一種利用數(shù)字pcr檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法。該方法包括如下步驟：1）富集待測(cè)食品中的細(xì)菌，將富集物與與DNA結(jié)合物共同孵育，獲得PCR擴(kuò)增模板；所述DNA結(jié)合物為不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能與細(xì)胞膜受損后暴露出來(lái)的DNA結(jié)合的物質(zhì)；2）配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)體系中含有所述PCR擴(kuò)增模板、細(xì)菌通用引物對(duì)、熒光染料、dNTP和DNA聚合酶；3）根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，計(jì)算所述待測(cè)液體食品中的菌落總數(shù)。本方法無(wú)需對(duì)食品中細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間縮短至2-3小時(shí)；同時(shí)大大減少了背景DNA和基質(zhì)的干擾，靈敏度低至1個(gè)拷貝；而且該方法無(wú)需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)結(jié)果可直接判讀樣品中的菌落總數(shù)，大大簡(jiǎn)化了操作步驟。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法，特別涉及一種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]民以食為天，食以安為先，食品安全關(guān)系到消費(fèi)者的身心健康與財(cái)產(chǎn)安全。食品中的致病微生物是引發(fā)食品安全問(wèn)題的重要原因之一，而菌落總數(shù)是作為食品安全一個(gè)很重要的微生物指標(biāo)，檢測(cè)食品中菌落總數(shù)是判斷樣品是否被人、畜糞便污染及污染程度的標(biāo)志，可以推測(cè)該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，以及潛伏著食物中毒和流行病的威脅，是否對(duì)人體健康具有潛在的危險(xiǎn)。所以各個(gè)國(guó)家都針對(duì)諸如肉、蛋、奶、飲料等各種食品中的菌落總數(shù)制定了限定標(biāo)準(zhǔn)，并依法對(duì)各種食品的微生物含量進(jìn)行抽查檢測(cè)。例如我國(guó)規(guī)定醬油、巴氏殺菌乳中的菌落總數(shù)不能超過(guò)30000cfu/ml,生鮮乳中不能超過(guò)200萬(wàn)cfu/mL.由于食品基質(zhì)復(fù)雜，食品中微生物數(shù)量較少，目前對(duì)食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法都要依賴(lài)于細(xì)菌培養(yǎng)，在培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測(cè)，因此檢測(cè)時(shí)間需要1-2天完成。如目前的國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法需要48-72個(gè)小時(shí)才能完成， 美國(guó)進(jìn)口 3M菌落總數(shù)測(cè)試片也需要48小時(shí)才能確認(rèn)結(jié)果。對(duì)于講究鮮活的食品來(lái)講，檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大大影響了食品的供應(yīng)，同時(shí)也降低了鮮活食品的質(zhì)量。因此急需一種快速的食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法。
[0003]數(shù)字PCR是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種定量分析技術(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門(mén)研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于I個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)定量PCR技術(shù)不同的是數(shù)字PCR不依賴(lài)于擴(kuò)增曲線(xiàn)的循環(huán)閾值(CT)進(jìn)行定量，不受擴(kuò)增效率的影響，也不必采用看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。在現(xiàn)階段的低豐度因子含量檢測(cè)中，定量PCR、雜交等方法都因受到背景DNA或雜質(zhì)的干擾，使得檢測(cè)靈敏度及精確性都達(dá)不到精細(xì)定量的要求(如定量PCR檢測(cè)中Ct值大于33的情況下，其重復(fù)性和準(zhǔn)確性就不是很高)，而微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)微滴化處理，使得稀有的待檢測(cè)片段從大量的背景DNA中分離出來(lái)，從而提高了檢測(cè)的靈敏度及精確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法。
[0005]數(shù)字PCR方法在檢測(cè)食品中菌落總數(shù)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0006]本發(fā)明所提供的利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法，具體可包括如下步驟:
[0007](I)富集待測(cè)食品中的細(xì)菌，將富集物與DNA結(jié)合物共同孵育，獲得PCR擴(kuò)增模板；[0008]所述DNA結(jié)合物為不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜(活細(xì)菌)，但能與細(xì)胞膜受損(死細(xì)菌)后暴露出來(lái)的DNA結(jié)合的物質(zhì)；
[0009](2)配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)體系中含有步驟(1)獲得的PCR擴(kuò)增模板、細(xì)菌通用引物對(duì)、熒光染料、dNTP和DNA聚合酶；
[0010](3)根據(jù)步驟(2)數(shù)字PCR反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，計(jì)算得到所述待測(cè)食品中的菌落總數(shù)。
[0011]在上述方法中，所述待測(cè)食品可為液體食品，也可為固體食品。如各種鮮活農(nóng)產(chǎn)品及其加工食品、水以及飲料等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述待測(cè)食品為奶，具體為牛奶，更加具體為生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶。
[0012]當(dāng)所述待測(cè)食品為液體食品(如牛奶)時(shí)，上述方法的步驟(1)中，所述“富集待測(cè)食品中的細(xì)菌”可為將所述待測(cè)食品(如牛奶)離心，所得沉淀即為所述富集物(富集了待測(cè)食品中的細(xì)菌)。進(jìn)一步，將所述待測(cè)食品(如牛奶)離心的轉(zhuǎn)速可為14000g，時(shí)間可為5-10min (如 IOmin),溫度可為 4°C。
[0013]在上述方法的步驟(1)中，將所述富集物與所述DNA結(jié)合物共同孵育的目的是為了讓所述DNA結(jié)合物與死細(xì)菌的DNA結(jié)合，從而阻斷死細(xì)菌DNA分子的PCR擴(kuò)增，從而有效實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)菌的選擇性擴(kuò)增。
[0014]在上述方法中，所述細(xì)菌通用引物對(duì)具體為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0015]在上述方法中，所述DNA結(jié)合物具體可為疊氮溴化丙錠(PMA)或疊氮溴化乙錠(EMA)0
[0016]在上述方法中，所述突光染料具體可為SybGreen或EvaGreen。
[0017]在上述方法的步驟(2)中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度可為58°C。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min;94°C 45S，50 °C 45S，72°C 60S，5 個(gè)循環(huán)；94°C 45S，58°C 45S，72°C 60S, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 保溫IOmin0
[0018]進(jìn)一步，在步驟(1)中，所述DNA結(jié)合物(PMA或EMA)在孵育體系中的終濃度為10 μ g/mlο
[0019]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述方法的步驟(1)具體為:將20_50ml牛奶(生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶)4°C 14000g離心IOmin后，收集沉淀，用Iml生理鹽水重懸后加入DNA結(jié)合物(PMA或EMA)至其終濃度為10μ g/ml，25°C孵育20分鐘，然后4°C 14000g離心5min，用生理鹽水重懸沉淀至10-20微升，得到所述PCR擴(kuò)增模板。
[0020]在上述方法的步驟(2)中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)體系中，所述細(xì)菌通用引物對(duì)中兩條單鏈DNA分子的終濃度均為10 μ M0
[0021]具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，上述方法的步驟(2)中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)體系(以總體積20微升為例)為:5微升所述PCR擴(kuò)增模板，所述細(xì)菌通用引物對(duì)中兩條單鏈DNA分子的終濃度均為10μM，l微升熒光染料(SybGreen或EVaGreen)，以及10微升PCR mix,余量為水。所述PCR mix由dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成，具體為Bio-rad公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為186-4035。
·[0022]在上述方法中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)，并根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號(hào)計(jì)算所述待測(cè)食品中的菌落總數(shù)，是在現(xiàn)有的數(shù)字PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。首先，利用數(shù)字PCR系統(tǒng)自帶的分液器將配制好的所述反應(yīng)體系進(jìn)行分液處理，生成數(shù)萬(wàn)個(gè)液滴，分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，使每個(gè)微滴或反應(yīng)器的PCR擴(kuò)增模板數(shù)少于或者等于I個(gè)；其次，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增，有一個(gè)PCR擴(kuò)增模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有PCR擴(kuò)增模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。進(jìn)一步，根據(jù)熒光信號(hào)的相對(duì)比例和PCR反應(yīng)液的體積，計(jì)算出所述待測(cè)食品(如牛奶)中活細(xì)菌總數(shù)。
[0023]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的試劑盒。所述食品可為液體食品，也可為固體食品。如各種鮮活農(nóng)產(chǎn)品及其加工食品、水以及飲料等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述食品為奶，具體為牛奶，更加具體為生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶。
[0024]具體的，本發(fā)明所提供的試劑盒，可包括如下物質(zhì):
[0025]Ca)引物對(duì)；所述引物對(duì)為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；
[0026](b) DNA結(jié)合物；所述DNA結(jié)合物為不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能與細(xì)胞膜受損后暴露出來(lái)的DNA結(jié)合的物質(zhì)；
[0027]所述DNA結(jié)合物具體可為疊氮溴化丙錠(PMA)或疊氮溴化乙錠(EMA)。
[0028]進(jìn)一步，所述試劑盒還可包括含熒光染料的PCR Mix ；
[0029]所述突光染料具體可為SybGreen或EvaGreen。
[0030]所述試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)緩沖液。
[0031]在本發(fā)明中，所有的所述菌落總數(shù)均為活細(xì)菌總數(shù)(細(xì)胞膜完整的活細(xì)菌總數(shù))。
[0032]在本發(fā)明中，所述引物對(duì)不限于由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)，只要是能夠特異性擴(kuò)增所有細(xì)菌的引物對(duì)均可。
[0033]本發(fā)明在數(shù)字PCR基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了可以擴(kuò)增所有細(xì)菌的通用引物，建立了基于數(shù)字PCR方法的食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法。與常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法無(wú)需對(duì)食品中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，使檢測(cè)時(shí)間從1-2天縮短至3-5小時(shí)；同時(shí)本發(fā)明的方法通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)PCR反應(yīng)液進(jìn)行分液處理，大大減少了背景DNA和基質(zhì)的干擾，靈敏度可以低至I個(gè)拷貝；而且該方法無(wú)需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)結(jié)果可以直接判讀樣品中的菌落總數(shù)，大大簡(jiǎn)化了操作步驟。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0035]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036]數(shù)字PCR系統(tǒng):Bio-rad公司Droplet Digital PCR System (購(gòu)自伯樂(lè)公司，目錄號(hào)為186-4001)。其工作原理為:將含有熒光染料的反應(yīng)體系進(jìn)行分液處理,生成數(shù)萬(wàn)個(gè)液滴，分散至芯片的微滴中，使每個(gè)微滴的模板數(shù)少于或者等于I個(gè)；這樣，在PCR循環(huán)擴(kuò)增時(shí)，有一個(gè)模板的微滴就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)，沒(méi)有PCR擴(kuò)增模板的微滴就沒(méi)有熒光信號(hào)。進(jìn)一步，根據(jù)熒光信號(hào)的相對(duì)比例和反應(yīng)液的體積，就可以計(jì)算出反應(yīng)體系中模板的濃度。
[0037]疊氮溴化丙錠(PMA):美國(guó)Biotium公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為40013。疊氮溴化乙錠(EMA):美國(guó)Biotium公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為40015。PMA和EMA均為DNA結(jié)合物，均不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能與細(xì)胞膜受損后暴露出來(lái)的DNA結(jié)合。因此，PMA和EMA可以與死細(xì)菌的DNA結(jié)合，但是不能與細(xì)胞膜完整的活細(xì)菌的DNA結(jié)合。
[0038]熒光染料SybGreen:美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為S-7585。熒光染料EvaGreen:美國(guó)Biotium公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為31000。熒光染料SybGreen和EvaGreen均可與雙鏈DNA分子結(jié)合，發(fā)出綠色熒光。[0039]PCR mix:Bio-rad公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為186-4035。所述PCR mix由dNTP、DNA聚合酶和PCR緩沖液組成。
[0040]美國(guó)3M菌落總數(shù)測(cè)試片:美國(guó)3M公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為6406。
[0041]實(shí)施例1、利用數(shù)字PCR對(duì)市售生鮮牛乳進(jìn)行菌落總數(shù)的檢測(cè)
[0042]本實(shí)施例以12份市售生鮮牛乳作為待測(cè)食品，編號(hào)為1-12，利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)其中的菌落總數(shù)(活細(xì)菌總數(shù))進(jìn)行檢測(cè)。
[0043]一、細(xì)菌通用引物對(duì)的設(shè)計(jì)
[0044]為了能夠利用PCR方法檢測(cè)食品中的所有細(xì)菌，根據(jù)細(xì)菌基因組保守序列，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增所有細(xì)菌的通用引物，具體如下:
[0045]正向引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(序列 I);
[0046]反向引物:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(序列 2)。
[0047]二、PCR擴(kuò)增模板的制備
[0048]取20ml市售生鮮牛乳，4°C 14000g離心lOmin，得沉淀(細(xì)菌)，用Iml生理鹽水重懸后加入疊氮溴化乙錠(EMA),使其終濃度為10μ g/ml,室溫(25°C)孵育20分鐘,然后40C 14000g離心5min，用生理鹽水將沉淀重懸至20微升，得到PCR擴(kuò)增模板。
[0049]三、配制PCR反應(yīng)體系
[0050]取5微升步驟二獲得的PCR擴(kuò)增模板，加入10微升PCR mix, 2微升正向引物和2微升反向引物(使正向引物和反向引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為10 μ M)，I微升熒光染料EvaGreen?；旌虾蟮玫?0微升的反應(yīng)體系。
[0051 ] 四、上機(jī)進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)
[0052]1、反應(yīng)體系的分液處理
[0053]將步驟三配制好的PCR反應(yīng)體系置于數(shù)字PCR系統(tǒng)的分液器內(nèi)，按照儀器使用說(shuō)明進(jìn)行操作，實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)體系的分液處理，生成2萬(wàn)個(gè)液滴。
[0054]2、PCR循環(huán)擴(kuò)增
[0055]每個(gè)液體在獨(dú)立的空間內(nèi)進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。設(shè)置反應(yīng)程序如下:94°C預(yù)變性3min ；94°C 45S，50°C 45S，72°C 60S，5 個(gè)循環(huán)；94°C 45S，58°C 45S，72°C 60S, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C保溫 IOmin。
[0056]3、分析突光信號(hào)
[0057]PCR循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，利用數(shù)字PCR系統(tǒng)自帶的微滴熒光檢測(cè)儀采集每個(gè)液滴的熒光信號(hào)。進(jìn)一步，根據(jù)發(fā)出熒光信號(hào)的液滴的數(shù)量，計(jì)算出所述待測(cè)食品(市售生鮮牛乳)中活細(xì)菌總數(shù)。
[0058]實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置以美國(guó)3M菌落總數(shù)測(cè)試片對(duì)作為待測(cè)食品的市售生鮮牛乳進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定的對(duì)照。具體的實(shí)驗(yàn)操作均按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)記載進(jìn)行。
[0059]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。[0060]結(jié)果如表1所示，從結(jié)果可以看出，本發(fā)明采用數(shù)字PCR方法對(duì)生鮮牛乳中菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果，與現(xiàn)有的“美國(guó)3M菌落總數(shù)測(cè)試片法”相比，12份樣本的誤差均小于25%，平均誤差為13%，這說(shuō)明本發(fā)明方法具有很高的準(zhǔn)確度。另外，本發(fā)明數(shù)字PCR方法的單樣本全程檢測(cè)時(shí)間為3小時(shí)，遠(yuǎn)短于現(xiàn)有“美國(guó)3M菌落總數(shù)測(cè)試片法”的48小時(shí)。
[0061]表1數(shù)字PCR法與美國(guó)3M菌落總數(shù)測(cè)試片法測(cè)定生鮮牛乳中菌落總數(shù)的結(jié)果對(duì)比(單位:CFU/mL)
[0062]
【權(quán)利要求】
1.數(shù)字PCR方法在檢測(cè)食品中菌落總數(shù)中的應(yīng)用。
2.一種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的方法，包括如下步驟: (O富集待測(cè)食品中的細(xì)菌，將富集物與DNA結(jié)合物共同孵育，獲得PCR擴(kuò)增模板；所述DNA結(jié)合物為不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能與細(xì)胞膜受損后暴露出來(lái)的DNA結(jié)合的物質(zhì)； (2)配制PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行數(shù)字PCR反應(yīng)；所述PCR反應(yīng)體系中含有步驟(1)獲得的PCR擴(kuò)增模板、細(xì)菌通用引物對(duì)、熒光染料、dNTP和DNA聚合酶； (3)根據(jù)步驟(2)數(shù)字PCR反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，計(jì)算得到所述待測(cè)食品中的菌落總數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述細(xì)菌通用引物對(duì)為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
4.根據(jù)權(quán) 利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述DNA結(jié)合物為疊氮溴化丙錠或疊氮溴化乙錠。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述熒光染料為SybGreen或EvaGreen0
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，進(jìn)行所述數(shù)字PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度為58°C。
7.一種利用數(shù)字PCR檢測(cè)食品中菌落總數(shù)的試劑盒，包括如下物質(zhì): Ca)引物對(duì)；所述引物對(duì)為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)； (b) DNA結(jié)合物；所述DNA結(jié)合物為不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能與細(xì)胞膜受損后暴露出來(lái)的DNA結(jié)合的物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述DNA結(jié)合物為疊氮溴化丙錠或疊氮溴化乙錠。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括熒光染料；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述熒光染料為SybGreen或EvaGreen0
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667462SQ201310613501
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】陳愛(ài)亮, 吳英, 蔣小玲, 呂珍珍, 劉金釧, 楊曙明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所