生以任何其它方式比測試的方式對雄性的一般健康具有最 ?。ɑ蛉鄙伲┴撔男坌陨诚堤禺惖闹滤佬Ч?。另外，雌性似乎不顯著受轉(zhuǎn)基因表達 的影響，支撐使用的序列的雄性生殖系特異性。下一步將是設計將在單個質(zhì)粒（0X4353)中 既含有啟動子也含有效應物序列的構建體。此種構建體將提供要用于開發(fā)父本效應致死系 統(tǒng)的轉(zhuǎn)座子的更現(xiàn)實的狀況。
[0304] 0X4353 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-tetol4-Dm魚精蛋白-核酸酶-cc微管蛋 白-hsp83-tTAVnew_SV40)
[0305] 4個品系被認為是除品系F(其被認為具有兩個插入）的，基于轉(zhuǎn)化標記的遺傳模 式單插入事件。如之前描述的在四環(huán)素存在和缺少的情況下，通過與野生型雜交測試所有 品系。將來自相同品系的雌性也與野生型雄性雜交并且以類似的方式評估其可育性。
[0306] 圖4.開和關四環(huán)素下0X4353雄性不育的百分數(shù)。
[0307] 在地中海果蠅中產(chǎn)生五株獨立的，攜帶tet〇-魚精蛋白-FokI效應物和由來自地 中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata))的0 2-微管蛋白啟動子驅(qū)動的四環(huán)素可 抑制反式激活子（tTAV)的0X4353轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系（A，B，C，D，F(xiàn))。將這些品系 的后代以有（100Ug/ml;tet+)或無四環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雄性與野生型雌 性雜交并且計算獲自這些雜交的卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。100-150個卵的兩 組卵用于每個雜交。在四環(huán)素存在或缺少的情況下與野生型雌性雜交的野生型雄性用作對 照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交（卡方檢驗，**表示P< 〇? 001，***表示P< 〇? 0001) 用星號標記。
[0308] 圖5.開和關四環(huán)素下0X4353雌性不育的百分數(shù)。在地中海果蠅中產(chǎn)生五個獨 立的，攜帶tet〇-魚精蛋白-FokI效應物和由來自地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata))的02-微管蛋白啟動子驅(qū)動的四環(huán)素可抑制反式激活子（tTAV)的0X4353轉(zhuǎn) 座子的常染色體插入品系（A，B，C，D，F(xiàn))。將這些品系的后代以有（lOOyg/ml;tet+)或無 四環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雌性與野生型雄性雜交并且計算獲自這些雜交的卵 孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。使用來自各個雜交的100-150卵的兩組卵收集物。在 存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌性雜交的野生型雄性用作對照。未觀察到顯著的雌 性不育（卡方檢驗，P> 〇? 05)。
[0309] 結(jié)果表明在飲食中缺少四環(huán)素（容許條件）的情況下，雜合0X4353雄性多達 100%不育。然而一些品系的雄性甚至在四環(huán)素存在的情況下是近乎可育的（sub-fertile) 并且來自多數(shù)品系的雌性在四環(huán)素缺少的情況下顯示可育性的稍微降低。從上述結(jié)果，我 們可以得出結(jié)論：轉(zhuǎn)基因的表達在所有5個測試的品系中就誘導精子致死性而言是起作用 的，然而實現(xiàn)對含有該轉(zhuǎn)基因的昆蟲的一般健康具有最小影響的完全（或非常接近）精子 致死性的精細調(diào)節(jié)，似乎極大地受位置效應（即插入的序列在昆蟲基因組合接近的調(diào)控元 件中的位置）影響。
[0310] 這里描述的工作顯示1030bp地中海果蠅（Medfly) 0 2-微管蛋白啟動子片段在四 環(huán)素的控制下足以驅(qū)動tTAV表達并進一步驅(qū)動精子自然發(fā)生中效應物基因表達。0X4353 株證明是功能的，四環(huán)素-可抑制的精子-致死株。另外，研究者可以得出結(jié)論：當在地中 海果蠅（Medfly)中表達時，Dm魚精蛋白保留其關鍵性質(zhì)中的至少一種；即結(jié)合精子DNA。 魚精蛋白序列不是良好保守的，因此在這些實驗之前陽性結(jié)果是不確定的。這些結(jié)果表明 進一步使用與二元"tet-關"系統(tǒng)有關的啟動子/效應物組合的對于地中海果蠅（Medfly) 群體控制的看法的希望。
[0311] 0X4718(PB4Hriel-AmC-MexMActPr〇-DsR-tet021-Prota-mCh-FokI-CcBTubPr〇-tT AV2-Hriel-ZsG)
[0312] 0X4718是地中海果蠅（Medfly)上的既攜帶啟動子組分又攜帶效應物組分的單個 構建體的實例。將該質(zhì)粒注射入前胚盤地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata)) 胚胎中。既表達紅也表達綠色熒光蛋白的蛹（含有不同顏色的pb端的4-端pb構建體 (Dafaala等人，2006)-意味著完全轉(zhuǎn)座子的插入-在兩組Go雜交V(1個蛹）和〇 (47個 蛹）中的G1后代之間發(fā)現(xiàn)。來自0X4718-V品系的單個蛹未存活至成年。來自0X4718-O 品系的蛹展現(xiàn)兩個明顯不同的表型：更強（30個蛹）和更弱（17個蛹）并且分別命名為〇 1 和〇 2。這些大多數(shù)增殖為與野生型的單個雄性或雌性雜交并且在此階段被認為是兩個獨 立的插入事件。0X4718- 〇 1 (b)和0X4718- 〇 2 (b)品系在G2階段終止。G2蛹的表型分析 表明每個這些品系中的多個插入。G3階段的品系的進一步分析證實〇 1(a)和〇 1(c)品系 二者都是單個，常染色體插入。0X4718-g2 (a)在X染色體上攜帶單個插入-如通過改變不 同代雄性中轉(zhuǎn)基因的缺少或存在所提示的并且尚未為了本研究的目的進一步分析。
[0313] 以有（100Ug/ml;tet+)或無四環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖0X4718-O1(a)和 0X4718-O1(c)品系并與野生型雜交。在存在或缺少四環(huán)素的情況下，野生型與野生型之間 和0X4718雌性與野生型雄性的雜交用作對照。在建立籠后第4天收集來自這些雜交的新 鮮-不老于24小時-卵。進行每個雜交/籠三次收集。將卵的總數(shù)量與四天后未能孵化 的卵數(shù)量進行比較。計算孵化率為平均孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)；這些數(shù)據(jù)顯示在四環(huán)素缺 失情況下0X4718-〇 1雄性的顯著不育。結(jié)果顯示于圖6。將在存在或缺少的四環(huán)素情況下 飼養(yǎng)的0X4718- 〇 1 (a)和X4718- 〇 1 (c)品系與野生型雌性雜交并且計算獲自這些雜交的 卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。野生型與野生型之間和0X4718雌性與野生型雄性的 雜交用作對照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交（卡方檢驗，P< 〇. 0001)用星號標記。
[0314] 上述結(jié)果證明成功以適于野外使用的方式在地中海實蠅（地中海果蠅 (Ceratitiscapitata))開發(fā)條件雄性特異的不育；即個體啟動子和效應物分子組裝于單 個構建體。
[0315] 圖7和8開和關四環(huán)素下橄欖果蠅中0X4705雄性和雌性不育的百分數(shù)。
[0316] 0X4705
[0317] (PBMexMActPr〇-DsR-tet021-Prota-mCh-FokI-CcBTubPr〇-tTAV2)
[0318] 這提供既含有啟動子組分又含有效應物組分的單個構建體的其它實例，在這一情 況中是在橄欖果蠅中。
[0319] 基于在地中海果蠅（Medfly)(地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata))) 中獲得的另人鼓舞的結(jié)果，對于相關的實蠅（Tephritid)，橄欖果蠅（Bactroceraoleae) (通常稱為橄欖果蠅）開發(fā)類似的質(zhì)粒。質(zhì)粒0X4705整合了驅(qū)動雄性生殖系中tTAV表達 和接著驅(qū)動tetO和Dro魚精蛋白-FokI融合效應物的表達的B2微管蛋白的改變的形式。 所述質(zhì)粒還整合了新的墨西哥果蠅（Mexfly)(墨西哥按實蠅（Anastrephaludens))肌肉 肌動蛋白啟動子，其驅(qū)動作為轉(zhuǎn)化標記的DsRed2熒光蛋白的表達。
[0320] 在橄欖果蠅前胚盤胚胎上顯微注射質(zhì)粒0X4705S產(chǎn)生10個獨立的插入事件。所 有株在顯微鏡下以適當?shù)募ぐl(fā)濾光片呈現(xiàn)強烈的熒光表型（熒光標記表達）并且根據(jù)孟德 爾遺傳法則是單個插入。9個插入是常染色體的，同時一個在X染色體上。在存在和缺少四 環(huán)素的情況下從幼蟲中期測試所有株的雄性和雌性不育。野生型雜交提供另外的對照。結(jié) 果顯示于圖7和8。
[0321] 圖7顯示開和關四環(huán)素下0X4705橄欖果蠅雄性不育的百分數(shù)。在橄欖果蠅中 產(chǎn)生9個獨立的，攜帶tet〇-魚精蛋白-FokI效應物和由來自地中海實蠅（地中海果蠅 (Ceratitiscapitata))的0 2-微管蛋白啟動子的改變形式驅(qū)動的四環(huán)素可抑制反式激 活子（tTAV)的0X4605轉(zhuǎn)座子的常染色體插入品系（A，A1，A2，A3，B，B1，F(xiàn)，F(xiàn)1，P)。將這些 品系的后代以有（100Ug/ml;tet+)或無四環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雄性與野生 型雌性雜交并且計算獲自這些雜交的卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。100-150卵的 三組卵收集物用于各個雜交以提供統(tǒng)計顯著性。在存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌 性雜交的野生型雄性用作對照。
[0322] 圖8顯示開和關四環(huán)素下0X4705橄欖果蠅雌性不育的百分數(shù)。在橄欖果蠅中產(chǎn)生 9個獨立的，攜帶tet〇-魚精蛋白-FokI效應物和來自地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata))的02-微管蛋白啟動子驅(qū)動的四環(huán)素可抑制反式激活子（tTAV)的0X4705轉(zhuǎn) 座子的常染色體插入（A，Al，A2,A3,B，Bl，F(xiàn)，F(xiàn)l，P)。將這些品系的后代以有（100iig/ml; tet+)或無四環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)和繁殖。將雌性與野生型雄性雜交并且計算獲自這些 雜交的卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。使用來自每個雜交的100-150卵的兩組卵收 集物。在存在或缺少四環(huán)素的情況下與野生型雌性雜交的野生型雄性用作對照。未觀察到 顯著的雌性不育。
[0323] 與野生型對照相比，當雄性在幼蟲飲食中存在四環(huán)素的情況下飼養(yǎng)時，數(shù)據(jù)強烈 地表明另人驚嘆的0X4705橄欖果蠅雄性不育，而在幼蟲飲食缺少四環(huán)素的情況下，雄性可 育性不降低（圖7)。雌性可育性（圖8)和雄性的一般健康未受影響，提示"父性致死盒" 的雄性生殖系特異表達。
[0324] 圖9開和關四環(huán)素下0X4466雄性和雌性不育的百分數(shù)
[0325] 接著地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitiscapitata))，和橄欖果蠅（Bactrocera oleae)中父系轉(zhuǎn)移的致死效果的成功，焦點轉(zhuǎn)移至具有經(jīng)濟上重要性的其它雙翅目；埃及 伊蚊（Aedesaegypti)。以下實例使用與在地中海果蠅（C.capitata)中類似的啟動子和效 應物序列提供在此物種上的顯著雄性不育的證據(jù)。在一些使用該生物的基因組序列的構建 體中發(fā)生稍微的改變以獲得最大化結(jié)果。
[0326] 0X4466(PB-hr5IEl-DsRed-Aeprot-tGFP-EcoRI)
[0327] 這也提供其它效應物的實例；將A印ro-EcoRI. 0X4466注射入前胚盤埃及伊蚊 (Aedesaegypti)胚胎中。該構建體的組分組成型表達而不是通過tet-關系統(tǒng)誘導。產(chǎn)生 4個獨立的插入事件。來自各個株的雄性和雌性與野生型異性蚊子回交。野生型昆蟲用作 對照。讓雌性在濾紙上產(chǎn)卵24小時。評估后代的存活。結(jié)果顯示于圖9。圖標顯示收集的 從各個測試雜交孵化的胚胎的百分數(shù)。內(nèi)部表格提供實際記錄的數(shù)量。該實驗證明當這些 以0X4466雄性為父本時，孵化的卵數(shù)量顯著減少；在品系D中，胚胎存活力的降低不明顯， 可能由于位置效應。結(jié)果證實胚胎致死性的性別特異性；來自轉(zhuǎn)基因雌性的胚胎野生型對 照雜交的這些同等地可成活。
[0328] 將構建體0X4466的伊蚊（Aedes)-魚精蛋白-核酸酶效應物DNA序列（EcoRI)融 合于熒光基因（turboGFP)，以致在精子中核酸酶的表達應該與熒光蛋白的表達共存。分離 自許多0X4466雄性中解剖的精巢的精子的熒光顯微，顯示與核/精子頭的強烈的GFP共定 為。這是融合于突光表達的核酸酶功能的實例。
[0329] 圖10開和關四環(huán)素下0X4467雄性和雌性不育的百分數(shù)
[0330] 0X4467(PB-hr5IEl-DsRed-A印rot-tGFP-FokICD)
[0331] 0X4467與質(zhì)粒0X4466相同，僅有的區(qū)別是核酸酶效應物是Fokl而不是EcoRI。
[0332] 將該質(zhì)粒注射入前胚盤埃及伊蚊（Aedesaegypti)胚胎產(chǎn)生3個獨立的插入事 件。這些事件中的兩個在通過轉(zhuǎn)基因G0雄性的代G1中喪失；表明父性致死效應的非常強 烈的表達。如之前的分析剩余株。結(jié)果顯示于圖10中。表格顯示收集的從各個測試雜交 中孵化的胚胎的百分數(shù)。內(nèi)部表格提供實際記錄的數(shù)量。該實驗表明當這些以0X4467雄 性為父本時孵化的卵的數(shù)量的顯著減少。結(jié)果證實預期的胚胎致死性的性別特異性；來自 轉(zhuǎn)基因雌性的胚胎與野生型對照雜交中的這些等同地可成活。
[0333] 如在0X4466質(zhì)粒中，將伊蚊-魚精蛋白-核酸酶效應物DNA序列（Fokl)融合于 熒光基因（turboGFP)，從而在精子中核酸酶的表達應該與熒光蛋白的表達共存。分離自許 多0X4467-E1雄性中解剖的精巢的精子的熒光顯微，顯示與核/精子頭強烈的GFP共定位。 這是融合于熒光表達的核酸酶功能的其它實例。
[0334] 0X4286(PB-AeTopi-tTAV-K10-3xP3-DsR)
[0335] 0X4286(圖23)是基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的構建體，其含有由埃及伊蚊（Aedes aegypti)驅(qū)動的topi啟動子驅(qū)動的tTAV和topi5'UTR。0X4286(圖23)使用3xP3驅(qū)動 的DsRed作為轉(zhuǎn)化標記。3xP3是人工的，眼特異的啟動子，負責進化保守的Pax-6轉(zhuǎn)錄因子 并且在胚胎，幼蟲和蛹階段過程中活化。為了測試Topi啟動子的活性，使用報道分子品系， 0X3979-Ae。0X3979-Ae含有在tetO操縱子控制下的AmCyan編碼序列，使用噬菌體C31系 統(tǒng)整合于基因組停泊位點（dockingsite)。其表達hr5IEl驅(qū)動的DsRed作為轉(zhuǎn)化標記。 由與0X4628B和0X3979品系雜交產(chǎn)生的既攜帶Topi-tTAV也攜帶tet〇-AmCyan的雙雜合 子，顯示來自后幼蟲期的埃及伊蚊（Aedesaegypti)精巢中明確地AmCyan表達。
[0336] 0X4635 (PB-HrIE-AmCyan-SV40-AeP2 微管蛋白-hsp83-tTAV-SV40)
[0337] 為了測試B2微管蛋白啟動子用于埃及伊蚊（Aedesaegypti)蚊子的條件雄性不 育系統(tǒng)中的適用性，構建基于PiggyBac的構建體0X4635。Smith等人，在他們的2007年文 章中描述了埃及伊蚊（Aedesaegypti)B2_微管蛋白啟動子的克隆和表征并限定其959bp 片段足以以類似于內(nèi)源啟動子的階段和組織-特異的方式驅(qū)動蚊子精巢中的DsRed表達。 這表明報道分子基因的成功直接表達并且就設計而言與我們之前測試的組成型雄性不育 系統(tǒng)類似。為了將啟動子適于用于我們的條件表達系統(tǒng)，我們決定盡可能去除B2-微管蛋 白的轉(zhuǎn)錄的序列，理由是這些可能介導典型的B2-微管蛋白的翻譯延遲，其對于建議的二 元表達系統(tǒng)將是極不想要的。將與0RF的前36bp-起存在于由Smith等人（2007)使用的 序列中的5'UTR去除并以來自地中海果蠅的hsp83最小啟動子替代。該改變的啟動子用于 驅(qū)動構建體0X4635中tTAV表達。0X4635含有hr5IEl驅(qū)動的AmCyan作為轉(zhuǎn)化標記。
[0338] 埃及伊蚊（Aedesaegvtoi)中的備件雄件不育
[0339] 圖 110X4282-0X4627Topi_tTAV-驅(qū)動的tet〇-Ae-魚精蛋白-FokI-CD(0X4286_Bx 0X4458)的表達
[0340] 0X4627 (PB-AeProt-FokI_sv40-多聚腺苷酸-hrIEl-DsRed)
[0341] 對于條件不育系統(tǒng)的第二部分；核酸酶效應物蛋白，以與0X4458(圖21)(在 地中海果蠅（C.capita)中成功使用）類似的方式建立構建體0X4627;主要區(qū)別是使用 的魚精蛋白序列源自埃及伊蚊（Aedesaegypti)并且為了優(yōu)化的結(jié)果，不源自黑腹果蠅 (D.melanogaster)〇
[0342] 株0X4282B與四個不同0X4627株雜交。將雙雜合雄性與野生型雌性雜交并且將產(chǎn) 生的胚胎對孵化率評分。包括野生型，0X4627自身，和雌性對照。在以無四環(huán)素的飲食飼養(yǎng) 的攜帶兩種等位基因的雄性的所有4個樣品中都觀察到胚胎孵化率的顯著（高達100% ) 降低。結(jié)果顯示于圖11。將0X4286B和0X4627品系之間的雜交的后代以有（tet+)或無四 環(huán)素（tet_)的飲食飼養(yǎng)。將既攜帶驅(qū)動物等位基因又攜帶效應物等位基因的雄性與野生 型雌性雜交并且計算獲自這些雜交的卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。野生型雄性與 野生型雌性的雜交用作對照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交（卡方檢驗）用星號標記。
[0343] 圖 120X4635-0X4627P2-tub-tTAV-驅(qū)動的tet〇-Ae-魚精蛋白-FokI-CD(0X4635x 0X4627)的表達
[0344] 將兩個0X4635株與四個不同0X4627株雜交。將雙雜合雄性與野生型雌性雜交并 且將產(chǎn)生胚胎對孵化率評分。野生型雜交用作對照。在一些以四環(huán)素飲食飼養(yǎng)的攜帶兩種 等位基因的雜合雄性（對于各個等位基因）中觀察到胚胎孵化率的顯著降低。相信不是所 有樣品都表現(xiàn)出相同比例的精子不育的事實是由于不同轉(zhuǎn)基因插入的位置效應。結(jié)果顯示 于圖12中。將0X4635和0X4627品系之間雜交的后代以有（tet+)或無四環(huán)素（tet-)的 飲食飼養(yǎng)。將既攜帶驅(qū)動物等位基因又攜帶效應物等位基因的雄性與野生型雌性雜交并且 計算獲自這些雜交的卵孵化率（孵化的所產(chǎn)卵的百分數(shù)）。野生型雄性與野生型雌性的雜 交用作對照。觀察到高度顯著雄性不育的雜交（卡方檢驗）用星號標記。
[0345] 在埃及伊蚊（Aedesaegypti)中，與B2-微管蛋白相比，在核酸酶表達由Topi啟 動子驅(qū)動的雜交中，看到更強的完全絕育效果。盡管如此，在兩種情況下均觀察到顯著雄性 不育，使topi和B2-微管蛋白合適啟動子的改變形式二者都成為蚊子物種埃及伊蚊（Aedes aegypti)中的"父本致死效應"。然而由Topi啟動子發(fā)揮的更強效應可能與多于一個 Topi-tTAV等位基因插入相關。根據(jù)表型分離數(shù)據(jù)，在0X4286B品系中存在一些Topi-tTAV 插入-它們中的一些與雄性性別確定位點連接。埃及伊蚊（Aedesaegypti)缺少性別二態(tài) 性染色體，作為替代，性別由雄性性別確定位點（M)的存在或缺少確定。
[0346] 核酸酶效應物融合蛋白；魚精蛋白-Fokl，在至今測試的三種不同雙翅目物種，即 地中海果蠅（C.capita),橄欖果蠅（B.oleae)和埃及伊蚊（Aedesaegypti)中完全行使功 能。
[0347] 雄件不育和雌件致死株一起雜奪
[0348] 為了檢測精子致死技術可以怎樣與雌性致死RIDL技術相互作用和對包含著兩種 轉(zhuǎn)基因的終產(chǎn)物的一般性能的可能的影響，建立了將0X4353的地中海果蠅（Medfly)雌性 (選擇兩個品系B和F)與地中海果蠅（Medfly)雌性致死品系（0X3864A和0X3647Q)的雄 性雜交的實驗。RIDL技術的使用第一次在W0 01/39599中描述。根據(jù)其熒光表型選擇包 含這兩種插入的個體并且不育和雌性致死性測定就位。在缺少四環(huán)素的情況下，這些雜交 的后代應該僅是雄性并且是不育的。在存在和缺少四環(huán)素（l〇〇ng/yl)的情況下評估雄性 可育性和雌性致死性。結(jié)果證實在缺少四環(huán)素的情況下在任何雜交中都無雌性后代產(chǎn)生， 然而，當幼蟲在含有四環(huán)素的食物上生長時，獲得正常的50 :50雄性對雌性比例。將含有兩 種插入無的雄性與野生型雌性回交并且如在之前的雜交評估雄性不育。結(jié)果顯示于圖13。 數(shù)據(jù)表明測試的0X4353株的雄性不育仍然不受雌性致死正反饋存在影響或?qū)嵸|(zhì)上其被進 一步稍微降低，盡管這可以歸因于隨機變異。因此重要的是，這些雜交強烈提示雌性和精子 致死質(zhì)粒的存在可以共存于單個生物中，而沒有對二者中任一個的任何負效應。
[0349] 精子-致死株中Cc3 2-微管蛋白啟動子的5'和3'UTR的作用
[0350] 如在文獻（Catteruccia等人，2005;Smith等人，2007;Scolari等人，2008 ; Nirmala等人，2009)中另外描述的Cc0 2-微管蛋白啟動子不驅(qū)動0X3671 (圖16)株所有 精子中DsRed2表達，可能與Cc3 2-微管蛋白基因的后期轉(zhuǎn)錄或翻譯相關。后期表達可以 導致對tetO重復的足夠tTAV蛋白結(jié)合，以激活轉(zhuǎn)基因株中報道分子基因或致死基因之一 的功能。具有修飾的5'UTR-0X3831，0X4282和0X4353的構建體-在精子中顯示更高水平 的熒光或致死性，其說明精子自然發(fā)生中基因表達中5'UTR的重要性。
[0351] 在黑腹果蠅（D.melanogaster)中，多數(shù)基因在減數(shù)分裂前表達并且產(chǎn)物儲存在 發(fā)育的生殖系細胞中，僅一些基因在減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄（White-Cooper2009)。轉(zhuǎn)錄和翻譯 的時機，和RNA和蛋白產(chǎn)物的穩(wěn)定性，對于開發(fā)精子-致死轉(zhuǎn)基因地中海果蠅（Medfly)株 是關鍵的。這點的重要性可以從一種類型的效應物到另一種而不同。實質(zhì)上Windbichler 等人推測部分他們的問題是核酸酶太穩(wěn)定，并且在胚胎中持續(xù)存在（Windbichler等人 2008)。另一方面，對于用熒光蛋白標記的精子，熒光蛋白存活于成熟精子顯然是關鍵的。 未修飾的Cc3 2-微管蛋白表達在雄性生殖系中，如通過使用來自該基因啟動子驅(qū)動精母 細胞中報道分子基因表達證實的。然而，以其正常構造即與源自相同基因的5'UTR序列 組合的該CcP2-微管蛋白啟動子，可以在很后期并且剛好在減數(shù)分裂之前驅(qū)動tTAV的翻 譯。在該情況下，當與tetO-報道分子株雜交時，對于tTAV蛋白結(jié)合tetO序列并進一步誘 導相鄰報道分子基因的足量表達無充足時間。以未修飾的Cc0 2-微管蛋白啟動子，20個 精巢中僅一個在一些精細胞束中顯示報道分子（DsRed2)表達。另一方面，5'UTR替代導致 株0X3831 (圖20)和0X4282雄性精巢中的早期精母細胞和解剖精細胞中更強的熒光表達。 3'UTR含有調(diào)節(jié)翻譯效率和mRNA穩(wěn)定性的序列，因此以已知在寬范圍的物種中行使功能的 序列替代微管蛋白基因的3'UTR;研究者可能排除負責微管蛋白基因的后期翻譯的調(diào)控元 件。
[0352] 0X4371
[0353] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-Topi-ubi-tTAV2-SV40)
[0354] 0X4112 (PB-IPP0-l-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)
[0355] 通過遺傳的方式，0X4371(圖27)品系似乎具有單拷貝的轉(zhuǎn)基因。當與品系 0X4112 (圖17)(其含有效應物IPpol)雜交時，含有兩種質(zhì)粒的個體的數(shù)量稍微減少（與相 同雜交的野生型蛹相比）。然而，大多數(shù)品系中孵化的卵的數(shù)量無顯著降低，除了品系E呈 現(xiàn)雄性可育性的40 %的降低。
[0356] 0X4371
[0357] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-Topi-ubi-tTAV2-SV40)
[0358] 0X4104(PB-YAFN-hsp83-tet〇2l-Hr5_IEl-Red)(圖I9).
[0359] 當將0X4371 (圖27)品系與3-鋅指品系雜交時，含有兩種質(zhì)粒的蠅完全可成活和 健康。品系F的雄性可育性無降低；然而品系B和E中分別存在45%和40%的降低。
[0360] 0X4391
[0361] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-Topi-ubi-tTAV2-Topi3'UTR)
[0362] 0X4104(PB-YAFN-hsp83-tet〇2l-Hr5_IEl-Red)(圖I9)
[0363] 評估品系0X4391G，C和D具有單個插入，同時品系B和H似乎各具有兩個拷貝的 轉(zhuǎn)基因。當將0X4391 (圖22)品系與tetO-3鋅指品系（0X4104,圖19)雜交時，似乎對含有 兩種質(zhì)粒的個體的生存力無任何負效應。這表明在體組織中存在非常低（如果有）的轉(zhuǎn)基 因的基礎表達。所有5個分析的品系中，B具有精子產(chǎn)生可成活后代能力的70%降低，同時 品系H為僅40%可育。在剩余的品系中，在開和關T下，卵生存力無顯著差異。結(jié)果強烈表 明該特定組合中存在兩個拷貝顯著減少測試的雄性的可育性。
[0364] 0X4391
[0365] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-Topi-ubi-tTAV2-Topi3，UTR)
[0366] 0X4112 (PB-IPP0-l-hsp83-tet021-Hr5-IEl-Red)
[0367] 當將相同的0X4391 (圖22)品系與IPP01品系雜交時，與含有兩種質(zhì)粒之一或都 不含的后代相比，在存在T的情況下含有兩種質(zhì)粒的后代的數(shù)量降低。如在類似的實驗中 描述的評估卵生存力。當與品系B，C，F(xiàn)和G中的野生型對照相比時，孵化的幼蟲的數(shù)量無 顯者降低。在品系H中存在50%的胚胎生存力降低。
[0368] Aetopi和Cctopi啟動子二者都顯示報道分子基因和tTAV的直接精巢-特異的表 達的能力，其隨后誘導報道分子基因或致死基因的精巢-特異表達。具體地，顯示1233-bp 序列（包括1168bp的Aetopi啟動子和65bpAetopi5' -UTR)驅(qū)動在埃及伊蚊（Ae. Aegypti)中tTAV-DsRed融合蛋白的精巢-特異表達（數(shù)據(jù)未顯示），并且tTAV表達可以 進一步誘導精巢-特異的AmCyan報道分子基因表達。1178bp推定的Cctopi啟動子不顯示 地中海果蠅（Medfly)中精巢-特異活性的證據(jù)。發(fā)現(xiàn)更大的（1708bp)Cctopi片段序列足 以驅(qū)動精巢-特異的tTAV表達。
[0369] 從應用遺傳工程的角度，證實使用的Cctopi推定的啟動子片段為地中海果蠅 (Medfly)中新的雄性生殖系-特異的啟動子，其比之前表征的0-2-微管蛋白啟動子更早 表達。
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[0436] 序列
[0437] 以下涉及此后提供的SEQ ID NOs :1-56。
[0438] SEQ ID NOS :l-5完全0 -2微管蛋白序列-不同昆蟲
[0439] SEQ ID NO ：1
[0440] > gi|l67822003|gb|EU386342. l| 地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata)) 0 _2 微管蛋白 mRNA，完全 cds
[0441] SEQ ID NO ：2
[0442] > gi|l58742|gb|M20420. l|DR0TUBB2A 黑腹果蠅（D.melanogaster) 0-2 微管蛋 白mRNA，完全cds
[0443] SEQ ID NO ：3
[0444] > gi 1111035017 | gb | DQ833526. 11 埃及伊蚊（Aedes aegypti) 0 _2 微管蛋白 (B2t)基因，完全cds
[0445] SEQIDNO：4
[0446] >gi|2198152711gb|EU938673. 11 東方果蠅（Bactroceradorsalis)P-2 微管蛋 白基因，完全cds
[0447] SEQIDNO：5
[0448] >gi| 219815267 |gb|EU938671. 11 加勒比按實妮（Anastrephasuspensa) 0 _2 微 管蛋白基因，完全cds
[0449] SEQIDN0S:6_10 :@-2微管蛋白5'UTR序列-不同昆蟲
[0450] SEQIDNO：6
[0451] >gi1167822003|gb|EU386342. 11 地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata)) 0 _2 微管蛋白 5'UTR
[0452] SEQIDNO：7
[0453] >gi1158742 |gb|M20420. 11DR0TUBB2A黑腹果蠅（D.melanogaster)P-2 微管蛋 白 5'UTR
[0454] SEQIDNO：8
[0455] >gi| 2198152711gb|EU938673. 11 東方果妮（Bactroceradorsalis) 0 _2 微管蛋 白 5'UTR
[0456] SEQIDNO：9
[0457] >gi| 111035017 |gb|DQ833526. 11 埃及伊蚊（Aedesaegypti) 0 _2 微管蛋白 (B2t)5,UTR
[0458] SEQIDNO: 10
[0459] >gi| 219815267 |gb|EU938671. 11 加勒比按實妮（Anastrephasuspensa) 0 _2 微 管蛋白5'UTR
[0460] SEQIDNOS: 11-15 -2微管蛋白3'UTR序列-不同昆蟲
[0461] SEQIDNO: 11
[0462] >gi1167822003 |gb|EU386342. 11 地中海實蠅（地中海果蠅（Ceratitis capitata)) 0 _2 微管蛋白 3'UTR
[0463] SEQIDNO: 12
[0464] >gi1158742 |gb|M20420. 11DR0TUBB2A黑腹果蠅（D.melanogaster)P-2 微管蛋 白mRNA3'UTR
[0465] SEQIDNO: 13
[0466] >gi| 111035017 |gb|DQ833526. 11 埃及伊蚊（Aedesaegypti) 0 _2 微管蛋白 (B2t)基因 3'UTR
[0467] SEQIDNO: 14
[0468] >gi| 2198152711gb|EU938673. 11 東方果妮（Bactroceradorsalis) 0 _2 微管蛋 白基因3'UTR
[0469] SEQIDNO: 15
[0470] >gi| 219815267 |gb|EU938671. 11 加勒比按實妮（Anastrephasuspensa) 0 _2 微 管蛋白基因3'UTR
[0471] tTAV和變體
[0472] SEQIDNO. 16 :tTAV的開放閱讀框
[0473] SEQIDNO. 17 :tTAV的蛋白序列
[0474] SEQIDNO. 18 :tTAV2 的開放閱讀框
[0475] SEQIDNO. 19 :tTAV2 的蛋白序列
[0476] SEQIDNO. 20 :tTAV3 的開放閱讀框
[0477] SEQIDNO. 21 :tTAV3 的蛋白序列
[0478] SEQIDNO :22_ 來自黑腹果蠅（D.melanogaster)的 5' UTRP-2 微管蛋白
[0479] SEQIDNO :23-24_ 黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster)的b2 微管蛋白啟動子 序列（SEQIDNO24)與Dmb2-微管蛋白的mRNA序列（SEQIDNO23)比對（5,UTR包括 在比對中）
[0480] SEQIDNO :25_Hsp83 的ORF地中海果蠅（Medfly)
[0481] SEQIDNO :26_ 如由Genebank給出的 5,UTR
[0482] SEQIDNO :27-來自 4353 的Hsp835,UTR
[0483] SEQIDNO :28_Hsp83的氨基酸序列，地中海果蠅（Medfly)
[0484] SEQIDNO :29-來自 0X3831 的DmAly5,UTR
[0485] SEQIDNO :30-DmAly啟動子
[0486] SEQIDNO :31_tetR
[0487] SEQIDNO :32_Vpl6
[0488] 組合TETR和VP16序列產(chǎn)生tTAV序列。
[0489] SEQIDNO:33-DmTopicDNA
[0490] SEQIDNO:34_如在蠅基部發(fā)現(xiàn)的Dm啟動子序列
[0491] SEQIDNO:35-#0X4254Cctopi啟動子
[0492] SEQIDNO :36_#0X4275Cctopi啟動子
[0493] SEQIDNO :37_#0X4371Cctopi啟動子
[0494] SEQIDNO:38-40-LA4254(SEQIDNO38)cfLA4275(SEQIDNO39)cf LA4371(SEQIDNO40)的比對
[0495] SEQIDNO :41_ 來自 4286 的伊蚊topi啟動子
[0496] SEQIDNO :42_ 來自 4286 的Aetopi 5, UTR
[0497] SEQIDNO:43_Topi黑腹果妮（Drosophilamelanogaster)ORF(編碼區(qū)域）
[0498] SEQIDNO:44_ 來自黑腹果妮（Drosophilamelanogaster)的AlyORF(編碼區(qū) 域）
[0499] SEQIDNO :45-LA3671B2 微管蛋白啟動子和 5'UTR
[0500] SEQIDNO :46-LA4353B2 微管蛋白啟動子
[0501] SEQIDNO:47-LA4353hsp835'UTR
[0502] SEQIDNO:48-B2 微管蛋白 5'UTR
[0503] SEQIDNO:49_Ae魚精蛋白
[0504] SEQIDNO:50_SG4
[0505] SEQIDNO:51-Fokl切割結(jié)構域
[0506] SEQIDNO:52-Ae魚精蛋白-SG4-Fokl
[0507] SEQIDN0:53_地中海果蠅（Medfly)B2微管蛋白啟動子正向引物
[0508] SEQIDN0:54_地中海果蠅（Medfly)B2微管蛋白啟動子反向引物
[0509] SEQIDNO:55-TopitestFl引物
[0510] SEQIDNO:56-TopitestR引物
[0511] SEQIDNO： 23-24
[0512] 黑腹果蠅的b2微管蛋白啟動子序列與Dmb2-微管蛋白的mRNA序列比對（5'UTR 包括在比對中）
[0513]
[0514]
[0515]
[0516]
[0517]
【權利要求】
1. 一種適于在節(jié)肢動物雄性生殖系中條件表達效應物基因的節(jié)肢動物雄性生殖系基 因表達系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括： -第一表達單元，所述第一表達單元包含效應物基因和與其可操作連接的用于其的啟 動子； -第二表達單元，所述第二表達單元包含轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列和可操作連接于其的上 游調(diào)控元件，所述轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于第一表達單元的啟動子上以驅(qū)動效應物基因的表 達，所述上游調(diào)控元件包括： -轉(zhuǎn)錄因子的啟動子；和 -臨近轉(zhuǎn)錄因子編碼序列起始位點的5' UTR ; 所述上游調(diào)控元件驅(qū)動轉(zhuǎn)錄因子的足量表達，從而轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)而在減數(shù)分裂前驅(qū) 動效應物基因的轉(zhuǎn)錄。
2. 根據(jù)權利要求1所述的基因表達系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄激活劑，如tTA， GAL4或它們的變體。
3. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中所述效應物是核酸內(nèi)切酶，最 優(yōu)選為3-鋅指核酸酶。
4. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中第一表達單元的啟動子是最小 啟動子。
5. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中第二表達單元中上游調(diào)控元件 的啟動子大多來自topi，aly或β-2微管蛋白（B2T)或其同源物。
6. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中第二表達單元的上游調(diào)控元件 中的5'UTR是來自hsp83,優(yōu)選來自地中海果蠅或hsp83的同源物，特別是在目標節(jié)肢動物 中發(fā)現(xiàn)的hsp83同源物的5' UTR。
7. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中使用Gal4-UAS系統(tǒng)，從而轉(zhuǎn)錄 因子是GAL4。
8. 根據(jù)權利要求1-6任一項所述的基因表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是誘導型系統(tǒng)，其中 誘導通過提供化學實體發(fā)生，如通過提供四環(huán)素發(fā)生，或通過提供四環(huán)素的類似物之一發(fā) 生，所述四環(huán)素的類似物包括多西環(huán)素。
9. 根據(jù)權利要求8所述的基因表達系統(tǒng)，其中第二表達單元中的轉(zhuǎn)錄因子是tTA或其 變體（tTAV，tTAV2, tTAV3)。
10. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中第二表達單元的轉(zhuǎn)錄因子是 tTA或變體并且所述第一表達單元包括tet操縱子（tetO)。
11. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中所述節(jié)肢動物是昆蟲，優(yōu)選雙 翅目（Dipteran)，包括實蠅科（Tephritid)，如地中海果蠅或橄欖果蠅。
12. 根據(jù)任一項在前權利要求所述的基因表達系統(tǒng)，其中所述效應物是核酸酶并賦予 或給予父本效應致死性。
13. -種在性腺或精子中表達效應物蛋白的方法，所述方法包括用根據(jù)任一項在前權 利要求的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化所述性腺。
14. 一種群體控制的方法，所述方法包括在雄性節(jié)肢動物的性腺中表達根據(jù)權利要求 1-12任一項所述的表達系統(tǒng)的效應物蛋白。
15. -種抗性管理方法，所述方法包括使用根據(jù)權利要求1-12任一項所述的表達系 統(tǒng)。
16. -種質(zhì)量控制方法，所述方法包括：包括報道分子如熒光蛋白作為根據(jù)權利要求 1-12任一項所述的表達系統(tǒng)中的效應物蛋白，或在根據(jù)權利要求1-12中任一項的表達系 統(tǒng)中的效應物蛋白之外包括報道分子如熒光蛋白，從而來自所述系統(tǒng)的表達被誘導或去抑 制的個體在合適波長的光下變得可見。
17. -種確定雌性節(jié)肢動物的交配狀況的方法，所述方法包括在轉(zhuǎn)基因雄性群體中使 用根據(jù)權利要求1-12任一項所述的表達系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包含標記如熒光報道蛋白；并 且精子存在時，測定雌性中所述標記的存在；標記的存在表示雌性已經(jīng)與攜帶所述系統(tǒng)的 轉(zhuǎn)基因雄性交配。
【文檔編號】C12N15/85GK104271747SQ201380023783
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月5日 優(yōu)先權日:2012年3月5日
【發(fā)明者】L·阿爾菲 申請人:奧西泰克有限公司