一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備苝醌類化合物的方法
【專利摘要】一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備苝醌類化合物的方法，本發(fā)明涉及利用竹黃菌株Shiraiasp.slf-14，保藏號為CCTCCNO：M209294，已在ZL200910186852.3公開，通過液體發(fā)酵制備獲得竹紅菌甲素(HypocrellinsA)、竹紅菌乙素(HypocrellinsB)、痂囊腔菌素B(ElsinochromesB)及痂囊腔菌素C(ElsinochromesC)四種苝醌類化合物。本發(fā)明為這4種苝醌類化合物的生產(chǎn)制備提供了一種新的資源和方法。
【專利說明】一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備茈醌類化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備茈醌類化合物的方法，尤其涉及一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備茈醌類化合物的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]花醌(Perylenequinones,PQ)類化合物主要是從子囊菌綱和半知菌類真菌中分離到的一類具有光敏活性的色素。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的差異茈醌類化合物分為弗萊菌素型、交鏈孢毒素型及蒽醌類物質(zhì)3大類化合物，其中弗萊菌素型主要包括竹紅菌素、痂囊腔菌素、弗萊菌素和尾孢素等化合物。1980年，中國學(xué)者萬象義等從竹紅菌子實體中分離到一種新的茈醌類化合物，因源于竹紅菌而命名為竹紅菌甲素(Hypocrel I inA，HA)。1991年，日本學(xué)者Kishi等從竹黃菌子座中分離得到另外兩種竹紅菌素，分別稱為竹紅菌乙素(HB)、竹紅菌丙素(HC)。目前，已從竹黃中分離到HA、HB和HC，其中對HA的研究最多，它是一種重要的天然光敏色素，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價值。痂囊菌素可以由許多子囊真菌產(chǎn)生，包括痂囊腔菌素A、痂囊腔菌素B、痂囊腔菌素C和痂囊腔菌素D四種。痂囊菌素最先由Weiss等在1957年}k Elsinoe培養(yǎng)物中分離得到，并對它們的物理化學(xué)性質(zhì)以及光敏抑菌性質(zhì)進行了初步研究。此后一些研究者先后確定了痂囊腔菌素A、B、C和D的結(jié)構(gòu)。隨著人們對各種茈醌類化合物認識的增加，在對痂囊腔菌素光敏性質(zhì)以及光敏行為進行了深入的研究同時，還發(fā)現(xiàn)痂囊腔菌素有很好的抗病蟲害的作用，而且不會對人體產(chǎn)生間接的毒副作用。其中痂囊腔菌素C可作為漂白劑，其漂白效果甚至要好于同為茈醌類化合物的竹紅菌甲素。
[0003]發(fā)明專利200710132510.4介紹了一株產(chǎn)茈醌化合物的竹黃菌株Shiraia sp.SUPER-H168，其主要代謝產(chǎn)物為竹紅菌甲素和竹紅菌乙素。專利201110100965.4從蜈蚣衣屬植物地衣的內(nèi)生真菌Phaeosphaeria sp.提取一類花醌類化合物,其在抗真菌和抗腫瘤方面有潛在的應(yīng)用價值。專利201210127338.4發(fā)明了一種高產(chǎn)竹紅菌素的竹黃菌株Shiraia bambusicola該菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量可達0.35%。劉為忠(《花醌類化合物產(chǎn)生菌固態(tài)發(fā)酵工藝研究》，云南大學(xué)學(xué)報，2000，225 (5) 389-391)和沈云修《一株產(chǎn)茈醌類化合物的真菌化學(xué)成分研究》，中草藥，2003，34 (2):111-113)等報導(dǎo)了產(chǎn)茈醌類化合物的真菌。
[0004]雖然已有報道可以通過液體發(fā)酵或者固體發(fā)酵來獲得茈醌類化合物，但產(chǎn)量不高且都是從竹林中篩選得到，本發(fā)明從江西廬山蛇足石杉內(nèi)生真菌中分離到一株高產(chǎn)茈醌類化合物的菌株Shiraia sp.slf_14，其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量較高，該發(fā)明為傳統(tǒng)茈醌類化合物的發(fā)酵制備提供新的菌種來源和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是，利用竹黃菌株Shiraia sp.slf-14，保藏號為CCTCC NO:M209294，已在ZL200910186852.3公開，通過液體發(fā)酵制備獲得竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、痂囊腔菌素B及痂囊腔菌素C四種茈醌類化合物。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:四種茈醌類化合物是從蛇足石杉內(nèi)生竹黃菌株Shiraia sp.slf-14發(fā)酵產(chǎn)物制備獲得的，其制備流程包括以下步驟:
a)制備內(nèi)生竹黃菌株Shiraiasp.slf-14的發(fā)酵培養(yǎng)物,將內(nèi)生真菌Shiraia sp.Slfl4發(fā)酵菌體進行干燥、碾碎，用質(zhì)量分數(shù)60%的乙醇浸提3次，每次24h，合并提取液后減壓濃縮，用等體積的石油醚、乙酸乙酯進行梯度萃取，石油醚相減壓濃縮后得到浸膏A ；乙酸乙酯相減壓濃縮后得到浸膏B ；
b)將浸膏A經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚/乙酸乙酯作為洗脫劑，從體積比100: O~O: 100進行梯度洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯體積比20: 80梯度洗脫下來的餾分Al ;餾分Al經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇體積比從100: O~O: 100梯度洗脫，收集氯仿/甲醇以20:1的餾分，重結(jié)晶分離到化合物I和II，分別為竹紅菌甲素和竹紅菌乙素；
c)將浸膏B經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0~0:100進行梯度洗脫，獲得餾分BI，B2及B3，其中流分BI分別經(jīng)正相硅膠柱色譜(氯仿-甲醇200:1)反復(fù)洗脫、重結(jié)晶分離到化合物I和II，分別為竹紅菌甲素和竹紅菌乙素；而餾分B2和B3分別經(jīng)正相硅膠柱色譜(氯仿-甲醇50:1,20:1)反復(fù)洗脫、重結(jié)晶分離到化合物III和IV，即為痂囊腔菌素B和痂囊腔菌素C ；
所述的a)步驟內(nèi)生竹黃菌株Shiraia sp.slf-14發(fā)酵是由液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得,培養(yǎng)基組成為:碳源 0-50g/L，氮源 0-50g/L，馬鈴薯汁 200 g/L, KH2PO4 0_5g/L，NaCl 0_5g/L，用自來水水配制；液體發(fā)酵條件:將斜面保藏的菌株S1H4轉(zhuǎn)接至PDA平板上進行活化，28° C培養(yǎng)7d后接種至裝有150mL PDB培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，發(fā)酵溫度為20-32° C發(fā)酵周期為 8-14d ；` 本發(fā)明具有如下特點:用于該`菌發(fā)酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。氮源可以是無機銨鹽、無機硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、或黃豆餅粉。馬鈴薯汁既可以補充碳源也可以補充氮源，200g/L是指稱取200g馬鈴薯’洗凈去皮切成小塊，加入1000mL水煮沸半小時，用6-8層紗布過濾，所得濾液加入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基終體積為1000mL。
[0007]本發(fā)明的從內(nèi)生竹黃真菌Shiraia sp.Slf 14的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備包括下述通式(1-1V)的化合物:
【權(quán)利要求】
1.一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備茈醌類化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)制備內(nèi)生竹黃菌株Shiraiasp.slf_14的發(fā)酵培養(yǎng)物,將內(nèi)生真菌Shiraia sp.Slfl4發(fā)酵菌體進行干燥、碾碎，用質(zhì)量分數(shù)60%的乙醇浸提3次，每次24h，合并提取液后減壓濃縮，用等體積的石油醚、乙酸乙酯進行梯度萃取，石油醚相減壓濃縮后得到浸膏A ;乙酸乙酯相減壓濃縮后得到浸膏B ； b)將浸膏A經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚/乙酸乙酯作為洗脫劑，從體積比100: O~O: 100進行梯度洗脫，收集石油醚/乙酸乙酯體積比20: 80梯度洗脫下來的餾分Al ;餾分Al經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇體積比從100: O~O: 100梯度洗脫，收集氯仿/甲醇以20:1的餾分，重結(jié)晶分離到化合物I和II，分別為竹紅菌甲素和竹紅菌乙素； c)將浸膏B經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿/甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0~0:100進行梯度洗脫，獲得餾分BI，B2及B3，其中流分BI分別經(jīng)正相硅膠柱色譜(氯仿-甲醇200:1)反復(fù)洗脫、重結(jié)晶分離到化合物I和II，分別為竹紅菌甲素和竹紅菌乙素；而餾分B2和B3分別經(jīng)正相硅膠柱色譜(氯仿-甲醇50:1,20:1)反復(fù)洗脫、重結(jié)晶分離到化合物III和IV，即為痂囊腔菌素B和痂囊腔菌素C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備茈醌類化合物的方法，其特征在于:所述的步驟a)內(nèi)生竹黃菌株Shiraia sp.slf_14發(fā)酵是由液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得,培養(yǎng)基組成為:碳源 0-50g/L，氮源 0-50g/L，馬鈴薯汁 200 g/L, KH2PO4 0_5g/L，NaCl 0_5g/L，用自來水配制；液體發(fā)酵條件:將斜面保藏的菌株Slf 14轉(zhuǎn)接至馬鈴薯-瓊脂(PDA)平板上進行活化，28° C培養(yǎng)7d后接種至裝有150mL馬鈴薯液體(PDB)培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，發(fā)酵溫度為20-32° C發(fā)酵周期為8-14d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備茈醌類化合物的方法，其特征在于:所述碳源選用葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、或半乳糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)生竹黃真菌發(fā)酵制備茈醌類化合物的方法，其特征在于:所述氮源選用無機銨鹽、無機硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、或黃豆餅粉。
【文檔編號】C12R1/645GK103642864SQ201310727483
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】張志斌, 李平, 朱篤, 顏日明, 汪涯, 楊慧林 申請人:江西師范大學(xué)