一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體及應(yīng)用。所述載體的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)為：右邊界-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子-Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子-NOS啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-左邊界，T-DNA區(qū)左右邊界內(nèi)無(wú)抗生素基因，其中正向雙價(jià)抗病序列即甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。得到的植物表達(dá)載體可用于轉(zhuǎn)化獲得同時(shí)具有4種抗性的轉(zhuǎn)基因作物，并且獲得的轉(zhuǎn)基因作物沒有抗生素抗性基因，可提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性。并且同一次轉(zhuǎn)化中可獲得同時(shí)具有4種抗性的轉(zhuǎn)基因作物，與單一抗性的遺傳轉(zhuǎn)化相比，可以提高效率3倍以。
【專利說(shuō)明】一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甘蔗黃葉病、花葉病是嚴(yán)重危害甘蔗的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糖業(yè)健康發(fā)展的病毒病，甘蔗黃葉病屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒(,其病毒由蛋白質(zhì)外殼及其包裹著的一條單鏈、正義RNA( ssRNA)構(gòu)成,在甘鹿體內(nèi)含量很低,僅分布于其韌皮部篩管伴胞細(xì)胞質(zhì)中。在全球30多個(gè)種植甘蔗的國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生，自2003年王伯輝等報(bào)道廣西發(fā)現(xiàn)甘蔗黃葉病以來(lái)，在我國(guó)桂、粵、滇、瓊、閩等蔗區(qū)也陸續(xù)出現(xiàn)，且有逐年加重的趨勢(shì)。該病的發(fā)生導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣以及種性退化，嚴(yán)重時(shí)甘蔗產(chǎn)量減產(chǎn)高達(dá)40%~60%。而甘蔗花葉病屬于馬鈴薯Y病毒組，其基因組為正單鏈RNA，約有10000個(gè)核苷酸，主要破壞甘蔗葉片的葉綠體，制約其光合作用，從而使甘蔗糖分減少，產(chǎn)量下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)當(dāng)該病病毒侵染率達(dá)到75%時(shí)，產(chǎn)量降低5%~19%，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量。該病在我國(guó)廣東、廣西、浙江、福建、云南、江西、四川、臺(tái)灣均有分布。螟蟲是我國(guó)蔗區(qū)發(fā)生最普遍，危害最嚴(yán)重的甘蔗害蟲，具有全生長(zhǎng)季、鉆蛀性危害的特點(diǎn)，苗期枯心率一般達(dá)10%~20%，嚴(yán)重的高達(dá)60%，Bt基因產(chǎn)生的毒蛋白對(duì)螟蟲具有防治作用。甘蔗生長(zhǎng)旺季田間管理難度大，人工成本高，隨著我國(guó)甘蔗機(jī)械化栽培管理的逐步推廣，減少田間管理成本的除草劑甘蔗品種更適宜機(jī)械化栽培管理模式。由于甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體植物，其遺傳背景非常復(fù)雜，并且抗病蟲、除草劑的甘蔗資源缺乏，因此，很難通過(guò)雜交育種的方式獲得高抗植株。
[0003]目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物抗病蟲害方面已廣泛應(yīng)用。2011年張雨良等以甘蔗黃葉病毒CP蛋白基因構(gòu)建RNAi表達(dá) 載體，并成功轉(zhuǎn)化到煙草中。2012年秦榮等利用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了抗甘蔗花葉病、番茄花葉病的雙價(jià)表達(dá)載體，2004年姚偉等獲得轉(zhuǎn)ScMV-CP基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗并進(jìn)行了抗病分析，結(jié)果轉(zhuǎn)基因甘蔗抗性明顯高于非轉(zhuǎn)基因甘蔗。2006年Weng等利用基因槍法將玉米泛素啟動(dòng)子Ubi驅(qū)動(dòng)下的導(dǎo)入甘蔗，用獲得了抗蛀莖蟲的轉(zhuǎn)基因甘蔗，2011年高世武等利用PPT篩選成功獲得抗螟蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗。甘蔗病蟲害往往是多種同時(shí)出現(xiàn)，并趨于多樣性，而現(xiàn)今獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗多屬單一抗性的轉(zhuǎn)基因改良，對(duì)甘蔗病蟲害防治作用有限。對(duì)于感病毒病的作物，RNAi技術(shù)已經(jīng)成為抗病毒轉(zhuǎn)基因作物育種的有效途徑。然而，到目前為止，同時(shí)抗兩種病毒病并具有抗蟲、抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甘蔗尚未見報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)將甘蔗花葉病毒、黃葉病毒CP基因干擾序列、CrylAC基因和抗除草劑fer基因同時(shí)構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，利用基因槍創(chuàng)制了抗病蟲和除草劑的四價(jià)轉(zhuǎn)基因甘蔗，為培育多抗甘蔗新品種提供了新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，可用于轉(zhuǎn)化獲得同時(shí)具有4種抗性的轉(zhuǎn)基因作物，并且獲得的轉(zhuǎn)基因作物沒有抗生素抗性基因，可提高轉(zhuǎn)基因作物的安全性。
[0005]本發(fā)明首先提供了一種甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，是由甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因和甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因的保守序列融合而成，其DNA序列如SEQ ID N0.1 所示。
[0006]一種甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)，是將所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列以反向重復(fù)的方式與丙酮酸磷酸雙激酶PPDK內(nèi)含子相連，以35S為啟動(dòng)子，OCS終止子,如圖2所示。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)了所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明還提供了一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，所述載體的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)(如圖1所示)為:右邊界-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子-Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子-NOS啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-左邊界，T-DNA區(qū)左右邊界內(nèi)無(wú)抗生素基因，其中正向雙價(jià)抗病序列即甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。其中內(nèi)含子為丙酮酸磷酸雙激酶PPDK內(nèi)含子。
[0009]所述抗蟲基因?yàn)榛颉?br> [0010]所述抗除早劑基因?yàn)閕fe/"基因。
[0011]所述載體的構(gòu)建如 下:
(1)將甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因和甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因的保守區(qū)融合在一起，形成正向雙價(jià)抗病序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示；
(2)將步驟(1)所得融合基因以反向重復(fù)的方式與內(nèi)含子相連，構(gòu)建甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)為35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子；
(3)構(gòu)建含步驟(1)所述融合基因、βτ以C基因和ifer基因的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)為:右邊界-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子-Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子-NOS啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-左邊界，T-DNA區(qū)左右邊界內(nèi)無(wú)抗生素基因。
[0012]本發(fā)明還保護(hù)了所述的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(1)效率高:本發(fā)明的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化甘蔗植株，同一次轉(zhuǎn)化中可獲得同時(shí)具有4種抗性的轉(zhuǎn)基因作物，與單一抗性的遺傳轉(zhuǎn)化相比，可以提高效率3倍以上；
(2)抗性表達(dá)好:雙價(jià)抗病毒干擾序列采用35S啟動(dòng)子，Or以C基因采用Ubi啟動(dòng)子，ifer基因采用NOS啟動(dòng)子；3種不同性質(zhì)的基因(干擾序列)分別采用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)，有利于每一種基因(干擾序列)表達(dá)框各自表達(dá)；
(3)轉(zhuǎn)基因安全性高:本發(fā)明的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化甘蔗，獲得的轉(zhuǎn)基因植株沒有抗生素抗性基因，可提高轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全性。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)圖:圖中“-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子為雙價(jià)抗病干擾序列結(jié)構(gòu)表達(dá)框；“_Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子_，，為抗蟲基因C表達(dá)框；“_N0S啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-，，為抗除草劑ifer基因表達(dá)框；”右邊界、左邊界”為TDNA插入結(jié)構(gòu)的左右邊界。
[0015]圖2為雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)。
[0016]圖3為抗病蟲和除草劑四價(jià)植物干擾表達(dá)載體pART27-MYCP_CrylAC的物理圖譜。
[0017]圖4A為抗性再生植株fer基因PCR檢測(cè)電泳圖，泳道中1_20為抗性再生植株P(guān)CR結(jié)果，WT為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照，P為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，CK為空白對(duì)照水。
[0018]圖4B為fer基因陽(yáng)性植株基因PCR檢測(cè)電泳圖，泳道中1_20為fer基因檢測(cè)陽(yáng)性植株，WT為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照，P為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，CK為空白對(duì)照水。
[0019]圖4C為fer基因陽(yáng)性植株MYCPf序列PCR檢測(cè)電泳圖，泳道中1_20為fer基因檢測(cè)陽(yáng)性植株，與圖4B各泳道對(duì)應(yīng)，WT為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照，P為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，CK為空白對(duì)照水。
圖4D為fer基因陽(yáng)性植株MYCPr序列PCR檢測(cè)電泳圖，泳道中1_20為fer基因檢測(cè)陽(yáng)性植株，與圖4B、圖4C各泳道對(duì)應(yīng)，WT為非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照，P為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，CK為空白對(duì)照水。
[0020]圖5為四價(jià)轉(zhuǎn)基因甘蔗植株Bt蛋白表達(dá)試紙檢測(cè)，圖中Tl、T4、T10、T13、T18為四價(jià)轉(zhuǎn)基因甘蔗植株GMFNl5，WT為非轉(zhuǎn)基因甘蔗植株FN15。圖中箭頭處為Bt蛋白試紙檢測(cè)陽(yáng)性條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0021]為了充分公開本發(fā)明一種培育無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑轉(zhuǎn)基因甘蔗植株的方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例中使用的質(zhì)粒pUBCG0229_CrylAc (含Ub1-βτ以C_N0S表達(dá)框)由農(nóng)業(yè)部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室改造[基因槍法獲得轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究，熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2011，19(2): 142-148]、質(zhì)粒 pGreen II 0229、pHANNIBAL 和 pART27 均由中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心提供；中間載體pHANNIBAL-Z和表達(dá)載體pART27_Z由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室改造保存。其中，中間載體 pHANNIBAL-Z:用 Sphl 和 SpeI 同時(shí)酶切 `pGreen II 0229 (含 NOSp-fer-NOS 表達(dá)框)和pHANNIBAL，并分別回收1050 bp和5812 bp片段，經(jīng)T4DNA酶16°C過(guò)夜連接而成，在Sphl和分el位點(diǎn)之間引入Sma I酶位點(diǎn)；表達(dá)載體pART27-Z (將篩選基因MT //換成Bar):用設(shè)計(jì)的在5’端加及? H I酶切位點(diǎn)和3’ MBsplW I酶切位點(diǎn)的克隆Sar基因引物Bar-F: 5’-GCGGATCCCGATCTCAGATCTCGGTGAC-3’ ， Bar-R: 5’-GATTCGAAAACGACGCCCGGCCGACATC-3從質(zhì)粒pGreen II 0229 (含NOSp-fer-NOS表達(dá)框)上克隆fer基因，以這兩種酶消化質(zhì)粒PART27回收11667 bp，酶切克隆的fer基因回收553 bp，經(jīng)T4DNA酶16 1:過(guò)夜連接而成。克隆載體pMD19_T購(gòu)自Takara公司。
[0023]實(shí)施例中使用的主要試劑:限制性酶內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司；E.Z.N.A.?GelExtraction Kit (D2500_02)、E.Ζ.N.A.?Plasmid Mini Kit (D6942-02)購(gòu)自 OMEGA 公司；Trizol購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；T4 DNA Ligase和大腸桿菌感受態(tài)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit (BSC13S1)購(gòu)自杭州博日科技有限公司產(chǎn)品.’Premix Taq? (RR902A)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，SYBR? Select Master Mix購(gòu)自ABI公司；BT_CrylAb/lAC抗蟲檢測(cè)試條(25T)購(gòu)自上海佑隆生物科技公司。
[0024]甘蔗ScMV-CP基因(423bp)和ScYLV-CP基因(230bp)保守序列:由上海生工生物技術(shù)公司合成。
[0025]PCR引物設(shè)計(jì):采用生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)收集的甘蔗ScMV-CP基因序列和ScYLV-CP基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)獲得的甘蔗ScMV-CP基因(423bp)和K-CF基因(230bp)保守序列分別設(shè)計(jì)克隆甘蔗基因保守序列的引物sMCP，上游引物添加內(nèi)切酶CZa I (ATCGAT)和I (GAATTC)位點(diǎn)，下游引物添加內(nèi)切酶油a I (TCTAGA)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)克隆甘蔗基因保守序列的引物sYCP，上游引物添加內(nèi)切酶油a I (TCTAGA)位點(diǎn)，下游引物添加內(nèi)切酶歷III (AAGCTT)和沿ο I(CTCGAG)位點(diǎn)，通過(guò)酶切連接將兩個(gè)片段連接起來(lái)，獲得的新序列命名為MYCP，根據(jù)MYCP序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物sMYCP ;同時(shí)根據(jù)RNAi中間載體pHANNIBAL-Z插入?yún)^(qū)的啟動(dòng)子CaMV35S和插入的正向序列MYCPf設(shè)計(jì)正向檢測(cè)引物sMYCPf，根據(jù)終止子OCS和插入的反向序列MYCPr設(shè)計(jì)反向檢測(cè)引物sMYCPr ;而檢測(cè)^基因的引物和程序參考農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-11-2010，引物命名為sBt ;檢測(cè)fer基因的引物和程序參考出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1202-2003，引物命名為 sBar (表 I)。
[0026]表1引物序列及片段大小
【權(quán)利要求】
1.一種甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，是由甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因和甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因的保守序列融合而成，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)，是將權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列以反向重復(fù)的方式與丙酮酸磷酸雙激酶PPDK內(nèi)含子相連，以35S為啟動(dòng)子，OCS終止子。
3.權(quán)利要求1所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
5.一種無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于:所述載體的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)為:右邊界-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子-Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子-NOS啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-左邊界，T-DNA區(qū)左右邊界內(nèi)無(wú)抗生素基因，其中正向雙價(jià)抗病序列即甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于:所述抗蟲基因?yàn)榛颉?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于:所述抗除草劑基因?yàn)閕fer基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，其特征在于:所述載體的構(gòu)建如下: (1)將甘蔗花葉病毒外殼蛋白基因和甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因的保守區(qū)融合在一起，形成正向雙價(jià)抗病序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示； (2)將步驟(1)所得融合基因以反向重復(fù)的方式與內(nèi)含子相連，構(gòu)建甘蔗花葉病毒和甘蔗黃葉病毒雙價(jià)干擾結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)為35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子； (3)構(gòu)建含步驟(1)所述融合基因、βτ以C基因和ifer基因的無(wú)抗生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體，T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)為:右邊界-35S啟動(dòng)子-正向雙價(jià)抗病序列-內(nèi)含子-反向雙價(jià)抗病序列-OCS終止子-Ubi啟動(dòng)子-抗蟲基因-NOS終止子-NOS啟動(dòng)子-抗除草劑基因-NOS終止子-左邊界，T-DNA區(qū)左右邊界內(nèi)無(wú)抗生素基因。
9.權(quán)利要求5所述的無(wú)抗 生素四價(jià)抗病蟲和除草劑植物表達(dá)載體在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103805620SQ201310715572
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】陳平華, 張卓, 陳忠偉, 王恒波, 施桂姣, 項(xiàng)慰, 劉迪, 邰連賽, 高世武, 林冰, 陳利平, 陳容, 高三基, 許莉萍, 陳如凱 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)