一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒及其應(yīng)用，屬于疾病檢測產(chǎn)品領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒包含β-地中海貧血基因五種常見突變位點的擴增引物對，還包括2xconc.Master?Mix、鎂離子。使用該試劑盒對分析樣本進行PCR擴增，然后進行高分辨率熔解曲線分析，與五種突變位點的陽性熔解曲線進行比對從而確定此五個位點是否存在突變以及突變的類型。該試劑盒可以同時檢測β-地中海貧血的五個突變位點包括-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-Ⅱ-654中的一個或者一個以上組合，無需特異性探針和測序，所需樣品量少，其檢測快速、準(zhǔn)確、成本低，更適用于大規(guī)模檢測。
【專利說明】一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疾病檢測產(chǎn)品領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢測五種β -地中海貧血突變的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]β_地中海貧血是由于珠蛋白基因突變導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成障礙為特征的遺傳性溶血性貧血，為我國南方各省發(fā)病率最高、影響最大的遺傳病之一。迄今為止，全世界已報道200多種β-珠蛋白基因突變，而我國也發(fā)現(xiàn)了 30多種，其中-28、⑶17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654這五種突變占了我國β -珠蛋白基因突變的90%以上。β-地中海貧血患者根據(jù)珠蛋白鏈合成程度不同其臨床輕重不一:輕型患者無癥狀或僅有輕度貧血，臨床容易漏診；中間型可有中度貧血，脾臟輕或中度大；重型患者表現(xiàn)為嚴(yán)重的慢性進行性貧血，需依靠輸血和去鐵治療維持生命，致死性極高，預(yù)防還是最佳的應(yīng)對措施，臨床上主要通過對可疑β -地中海貧血患者進行基因診斷(包括產(chǎn)前診斷)來達到控制重型地中海貧血患兒出生的目的。
[0003]目前最常用的基因診斷方法是反向斑點雜交技術(shù)和DNA直接測序法。反向斑點雜交技術(shù)能夠一次性檢測β -珠蛋白基因的17個常見突變位點，但是該法耗時長，操作繁瑣，檢測結(jié)果受PCR反應(yīng)體系、緩沖液、DNA純度等因素影響，容易造成誤診甚至漏診，而DNA直接測序法儀器試劑成本較高、檢測周期長，對雜合突變、富集GC的樣本很難一次檢測獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，也有報道將TaqMan探針法、基因芯片技術(shù)應(yīng)用于β -地中海貧血基因突變的檢測，然而，這些技術(shù)操作復(fù)雜、實驗需要精密儀器和特殊的標(biāo)記引物、試劑耗材成本昂貴，在臨床上無法普遍推廣應(yīng)用。
[0004]高分辨率熔解曲線(high resolution melting,HRM)是最近興起的用于突變掃描和基因分型的技術(shù)，其基本原理為利用雙鏈DNA受熱解離成為單鏈的核酸物理特性，采集解鏈時釋放的熒光信號繪制熔解曲線，再通過熔解曲線的變化來反映核酸性質(zhì)的差異。HRM具有高靈敏度、特異性好、操作簡單、完全閉管操作等優(yōu)點，其檢測不受突變堿基位點和種類的限制。
[0005]申請?zhí)枮?01210382305.4的中國專利公開了 “HRM法檢測突變型a-地中海貧血基因的試劑盒和方法”，該試劑盒可同時檢測6種突變型a-地中海貧血，目前國內(nèi)尚未有關(guān)于應(yīng)用高分辨率熔解曲線(HRM)檢測β -地中海貧血基因突變方面的專利報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒。所述五種β-地中海貧血突變指的是_28(c.-78A>G)、⑶17(c.52A>T)、CDs41/42 (c.126_129delCTTT)、CDs71/72 (c.216_217insA)、IVS-11-654(c.316_197C>T)。
[0007]本發(fā)明的另 一目的在于提供應(yīng)用上述試劑盒進行快速檢測五種β -地中海貧血突變的方法。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供所述試劑盒的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):一種快速檢測五種地中海貧血突變的試劑盒，包括-28位點引物對、⑶S41/42和⑶S71/72位點引物對、⑶17位點引物對和IVS-11-654位點引物對:
[0010]-28位點引物對:
[0011]上游引物為:5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3’ ；
[0012]下游引物為:5’-ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGT-3’ ；
[0013]CDs41/42 和 CDs71/72 位點引物對:
[0014]上游引物為:5’-GAAGACTCTTGGGTTTCTGA-3’ ；
[0015]下游引物為:5’-AGAAAACATCAAGGGTCCCA-3’ ；
[0016]⑶17位點引物對:
[0017]上游引物為:5’-AGACACCATGGTGCACCTGAC-3’ ；
[0018]下游引物為:5’-GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3’ ；
[0019]IVS-11-654 位點引物對:
[0020]上游引物為:5’-GTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’ ；
[0021]下游引物為:5’-GGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3’。
[0022]所述的快速檢測五種β -地中海貧血突變的試劑盒優(yōu)選為將-28位點引物對及⑶S41/42和⑶S71/72位點引物對按1:1的比例在放置在一起，用于同一個PCR體系中進行反應(yīng)，CD17位點引物對、IVS-11-654位點引物對分別放置，分別用于另外的PCR體系中反應(yīng)；3個反應(yīng)體系即可檢測-28、CDs41/42、CDs71/72、CD17和IVS-11-654五個突變位點。
[0023]所述的快速檢測五種β -地中海貧血突變的試劑盒還包含Taq DNA聚合酶、dNTP、染料、MgCl2、PCR緩沖液、水和對照模板；
[0024]所述的染料優(yōu)選為SYBR Green I ；
[0025]所述的水為能用于PCR級別的水，優(yōu)選為雙蒸水或超純水；
[0026]所述的對照模板包括正常樣本和已知陽性對照突變位點樣本；
[0027]所述的正常樣本為經(jīng)測序證實的無β -珠蛋白基因突變的人DNA模板樣本；
[0028]所述的已知陽性對照突變位點樣本為-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654位點突變的純合子及雜合子的人的陽性DNA模板；
[0029]所述的快速檢測五種地中海貧血突變的試劑盒優(yōu)選含有-28位點引物對、CDs41/42和CDs71/72位點引物對、CD17位點引物對、IVS-11-654位點引物對、2倍濃度的Master Mix (含有染料SYBR Green I )、MgCl2、水和對照模板;
[0030]所述的2倍濃度的Master Mix即為羅氏制藥有限公司生產(chǎn)的LightCycle:1 R 480High Resolution Melting Master 中的濃度為 2 X conc.的 Master Mix，其中含有 laq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP和染料；
[0031]所述的MgCl2的濃度優(yōu)選為25mM。
[0032]一種應(yīng)用上述試劑盒進行快速檢測五種β -地中海貧血突變的使用方法，包括以下步驟:
[0033](1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；[0034](2)配制反應(yīng)體系，具體如下:取3個PCR反應(yīng)管，PCR反應(yīng)管I中加入_28位點的引物對及CDs41/42和CDs71/72位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反應(yīng)管2中加入CD17位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反應(yīng)管3中加入IVS-11-654位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master Mix、MgCl2和水；
[0035](3)分別用步驟(2)配制的反應(yīng)體系進行PCR擴增，分別得到相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，同時擴增含有對照模板的反應(yīng)體系；
[0036](4)將步驟(3)得到的PCR產(chǎn)物使用LightCycler ?, 480進行高分辨率熔解曲線分析(HRM)；
[0037](5)結(jié)果判斷:以無β_珠蛋白基因突變的正常樣本曲線作為基線，得到對應(yīng)的熔解曲線圖，與陽性對照突變位點熔解曲線圖進行比對從而確定是否存在突變，熔解曲線形狀與已知陽性對照突變位點熔解曲線圖不一致的，需重新檢測或者測序明確基因型；
[0038]步驟(1)中所述的樣本為外周血、絨毛、羊水或臍血樣品中的一種；
[0039]步驟(2)中所述的反應(yīng)體系中各組分的濃度為:各引物:0.I~0.2ymol/L ；DNA模板:1~2ng/y L ;鎂離子:2.5mmol/L，剩余體積用雙蒸水補足，反應(yīng)體積優(yōu)選為20 μ L ;
[0040]步驟(2)中所述的PCR反應(yīng)管I中優(yōu)選為含有-28位點引物濃度為0.1 μ mol/L,CDs41/42位點和CDs71/72位點引物濃度為0.1 μ mol/L ;所述的β -PCR反應(yīng)管2中優(yōu)選為含有⑶17位點引物濃度為0.1 μ mol/L ;所述的β-PCR反應(yīng)管3中優(yōu)選為含有IVS-11-654位點引物濃度為0.1 μ mol/L；
[0041]步驟(3)中所述的PCR擴增反應(yīng)的條件優(yōu)選為:95°C預(yù)變性8~lOmin，然后95°C變性15~30s，54~58°C退火15~30s，72°C延伸15~30s，35~45個循環(huán)；
[0042]步驟(4)中所述的使用LightCycler ? 480進行高分辨率熔解曲線分析的條件為95°C變性I~3min，40°C復(fù)性I~3min，然后以0.1~0.5°C /s的速度從60°C升溫至90°C收集熔解曲線數(shù)據(jù)進行分析；所述的熔解曲線分析的操作依照LightCycler ?_ 480用戶手冊標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行；
[0043]所述試劑盒應(yīng)用于臨床尤其是產(chǎn)前診斷五種β -地中海貧血基因突變。
[0044]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0045](I)本發(fā)明能同時對五種β-地中海貧血基因突變進行檢測,所需樣本量少且來源廣泛，外周血、絨毛、羊水和臍血樣品都可以進行診斷。
[0046](2)本發(fā)明通過通過3個反應(yīng)體系即可檢測-28、CDs41/42、CDs71/72、CD17和IVS-11-654五個突變位點，極大的簡化了檢測反應(yīng)的步驟。
[0047](3 )本發(fā)明快速、高通量、高靈敏度，可以在24小時內(nèi)完成96/384孔板的PCR產(chǎn)物檢測。
[0048](4)本發(fā)明借助于LightCycler R 480熒光定量PCR設(shè)備進行結(jié)果分析，自動化程
度高，重復(fù)性好。
[0049](5)本發(fā)明檢測成本低，完全閉管操作，解決了 PCR產(chǎn)物污染問題，適用于大規(guī)模檢測。
[0050](6)加入的染料不影響后續(xù)的測序。
[0051](7)選用的五個突變位點覆蓋了中國β-珠蛋白基因突變位點的90%以上。由于每段DNA在長度、GC含量及堿基的互補性等方面存在差異，因此每個DNA片段都有獨特的熔解曲線，根據(jù)每個位點的獨特熔解曲線形狀來判斷是否存在突變，診斷的準(zhǔn)確率可達到99%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1是本實驗的操作流程示意圖。
[0053]圖2是本發(fā)明實施例對羊水樣品行HRM檢測發(fā)現(xiàn)無CD17位點突變的熔解曲線圖。
[0054]圖3是本發(fā)明實施例對羊水樣品行HRM檢測發(fā)現(xiàn)CD17位點雜合突變的熔解曲線圖。
[0055]圖4是本發(fā)明實施例對羊水樣品行HRM檢測發(fā)現(xiàn)CD17位點純合突變的熔解曲線圖。
[0056]圖5是本發(fā)明實施例對羊水樣品行HRM檢測發(fā)現(xiàn)異常曲線的熔解曲線圖。
[0057]圖6是-28雜合子、-28純合子、正常樣本的擴增產(chǎn)物進行HRM的熔解曲線圖。
[0058]圖7是⑶17雜合子、⑶17純合子、正常樣本的擴增產(chǎn)物進行HRM的熔解曲線圖。
[0059]圖8是⑶S41/42雜合子XDs41/42純合子、正常樣本的擴增產(chǎn)物進行HRM的熔解曲線圖。
[0060]圖9是⑶S71/72雜合子、正常樣本的擴增產(chǎn)物進行HRM的熔解曲線圖。
[0061]圖10是IVS-11-654雜合子、IVS-11-654純合子、正常樣本的擴增產(chǎn)物進行HRM的熔解曲線圖。`
【具體實施方式】
[0062]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0063]實施例
[0064]對羊水樣品進行地中海貧血五種突變位點檢測(操作流程示意圖見圖1)，具體步驟如下:
[0065](I)羊水標(biāo)本放入離心機離心，2000rpm離心10分鐘；把標(biāo)本上清倒入玻璃管，剩下大概200 μ L沉淀，用濾芯吸頭移液到1.5mLEP管準(zhǔn)備DNA提取。
[0066](2)使用 DNA 提取試劑盒(Quick Gene SP kit DNA whole blood, FUJIFILM)進行DNA 提取得到基因組 DNA。DNA 濃度使用 30ng/ μ L, 280/260>l.8，230/260>2.5。
[0067](3)進行LightCycler ?, 480熒光定量PCR擴增，在PCR反應(yīng)管1、PCR反應(yīng)管2、PCR反應(yīng)管3中進行，同時檢測一例經(jīng)測序證實的無β -珠蛋白基因突變的正常樣本以及-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654位點突變的純合子及雜合子陽性DNA作為對照。PCR反應(yīng)體系(總反應(yīng)體積20 μ L)如下表1~3所示:
[0068]表1 PCR反應(yīng)管I的體系成份[0069]
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于包括-28位點引物對、CDs41/42和CDs71/72位點引物對、CD17位點引物對和IVS-11-654位點引物對:-28位點引物對: 上游引物為:5’ -CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3’ ；下游引物為:5’ -ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGT-3’ ；CDs41/42和CDs71/72位點引物對:上游引物為:5’ -GAAGACTCTTGGGTTTCTGA-3’ ；下游引物為:5’ -AGAAAACATCAAGGGTCCCA-3’ ；⑶17位點引物對:上游引物為:5’ -AGACACCATGGTGCACCTGAC-3’ ；下游引物為:5’ -GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3’ ；IVS-11-654位點引物對:上游引物為:5’ -GTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’ ；下游引物為:5’ -GGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測五種β_地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒將-28位點引物對及⑶S41/42和⑶S71/72位點引物對按1:1的比例在放置在一起，⑶17位點引物對、IVS-11-654位點引物對分別放置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測五種β_地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒還包含Taq DNA聚合酶、dNTP、染料、MgCl2、PCR緩沖液、水和對照模板；所述的染料為SYBR Green I ；所述的水為雙蒸水或超純水；所述的對照模板包括正常樣本和已知陽性對照突變位點樣本。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測五種β_地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于:所述的正常樣本為經(jīng)測序證實的無珠蛋白基因突變的人DNA模板樣本；所述的已知陽性對照突變位點樣本為-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-11-654位點突變的純合子及雜合子的人的陽性DNA模板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測五種β_地中海貧血突變的試劑盒，其特征在于:含有-28位點引物對、CDs41/42和CDs71/72位點引物對、CD17位點引物對、IVS-11-654位點引物對、2倍濃度的Master Mix、MgCl2、水和對照模板；所述的2倍濃度的Master Mix為羅氏制藥有限公司生產(chǎn)的LightCycler R 480HighResolution Melting Master 中的濃度為 2 X conc.的 Master Mix,其中含有 Taq DNA 聚合酶、PCR緩沖液、dNTP和染料。
6.一種應(yīng)用上述試劑盒進行快速檢測五種β_地中海貧血突變的使用方法，其特征在于包括以下步驟:(1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；(2)配制反應(yīng)體系，具體如下:取3個PCR反應(yīng)管，PCR反應(yīng)管1中加入-28位點的引物對及CDs41/42和CDs71/72位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反應(yīng)管2中加入CD17位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master Mix、MgCl2和水；PCR反應(yīng)管3中加入IVS-11-654位點的引物對、DNA模板、2倍濃度的Master Mix、MgCl2和水；(3)分別用步驟（2)配制的反應(yīng)體系進行PCR擴增，分別得到相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，同時擴增含有對照模板的反應(yīng)體系；(4)將步驟（3)得到的PCR產(chǎn)物使用LightCycler_? 480進行高分辨率熔解曲線分析；(5)結(jié)果判斷：以無β_珠蛋白基因突變的正常樣本曲線作為基線，得到對應(yīng)的熔解曲線圖，與陽性對照突變位點熔解曲線圖進行比對從而確定是否存在突變，熔解曲線形狀與已知陽性對照突變位點熔解曲線圖不一致的，需重新檢測或者測序明確基因型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用試劑盒進行快速檢測五種β-地中海貧血突變的使用方法，其特征在于：步驟（1)中所述的樣本為外周血、絨毛、羊水或臍血樣品中的一種；步驟（2)中所述的反應(yīng)體系中各組分的濃度為：各引物：0. 1~0. 2ymol/L ;DNA模板：1~2ng/ μ L ;鎂離子：2. 5mmol/L,剩余體積用雙蒸水補足,反應(yīng)體積為20 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用試劑盒進行快速檢測五種β-地中海貧血突變的使用方法，其特征在于：步驟（2)中所述的PCR反應(yīng)管1中含有-28位點引物濃度為0. lymol/L，⑶s41/42位點和⑶S71/72位點引物濃度為0. 1 μ mol/L ;所述的PCR反應(yīng)管2中含有⑶17位點引物濃度為0. lymol/L;所述的PCR反應(yīng)管3中含有IVS- II -654位點引物濃度為0.1 μmol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用試劑盒進行快速檢測五種β_地中海貧血突變的使用方法，其特征在于：步驟（3)中所述的PCR擴增反應(yīng)的條件為：95°C預(yù)變性8~lOmin，然后95°C變性15~30s，54~58°C退火15~30s，72°C延伸15~30s，35~45個循環(huán)；步驟（4)中所述的使用Lig`htCycler ? 480進行高分辨率熔解曲線分析的條件為95°C變性1~3min，40°C復(fù)性1~3min，然后以0. 1~0. 5°C /s的速度從60°C升溫至90°C收集熔解曲線數(shù)據(jù)進行分析；所述的熔解曲線分析的操作依照LightCycler ? 480用戶手冊標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行。
10.權(quán)利要求1~5任一項所述的快速檢測五種β-地中海貧血突變的試劑盒在產(chǎn)前診斷五種地中海貧血基因突變中應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602736SQ201310556987
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】尹愛華, 張彥, 何天文, 陳漢彪, 杜麗 申請人:廣東省婦幼保健院