一種花生高油酸性狀基因選擇方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種花生高油酸性狀基因選擇方法，包括以下步驟：提取不同花生品種（系）的葉片基因組，采用特異性引物從基因組中擴(kuò)增AhFAD2A和AhFAD2B基因。將特異擴(kuò)增條帶切膠回收后，進(jìn)行序列測(cè)定，得到基因的序列。對(duì)所獲得的序列進(jìn)行翻譯，比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，據(jù)此來判斷品種（系）油酸含量和油酸/亞油酸（O/L）比值的高低。本發(fā)明方法操作簡單，能夠?qū)ωS富多樣的花生種質(zhì)進(jìn)行分析，可以在苗期確定花生單株的油酸含量，結(jié)合單株綜合農(nóng)藝性狀選擇，能夠縮短育種進(jìn)程，提高高油酸育種的成效。
【專利說明】一種花生高油酸性狀基因選擇方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及花生高油酸性狀基因選擇方法，屬于花生生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是世界上最大的花生生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國?；ㄉ谖覈鴩窠?jīng)濟(jì)中具有重要的地位和作用。油酸是花生油脂中的主要脂肪酸，占花生脂肪酸總量的39%-49%之間，在人體脂類代謝中能降低有害膽固醇，但保持有益膽固醇的水平，從而減緩動(dòng)脈粥樣硬化，有效預(yù)防冠心病等心腦血管疾病的發(fā)生。另外，油酸含量高，抗氧化能力強(qiáng)，產(chǎn)品不易氧化酸敗，貨架壽命較長，耐儲(chǔ)能力也強(qiáng)。因此，世界主要油料作物(大豆、油菜、花生)的育種者都把培育高油酸新品種作為主要的育種目標(biāo)。
[0003]在花生育種過程中，油酸等內(nèi)在品質(zhì)只有通過種子化學(xué)測(cè)試才能確定其具體含量，因此在分離世代難以對(duì)油酸等品質(zhì)性狀進(jìn)行選擇。近紅外種子無損傷選擇技術(shù)的應(yīng)用解決了分離世代對(duì)油酸等內(nèi)在品質(zhì)性狀選擇的問題，但該技術(shù)僅能對(duì)收獲后種子的油酸含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，有些田間綜合性狀較差的超高油酸含量的材料容易丟失。發(fā)明與油酸含量相關(guān)的基因標(biāo)記，在苗期確定單株的油酸含量，同時(shí)結(jié)合綜合農(nóng)藝性狀選擇，可以大大提聞聞?dòng)退嵊N的成效。
遺傳研究表明，花生高油酸性狀由兩對(duì)隱性基因(o77和o7J?)共同控制。研究表明A 12脂肪酸脫氫酶基因(/?/--)是控制花生油酸性狀的關(guān)鍵基因。FAD2由位于不同基因組上的兩個(gè)非等位基因FW2A和/?/--共同編碼，oil是突變了的/?/--基因，是突變了的/?/--基因。這兩個(gè)基因的 突變引起酶結(jié)構(gòu)、酶活性或表達(dá)調(diào)控的變化，共同導(dǎo)致高油酸性狀的產(chǎn)生。
[0004]為了深入了解控制花生高油酸性狀的遺傳基礎(chǔ)，提高花生育種的選育效率，育種者針對(duì)一些高0/L比值的花生品種開發(fā)了 CAPS、Real-time PCR、AS-PCR(Allele-Specific PCR)等標(biāo)記方法，但這些方法僅限于特定類型的突變體，無法對(duì)豐富多樣的花生種質(zhì)進(jìn)行分析。本研究通過對(duì)不同花生品種(系)的4?/?/--基因進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，尋找與高油酸性狀關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)，為花生高油酸育種提供重要的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供方便快捷的花生高油酸性狀基因選擇方法，在苗期確定單株的油酸含量，同時(shí)結(jié)合綜合農(nóng)藝性狀選擇，來提高高油酸育種的成效。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下步驟:
提取不同花生品種(系)的葉片基因組，采用特異性引物從基因組中擴(kuò)增和基因。將特異擴(kuò)增條帶切膠回收后，進(jìn)行序列測(cè)定，得到基因的序列。對(duì)所獲得的序列進(jìn)行翻譯，比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，據(jù)此來判斷品種(系)油酸含量和油酸/亞油酸(0/L)比值的高低。[0007]具體來說，所述的方法如下:
(1)采用粗提法提取不同花生品種(系)的葉片基因組；
(2)采用特異性引物從基因組中擴(kuò)增mAhFAD2B基因。將特異擴(kuò)增條帶切膠回收后連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性克隆送往測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，即得到了基因的序列；
(3)對(duì)所獲得的序列 進(jìn)行翻譯，比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，據(jù)此來判斷品種(系)油酸含量和油酸/亞油酸(0/L)比值的高低。
優(yōu)選地，步驟(2 )所述的特異性引物為FAD2A-F/FAD2A-R和FAD2B-F/FAD2B-R，分別擴(kuò)增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 為 5’ -GATTACTGATTAITGACTT-3’，F(xiàn)AD2A-R為 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’ ;FAD2B_F 為 5’-CAGAACCATTAGCTTTG-3’ ， FAD2B-R 為5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’ 。
[0008]優(yōu)選地，步驟(2)所述的基因擴(kuò)增是通過PCR方法，擴(kuò)增所用的聚合酶為LATaq?DNA polymerase (TaKaRa)，在 25 ii L 體系中加入以下成分:2.5 uL IOX PCR buffer(含 MgCl2) ；2.5 u L IOmM dNTPs ；1 u L cDNA 模板；0.5 y L LA polymerase 和 17.5 y LddH20。PCR 反應(yīng)條件為:(a)94 °C，5min ；(b) 94 °C，30s ；58 °C，lmin40s ；72 °C，90s ；共30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化,純化產(chǎn)物連接pMD18_T Easy vector (Takara),轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性克隆送往測(cè)序公司(Sangon, Shanghai)測(cè)序。
[0009]優(yōu)選地，步驟(3)中測(cè)序得到的普通花生品種中4?/?/--基因長度為1228bp，AhFAD2B基因?yàn)?220bp，開放閱讀框均為1140bp，編碼379個(gè)氨基酸。通過比對(duì)不同品種(系)中獲得的AhFAD2A和AhFAD2B基因的核苷酸序列和氨基酸序列，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn),據(jù)此來判斷品種(系)油酸含量和油酸/亞油酸(0/L)比值的高低。
[0010]我們克隆了不同油酸含量的3152份花生的AhFAD2A和AhFAD2B基因，結(jié)合油酸含量和油酸/亞油酸(0/L)比值分析表明AhFAD2A基因存在G448A點(diǎn)突變和4?/?/--基因存在442A點(diǎn)插入的花生是超高油酸(70%以上)材料或品種，0/L值超過7.0。只存在點(diǎn)突變或點(diǎn)插入的花生是高油酸(49%以上)材料或品種，0/L值在1.5-7.0之間。因此，4?/?/--和AhFAD2B是高油酸性狀的標(biāo)記基因。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
對(duì)3個(gè)花生品種(系)花育30、魯花12和E 11，取花生新生葉I片(約IOmg),置于1.5mLEP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒將葉片迅速研磨成粉末；加入400 u L提取液(包含濃度200mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(PH8.0)，濃度 250mmol/L 的氯化鈉溶液，濃度 25mmol/L 的 EDTA溶液，濃度0.5%的SDS溶液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用。使用前加入濃度為1%的P -巰基乙醇溶液。)，震蕩混勻，靜置IOmin ;加入200 ii L 5mol/L的醋酸鉀溶液(pH5.0或不調(diào)pH)，震蕩混勻，靜置15min ;12000r/min轉(zhuǎn)速離心2min，取上清液400 y L移入另一個(gè)1.5mL EP管中，加入等體積異丙醇；輕輕混勻后于室溫下靜置2分鐘，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清液，沉淀再用75%酒精洗漆1-2次，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min ;在室溫下開蓋放置15min,加入10 y L蒸餾水，溶解沉淀，即得到花生葉片基因組粗提液。提取的基因組產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能看到明顯的基因組條帶，表明基因組提取成功。采用基因特異的引物 FAD2A-F/FAD2-R 和 FAD2B-F/FAD2-R 通過 PCR 方法分別擴(kuò)增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 為 5’ -GATTACTGATTATTGACTT-3’，F(xiàn)AD2B-F 為 5’ -CAGAACCATTAGCTTTG-3’，F(xiàn)AD2_R 為5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。擴(kuò)增所用的聚合酶為 LA Taq? DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 體系中加入以下成分:2.5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；I u L cDNA 模板；0.5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為:(a)94°C，5min ；(b)94°C,30s ；58°C, lmin40s ；72°C,90s ;共 30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18_TEasy vector (Takara),轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性克隆送往測(cè)序公司(Sangon,Shanghai)測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)品種(系)中，必/?/--和必/?/--皆不存在基因突變。必/?/--基因長度為1228bp，AW^iM9基因長度為1220bp，開放閱讀框均為1140bp，編碼379個(gè)氨基酸。這3個(gè)品種(系)花育30、魯花
12、E 11的籽仁油酸含量分別為45.5%, 44.1%, 43.5%，0/L比值分別為1.40，1.35，1.30。
實(shí)施例2
對(duì)3個(gè)花生品種花育19，花育23和魯花14，取花生新生葉I片(約10mg)，置于1.5mLEP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒將葉片迅速研磨成粉末；加入400 u L提取液(包含濃度200mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(PH8.0)，濃度 250mmol/L 的氯化鈉溶液，濃度 25mmol/L 的 EDTA溶液，濃度0.5%的SDS溶液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用。使用前加入濃度為1%的P -巰基乙醇溶液。)，震蕩混勻，靜置IOmin ;加入200ii L 5mol/L的醋酸鉀溶液(pH5.0或不調(diào)pH)，震蕩混勻，靜置15!^11;1200017^11轉(zhuǎn)速離心2111111，取上清液4001^移入另一個(gè)1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇；輕輕混勻后于室溫下靜置2分鐘，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清液，沉淀再用75%酒精洗漆1-2次，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min ;在室溫下開蓋放置15min,加入10 y L蒸餾水，溶解沉淀，即得到花生葉片基因組粗提液。提取的基因組產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能看到明顯的基因組條帶，表明基因組提取成功。采用基因特異的引物 FAD2A-F/FAD2-R 和 FAD2B-F/FAD2-R 通過 PCR 方法分別擴(kuò)增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 為 5’ -GATTACTGATTATTGACTT-3’，F(xiàn)AD2B_F 為 5’ -CAGAACCATTAGCTTTG-3’，F(xiàn)AD2_R 為5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。擴(kuò)增所用的聚合酶為 LA Taq? DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 體系中加入以下成分:2.5 u L 10X PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；I u L cDNA 模板；0.5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為:(a)94°C，5min ；(b)94°C,30s ；58°C, lmin40s ；72°C,90s ;共 30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18_TEasy vector (Takara),轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性克隆送往測(cè)序公司(Sangon,Shanghai)測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)品種中，4?/?/--沒有發(fā)生基因突變，基因長度為1220bp，開放閱讀框?yàn)?140bp，編碼379個(gè)氨基酸。而4?/?/--突變成為它的等位基因o77，基因開放讀碼框的第448bp處的堿基G突變?yōu)锳 (G448A)，導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸由天冬氨酸(D)突變?yōu)樘於０?N，D150N)，基因長度仍為1228bp，開放閱讀框?yàn)?140bp，編碼379個(gè)氨基酸。這3個(gè)品種花育19，花育23和魯花14的籽仁油酸含量分別為54.02%，49.3%, 51.0%，0/L比值分別為1.97，1.54，1.57。
[0012] 實(shí)施例3對(duì)3個(gè)花生品種(系)E18、花育32號(hào)和E16，取花生新生葉I片(約10mg)，置于1.5mLEP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒將葉片迅速研磨成粉末；加入400 u L提取液(包含濃度200mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(PH8.0)，濃度 250mmol/L 的氯化鈉溶液，濃度 25mmol/L 的 EDTA溶液，濃度0.5%的SDS溶液，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用。使用前加入濃度為1%的P -巰基乙醇溶液。)，震蕩混勻，靜置IOmin ;加入200 u L 5mol/L的醋酸鉀溶液(pH5.0或不調(diào)pH)，震蕩混勻，靜置15!^11;1200017^11轉(zhuǎn)速離心2111111，取上清液4001^移入另一個(gè)1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇；輕輕混勻后于室溫下靜置2分鐘，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清液，沉淀再用75%酒精洗漆1-2次，12000r/min轉(zhuǎn)速離心5min ;在室溫下開蓋放置15min,加入10 UL蒸餾水，溶解沉淀，即得到花生葉片基因組粗提液。提取的基因組產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能看到明顯的基因組條帶，表明基因組提取成功。采用基因特異的引物 FAD2A-F/FAD2-R 和 FAD2B-F/FAD2-R 通過 PCR 方法分別擴(kuò)增 AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因。FAD2A-F 為 5’ -GATTACTGATTATTGACTT-3’，F(xiàn)AD2B_F 為 5’ -CAGAACCATTAGCTTTG-3’，F(xiàn)AD2_R 為 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。擴(kuò)增所用的聚合酶為 LA Taq? DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 體系中加入以下成分:2.5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；I u L cDNA 模板；0.5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為:(a)94°C，5min ；(b)94°C,30s ；58°C, lmin40s ；72°C,90s ;共 30cycles ； (c) 72°C, IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18_TEasy vector (Takara),轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性克隆送往測(cè)序公司(Sangon,Shanghai)測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)品種中，AhFAD2A和必/?/--都發(fā)生基因突變。AhFAD2A基因開放讀碼框的第448bp處的堿基G突變?yōu)锳 (G448A)，導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸由天冬氨酸(D)突變?yōu)樘於０?N，D150N)，基因長度仍為1228bp，開放閱讀框?yàn)?140bp，編碼379個(gè)氨基酸。4?/?/--基因序列在起始密碼子后第442bp處有堿基A的插入，基因長度增長lbp，導(dǎo)致編碼區(qū)提前終止，編碼一個(gè)截短的蛋白(164個(gè)氨基酸)，丟失了一個(gè)膜結(jié)合蛋白保守的組氨酸框。這3個(gè)品種(系)E18、花育32號(hào)和E16的籽仁油酸含量分別為83.7%, 77.8%, 73.21%，0/L比值分別為41.85，12.3,7.0。
【權(quán)利要求】
1. 一種花生高油酸性狀基因選擇方法，包括以下步驟: (1)采用粗提法提取不同花生品種(系)的葉片基因組； (2)采用特異性引物從基因組中擴(kuò)增必/?/--和必/?/--基因； 將特異擴(kuò)增條帶切膠回收后連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性克隆送往測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，即得到了基因的序列； (3)對(duì)所獲得的序列進(jìn)行翻譯，比對(duì)分析，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，據(jù)此來判斷品種(系)油酸含量和油酸/亞油酸(0/L)比值的高低.卿2A基因存在G448A點(diǎn)突變和/?/--基因存在442A點(diǎn)插入的花生是超高油酸(70%以上)材料或品種，0/L值超過7.0;只存在點(diǎn)突變或點(diǎn)插入的花生是高油酸(49%以上)材料或品種，0/L值在1.5-7.0之間，不存在點(diǎn)突變或點(diǎn)插入的花生是普通花生，油酸含量在49%以下，0/L值小于1.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生高油酸性狀基因選擇方法，其特征在于，步驟(2)所述的特異性引物為FAD2A-F/FAD2A-R和FAD2B-F/FAD2B-R，分別擴(kuò)增4?/?/--和基因；
FAD2A-F 為 5’-GATTACTGATTATTGACTT-3’ ， FAD2A-R 為 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’ ；FAD2B-F 為 5’-CAGAACCATTAGCTTTG-3’，F(xiàn)AD2B-R 為 5’-CTCTGACTATGCATCAG-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生高油酸性狀基因選擇方法，其特征在于，步驟(2)所述的基因擴(kuò)增是通過PCR方法，擴(kuò)增所用的聚合酶為LA Taq?DNA polymerase (TaKaRa)，在25 ii L 體系中加入以下成分:2.5 u L IOX PCR buffer (含 MgCl2);2.5 u L IOmM dNTPs ；IuL cDNA 模板；()? 5 u L LA polymerase 和 17.5 u L ddH20 ； PCR 反應(yīng)條件為:(a) 94 °C, 5min ；(b)94 °C，30s ；58 °C，lmin40s ；72 °C，90s ；共30cycles ； (c) 72°C, IOmin ； PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒(Axygen)進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18_T Easy vector (Takara),轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞后,篩選陽性克隆送往測(cè)序公司(Sangon, Shanghai)測(cè)序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生高油酸性狀基因選擇方法，其特征在于，步驟(3)中測(cè)序得到的普通花生品種中必/?/--基因長度為1228bp，必/?/--基因?yàn)?220bp，開放閱讀框均為1140bp，編碼379個(gè)氨基酸，通過比對(duì)不同品種(系)中獲得的4?/?/-- MAhFAD2B基因的核苷酸序列和氨基酸序列，查找點(diǎn)突變或插入位點(diǎn)，據(jù)此來判斷品種(系)油酸含量和油酸/亞油酸(0/L)比值的高低。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103525931SQ201310482957
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】禹山林, 遲曉元, 楊慶利, 陳娜, 潘麗娟, 陳明娜, 王通, 王冕, 楊珍 申請(qǐng)人:山東省花生研究所