檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法、試劑盒及引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法、試劑盒及引物。本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)，對蓮藕腐敗病病原菌的種類進(jìn)行了有效鑒定確定為尖孢鐮刀菌蓮專化型;針對該專屬致蓮藕腐敗病病原菌的測序結(jié)果設(shè)計出對蓮藕腐敗病病菌基因組高度特異性的一對引物，結(jié)合PCR技術(shù)，建立了一套快速、高靈敏度的蓮藕腐敗病病菌的分子檢測技術(shù)，該技術(shù)可以對藕種進(jìn)行帶菌性檢測，實(shí)現(xiàn)蓮藕腐敗病的早期診斷和預(yù)防，對蓮藕病害的綠色防控以及無公害化種植有著重大的意義。
【專利說明】檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法、試劑盒及引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蓮藕的真菌性腐敗病病原菌檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法、試劑盒及引物。
【背景技術(shù)】
[0002]蓮藕(含藕蓮和籽蓮)屬睡蓮科植物，是一種國內(nèi)外廣泛種植的多年生宿根草本植物。我國蓮藕種植歷史十分悠久，蓮藕的根、莖、果均含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)和維生素，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，是一種優(yōu)良的水生蔬菜，已成為農(nóng)民經(jīng)濟(jì)增長的重要作物之一。近年來，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國的蓮藕種植面積有了較大幅度增加，據(jù)估計，目前全國蓮藕種植面積約33萬hm2以上。
[0003]蓮藕腐敗病是由鐮刀菌屬侵染引起的一種重要土傳病害。在蓮藕種植過程中，藕種帶菌是蓮藕腐敗病的主要初侵染源，該病害主要危害蓮地下莖和根部，一般能夠造成蓮藕減產(chǎn)15%-40%，嚴(yán)重時達(dá)60%以上，甚至絕收。該病首先在受害的地下莖(藕節(jié))出現(xiàn)癥狀，其后才逐漸在病莖生出的地上葉片和葉柄顯癥，由于腐敗病發(fā)生的環(huán)境特殊性及葉片顯癥的滯后性，往往造成錯過該病的防治適期，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。而且目前，學(xué)者們對蓮藕腐敗病致病菌為鐮刀菌屬真菌多已認(rèn)同，但對其種的確定卻說法不一，已見報道的就有尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、珠鐮刀菌(F.moniliforme)、腐皮鐮刀菌(F.poae)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)和半裸鐮刀菌(F.avenaceum)等。因此,對蓮藕腐敗病病原菌的分類地位進(jìn)行鑒定，進(jìn)而對藕種是否攜帶腐敗病病菌進(jìn)行檢測的研究是有積極意義的；如果能夠通過PCR技術(shù)與測序法相結(jié)合，高效實(shí)現(xiàn)真菌屬內(nèi)不同的種之間的系統(tǒng)分類；進(jìn)一步通過序列比對,確定蓮藕腐敗病 的致病菌種屬類群；結(jié)合測序方法，設(shè)計蓮藕腐敗病病原菌的特異性檢測引物，實(shí)現(xiàn)對藕種的蓮真菌性腐敗病的快速檢測，是能達(dá)到蓮藕腐敗病的早期診斷與預(yù)防目的的，具有重要實(shí)際應(yīng)用價值。
[0004]就現(xiàn)有技術(shù)而言，獲得蓮藕腐敗病病原菌的分子檢測引物需要克服致病菌的種類鑒定，因?yàn)樯徟焊瘮〔〉闹虏【姆N類還未能完全確定，本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對蓮藕腐敗病致病菌進(jìn)行了種類鑒定，明確了蓮藕腐敗病病原菌的種屬，屬于尖孢鐮刀菌蓮?；?F.0xysporum Schl.sp.nelumbicola(Nis.et Wat.)Booth),并根據(jù)該尖抱鍵刀菌蓮?；瓦M(jìn)一步設(shè)計特異性檢測引物，實(shí)現(xiàn)高效準(zhǔn)確的對蓮藕腐敗病病原菌的分子檢測。目前來說，還沒有關(guān)于針對尖孢鐮刀菌蓮?；驮O(shè)計的特異性檢測引物，以及將其用于檢測藕種是否攜帶該蓮藕腐敗病致病菌的方法報道或公開過。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種快速檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法，尤其是特別針對于尖孢鐮刀菌蓮?；椭虏【母咝z測方法。
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供上述方法配套的試劑盒和引物。[0007]本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的:
[0008]—種檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法:
[0009]對藕種進(jìn)行取樣，提取樣品基因組DNA作為模板，以
[0010]上游引物:5’
【權(quán)利要求】
1.一種檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的方法，其特征在于: 對藕種進(jìn)行取樣，提取樣品基因組DNA作為模板，以
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系中含有:2.5μ L含 15mM MgCl2 的 IOXTrans Start Buffer ；2.5μ L濃度為 2.5mM 的 dNTPs ；1U Trans Start Taq DNA Polymerase ；2 μ L 濃度為 IOmM PCR 上、下游混合引物；50ng模板DNA ；ddH20補(bǔ)足到25 μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于， PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)? 階段 1:94°C預(yù)變性 5min ;階段 2:94°C 20s, 55°C 20s, 72°C 30s，共循環(huán) 34 次；階段 3:72°C延伸4min ;階段4:4°C保持。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蓮真菌性腐敗病病原菌為尖孢鐮刀菌蓮?；汀?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，藕種包括藕蓮或籽蓮的藕種。
6.一種檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的試劑盒，其特征在于:包括
7.—種檢測藕種攜帶蓮真菌性腐敗病病原菌的引物，其特征在于:
【文檔編號】C12Q1/04GK103725782SQ201310715070
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】魏林, 梁志懷, 張屹, 成燕清, 陳玉榮, 呂剛, 肖密 申請人:湖南省植物保護(hù)研究所