木質纖維素水解產物脫毒的方法

木質纖維素水解產物脫毒的方法
【專利摘要】本公開涉及對從木質纖維素生物質獲得的水解產物進行脫毒的方法和從所述脫毒的水解產物生產乙醇的方法。本發(fā)明的方法提供了脫毒的水解產物，其中相對于所述起始水解產物，對發(fā)酵微生物有害的化合物的量顯著降低，并且其中總可發(fā)酵性糖損失量最小化。
【專利說明】木質纖維素水解產物脫毒的方法

【背景技術】
[0001] 許多工業(yè)產品通過在培養(yǎng)物中生長的微生物來生產。微生物生長可以由木質 纖維素生物質所釋放的可溶性糖分子來支持。木質纖維素生物質主要由纖維素（通過 β-1，4-糖苷鍵相連的葡萄糖的聚合物）、半纖維素（由通過各種不同的β連鍵和α連鍵 相連的五碳（C5)糖和六碳（C6)糖構成的多糖）和木質素（由通過醚鍵或碳-碳鍵相連的 苯丙烷單元構成的復雜聚合物）構成。在某些情況下，對木質纖維素生物質進行稀酸水解， 在此期間半纖維素被水解成單體糖（液體流），并且纖維素的晶體結構被破壞，便于將來的 酶消化（固體纖維）。從纖維素和木質素固體分離出含有C5糖和C6糖的液體、即所謂的水 解產物，并且其可以被發(fā)酵成各種產品，例如乙醇。然而，除了糖之外，水解產物還含有脂族 酸、酯（乙酸酯）、酚物質（從木質素水解獲得的不同化合物）和糖脫水的產物，包括呋喃醛 類糠醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF)。大多數這些化合物對微生物具有負面影響并且可以抑制 發(fā)酵。在發(fā)酵之前將水解產物脫毒，是為了避免由水解產物中存在的有毒化合物引起的抑 制而可以采取的一種措施。
[0002] 已經試驗了各種脫毒方法，其中超施堿石灰（alkaline overliming)是高效和高 成本效益的。在超施石灰過程中，通常在高溫下，通過添加適量氫氧化鈣（石灰），將水解產 物的pH從約2的pH暫時提高到9至10之間的pH。在一段時間、通常為約30分鐘后，通過 添加酸將水解產物溶液的pH降低到適合于發(fā)酵微生物的pH。在所述脫毒過程中，呋喃醛被 降解，并且酸（無機酸和有機酸）被中和。
[0003] 超施石灰已被了解很長時間（Leonard和他加7，1945，1]1(^1^· Chem.，37 (4) :390 - 395)，并且仍被當作是有效的脫毒方法。然而，所述方法的顯著缺點 是在脫毒期間發(fā)生可發(fā)酵性糖的相當大量的損失。參見例如Larsson等，1999，Appl. Biochem. Biotechnol. 77-79:91-103。可發(fā)酵性糖的損失導致可發(fā)酵產物例如乙醇的 總得率較低。此外，脫毒期間不溶性硫酸鈣（石膏）的形成也是有問題的。參見例如 Martinez 等，2001，Biotechnol. Prog. 17 (2) : 287 - 293。石膏形成引起結垢和管線堵塞， 這顯著抬高了維護成本。為了克服與氫氧化鈣相關的問題，已經嘗試了將其他堿用于水解 產物脫毒目的，并取得了不同程度的成功。參見例如Alriksson等，2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121-124:911-922。
[0004] 因此，對于減少從木質纖維素生物質獲得的水解產物中的發(fā)酵抑制劑和對所述水 解產物進行脫毒的新的改進的方法，存在著需求。具體來說，對于經濟上可行并且提供能夠 以高得率生產乙醇的脫毒的水解產物的脫毒方法，存在著需求。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本公開源自于下述發(fā)現，即多步驟脫毒方法可以顯著減少從木質纖維素生物質獲 得的水解產物（在本文中有時被稱為"木質纖維素水解產物"）中對發(fā)酵微生物有害的化合 物的量，并且所述脫毒方法產生最小的可發(fā)酵性糖損失。當在本文中使用時，術語"脫毒"是 指從起始木質纖維素水解產物除去一種或多種對發(fā)酵微生物有害的化合物（在本文中被 稱為"毒素"）或使其失活，由此形成脫毒的水解產物的過程。當在本文中使用時，短語"脫 毒的水解產物"是指與在對水解產物進行本公開的多步驟脫毒方法之前的水解產物（在本 文中被稱為"起始水解產物"）中的毒素水平相比，含有較低毒素水平的水解產物。這樣的 毒素包括但不限于呋喃醛、脂族酸、酯和酚物質。
[0007] 因此，總的來說，本公開提供了降低水解產物對發(fā)酵生物體的毒性（即脫毒）的方 法。更具體來說，本公開涉及在不同時間添加至少兩種不同的堿或堿的混合物，以實現水解 產物脫毒的方法。在本公開的某些情況下，脫毒包括兩步方法。第一步包括將水解產物的起 始溶液（即起始水解產物溶液）與其量足以將所述溶液的pH提高到足以中和所述溶液中 存在的大部分酸（例如脂肪酸）的值的第一種堿或第一種堿的混合物進行混合，并且第二 步包括將所述水解產物溶液與其量足以將所述水解產物溶液的pH提高到足夠的值的第二 種堿或第二種堿的混合物進行混合，所述混合歷時足以移除所述溶液中顯著量的毒素（例 如呋喃醛）的時間，由此產生脫毒的水解產物溶液。
[0008] 所述水解產物脫毒方法的第一步（即將所述水解產物與所述第一種堿或第一種 堿的混合物進行混合）可以在3至9范圍內的pH，例如3、4、5、6、7、8或9的pH下進行。在 特定實施方式中，所述pH在以任兩個上述實施方式為邊界的范圍之內，例如3至4、3至5、 4至6等范圍內的pH。
[0009] 所述水解產物脫毒方法的第二步（即將所述水解產物與第二種堿或第二種堿的 混合物進行混合）可以在7至10范圍內的pH，例如7、8、9或10的pH下進行。在特定實施 方式中，所述pH在以任兩個上述實施方式為邊界的范圍之內，例如7至9、8至9、8至10等 范圍內的pH。
[0010] 生物質優(yōu)選地為木質纖維質的，并且可以包括但不限于種子、谷粒、塊莖、植物廢 料或食品加工或工業(yè)加工的副產物（例如莖桿）、玉米（包括玉米芯、秸桿等）、禾本科植物 (包括例如印度草，例如黃假高粱（Sorghastrum nutans),或柳枝稷例如稷屬物種（Panicum species)如柳枝稷（Panicum virgatum))、木材（包括例如木片、加工廢料）、紙張、紙楽和 再生紙（包括例如報紙、打印紙等）。其他生物質材料包括但不限于馬鈴薯、大豆（例如油 菜籽）、大麥、黑麥、燕麥（oat spelt)、小麥、甜菜和甘鹿?jié)O。生物質的其他來源公開在第 4. 1節(jié)中，并且可用于本發(fā)明的方法中。從木質纖維素生物質獲得的木質纖維素水解產物導 致產生糖、脂族酸、酚物質和糖脫水的產物（例如糠醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF))。
[0011] 在脫毒之前，所述水解產物溶液中水解產物的個體化合物的濃度部分取決于獲得 所述水解產物的生物質和用于水解所述生物質的方法。在某些實施方式中，所述起始水解 產物溶液包含（a)濃度在30g/L至160g/L、40g/L至95g/L或50g/L至70g/L范圍內的總 可發(fā)酵性糖；(b)濃度在0. 5g/L至10g/L、2. 5g/L至4g/L或1.5g/L至5g/L范圍內的糠醛； (c)濃度在 0. lg/L 至 5g/L、0. 5g/L 至 2. 5g/L 或 lg/L 至 2g/L 范圍內的 5-HMF ; (d)濃度在 2g/L至17g/L或llg/L至16g/L范圍內的乙酸；（e)濃度在Og/L至12g/L或4g/L至10g/ L范圍內的乳酸；(f)濃度在Og/L至2. 5g/L范圍內的其他脂族酸（例如琥珀酸、甲酸、丁酸 和乙酰丙酸）；和/或（g)濃度在0g/L至10g/L、0. 5g/L至5g/L或lg/L至3g/L范圍內的 酚物質。
[0012] 在脫毒之前，可以將所述起始水解產物溶液濃縮。例如，在生物質水解后，可以將 水解產物溶液濃縮1. 2倍、1. 5倍、2倍、3倍或5倍。在特定實施方式中，將所述起始水解產 物濃縮以任兩個上述實施方式為邊界的范圍，例如濃縮1倍至3倍、1. 5倍至3倍、3倍至5 倍等的范圍。
[0013] 有利情況下，向所述水解產物溶液添加的所述第一種堿包含含鎂堿（例如氫氧化 鎂、碳酸鎂或氧化鎂），其可以中和所述水解產物溶液中存在的任何酸，并在一定程度上與 所述水解產物溶液中的其他毒素反應。在特定實施方式中，向所述水解產物溶液添加的所 述第一種堿是氫氧化鎂。
[0014] 在本公開的某些情況下，向所述水解產物溶液添加的所述第二種堿包括氫氧化 銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或其混合物。在特定實施方式中，向所述水解產物溶液添 加的所述第二種堿是氫氧化銨。
[0015] 在某些實施方式中，所述脫毒方法的每個步驟可以在相同或基本上相似的溫度下 進行。在這些實施方式中，所述水解產物溶液的脫毒可以在25°C或更高和90°C或更低的溫 度下進行。所述脫毒方法可以在例如 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、 75°C、80°C、85°C或90°C下進行。在特定實施方式中，所述脫毒方法可以在以任兩個上述溫 度為邊界的范圍內的溫度下，例如在40°C至60°C、45°C至55°C、45°C至50°C等范圍內的溫 度下進行。
[0016] 在其他實施方式中，所述脫毒方法的每個步驟可以在不同溫度下進行。例如，在添 加所述第一種堿后所述水解產物溶液的溫度，可以不同于在添加所述第二種堿和/或第三 種堿等后所述水解產物溶液的溫度。在涉及兩種堿（或兩種堿的混合物）的添加的實施方 式中，在所述脫毒方法的第一步（即混合所述水解產物與所述第一種堿）期間的溫度可以 在30°C至90°C之間的范圍內，并且更通常在40°C至70°C之間的范圍內。在這些實施方式 中，在所述脫毒方法的第二步（即混合所述水解產物與所述第二種堿）期間的溫度可以在 30°C至80°C之間的范圍內，并且更通常在40°C至60°C之間的范圍內。
[0017] 所述脫毒過程可以作為分批過程、作為連續(xù)過程或作為半連續(xù)過程來進行。例如， 脫毒過程可以在分批反應器、連續(xù)攪拌釜式反應器（CSTR)或活塞流反應器（PFR)中進行。 在某些實施方式中，所述脫毒的每個步驟可以在同一分批反應器中進行。在這些實施方式 中，可以在所述起始水解產物溶液中的酸已被所述第一種堿或第一種堿的混合物充分中和 之后，向所述分批反應器添加所述第二種堿或第二種堿的混合物。在其他實施方式中，脫毒 過程的每個步驟可以在不同反應器中進行。例如，在涉及兩種堿（或兩種堿的混合物）的 添加的實施方式中，所述脫毒方法的第一步（即混合所述水解產物與所述第一種堿）可以 在CSTR中進行，并且所述第二步（即混合所述水解產物與所述第二種堿）可以在PFR中進 行。在其他實施方式中，所述脫毒方法的第一步可以在PFR中進行，并且所述第二步可以在 CSTR中進行。在其他實施方式中，兩個步驟可以在PFR中進行。在其他實施方式中，兩個步 驟可以在CSTR中進行。
[0018] 在某些實施方式中，本公開提供了用于連續(xù)減少木質纖維素水解產物中呋喃醛的 量的方法，所述方法包括下列步驟：將水解產物溶液流入第一反應器或第一反應器系列中， 所述溶液包含可發(fā)酵性糖、呋喃醛、酚物質和脂族酸的混合物，將第一種堿流入所述第一反 應器或第一反應器系列中，將所述水解產物溶液與所述第一種堿在所述第一反應器或第一 反應器系列中反應歷時足以中和所述水解產物溶液中的酸的時段，將所述水解產物溶液流 入所述第二反應器或第二反應器系列中，將第二種堿流入所述第二反應器或第二反應器系 列中，將所述水解產物溶液與所述第二種堿在所述第二反應器或第二反應器系列中反應歷 時足以減少所述水解產物溶液中的呋喃醛的量的時段，由此產生脫毒的水解產物溶液，以 及將所述脫毒的水解產物溶液流出所述第二反應器或第二反應器系列。
[0019] 本公開的方法提供了脫毒的水解產物，其具有存在于所述起始水解產物中的至少 70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少93%、至少95%或至少99%的總 可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產物中的不超過70 %、不超過60 %、不超過50 %、不超 過40%、不超過30 %、不超過20 %或不超過10 %的呋喃醛。在特定實施方式中，本公開的 脫毒方法提供了脫毒的水解產物，其具有（a)存在于所述起始水解產物中的至少90%的總 可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產物中的不超過50 %的呋喃醛；(b)存在于所述起始水 解產物中的至少90 %的總可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產物中的不超過40 %的呋喃 醛；（c)存在于所述起始水解產物中的至少90%的總可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產 物中的不超過30 %的呋喃醛；（d)存在于所述起始水解產物中的至少90 %的總可發(fā)酵性糖 和存在于所述起始水解產物中的不超過20%的呋喃醛；（e)存在于所述起始水解產物中的 至少80%的總可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產物中的不超過50%的呋喃醛；（f)存在 于所述起始水解產物中的至少80%的總可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產物中的不超 過40 %的呋喃醛；（g)存在于所述起始水解產物中的至少80 %的總可發(fā)酵性糖和存在于所 述起始水解產物中的不超過30%的呋喃醛；或（h)存在于所述起始水解產物中的至少80% 的總可發(fā)酵性糖和存在于所述起始水解產物中的不超過20%的呋喃醛。
[0020] 本公開的脫毒的水解產物可以更高效地被發(fā)酵微生物發(fā)酵，以生產發(fā)酵產物例如 乙醇。因此，本公開的方法還包括在按照本公開生產的脫毒的水解產物存在下，在產生發(fā)酵 產物的條件下培養(yǎng)微生物。可以使用各種發(fā)酵微生物（例如產乙醇菌）來生產乙醇，例如 在第4. 5節(jié)中所描述的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1 :本公開的示例性連續(xù)過程的示意流程圖。
[0022] 圖2 :描述了使用氫氧化鎂和隨后的氫氧化銨的兩步脫毒方法，在不同的初始pH 靶（pH 8. 5和9.0)下進行的脫毒反應的不同時間點處，木糖和糠醛消除的量的圖。
[0023] 圖3 :示出了使用串聯CSTR構造的雙堿脫毒過程的示意圖。每個端口可用于遞送 堿或堿漿液，每個容器可以獨立地保持溫度。
[0024] 詳細描述
[0025] 本公開涉及對從生物質獲得的水解產物進行脫毒的方法以及從所述脫毒的水解 產物生產發(fā)酵產物例如乙醇的方法?？捎糜诒景l(fā)明的方法的生物質的類型包括但不限于在 第4. 1節(jié)中所描述的。水解生物質的方法描述在第4. 2節(jié)中。水解產物在脫毒之前的典型 組成描述在第4. 3節(jié)中。使用多種堿對水解產物進行脫毒的方法描述在第4. 4節(jié)中。發(fā)酵 脫毒的水解產物以生產發(fā)酵產物的方法描述在第4. 5節(jié)中，并且回收發(fā)酵產物的方法描述 在第4. 6節(jié)中。
[0026] 生物質（4. 1節(jié)）
[0027] 當在本文中使用時，術語"生物質"是指包含纖維素（任選地還包含半纖維素和/ 或木質素）的任何組合物。
[0028] 可以按照本公開水解或脫毒的相關類型的生物質可以包括來自于下列物質的生 物質：農作物，例如含有谷粒的農作物；玉米秸桿，禾本科植物，甘蔗渣，來自于例如水稻、 小麥、黑麥、燕麥、大麥、油菜、高粱的桿；塊莖，例如甜菜和馬鈴薯。
[0029] 生物質優(yōu)選地是木質纖維素的。木質纖維素生物質適合地來自于禾本科。正確名 稱是有花植物的百合綱（Liliopsida)(單子葉植物綱）中被稱為禾本科（Poaceae)或牧草 科（Gramineae)的科。這一科的植物通常被稱為禾本科植物，并包括竹。禾本科植物存在 約600個屬和約9, 000-10, 000或更多的種（《Kew世界禾本科植物物種索引》（Kew Index of World Grass Species))。
[0030] 禾本科（Poaceae)包括在全世界生長的主食用糧和禾谷類作物、草坪和飼料用草 以及竹。
[0031] 禾本科植物的成功部分在于它們的形態(tài)和生長過程，部分在于它們的生理學多樣 性。大多數禾本科植物分成兩個生理學組，使用C3和C4光合途徑進行碳固定。C4禾本科 植物具有與特化的葉解剖學相關聯的光合途徑，所述葉解剖學使它們特別適應于炎熱氣候 和低二氧化碳的大氣。C3禾本科植物被稱為"冷季禾本科植物"，而C4植物被稱為"暖季禾 本科植物"。
[0032] 禾本科植物可以是一年生或多年生的。一年生冷季禾本科植物的實例是小麥、黑 麥、一年生藍草（一年生草地早熟禾，Poa annua)和燕麥。多年生冷季禾本科植物的實例 是野茅（鴨茅，Dactylis glomerata)、羊茅（Festuca spp·)、肯塔基藍草和多年生黑麥草 (Lolium perenne)。一年生暖季禾本科植物的實例是玉米、蘇丹草和珍珠稷。多年生暖季 禾本科植物的實例是大須芒草、假高粱、狗牙根和柳枝稷。
[0033] 禾本科植物的一種分類辨別出12個亞科：它們是l)anomochlooideae，一個闊 葉禾本植物的小譜系，其包括兩個屬（Anomochloa，Streptochaeta) ;2)Pharoideae(aka Poaceae)，包含三個屬、包括Pharus和Leptaspis的禾本科植物的小譜系；3)Puelioideae, 包括非洲Puelia屬的小譜系；4)早熟禾亞科（Pooideae)，其包括小麥、大麥、燕麥、雀麥 草（Bronnus)和拂子茅（Calamagrostis) ;5)竹亞科（Bambusoideae)，其包括竹子；6)稻 亞科（Ehrhartoideae)，其包括水稻和野生稻；7)蘆竹亞科（Arundinoideae)，其包括蘆竹 和蘆葦；8)假淡竹葉亞科（Centothecoideae)，由11個屬組成的小亞科，有時被包含在黍 亞科（Panicoideae)中； 9)畫眉草亞科（Chloridoideae)，其包括畫眉草（Eragrostis， 約350個種，包括埃塞俄比亞畫眉草）、鼠尾粟（Sporobolus，約160個種）、龍爪稷 (Eleusine coracana(L.)Gaertn.)和亂子草（Muhlenbergia，約 175 個種）；10)黍亞科 (Panicoideae)，包括黍、玉米、高粱、甘鹿、大多數粟、fonio和須芒草；ll)Micrairoideae ; 12)Danthoniodieae，包括蒲華；其中早熟禾屬（Poa)是包含原產于兩個半球的溫帶地區(qū)的 約500個禾本科植物物種的屬。
[0034] 為其可食用的種子而種植的農業(yè)禾本科植物被稱為谷類。三種常見的谷類是水 稻、小麥和玉米。在所有作物中，70 %是禾本科植物。
[0035] 因此，優(yōu)選的生物質選自能源作物。在另一種優(yōu)選實施方式中，能源作物是禾本 科植物。優(yōu)選的禾本科植物包括象草（Napier Grass)或烏干達草（Uganda Grass),例如 象草（Pennisetum purpureum);或芒草（Miscanthus)例如奇崗(Miscanthus giganteus) 和芒屬（Miscanthus)的其他品種，或印度草（Indian grass)例如黃假高粱（Sorghastrum nutans);或柳枝稷例如柳枝稷（Panicum virgatum)或稷屬（Panicum)的其他品種，蘆竹 (arundo donax)，能源甘鹿（saccharum spp·)，木材（包括例如木片、加工廢料）、紙張、紙 漿和再生紙（包括例如報紙、打印紙等）。在某些實施方式中，生物質是甘蔗，其是指甘蔗屬 (Saccharum)的高的多年生禾本科植物的任何物種。
[0036] 其他類型的生物質包括種子、谷粒、塊莖（例如馬鈴薯和甜菜）、植物廢料或食品 加工或工業(yè)加工的副產物（例如桿）、玉米和玉米副產物（包括玉米皮、玉米芯、玉米纖維、 玉米秸桿等）、木材和木材副產物（包括例如加工廢料、落葉木材、針葉木材、木片（例如 落葉或針葉木片）、鋸末（例如落葉或針葉木鋸末））、紙張和紙張副產物（例如木漿、廢材 和再生紙，包括例如報紙、打印紙等）、大豆（例如油菜籽）、大麥、黑麥、燕麥、小麥、甜菜、 蘇丹高粱、買羅高粱、碾碎的干小麥、水稻、甘蔗渣、林業(yè)殘余物、農業(yè)殘余物、藜麥、麥草、高 粱桿、柑橘廢料、城市綠色廢物或殘余物、食品制造工業(yè)廢料或殘余物、谷物制造廢料或殘 余物、干草、禾桿、稻草、谷粒殼、用過的酒糟、稻殼、柳木、杉木、楊木、桉木、埃塞俄比亞芥 (Brassica carinata)殘余物、海棠寥（Antigonum leptopus)、楓香樹、胡枝子（Sericea lespedeza)、烏柏、大麻、油菜籽、高粱（Sorghum bicolor)、大豆和大豆產品（大豆葉、大豆 莖、大豆莢和大豆殘余物）、向日葵和向日葵產品（例如葉、向日葵莖、無籽向日葵頭、葵花 籽殼和葵花籽殘余物）、蘆竹、堅果殼、落葉木葉子、棉纖維、糞肥、沿海百慕大草、三葉草、 約翰遜草、亞麻、禾桿（例如大麥桿、蕎麥桿、燕麥桿、黍桿、黑麥桿、莧菜桿、斯佩耳特小麥 桿）、莧菜和莧菜產品（例如莧菜莖、莧菜葉和莧菜殘余物）、苜蓿和竹子。
[0037] 生物質的其他來源包括硬木和軟木。適合的軟木和硬木樹的實例包括但不限于 下列：松樹，例如火炬松、短葉松、加勒比松、美國黑松、美國短葉松、沼澤松、洪都拉斯松、馬 尾松、蘇門答臘松、山白松、卵果松、長葉松、帕圖拉松、海岸松、西黃松、輻射松、紅松、北美 白松、歐洲赤松、南洋杉樹；杉樹,例如花旗松；以及鐵杉樹，加上任何上述樹的雜交種。其 他實例包括但不限于下列：桉樹，例如鄧恩桉、藍桉、玫瑰桉、悉尼藍桉、帝汶白桉和尾巨桉 (E. urograndis)雜交種；楊樹，例如美洲黑楊、大齒楊、顫楊和黑楊；以及其他硬木樹例如 赤楊、楓香、馬褂木、闊葉涔木、綠白蠟木和柳樹，加上任何上述樹的雜交種。
[0038] 生物質的水解（4. 2節(jié)）
[0039] 任何水解方法可用于制備木質纖維素水解產物，包括酸水解和堿水解。酸水解是 便宜和快速的方法，并且可以適合地使用。濃酸水解優(yōu)選地在20°C至100°C的溫度下進 行，并且酸強度在10%至45%的范圍內（例如10%、10. 5%、11 %、11. 5%、12%、12. 5%、 13%U3. 5%,14%U4. 5%U5%U5. 5%U6%U7%U7. 5%U8%U8. 5%,19%U9. 5%, 20%,20. 5%,21%,21. 5%,22%,22. 5%,23%,23. 5%,24%,24. 5%,25%,25. 5%,26%, 26. 5 %,27 %,27. 5 %,28 %,28. 5 %,29 %,29. 5 %,30 %,30. 5 %,31 %,31. 5 %,32 32. 5%,33%,33. 5%,34%,34. 5%,35%,35. 5%,36%,37%,37. 5%,38%,38. 5%,39%, 39. 5%、40%、41%、41. 5%、42%、42. 5%、43%、43. 5%、44%、44. 5%、45%或以任兩個上 述值為邊界的任何范圍）。稀酸水解是更簡單的方法，但是在更高溫度（l〇〇°C至230°C) 和壓力下最優(yōu)。優(yōu)選地使用不同種類的酸，其中濃度在0.001%至10%的范圍內（例 如 0· 001 %、0· 01 %、0· 05%、0· 1%、0· 15%、0· 2%、0· 25%、0· 3%、0· 35%、0· 4%、0· 5%、 0. 6 %,0. 7 %,0. 8 %,0. 9 %U %>2 %,3 %,4 %,5 %,5. 5 %,6 %,6. 5 %,7 %,7. 5 %,8 %, 8. 5%、9%、9. 5%或10%或以任兩個上述值為邊界的任何范圍）。在水解步驟中可以使用 適合的酸，包括硝酸、亞硫酸、亞硝酸、磷酸、乙酸、鹽酸和硫酸。優(yōu)選情況下使用硫酸。
[0040] 取決于酸的濃度、執(zhí)行酸水解步驟的溫度和壓力，可能需要耐腐蝕設備和/或耐 壓設備。
[0041] 水解可以進行 2 分鐘至 10 小時（例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、26、27、28、 29 或 30 分鐘，或 0· 5、0· 75、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8· 5、9、9· 5 或10小時，或以任兩個上述值為邊界的范圍）、優(yōu)選地1分鐘至2小時、2分鐘至15分鐘、 2分鐘至2小時、15分鐘至2小時、30分鐘至2小時、10分鐘至1. 5小時或1小時至5小時 的時段。
[0042] 作為酸處理的可替選方案（例如在不存在酸水解的情況下）或除了酸水解之外 (例如在其之前或之后），水解還可以包括熱或壓力處理或熱和壓力的組合，例如用蒸汽處 理約 0· 5 小時至約 10 小時（例如 0· 5、1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、 8. 5、9、9. 5或10小時，或以任兩個上述值為邊界的范圍）。
[0043] 酸水解方法的變化形式在本領域中是已知的，并且可以被本公開的方法所涵蓋。 例如，可以通過使生物質材料經歷兩步過程來進行水解。第一（化學）水解步驟在水性介 質中、在所選溫度和壓力下進行，以主要實現半纖維素的解聚而不實現纖維素向葡萄糖的 顯著解聚。這一步驟產生漿液，其中液體水性相含有從半纖維素的解聚得到的溶解的單糖 和可溶性和不溶性的半纖維素寡聚物，并且固體相含有纖維素和木質素。參見例如美國專 利號5, 536, 325。在優(yōu)選實施方式中，利用硫酸來執(zhí)行第一水解步驟。在從第一階段的水解 過程分離糖之后，在更嚴苛的條件下運行第二水解步驟，以水解更具有抗性的纖維素級分。
[0044] 在另一種實施方式中，水解方法要求使生物質材料在反應器中經歷包含強酸和金 屬鹽的稀溶液的催化劑。生物質材料可以是例如原材料或干燥的材料。這種類型的水解可 以降低纖維素水解的活化能或溫度，最終允許可發(fā)酵性糖的較高得率。參見例如美國專利 號 6, 660, 506、6, 423, 145。
[0045] 另一種示例性方法包括下列步驟：通過一個或多個使用約0. 4%至約2%的酸的 稀酸水解階段來加工生物質材料；然后用堿去木質素作用處理酸水解的材料的未反應的固 體木質纖維素組分。參見例如美國專利號6, 409, 841。另一種示例性水解方法包括在預水 解反應器中對生物質（例如木質纖維素材料）進行預水解；向固體木質纖維素材料添加酸 性液體以制造混合物；將所述混合物加熱至反應溫度；將反應溫度維持足以將木質纖維素 材料分級成含有來自于所述木質纖維素材料的至少約20%的木質素的增溶的部分，以及含 有纖維素的固體級分；將所述增溶的部分與所述固體級分分離開，并在等于或接近反應溫 度下除去增溶的部分；以及回收所述增溶的部分。
[0046] 水解還可以包括將生物質材料與化學計算量的非常低濃度的氫氧化鈉和氫氧化 銨相接觸。參見 Teixeira 等，1999, Appl.Biochem. and Biotech. 77-79:19-34。水解還可 以包括將木質纖維素與化學品（例如堿，例如碳酸鈉或氫氧化鉀）在約9至約14的pH和 適度的溫度、壓力和pH下相接觸。參見PCT公開W0 2004/081185。
[0047] 也可以使用氨水解。這樣的水解方法包括使生物質材料在高固體條件下經歷低的 氨濃度。參見例如美國專利公布號20070031918和PCT公布W0 2006/110901。
[0048] 在水解后，水解產物包含酸和堿、部分降解的生物質和可發(fā)酵性糖的混合物。在進 一步加工之前，可以通過施加真空從混合物中除去酸或堿。也可以在脫毒之前將混合物中 和。
[0049] 在脫毒之前，可以在被稱為固/液分離的過程中，將包含增溶的糖的水性級分與 混合物中殘留的不溶性顆粒物分離開。將可溶性級分與不溶性級分分離開的方法包括但不 限于離心（連續(xù)、半連續(xù)和分批）、傾析和過濾?？梢匀芜x地將水解的生物質固體用水性溶 劑（例如水）清洗，以除去吸附的糖。
[0050] 在脫毒之前，可以對固體進行進一步處理，例如脫水。脫水可以使用螺旋壓力機適 合地實現。螺旋壓力機是使用大的螺桿將含有固體的料流沿著水平篩管推動的機器。固體 的移動可以受到管末端處的加重板的阻礙。該板對固體塞的壓力迫使液體流出固體并通過 篩管側面中的孔，然后沿著排液管流出。然后螺桿將剩余的固體推過所述板，在那里它們跌 落在下方的收集墊或傳送帶上。
[0051] 水解產物特征（4. 3節(jié)）
[0052] 在生物質水解和固/液分離步驟之后，對木質纖維素水解產物進行脫毒。在脫毒 之前的木質纖維素水解產物溶液（即起始木質纖維素水解產物溶液）中包含的個體化合 物、包括可發(fā)酵性糖、呋喃醛、脂族酸和酚物質的相對量和濃度，取決于具體的木質纖維素 生物質和獲得水解產物的水解方法。
[0053] 在某些實施方式中，起始水解產物溶液包含（a)濃度在30g/L至160g/L、40g/L至 95g/L或50g/L至70g/L范圍內的總可發(fā)酵性糖；(b)濃度在0. 5g/L至10g/L、2. 5g/L至 4g/L 或 1. 5g/L 至 5g/L 范圍內的糠醒；（c)濃度在 0. lg/L 至 5g/L、0. 5g/L 至 2. 5g/L 或 lg/ L至2g/L范圍內的5-HMF ;(d)濃度在2g/L至17g/L或llg/L至16g/L范圍內的乙酸；（e) 濃度在lg/L至12g/L或4g/L至10g/L范圍內的乳酸；（f)濃度在Og/L至2. 5g/L范圍內 的其他脂族酸（例如琥珀酸、甲酸、丁酸和乙酰丙酸）；和/或（g)濃度在〇g/L至10g/L、 0. 5g/L至5g/L或lg/L至3g/L范圍內的酚物質。在這些實施方式中，起始水解產物溶液在 本文中被稱為"lx"。
[0054] 在其他實施方式中，起始水解產物可以比lx更濃。例如，起始水解產物溶液可以 比lx濃1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在這些實施方式中，起 始水解產物將分別被稱為1. 5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x和10x。
[0055] 在其他實施方式中，起始水解產物濃度可以比lx更低。例如，起始水解產物溶液 的濃度可以為lx的〇. 1倍、〇. 2倍、0. 3倍、0. 4倍、0. 5倍、0. 6倍、0. 7倍、0. 8倍或0. 9倍。 在這些實施方式中，起始水解產物將分別被稱為0. lx、〇. 2x、0. 3x、0. 4x、0. 5x、0. 6x、0. 7x、 0· 8x 和 0· 9。
[0056] 在脫毒過程之前，可以調整可發(fā)酵性糖和毒素的濃度。在連續(xù)過程的情形中，水解 產物溶液的濃縮可能特別有利（參見圖1和第4. 4節(jié)）。例如，在稀酸水解和固/液分離后 離開水解器的水解產物溶液，可以在添加用于脫毒的第一種堿之前進行濃縮。在某些實施 方式中，在脫毒之前可以將水解產物溶液濃縮1. 2倍、1. 5倍、2倍、3倍或5倍。在特定實 施方式中，可以將起始水解產物在以任兩個上述實施方式為邊界的范圍內濃縮，例如濃縮1 倍至3倍、1. 5倍至3倍、3倍至5倍等。
[0057] 在脫毒之前濃縮水解產物溶液，可以導致對呋喃醛消除的選擇性增加到超過糖降 解。不受理論限制，據信對于糖降解來說反應速率是一階的，對于呋喃醛消除來說反應速率 是二階的。因此，濃縮水解產物溶液導致呋喃醛消除速率相對于可發(fā)酵性糖降解速率增加。
[0058] 水解產物溶液可以在減壓下和/或通過加熱來濃縮。在一種實施方式中，水解產 物溶液在多級蒸發(fā)裝置中濃縮（參見圖1和實施例1)。水解產物的濃縮液可以通過其他技 術例如膜過濾、碳處理和離子交換樹脂來進行。蒸發(fā)導致糖濃度增加，并且可以導致一定量 糠醛和乙酸鹽的移除。
[0059] 水解產物的脫毒（4. 4節(jié)）
[0060] 一般來說，本公開的脫毒方法需要使木質纖維素水解產物經歷多步過程，其中在 脫毒過程中的不同時間添加至少兩種不同的堿或兩種不同的堿的混合物。脫毒方法對于呋 喃醛的消除來說是高選擇性的。當在本文中使用時，短語"對呋喃醛的消除高選擇性"是指 觀察到呋喃醛被消除（反應）的速率高于可發(fā)酵性糖從水解產物中的消除速率。結果，按 照本公開生產的脫毒的水解產物相對于起始水解產物具有較高百分率的可發(fā)酵性糖和較 低百分率的呋喃醛。脫毒的木質纖維素水解產物然后可以被適合的發(fā)酵微生物（例如產乙 醇菌）發(fā)酵，以生產發(fā)酵產物（例如乙醇）。
[0061] 脫毒方法一般包括將起始木質纖維素水解產物溶液與第一種堿或第一種堿的混 合物，在引起水解產物溶液中存在的大部分酸（例如脂族酸和用于水解的酸的平衡離子） 中和的條件下混合一段時間，然后將所述水解產物溶液與顯著減少水解產物溶液中的毒素 (例如呋喃醛）的量的第二種堿或第二種堿的混合物混合。在每個步驟中使用的堿可以包 括但不限于氫氧化鎂、碳酸鎂、氧化鎂、氫氧化鈣、氫氧化銨和氫氧化鈉。在某些實施方式 中，第一種堿或第一種堿的混合物與第二種堿或第二種堿的混合物相同。在其他實施方式 中，第一種堿或第一種堿的混合物與第二種堿或第二種堿的混合物不同。
[0062] 適合于執(zhí)行脫毒過程的每個步驟的時間量取決于多種因素，包括水解產物的化學 組成、水解產物溶液的濃度、反應溫度、水解產物溶液的pH、在每個步驟中添加的堿的總量、 攪拌速率和所使用的反應器的類型。在脫毒包括兩個步驟的實施方式中，脫毒的第一步可 以進行1分鐘至15分鐘范圍內的時段，脫毒的第二步可以進行30分鐘至20小時范圍內的 時段?？偟拿摱具^程通常進行30分鐘至20小時范圍內的時段，更通常為1小時至10小時 之間。例如，總脫毒時間可以為1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或10小時。在特定實 施方式中，總脫毒過程進行1小時至6小時、1. 5小時至5小時、2小時至5小時、2. 5小時至 5小時、2. 5小時至4小時或3小時至4小時范圍內的時段。
[0063] 脫毒過程的第一步（即與第一種堿或第一種堿的混合物混合）通常在95°C或或更 低的溫度下，例如在 30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、 90°C或95°C的溫度下進行。在特定實施方式中，反應的第一步可以在以任兩個上述實施 方式為邊界的溫度下進行，例如但不限于40°C至80°C、40°C至70°C、40°C至65°C、40°C至 60°C、45°C至50°C、50°C至55°C或40°C至50°C范圍內的溫度。在添加水解產物溶液后的任 何時間，可以提高或降低混合物的溫度。
[0064] 在脫毒反應包含兩個步驟（即添加兩種堿）的實施方式中，過程的第二步（即 與第二種堿或第二種堿的混合物混合）通常在85°C或更低的溫度下，例如在40°C、45°C、 50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C或90°C的溫度下進行。脫毒過程的第一步的 溫度可以與脫毒過程的第二步的溫度相同或不同。在特定實施方式中，反應的第二步可以 在以任兩個上述實施方式為邊界的溫度下進行，例如但不限于40°C至80°C、40°C至70°C、 40°C至 65°C、40°C至 60°C、40°C至 50°C、50°C至 55°C、45°C至 50°C或 47°C至 50°C范圍內的 溫度。在添加第二種堿后的任何時間，可以提高或降低水解產物溶液的溫度。
[0065] 在特別有利的實施方式中，脫毒過程的第二步在約40°C至60°C之間的溫度范圍 內進行，這允許脫毒反應以商業(yè)上可行的速率進行，同時最小化可發(fā)酵性糖的損失，由此提 高發(fā)酵產物（例如乙醇）的得率。
[0066] 水解產物脫毒過程的第一步通常在3至9范圍內的pH下，例如在3、4、5、6、7、8或 9的pH下進行。在特定實施方式中，pH在以任兩個上述實施方式為邊界的范圍內，例如但 不限于3至4、3至5、4至5或4至6范圍的pH。應該理解，在添加第一種堿后水解產物溶 液的pH取決于向水解產物溶液添加的堿的本質和濃度。水解產物溶液的pH還取決于溫 度。例如，在第一種堿是氫氧化鎂的實施方式中，氫氧化鎂的溶解度隨著溫度升高而降低。 因此，對于向水解產物溶液添加的給定量的氫氧化鎂來說，當溫度升高，所有其他變量保持 恒定時，平衡pH降低。
[0067] 水解產物脫毒過程的第二步通常在7至10范圍內的pH，例如7、8、9或10的pH下 進行。在特定實施方式中，pH在以任兩個上述實施方式為邊界的范圍之內，例如但不限于7 至8、7至9、8至9或8至10范圍的pH。應該理解，在添加第二種堿后水解產物溶液的pH 取決于向水解產物溶液添加的堿的本質和濃度以及水解產物溶液的pH。還應該理解，溶液 的pH可以隨著脫毒過程的進展而改變。在過程期間可以通過添加適合的酸或堿來調整水 解產物溶液的pH。
[0068] 在本公開的某些情況下，在脫毒過程的第一步中向水解產物溶液添加的第一種堿 是含鎂堿，例如氫氧化鎂、碳酸鎂或氧化鎂。含鎂堿可以在單一步驟中、分多個部分或連續(xù) 地向水解產物溶液添加。在特定實施方式中，向水解產物溶液添加的第一種堿是氫氧化鎂。 氫氧化鎂在酸性pH水平下可以溶解在水性溶液中，但是在7的中性pH或更高pH下具有低 的溶解度。因此，氫氧化鎂在水解產物的等當量點附近提供緩沖效果。使用氫氧化鎂作為 第一種堿的特別優(yōu)點在于緩沖效果降低了在脫毒過程的第二步中添加第二種堿或第二種 堿的混合物之前pH超調的可能性。
[0069] 在脫毒過程的第一步中向水解產物溶液添加的含鎂堿的總量取決于水解產物溶 液的所需pH。通過添加較大量含鎂堿以獲得所需pH，可以獲得較高pH水平。在含鎂堿是 氫氧化鎂的實施方式中，可以在脫毒過程的第一步中向lx水解產物溶液添加以獲得3至8 之間的pH的氫氧化鎂的總量，可以在1克每1千克水解產物（lg/lkg水解產物）至30克 每1千克水解產物（30g/lkg水解產物）的范圍內。例如，向lx水解產物溶液添加的氫氧 化鎂的總量可以為1 g/ lkg水解產物、2g/ lkg水解產物、4g/ lkg水解產物、6g/ lkg水解產物、 8g/lkg水解產物、10g/lkg水解產物、12g/lkg水解產物、15g/lkg水解產物、20g/lkg水解產 物或25g/lkg水解產物。在特定實施方式中，向lx水解產物溶液添加的氫氧化鎂的總量在 以任兩個上述實施方式為邊界的范圍之內，例如但不限于lg/lkg水解產物至20g/lkg水解 產物、lg/lkg水解產物至10g/lkg水解產物、4g/lkg水解產物至20g/lkg水解產物、4g/lkg 水解產物至12g/lkg水解產物或10g/lkg水解產物至12g/lkg水解產物范圍內的氫氧化鎂 量。對于更濃的水解產物溶液（例如4x)來說，足以將pH升高到所需水平的氫氧化鎂的量 相對于lx水解產物溶液將會增加。對于濃度較低的水解產物溶液（例如〇.5x)來說，足以 將pH升高到所需水平的氫氧化鎂的量相對于lx水解產物溶液將會減少。
[0070] 在本公開的某些情況下，向水解產物溶液添加的第二種堿包括氫氧化銨、氫氧化 鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣或其混合物。在這些實施方式中，在添加第二種堿或第二種堿的混 合物后，溶液的pH被調整到7至11之間。例如，在添加第二種堿或第二種堿的混合物后， 水解產物的pH可以為7、8、9、10或11。在特定實施方式中，在添加第二種堿后溶液的pH可 以以任兩個上述值為邊界，例如但不限于7至9、8至9、8至10或9至11范圍內的pH。
[0071] 在本公開的某些情況下，在脫毒過程的第二步中向水解產物溶液添加的第二種堿 是氫氧化銨。氫氧化銨具有約9.25的pK b。結果，可以將水解產物溶液的pH升高至所需 水平（例如7至10之間、8至10之間或8至9之間），而沒有pH超調并由此造成過量糖 降解的風險。此外，氫氧化銨在發(fā)酵期間為發(fā)酵微生物提供氮源（參見第4.5節(jié)），這降低 了發(fā)酵培養(yǎng)基的成本。向lx水解產物溶液添加以將pH帶到所需水平的氫氧化銨的總量， 可以在1克每1千克水解產物（lg/lkg水解產物）至50克每1千克克每1千克水解產物 (50g/lkg水解產物）的范圍內。例如，向lx水解產物溶液添加的氫氧化銨的總量可以為 5g/lkg水解產物、10g/lkg水解產物、15g/lkg水解產物、20g/lkg水解產物、25g/lkg水解 產物或30g/lkg水解產物。氫氧化銨可以在單一步驟中、分多個部分或連續(xù)地向水解產物 溶液添加。在特定實施方式中，向lx水解產物溶液添加的氫氧化銨的總量在以任兩個上述 實施方式為邊界的范圍之內，例如但不限于lg/lkg水解產物至30g/lkg水解產物、lg/lkg 水解產物至20g/lkg水解產物、lg/lkg水解產物至15g/lkg水解產物、lg/lkg水解產物至 10g/lkg水解產物或10g/lkg水解產物至22g/lkg水解產物范圍內的氫氧化銨。對于更濃 的水解產物溶液（例如4x)來說，足以將pH升高到所需水平的氫氧化銨的量相對于lx水 解產物溶液將會增加。對于濃度較低的水解產物溶液（例如〇.5x)來說，足以將pH升高到 所需水平的氫氧化銨的量相對于lx水解產物溶液來說將會減少。
[0072] 在本公開的其他情況下，在脫毒過程的第二步中向水解產物溶液添加的第二種堿 是氫氧化鈣。在這些實施方式中，在脫毒后通過帶過濾或離心過程進行固體石膏（硫酸鈣） 的移除。向lx水解產物溶液添加以將pH帶到所需水平（例如7至10之間、8至10之間或 8至9之間）的氫氧化銨的總量，可以在2克每1千克水解產物（2g/lkg水解產物）至50 克每1千克水解產物（50g/lkg水解產物）的范圍內。例如，向lx水解產物溶液添加的氫 氧化鈣的總量可以為2g/lkg水解產物、10g/lkg水解產物、15g/lkg水解產物、20g/lkg水解 產物、25g/lkg水解產物或30g/lkg水解產物。氫氧化鈣可以在單一步驟中、分多個部分或 連續(xù)地向水解產物溶液添加。在特定實施方式中，向lx水解產物溶液添加的氫氧化鈣的總 量在以任兩個上述實施方式為邊界的范圍之內，例如但不限于2g/lkg水解產物至30g/lkg 水解產物、2g/lkg水解產物至20g/lkg水解產物、2g/lkg水解產物至15g/lkg水解產物、 2g/lkg水解產物至20g/lkg水解產物或10g/lkg水解產物至25g/lkg水解產物范圍內的氫 氧化鈣量。對于更濃的水解產物溶液（例如4x)來說，足以將pH升高到所需水平的氫氧化 鈣的量相對于lx水解產物溶液將會增加。對于濃度較低的水解產物溶液（例如〇. 5x)來 說，足以將pH升高到所需水平的氫氧化鈣的量相對于lx水解產物溶液來說將會減少。
[0073] 本公開的脫毒過程的每個步驟可以在任何適合的容器例如分批反應器或連續(xù)反 應器（例如連續(xù)攪拌釜式反應器（CSTR)或活塞流反應器（PFR))中進行。連續(xù)反應器允 許在脫毒反應進行時連續(xù)添加和移除輸入的材料（例如水解產物、含鎂堿漿液）。適合的 容器可以裝備有用于攪拌水解產物溶液的手段，例如旋槳。反應器設計在Lin，K.-H.和 Van Ness, H.C.(在 Perry, R.H.和Chilton, C.H.主編的《化學工程師手冊》（Chemical Engineer' s Handbook)第 5 版（1973)，第 4 章，McGraw-Hill, NY)中討論。
[0074] 脫毒過程可以以分批模式進行。所述方法通常包括將水解產物溶液與堿（或堿漿 液）在反應器中合并。水解產物溶液和脫毒堿可以一起或分開地進料到反應器。任何類型 的反應器可用于分批模式脫毒，其簡單地包括添加原料，在特定條件（例如溫度、劑量和時 間）下進行脫毒過程，以及從反應器移除脫毒的水解產物。
[0075] 或者，脫毒過程可以以連續(xù)模式進行。本公開的連續(xù)過程有利地減少了對停止和 清潔反應器的需要，并因此可以以連續(xù)模式進行例如幾天或更長（例如一周或更長）的時 段，以支持總的連續(xù)過程。方法通常需要向反應器連續(xù)進料水解產物溶液和堿漿液。水解 產物和堿漿液可以一起或分開地進料。得到的混合物在反應器中具有特定的滯留或停留時 間。停留時間由向反應器添加水解產物和堿后達到所需水平的酸中和和/或脫毒的時間所 決定。在脫毒過程后，脫毒的水解產物離開反應器，并且可以向反應器添加其他組分（例如 水解產物和堿漿液）?？梢詫⒍鄠€這樣的反應器串聯連接，以在延長的滯留時間內支持進一 步的pH調節(jié)和/或在延長的滯留時間內調節(jié)溫度。
[0076] 對于連續(xù)模式的脫毒來說，可以使用允許相等的輸入和輸出速率的任何反應器例 如CSTR或PFR，以便在反應器中實現穩(wěn)態(tài)并使反應器的填充水平保持恒定。
[0077] 本公開的脫毒過程可以以半連續(xù)模式進行。可以使用具有不相等的輸入和輸出料 流并最終需要將系統(tǒng)重新設定到起始條件的半連續(xù)反應器。
[0078] 脫毒的每個步驟可以在相同的反應器或不同的反應器中進行。例如，在包含兩步 脫毒過程的實施方式中，第一和第二步可以在分批反應器中進行。在這些實施方式中，第二 種堿或第二種堿的混合物在第一種堿或第一種堿的混合物之后添加，中和水解產物溶液中 存在的酸。在添加第二種堿之前或期間，可以調整分批反應器的溫度。
[0079] 在包括兩步脫毒過程的某些實施方式中，脫毒過程的第一步（即將水解產物與第 一種堿或第一種堿的混合物混合）和脫毒過程的第二步（即將水解產物與第二種堿或第二 種堿的混合物混合）兩者可以在CSTR(或一系列CSTR)或PFR中進行。在某些實施方式中， 脫毒過程的第一步和脫毒過程的第二步兩者可以在CSTR(或一系列CSTR)中進行。在其他 實施方式中，脫毒過程的第一步和脫毒過程的第二步兩者可以在PFR中進行。在其他實施 方式中，脫毒過程的第一步可以在CSTR (或一系列CSTR)中進行，并且脫毒過程的第二步可 以在PFR中進行。在其他實施方式中，脫毒過程的第一步可以在PFR中進行，并且脫毒過程 的第二步可以在CSTR (或一系列CSTR)中進行。
[0080] 除了多步脫毒過程之外，本公開方法還可以包括其他步驟，例如在圖1中示出了 在脫毒步驟上游或下游的一個或多個步驟。在圖1中，示出了在生物質水解下游的步驟。在 生物質水解和固/液分離后，將水解產物在多級蒸發(fā)裝置100中濃縮。水解產物通過管線 101離開多級蒸發(fā)裝置100,并被泵入到混合器102中。通過管線103將分開的氫氧化鎂料 流泵入到混合器102中。然后將水解產物與氫氧化鎂的混合物泵入到CSTR 104中?；旌衔?在CSTR 104中的停留時間約為30分鐘至1小時。CSTR中的pH被維持在5至6之間的范 圍內，并且溫度在45°C至60°C之間的范圍內。通過管線105將離開CSTR 104的液體料流 泵入到CSTR或PFR反應器106中。通過管線107將氫氧化銨連續(xù)供應到CSTR或PFR反應 器106?；旌衔镌诘诙﨏STR或PFR反應器106中的停留時間約為3至5小時，并且反應器 的pH被維持在8至10之間的范圍內。在第二CSTR或PFR反應器106中脫毒后，將脫毒的 水解產物通入到管線108中，在那里它遇到來自于管線109的酸（例如硫酸或磷酸）料流。 將脫毒的水解產物的混合物通入到混合器110中。中和的脫毒的水解產物通過管線111離 開混合器110,并流入到發(fā)酵容器112中。
[0081] 在添加每種堿或堿的混合物后水解產物溶液的充分混合，可以提高堿的溶解速率 并確保在整個溶液中pH保持基本上均勻。例如，理想的混合將避免形成局部的較高pH的口 袋，所述口袋可以造成對呋喃消除的較低選擇性?？梢允褂?00轉每分鐘（rpm)至1500rpm 之間的混合速度來確保水解產物溶液的充分混合。例如，可以使用100rpm、200rpm、400rpm、 800rpm和1500rpm的混合速度。在特定實施方式中，混合可以在以任兩個上述混合速度為 邊界的速度下進行，例如但不限于l〇〇rpm至200rpm、lOOrpm至400rpm、200rpm至400rpm、 400rpm至800rpm或800rpm至1，500rpm。在其他實施方式中，可以使用間歇的混合方案， 其中混合速率隨著脫毒過程的進展而變。水解產物溶液的混合物可以使用本領域中已知的 任何混合器來實現，例如高剪切混合器、槳式混合器、磁力攪拌機或振搖器、渦旋振蕩、使用 珠子的攪拌和頂置式攪拌。
[0082] 本公開的脫毒方法提供了與脫毒前的起始水解產物相比已除去顯著部分的呋喃 醛（例如糠醛）的脫毒的水解產物。同時，脫毒導致總可發(fā)酵性糖的極小損失。因此，脫毒 反應對呋喃醛的消除是高度選擇性的。在特定實施方式中，本公開提供的脫毒的水解產物 具有存在于起始水解產物中的至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少 93%、至少95%或至少99%的總可發(fā)酵性糖，以及存在于起始水解產物中的不超過50%、 不超過40%、不超過30%或不超過20%的呋喃醛。
[0083] 在特定實施方式中，本公開的脫毒方法提供的脫毒的水解產物具有（a)起始水 解產物中存在的至少90 %的總可發(fā)酵性糖和起始水解產物中存在的不超過50 %的呋喃 醛；(b)起始水解產物中存在的至少90%的總可發(fā)酵性糖和起始水解產物中存在的不超過 40%的呋喃醛；（c)起始水解產物中存在的至少90%的總可發(fā)酵性糖和起始水解產物中存 在的不超過30%的呋喃醛；（d)起始水解產物中存在的至少90%的總可發(fā)酵性糖和起始水 解產物中存在的不超過20%的呋喃醛；（e)起始水解產物中存在的至少80%的總可發(fā)酵性 糖和起始水解產物中存在的不超過50%的呋喃醛；（f)起始水解產物中存在的至少80%的 總可發(fā)酵性糖和起始水解產物中存在的不超過40%的呋喃醛；（g)起始水解產物中存在的 至少80%的總可發(fā)酵性糖和起始水解產物中存在的不超過30%的呋喃醛；或（h)起始水解 產物中存在的至少80%的總可發(fā)酵性糖和起始水解產物中存在的不超過20%的呋喃醛。
[0084] 在脫毒過程完成后，可以通過添加適合的酸（例如硫酸或磷酸）（參見圖1和實施 例3)來降低脫毒的水解產物溶液的pH。可以將pH調整到適合于發(fā)酵微生物的水平。一般 來說，將pH調整到3. 5至8之間的值，更通常為4至7之間的值。在將pH調整到所需水平 之后，可以將脫毒的水解產物轉移到發(fā)酵容器。
[0085] 脫毒的水解產物的發(fā)酵（4. 5節(jié)）
[0086] 糖向發(fā)酵產物的發(fā)酵可以在單步或多步發(fā)酵中，通過一種或多種適合的 發(fā)酵微生物來進行。發(fā)酵微生物可以是野生型微生物或重組微生物，并包括埃希 氏菌（Escherichia)、發(fā)酵單胞菌（Zymomonas)、酵母（Saccharomyces)、假絲酵母 (Candida)、畢赤酵母（Pichia)、鏈霉菌（Streptomyces)、芽抱桿菌（Bacillus)、乳桿菌 (Lactobacillus)和梭狀芽孢桿菌（Clostridium)。特別適合的產乙醇菌物種包括大腸 埃希氏菌（Escherichia coli)、運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)、嗜熱脂肪芽孢桿 菌（Bacillus stearothermophilus)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、熱纖梭狀 芽抱桿菌(Clostridia thermocellum)、Thermoanaerobacterium saccharolyticum 和 樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)。大腸桿菌或運動發(fā)酵單胞菌的遺傳修飾菌株可用于 乙醇生產（參見例如 Underwood 等，2002, Appl. Environ. Microbiol. 68:6263-6272 和 US 2003/0162271A1)。
[0087] 發(fā)酵可以在含有或不含其他營養(yǎng)物例如維生素和玉米漿（CSL)的最低培養(yǎng)基 中進行。發(fā)酵可以在本領域中已知的任何適合的發(fā)酵容器中進行。例如，發(fā)酵可以在 Erlenmeyer 搖瓶、Fleaker、DasGip fedbatch-pro (DasGip technology)、2L BioFlo 發(fā)酵罐 或l〇L發(fā)酵罐（B. Braun Biotech)中進行（參見實施例5)。發(fā)酵過程可以作為分批、補料 分批或連續(xù)過程來進行。發(fā)酵液的起始pH在3. 5的值至8的值的范圍內，更通常在4的值 至7的值的范圍內。發(fā)酵一般在20°C至40°C之間的溫度下進行，更通常在25°C至35°C之 間。在特定實施方式中，發(fā)酵進行5至90小時、10至50小時或20至40小時之間的時段。
[0088] 發(fā)酵產物的回收（4. 6節(jié)）
[0089] 發(fā)酵產物可以使用本領域中已知的各種方法來回收。產物可以通過離心、過濾、 微濾和納濾與其他發(fā)酵組分分開。產物可以通過離子交換、溶劑萃取或電透析來提取。 可以使用絮凝劑來協助產物分離。作為具體實例，可以使用本領域中已知的用于ABE發(fā) 酵的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基分離生物生產的乙醇（參見例如Durre, 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:639-648 ;Groot 等，1992, Process. Biochem. 27:61-75 ;以及其中的參考文 獻）。例如,可以通過離心、過濾、傾倒等從發(fā)酵培養(yǎng)基中移除固體。
[0090] 在發(fā)酵后，發(fā)酵產物例如乙醇，可以通過已知用于從水性溶液分離乙醇的許多常 規(guī)技術中的任一種，從發(fā)酵液分離。這些方法包括蒸發(fā)、蒸餾、共沸蒸餾、溶劑萃取、液-液 萃取、膜分離、薄膜蒸發(fā)、吸附、滌氣、滲透汽化等。

【具體實施方式】
[0091] 實施例1 :木質纖維素生物質的水解（5. 1節(jié)）
[0092] 收獲木質纖維素生物質（例如能源甘蔗或甘蔗）并使用飼料切碎機切成一定大 小，用乳桿菌細菌制備物接種并儲存在農用袋中直至使用。在稀酸水解之前，從袋子中取出 木質纖維素生物質并用工藝用水清洗以除去有機酸，然后使用螺旋壓力機脫水。然后將生 物質與水和硫酸（〇. 2%至3 % ) -起運送到加壓反應室（即水解器）。最小化漿液的液/ 固比，以最大化水解后水解產物中溶解的糖的濃度。在水解器中的滯留時間和水解器的溫 度取決于生物質的參數（例如濕度和葡聚糖水平）。一般來說，水解器的溫度在120°C至 180°C的范圍內，滯留時間在3分鐘至2小時的范圍內。
[0093] 在稀酸水解后，得到的水解器漿液含有溶解的糖以及殘留的不溶性纖維。將漿液 爆炸減壓并吹入到旋風分離器裝置中，以將漿液減壓。使用清洗用水將材料重新形成漿液， 并使用螺旋壓力機將漿液脫水，以便榨出溶解的糖和毒素。使用具有反向流清洗的三個螺 旋壓力機步驟來脫水和清洗抑制劑餅。反向流清洗被定義為清洗用水以與餅流動相反的方 向流動。將高固體百分率的漿液稀釋成低固體百分率的漿液（〈10%固體）并泵向螺旋壓力 機。這種稀釋使用當系統(tǒng)達到穩(wěn)態(tài)時從后面的螺旋壓力機通過反向流交換所提供的一部分 重循環(huán)液體（被定義為"壓出液"）。在最后的螺旋壓力機步驟中與壓出液一起加入清潔的 水，以使餅可泵送。使用另外兩個螺旋壓力機重復最初的液/固分離步驟，以從餅中除去毒 素。將得到的高固體百分率的餅推進到進行同時糖化和發(fā)酵，并收集來自于第一步的壓出 液用于脫毒工作。
[0094] 來自于幾種生物質來源的起始水解產物中各個化合物（例如糖、呋喃和脂族酸） 在稀酸水解和固/液分離后的濃度，示出在表1中。
[0095] 表1 :起始水解產物的組成
[0096]

【權利要求】
1. 一種降低木質纖維素水解產物對發(fā)酵生物體的毒性或減少來自于木質纖維素水解 產物的對發(fā)酵生物體的一種抑制劑的至少一部分的方法，所述方法包括下列步驟： (a) 將從木質纖維素生物質獲得的木質纖維素水解產物的起始溶液，與其量足以將所 述溶液的pH提高到3至8之間的第一種堿或第一種堿的混合物混合，所述起始溶液包含可 發(fā)酵性糖、呋喃醛和脂族酸的混合物；以及 (b) 將在步驟（a)中產生的溶液與其量足以將所述溶液的pH提高到7至10之間的第 二種堿或第二種堿的混合物混合，所述混合歷時足以消除所述木質纖維素水解產物中至少 40%的呋喃醛的時間， 由此降低所述木質纖維素水解產物的毒性。
2. 權利要求1的方法，其中所述第一種堿和第二種堿是相同的。
3. 權利要求1的方法，其中所述第一種堿和第二種堿是不同的。
4. 權利要求1-3任一項的方法，其中所述第一種堿以足以將所述溶液的pH提高到3至 5之間的量添加。
5. 權利要求1-3任一項的方法，其中所述第一種堿以足以將所述溶液的pH提高到4至 6之間的量添加。
6. 權利要求1-5任一項的方法，其中所述第二種堿以足以將所述溶液的pH提高到8至 10之間的量添加。
7. 權利要求1-5任一項的方法，其中所述第二種堿以足以將所述溶液的pH提高到9至 10之間的量添加。
8. 權利要求1-7任一項的方法，其中步驟（a)在40°C至60°C之間的溫度下進行。
9. 權利要求1-7任一項的方法，其中步驟（a)在40°C至50°C之間的溫度下進行。
10. 權利要求1-9任一項的方法，其中步驟（b)在30°C至90°C之間的溫度下進行。
11. 權利要求1-9任一項的方法，其中步驟（b)在40°C至70°C之間的溫度下進行。
12. 權利要求1-11任一項的方法，其中所述木質纖維素生物質選自象草、能源甘蔗、高 粱、蘆竹、糖用甜菜、柳枝稷、甘蔗渣、稻桿、芒草、柳枝稷、麥桿、木材、木材廢料、紙張、廢紙、 農業(yè)廢料、城市廢料、樺木、燕麥、玉米秸桿、桉木、柳木、雜交楊木、短周期木本作物、針葉軟 木和作物殘茬。
13. 權利要求1-12任一項的方法，其中所述第一種堿是含鎂堿。
14. 權利要求13的方法，其中所述含鎂堿是氫氧化鎂。
15. 權利要求13的方法，其中所述含鎂堿是碳酸鎂。
16. 權利要求13的方法，其中所述含鎂堿是氧化鎂。
17. 權利要求1-16任一項的方法，其中所述第二種堿選自氫氧化銨、氫氧化|丐、氫氧化 鈉和氫氧化鉀。
18. 權利要求17的方法，其中所述第二種堿是氫氧化銨。
19. 權利要求17的方法，其中所述第二種堿是氫氧化鈣。
20. 權利要求17的方法，其中所述第二種堿是氫氧化鈉。
21. 權利要求17的方法，其中所述第二種堿是氫氧化鉀。
22. 權利要求1-21任一項的方法，其中步驟（a)和步驟（b)在分批反應器中進行。
23. 權利要求1-21任一項的方法，其中步驟（a)在分批反應器中進行，并且步驟（b)在 連續(xù)攪拌釜式反應器（CSTR)或一系列CSTR中進行。
24. 權利要求1-21任一項的方法，其中步驟（a)和步驟（b)兩者都在CSTR或一系列 CSTR中進行。
25. 權利要求1-21任一項的方法，其中步驟（a)在CSTR或一系列CSTR中進行，并且步 驟（b)在活塞流反應器（PFR)中進行。
26. 權利要求1-21任一項的方法，其中步驟（a)和步驟（b)兩者都在PFR中進行。
27. 權利要求1-26任一項的方法，其中所述起始水解產物與所述含鎂堿的混合進行 0. 05小時至4小時之間的時段。
28. 權利要求1-26任一項的方法，其中步驟（a)和步驟（b)進行1小時至6小時之間 的合并時段。
29. 權利要求1-26任一項的方法，其中步驟（a)和步驟（b)進行2小時至5小時之間 的合并時段。
30. 權利要求1-29任一項的方法，其中所述起始溶液中總可發(fā)酵性糖的濃度在30g/L 至160g/L之間。
31. 權利要求1-29任一項的方法，其中所述起始溶液中總可發(fā)酵性糖的濃度在40g/L 至95g/L之間。
32. 權利要求1-29任一項的方法，其中所述起始水解產物中總可發(fā)酵性糖的濃度在 50g/L 至 70g/L 之間。
33. 權利要求1-32任一項的方法，其中所述呋喃醛包含糠醛和5-HMF。
34. 權利要求33的方法，其中所述起始溶液中糠醛的起始濃度在0. 5g/L至10g/L之 間。
35. 權利要求33的方法，其中所述起始溶液中糠醛的起始濃度在1. 5g/L至5g/L之間。
36. 權利要求33-35任一項的方法，其中所述起始溶液中5-HMF的濃度在0. lg/L至5g/ L之間。
37. 權利要求33-35任一項的方法，其中所述起始溶液中5-HMF的濃度在0. 5g/L至 2. 5g/L 之間。
38. 權利要求1-37任一項的方法，其中所述脂族酸包含乙酸和乳酸。
39. 權利要求38的方法，其中所述起始溶液中乙酸的濃度在2g/L至17g/L之間。
40. 權利要求38的方法，其中所述起始溶液中乙酸的濃度在llg/L至16g/L之間。
41. 權利要求38-40任一項的方法，其中所述起始溶液中乳酸的濃度在4g/L至10g/L 之間。
42. 權利要求1-41任一項的方法，其中所述起始水解產物還包含酚物質。
43. 權利要求42的方法，其中所述起始溶液中酚物質的濃度在0. 5g/L至5g/L之間。
44. 權利要求1-43任一項的方法，其中所述可發(fā)酵性糖包括木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、 葡萄糖、甘露糖和半乳糖中的一種或多種。
45. 權利要求1-44任一項的方法，其中在步驟（b)中產生的水解產物溶液包含不超過 30%、不超過20%或不超過10%的存在于所述起始木質纖維素水解產物溶液中的呋喃醛。
46. 權利要求1-45任一項的方法，其中在步驟（b)中產生的水解產物溶液包含至少 90%、至少93%或至少95%的存在于所述起始水解產物溶液中的總可發(fā)酵性糖。
47. 權利要求1-46任一項的方法，其還包括添加酸以將在步驟（b)中產生的溶液的pH 降低到3. 5至9之間的步驟。
48. 權利要求1-46任一項的方法，其還包括添加酸以將在步驟（b)中產生的溶液的pH 降低到4至6之間的步驟。
49. 權利要求1-48任一項的方法，其還包括在步驟（a)之前濃縮所述起始水解產物溶 液的步驟。
50. -種生產乙醇的方法，所述方法包括在通過權利要求1-49任一項的方法產生的脫 毒的水解產物溶液存在下、在生產乙醇的條件下培養(yǎng)發(fā)酵微生物由此生產乙醇的步驟。
51. 權利要求50的方法，其還包括從所述培養(yǎng)物中分離乙醇。
52. 權利要求50或51的方法，其中所述發(fā)酵生物體包括大腸埃希式桿菌 (Escherichia coli)、運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)、嗜熱脂肪芽抱桿菌（acillus stearothermophilus)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、熱纖梭菌（Clostridia thermocellum)、Thermoanaerobacterium saccharolyticum 和樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)中的一種或多種。
53. 權利要求50-52任一項的方法，其還包括在所述培養(yǎng)步驟之間生產所述脫毒的水 解產物。 5 4. -種連續(xù)減少木質纖維素水解產物中呋喃醛的量的方法，所述方法包括下列步 驟： (a) 將水解產物溶液流入第一反應器或第一反應器系列，所述水解產物溶液包含可發(fā) 酵性糖、呋喃醛和脂族酸的混合物； (b) 將第一種堿流入所述第一反應器或第一反應器系列； (c) 將所述水解產物溶液與所述第一種堿在所述第一反應器或第一反應器系列中混合 歷時足以中和所述水解產物溶液中的酸的時段； (d) 將所述水解產物溶液流入第二反應器或第二反應器系列； (e) 將第二種堿流入所述第二反應器或第二反應器系列； (f) 將所述水解產物溶液與所述第二種堿在所述第二反應器或第二反應器系列中混合 歷時足以減少所述水解產物中的呋喃醛的量的時段，由此產生脫毒的水解產物溶液；以及 (g) 將所述脫毒的水解產物溶液流出所述第二反應器或第二反應器系列。
55. 權利要求54的方法，其還包括酸化流出所述第二反應器的水解產物。
56. 權利要求54或55的方法，其中所述第一種堿是含鎂堿。
57. 權利要求56的方法，其中所述含鎂堿選自氫氧化鎂、氧化鎂和碳酸鎂。
58. 權利要求57的方法，其中所述第一種堿是氫氧化鎂。
59. 權利要求54-58任一項的方法，其中所述第二種堿是氫氧化銨。
60. 權利要求54-58任一項的方法，其中所述第二種堿是氫氧化隹丐。
61. 權利要求54-60任一項的方法，其中所述第一反應器是CSTR，并且所述第二反應器 是 PFR。
62. 權利要求54-60任一項的方法，其中所述第一反應器是PFR，并且所述第二反應器 是活塞流反應器PFR。
63. 權利要求54-60任一項的方法，其中所述第一反應器是PFR，并且所述第二反應器 是 CSTR。
64. 權利要求54-60任一項的方法，其中所述第一反應器是CSTR，并且所述第二反應器 是 CSTR。
65. 權利要求54-64任一項的方法，其還包括在步驟（a)之前濃縮所述水解產物。
【文檔編號】C12P19/00GK104254613SQ201380009224
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年2月12日 優(yōu)先權日:2012年2月13日
【發(fā)明者】馬烏戈熱塔·斯盧普斯卡, 佐藤裕紀子, 卡倫·庫斯特佐, 黃永寧 申請人:Bp北美公司