一種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因及其制備和應(yīng)用。CfSRCR-2基因的重組蛋白為序列表SEQ?ID?NO.1中氨基酸序列所示。具體構(gòu)建采用通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增櫛孔扇貝CfSRCR-2分子基因的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其編碼區(qū)進(jìn)行原核重組表達(dá)。本發(fā)明提供的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因含有SRCR結(jié)構(gòu)域的活性分子。該蛋白不僅可以結(jié)合乙酰化的低密度脂蛋白和甘露糖，是一種重要的免疫受體分子，而且能夠直接抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，從而起到免疫效應(yīng)分子的作用，可見(jiàn)本發(fā)明蛋白可作為較好的免疫增強(qiáng)劑候選分子。
【專利說(shuō)明】—種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因及其制備和

應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫增強(qiáng)劑是指能夠促進(jìn)或誘發(fā)宿主防御反應(yīng)，增強(qiáng)生物機(jī)體抗病能力的一類物質(zhì)。因其具有安全、廣譜、高效、無(wú)毒、無(wú)污染、低成本等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前已在畜牧養(yǎng)殖中作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用。但快速發(fā)展的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所需的免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用仍處于起步階段，其中較為關(guān)鍵的就是解決活性物質(zhì)的導(dǎo)入技術(shù)和應(yīng)用方法的難題。
[0003]貝類是我國(guó)優(yōu)勢(shì)海水養(yǎng)殖對(duì)象，目前年產(chǎn)量接近3千萬(wàn)噸，占全國(guó)海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80%，其中雙殼貝類產(chǎn)量占海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的95%以上。貝類養(yǎng)殖在我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展中占據(jù)舉足輕重的地位，并具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，但良種缺乏和病害問(wèn)題的困擾一直是產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的主要制約因素。從貝類自身的免疫防御系統(tǒng)入手，闡明重要受體分子的基因結(jié)構(gòu)和功能，將有助于深入探討貝類免疫防御機(jī)制，為病害防治和良種選育提供新思路。
[0004]SRCR結(jié)構(gòu)域(Scavenger receptor Cys-rich)最早發(fā)現(xiàn)于清道夫受體(Scavengerreceptor)中，是其主要的功能結(jié)構(gòu)之一，后來(lái)在其他分子中也發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域。具有SRCR結(jié)構(gòu)域的分子都是固有免疫反應(yīng)中的重要受體，通過(guò)識(shí)別外源物質(zhì)和進(jìn)行信號(hào)傳遞，在免疫應(yīng)答通路中起重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因及其制備和應(yīng)用。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因，CfSRCR-2基因的重組蛋白為序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示。
[0008]原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因的制備方法，
[0009]1)以櫛孔扇貝CfSRCR-2編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用；
[0010]2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-El載體通過(guò)T4連接酶連接，而后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行重組表達(dá)；
[0011]3)將上述構(gòu)建的陽(yáng)性重組菌株加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得產(chǎn)物，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白CfSRCR-2 ;所述因?yàn)镻l和P2分別為Pl:5’ -ATGCGTACACAGGACAACTTCATAT-3’ ；P2:5’ -TGGTATCTCAGCCAGAACTGGACTT-3’。
[0012]原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因的應(yīng)用，所述序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白CfSRCR-2可作為制備抑制革蘭氏陰性細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制劑。[0013]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明提供的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因含有SRCR結(jié)構(gòu)域的活性分子。該蛋白不僅可以結(jié)合乙?；牡兔芏戎鞍缀透事短?，是一種重要的免疫受體分子，而且能夠直接抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，從而起到免疫效應(yīng)分子的作用，可見(jiàn)本發(fā)明蛋白可作為較好的免疫增強(qiáng)劑候選分子。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為SDS-PAGE檢測(cè)的CfSRCR-2的表達(dá)圖，其中，1，誘導(dǎo)表達(dá)的含CfSRCR-2的重組大腸桿菌；2,陰性對(duì)照；M,蛋白Marker。 [0015]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的櫛孔扇貝CfSRCR-2對(duì)真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)的抑制作用圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。實(shí)驗(yàn)例I
[0017]櫛孔扇貝CfSRCR-2原核重組表達(dá)氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
[0018]SEQ ID N0.1
[0019]MRTQDNFILLVDTGLGGRIFRMDIDTQSFSPIPLNTLYTPSAFDYDPTEARIYFVDPTLKQLLSVHFSGTDIRELQQLDTNADLEKVAVDPINRVLFYADTGNDFIASVNLDGSNFKTLANDTIDEPRDLAIDPKNRVVYWTDWGASPKIEKMNYDGTGRQTIASTNMKWPNGLALDYTTNILYFVDASTDQIEKINTDGTGRSVVMSDPGSHMYGISLYKRYIYYTDWTRTSVMRVNKDGTGKTTVGPPSFKELADIHVQHYGTGMPGIVTPAPIVQDETHMFVRLVGRGNHNEGLVEVYANGVWGTICDDGWTNKDAGVICDMMGFGKANAVAVNESRYGSDGNILIFSDEVNCTGEESHIAQCTVPSDWGVHDCSHTEDAGVTCQLDPTTIRSFVLMTDSYTSEVYRMDLETGSYSAIPNANVYSPIAVDYDPVSHNVFYTDVRMGVIRQTSLDGATQKDLLQLNRISTPDGLVVDDTNRLIFYTDTGNDVIGKVGIDGTGPANIITTNLDQPRAIAVDKKNQVVYWTDWGKDPKIEKANYDGSGRQVIANGTGLNLPNGLTFDEGDQKLYFWDAGTNKIEVMNTDGSPRKVLFEDSGAHFFGLDTDEQFIYFTDWTKDGVTKIEKSGVSEIPIGPPSFVRVNGVAVYKSSSG 序列特征:
[0020]?長(zhǎng)度:656個(gè)氨基酸
[0021]?類型:蛋白
[0022]?鏈型:單鏈
[0023]?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線形
[0024]?特性:分子量為74.48kDa，等電點(diǎn)為4.73，其編碼序列具有一個(gè)保守的SRCR結(jié)構(gòu)域和十個(gè)低密度脂蛋白受體YWTD結(jié)構(gòu)域。
[0025]?來(lái)源:柿孔扇貝(Chlamys farreri)
[0026]櫛孔扇貝CfSRCR-2原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0027]1.重組載體的構(gòu)建:本發(fā)明中采用pEASY-El原核表達(dá)載體。通過(guò)PCR技術(shù)，使用基因特異性引物 Pl (5’-ATGCGTACACAGGACAACTTCATAT-3’)和 P2(5’-TGGTATCTCAGCCAGAACTGGACTT-3’)擴(kuò)增櫛孔扇貝一種含SRCR結(jié)構(gòu)域的分子CfSRCR-2基因全部的編碼區(qū)片段。反應(yīng)條件為:首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收，與pEASY-El載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci后，挑取單克隆利用上述載體引物進(jìn)行菌落PCR篩選并測(cè)序,驗(yàn)證測(cè)序正確后將陽(yáng)性菌株進(jìn)行保種,完成載體的構(gòu)建。[0028]2.重組蛋白的表達(dá):以BL21(DE3)為重組表達(dá)菌株，將上述構(gòu)建的重組載體和空載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確。挑取單克隆，接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12-16小時(shí)，然后以1:100的體積比接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)至OD600=0.5-0.7。加入IPTG，使終濃度達(dá)到lmmol/mL，18°C繼續(xù)培養(yǎng)12h。4 °C，5000rpm，離心lOmin，收集菌體，于-20 °C凍存?zhèn)溆?。取Iml菌液離心，棄去上清后，加入80 ii L水和20UL5X蛋白上樣緩沖液(250nmTris-HCl, pH6.8, 10% (w/v) SDS, 0.5% (w/v) BPB, 50% (v/v)甘油，5%(v/v) (6-巰基乙醇)，100°C沸水煮沸10分鐘，離心，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物(參見(jiàn)圖1)。
[0029]3.重組蛋白的純化:將上述所得蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF純化獲得了重組蛋白。
[0030]用具體操作步驟如下:
[0031]鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白:
[0032](I)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1.6 X 20cm,柱床體積為IOml ；
[0033](2)用緩沖液 I (50mM PBS, pH7.4,0.5M NaCl)平衡 2-5 個(gè)床體積，流速為 2mLmirf1 ；
[0034](3)將 20ml 細(xì)胞破碎液(50mM PBS, pH7.4,0.5M NaCl) 0.45 y m 濾膜過(guò)濾，上樣，流速為ImL min_1 ；
[0035](4)用緩沖液I再洗2-5個(gè)床體積，流速為2mL min_1 ；
[0036](5)用分別含 10、20、50、100、200、300、400mM 的咪唑的緩沖液 3(50mM PBS,pH7.4,
0.5M NaCl)進(jìn)行階段洗脫，流速為2mL mirT1，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)；
[0037](6)用純水流洗5個(gè)柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個(gè)柱床體積，流速為2mLmirT1，柱子置于4°C環(huán)境中保存。
[0038](7)純化的重組蛋白需要在適當(dāng)?shù)膹?fù)性緩沖液中通過(guò)透析除去咪唑，防止其對(duì)蛋白功能的影響。純化產(chǎn)物經(jīng)50mM PBSUOOmM NaCl在4°C透析24h，即得到櫛孔扇貝CfSRCR-2基因重組蛋白。
[0039]實(shí)施例2
[0040]重組的CfSRCR-2抑制微生物生長(zhǎng)的活性分析
[0041]對(duì)畢赤酵母(Pichiapastoris)、金黃色葡萄球菌(Staphy loccous aureus)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn):分別從真菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌中選取一株代表菌(畢赤酵母、金黃色葡萄球菌、燦爛弧菌)，其中，畢赤酵母接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，金黃色葡萄球菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，燦爛弧菌接種到2216E培養(yǎng)基中；畢赤酵母和燦爛弧菌28°C培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌37°C培養(yǎng)至OD值=0.5-0.6，用Tris-HCl緩沖液稀釋OD值至0.001，進(jìn)行抑菌活性分析。
[0042]取50 ii L稀釋后的菌液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后加100 U L的重組蛋白，空白組加50 u L Tris-HCl(pH7.4)，對(duì)照組加50 u L的BSA蛋白，18°C孵育3小時(shí)，然后加50 u L相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，孵育24小時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)表明，空白組和對(duì)照組對(duì)畢赤酵母，金黃色葡萄球菌和燦爛弧菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用；CfSRCR-2蛋白對(duì)燦爛弧菌有顯著的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和畢赤酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用(參見(jiàn)圖2)。[0043] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因，其特征在于:CfSRCR-2基因的重組蛋白為序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因的制備方法，其特征在于: 1)以櫛孔扇貝CfSRCR-2編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用； 2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-El載體通過(guò)T4連接酶連接，而后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行重組表達(dá)； 3)將上述構(gòu)建的陽(yáng)性重組菌株加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得產(chǎn)物，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白CfSRCR-2 ;所述因?yàn)镻l和P2分別為Pl:5’ -ATGCGTACACAGGACAACTTCATAT-3’ ；P2:5’ -TGGTATCTCAGCCAGAACTGGACTT-3’。
3.—種權(quán)利要求1所述的原核重組表達(dá)的櫛孔扇貝CfSRCR-2基因的應(yīng)用，其特征在于:所述序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白CfSRCR-2可作為制備抑制革蘭氏陰性細(xì)菌生長(zhǎng)的抑 制劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103642816SQ201310655247
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】宋林生, 劉瑞, 王玲玲, 邱麗梅, 張峘 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所