一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種β-葡萄糖苷酶突變體及其應用，該突變體蛋白的最適反應溫度為48℃；與野生型蛋白相比，酶活水平基本沒有變化，并具有良好的熱穩(wěn)定性；本發(fā)明的突變體為β-葡萄糖苷酶的應用提供了一種新的途徑，可以用于高溫條件下纖維素材料的降解以及食品、化工等領(lǐng)域。
【專利說明】一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體及其應用
[0001](一)【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種β-葡萄糖苷酶突變體，尤其涉及一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體及其應用。
[0002](二)【背景技術(shù)】
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，其英文名為:beta glucosidase，又稱β _D_葡萄糖苷葡萄糖水解酶，屬于水解酶類，能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β -D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。根據(jù)氨基酸序列的相似性和底物特異性，β-葡萄糖苷酶被劃為糖苷酶57個家族中的第一家族，該家族的顯著特征是高度的序列同源性和廣泛的底物特異性，主要是對底物的糖苷配基部分顯示出廣泛的底物特異性。
[0003]β_葡萄糖苷酶分布較為廣泛，特別是植物的種子和微生物中尤為普遍，微生物β -葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、細菌、真菌和鏈霉菌中，已從多種微生物中分離得到葡萄糖苷酶。不同來源的葡萄糖苷酶的相對分子量由于其結(jié)構(gòu)和組成不同而差異很大，一般在40-250kDa之間，而其可能是單亞基、雙亞基或多亞基的。多數(shù)研究結(jié)果表明，β -葡萄糖苷酶為酸性蛋白，其最適PH —般在3.0-6.0之間，許多酵母、細菌的胞內(nèi)β -葡萄糖苷酶的最適PH都接近6.0。
[0004]葡萄糖苷酶在許多領(lǐng)域都有著廣泛的應用，例如:在工業(yè)上可以用于生產(chǎn)低聚龍膽糖，生產(chǎn)過程中，將高濃度的葡萄糖液用霉菌來源的β -葡萄糖苷酶進行反應，使葡萄糖發(fā)生轉(zhuǎn)移反應和縮合反應來合成低聚龍膽糖；β-葡萄糖苷酶還可以用于纖維素的降解，纖維素是葡萄糖以β -1, 4-鍵結(jié)合的聚合物，為植物細胞壁的構(gòu)成成分，是非常豐富的可再生資源，β -葡萄糖苷酶在纖維素水解成葡萄糖的過程中起著關(guān)鍵作用；β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力可用于乳品工`業(yè)來分解乳糖，可與其他酶協(xié)同作用生產(chǎn)葡萄糖與單細胞蛋白；β -葡萄糖苷酶還能用于改良果汁風味，其可以釋放出潛在的芳香成分，對于天然香精香料工業(yè)有著重要意義；此外，葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性可用于生產(chǎn)日化工業(yè)的非離子表面活性劑烷基糖苷，以及用于飼料工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域等。
[0005]目前工業(yè)上常用的瑞氏木霉來源的葡萄糖苷酶最適反應溫度通常在35°C左右，無法滿足高溫工業(yè)的應用，獲得最適反應溫度提高的β_葡萄糖苷酶將具有重大意義。本發(fā)明利用來源于瑞氏木霉的β_葡萄糖苷酶，通過定點突變的方法獲得了最適反應溫度提高的β -葡萄糖苷酶，突變體的最適反應溫度為48°C，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，其可以用于高溫條件下纖維素的降解以及食品工業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域。
[0006](三)
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是提供一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體，以及高溫條件下該突變體在纖維素材料降解和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應用。
[0007]本發(fā)明通過PCR的方法從瑞氏木霉中克隆得到了野生型的葡萄糖苷酶BGL1，其基因全長1455bp，編碼484個氨基酸；將其編碼基因重組到表達載體pET_32a中，在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行異源表達并純化得到重組蛋白，酶活測定結(jié)果顯示，其最適反應溫度為36°C。[0008]為了提高BGLl的最適反應溫度，利用生物信息學分析可能會影響其最適反應溫度的氨基酸殘基，結(jié)果顯示105位Ser、273位Ile以及409位Phe可能是影響其最適反應溫度的關(guān)鍵位點，之后通過定點突變的方式，對這三個氨基酸殘基進行突變:將105位Ser分別突變?yōu)锳la和Asn，得到S105A和S105N ;將273位Ile分別突變?yōu)锳la和Asn，得到I273A和I273N ;將409位Phe分別突變?yōu)锳la和Asn，得到F409A和F409N ;將105位Ser和273位Ile均突變?yōu)锳sn，得到雙突變體S105N-1273N ;對上述七個不同的突變體的酶活進行了研究，結(jié)果表明雙突變體S105N-1273N的最適反應溫度提高程度最高，達到48°C，其在45-50°C的高溫條件下均可以對底物產(chǎn)生較高的活性。
[0009]有益效果
本發(fā)明得到的葡萄糖苷酶突變體的最適反應溫度相對于野生型得到了提高，可以用于較高溫度時的纖維素材料降解以及食品、日化等領(lǐng)域中，為β_葡萄糖苷酶的應用提供了更多途徑的選擇，具有重要的經(jīng)濟價值。
[0010](四)【專利附圖】

【附圖說明】
圖1:野生型β-葡萄糖苷酶和單一位點氨基酸突變體的酶活最適反應溫度曲線；圖1A:野生型；圖1B:F409A ；圖1C:F409N ；圖1D:S105A ；圖1E:I273A ；圖1F:S105N ;圖1G:1273N ；
圖2:雙突變體S105N-1273N酶活最適反應溫度曲線；
圖3:野生型β-葡萄糖苷酶和雙突變體S105N-1273N酶活熱穩(wěn)定曲線；虛線(…)表示野生型β -葡萄糖苷酶在36°C保溫12小時的酶活變化曲線；實線(一)表示雙突變體S105N-1273N在48°C保溫12小時的酶活變化曲線。
[0011](五)【具體實施方式】
下面結(jié)合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作出更進一步的說明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。
[0012]實施例1: β -葡萄糖苷酶BGLl基因的分離
(O以編號為ATCC 26921的瑞氏木霉為材料，對其進行接種、培養(yǎng)、收集菌絲；采用Trizol法提取RNA，將RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RNA的提取以及反轉(zhuǎn)錄采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段即可實現(xiàn)，本發(fā)明利用了 Irwitrogen公司的Trizol試劑以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到了 cDNA。
[0013](2)設(shè)計引物進行β -葡萄糖苷酶BGLl的cDNA的擴增，引物序列如下=BGLlF:ccggaattccccgagtcgctagctctgcc ；BGLlR:cccaagctttgccgccactttaaccctctg ;利用酶切連接的方法將BGLl連接到表達載體pET32a，得到重組載體，對其進行測序，得到BGLl的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0014]實施例2: β -葡萄糖苷酶BGLl突變體的獲得
【權(quán)利要求】
1.一種β-葡萄糖苷酶BGLl，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQID N0.2所示，最適反應溫度為36°C。
2.一種最適反應溫度提高的葡萄糖苷酶S105N-1273N，其特征在于，其是權(quán)利要求1所述的β -葡萄糖苷酶BGLl的突變體，氨基酸序列如SEQ ID N0.16所示，最適反應溫度為 48℃。
3.編碼權(quán)利要求2所述的β-葡萄糖苷酶S105N-1273N的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID N0.15所示。
5.包含權(quán)利要求3或4所述基因的表達載體。
6.包含權(quán)利要求6所述表達載體的宿主細胞。
7.權(quán)利要求1所述的β_葡萄糖苷酶BGLl在纖維素材料降解中的應用。
8.權(quán)利要求2所述的β-葡萄糖苷酶S105N-1273N在纖維素材料降解中的應用。
9.權(quán)利要求2所述的β-葡萄糖苷酶S105N-1273N在高溫條件下降解纖維素材料的應用，所述高溫條件為45-50°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述高溫條℃件為48°C。
【文檔編號】C12N15/56GK103602646SQ201310583593
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】王宜磊, 王文爽 申請人:王宜磊