一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法，組合物和試劑盒。核酸檢測(cè)系統(tǒng)利用加上pyrophosphorylation磷酸核糖焦磷酸合成酶催化產(chǎn)生無論是三磷酸脫氧核糖核苷或核糖核苷三磷酸的各種聚合酶或核酸酶消化催化焦磷酸解反應(yīng)。dNTPs濃度轉(zhuǎn)化為ATP的核苷二磷酸激酶的作用。這些反應(yīng)產(chǎn)生的ATP可被檢測(cè)到的熒光素酶或NADH的檢測(cè)系統(tǒng)。如果需要更靈敏的檢測(cè)，NTPs和dNTPs濃度的擴(kuò)增方案中所提供的。樣品中的細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)的檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，AMP和磷酸供體的高能量被轉(zhuǎn)換為內(nèi)源酶的作用，隨后檢測(cè)的ATP的ATP加入到樣品。
【專利說明】一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法
[0001]發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法。
[0002]發(fā)明背景
目前的準(zhǔn)則規(guī)定，存在于重組治療性蛋白質(zhì)的核酸量小于10 Pg的每日劑量的重組蛋白的DNA。因此，用于檢測(cè)核酸的量極低的方法是必要的。這種方法也將得到廣泛的使用，法醫(yī)樣品中的DNA的定量。已經(jīng)描述的核酸檢測(cè)的低水平的幾種方法。第一種方法是基于經(jīng)典的雜交技術(shù)。此方法利用放射性標(biāo)記的核酸探針結(jié)合到感興趣的DNA。然而，這種方法有幾個(gè)缺點(diǎn)，包括再現(xiàn)性差，產(chǎn)生大量廢試劑，引起的非特異性結(jié)合的高背景水平。此夕卜，這種技術(shù)用于確定低量的未知序列的DNA的存在通常是不適當(dāng)?shù)臋z測(cè)核酸的第二種方法利用能夠插入到核酸的熒光染料。然而，如清潔劑，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的許多干擾物質(zhì)影響通過該方法產(chǎn)生的信號(hào)的再現(xiàn)性，利用生物素化的檢測(cè)的DNA的水平低的第三種方法的單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)，鏈霉抗生物素蛋白，抗稠合到脲酶DNA抗體，以及作為試劑的生物素化的硝化纖維素。此法是市售Kung等分子器件和描述，皮克總DNA定量使用SNA-結(jié)合蛋白在硅基于傳感器的系統(tǒng)，肛交。生物化學(xué)。187:220-27 (1990)。該試劑盒的操作，允許將要形成一個(gè)復(fù)雜的的鏈霉抗生物素蛋白，生物素，SSB,抗DNA抗體一起孵育。然后將復(fù)合體上的生物素化的過濾器捕獲，洗滌，讀取捕獲的脲酶的量。此方法是高度敏感的，但是有幾個(gè)缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)包括昂貴的試劑和廣泛的控制的需要。第四種方法包括解聚或降解核酸和檢測(cè)由熒光素酶的ATP。多核苷酸聚合酶的核酸在細(xì)胞中的合成負(fù)責(zé)。這些酶也能夠德意志和Kornberg,脫氧核糖核酸酶催化合成,生物化學(xué)雜志中所描述的催化其它反應(yīng)。化學(xué)244 (11):3019-28 (1969)。很多，但不是全部，聚合酶能夠解聚磷酸鹽或焦磷酸鹽存在下，無論是在核酸的美國專利。第4735897號(hào)描述了一種方法，檢測(cè)的多聚腺苷酸化，信使RNA (聚(A) -mRNA的)。解聚的聚(A) -mRNA的磷酸鹽的存在已被證實(shí)會(huì)導(dǎo)致在形成ADP，它可以被轉(zhuǎn)換為ATP由丙酮酸激酶或肌酸磷酸激酶。RNA也可通過核糖核酸酶消化AMP,腺苷酸激酶轉(zhuǎn)化為ADP，然后轉(zhuǎn)換為ATP的丙酮酸激酶的ATP這樣生產(chǎn)的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。在ATP和02的存在下，熒光素酶催化熒光素的氧化作用，產(chǎn)生光，然后可以使用光度計(jì)定量。其他反應(yīng)的副產(chǎn)物是AMP的磷酸鹽，焦磷酸鹽和氧合蟲熒光素，ATP的產(chǎn)生在所有的生物體中的酶的存在下，也允許使用熒光素酶系統(tǒng)的，用于檢測(cè)污染細(xì)胞的存在或量的樣品中，如描述在美國專利。第5648232號(hào)。例如，可能會(huì)增加ADP懷疑含有污染細(xì)胞的樣品。轉(zhuǎn)換的ADP轉(zhuǎn)化為ATP酶的細(xì)胞的熒光素酶測(cè)定法檢測(cè)，如上所述。這種方法的缺點(diǎn)是相對(duì)不穩(wěn)定的ADP襯底，這是本領(lǐng)域需要的是可靠的，成本效益的方法，核酸，細(xì)胞，細(xì)胞物質(zhì)在多種類型的樣品的檢測(cè)非常低的水平。本發(fā)明公開了新穎的方法，用于檢測(cè)的DNA，RNA和細(xì)胞數(shù)量低。這些方法利用焦磷酸或核酸酶降解的新穎的組合，轉(zhuǎn)換為ATP的dNTPs，直接向ΑΤΡ,ΑΜΡ的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增的ATP敏感性增加，寡核苷酸探針的解聚，和優(yōu)化的反應(yīng)條件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]核酸和多孔材料與ATP的檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)的極低量的方法和組合物進(jìn)行了描述。背景生產(chǎn)大量的重組蛋白質(zhì)的方法是眾所周知的。重組蛋白行業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種質(zhì)量控制檢測(cè)的需要。一個(gè)例子是需要重組蛋白抽提物中存在的核酸的定量分析。
[0004]甲需要由重組方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制檢測(cè)。目前的指引建議，重組蛋白制劑應(yīng)含有小于10微微克的核酸。也有必要可以定量取證樣品中核酸的非常低的水平。因此，它是本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)低量的核酸和低數(shù)量的細(xì)胞或細(xì)胞物質(zhì)的方法。這也是本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于檢測(cè)核酸和檢測(cè)核酸的試劑盒組合物，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供一種方法，用于檢測(cè)和/或在一個(gè)反應(yīng)體系中磷酸鹽測(cè)定脫氧核糖核酸腺苷5’ - 二磷酸,或它們的組合。該方法包括的核酸酶裂解的終端internucleoside的磷酸二酯鍵和重整與焦磷酸鹽分子相同，根據(jù)下列反應(yīng)，以形成脫氧核糖核苷三磷酸分子在末端核苷酸:選自下組的DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶催化的解聚T4聚合酶，Taq DNA聚合酶，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶組成的。解聚工序中的定量測(cè)定核酸，重復(fù)基本上完成或均衡，取得至少兩個(gè)從最小3個(gè)核苷酸的鏈的核苷三磷酸分子。檢測(cè)DNA，無需重復(fù)解聚步驟，如果有足夠的核酸分子，本以產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。下一步涉及酶促脫氧核糖核苷三磷酸分子5’端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成腺苷_5’ -三磷酸腺苷-5’ - 二磷酸分子根據(jù)下面的反應(yīng):核苷二磷酸激酶的催化式中，P *是終端5 ’磷酸轉(zhuǎn)移。最后的步驟是檢測(cè)的ATP，通過熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或NADH的檢測(cè)系統(tǒng)。的解聚步驟和磷酸轉(zhuǎn)移步驟可任選地在一個(gè)單一的一鍋反應(yīng)進(jìn)行。如果需要更高的靈敏度，所產(chǎn)生的磷酸轉(zhuǎn)移步驟或解聚步驟中生產(chǎn)的國家結(jié)核病ATP分子可能被放大，以形成多個(gè)ATP分子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種方法，用于檢測(cè)多聚腺苷酸化的mRNA含有焦磷酸的反應(yīng)。第一解聚在一個(gè)末端核苷酸的多聚腺苷酸化的mRNA的酶裂解終端internucleoside的磷酸二酯鍵和重整與焦磷酸鹽分子相同，根據(jù)下列反應(yīng)，形成游離的ATP分子:聚(A)聚合酶催化。解聚工序中的RNA的定量測(cè)定，重復(fù)基本上完成或均衡，取得至少兩個(gè)從最小3個(gè)核苷酸的鏈的核苷三磷酸分子。檢測(cè)DNA，無需重復(fù)解聚步驟，如果有足夠的核酸分子，本以產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。然后，如此形成的ATP分子的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或NADH檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。反應(yīng)的靈敏度可以增加在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供一種方法，用于有選擇地檢測(cè)和/或測(cè)定聚(A) mRNA在一個(gè)反應(yīng)體系中，焦磷酸，腺苷5’-二磷酸任選放大ATP分子?；蛩鼈兊慕M合。在該方法中，互補(bǔ)的寡聚(dT)探針的poly(A)mRNA的雜交，形成RNA-DNA雜合體。然后解聚酶裂解終端internucleotide的磷酸二酯鍵和重整與焦磷酸分子以形成脫氧胸苷_5’ -三磷酸的末端核苷酸的寡聚(dT)鏈的 RNA-DNA 雜合體。根據(jù)下面的反應(yīng):TT.sub.n + PP.sub.1.fwdarw.TT.sub.n-1 +dTTP的利用逆轉(zhuǎn)錄酶催化。解聚工序中的定量測(cè)定核酸，重復(fù)基本上完成或均衡，取得至少兩個(gè)從最小3個(gè)核苷酸的鏈的核苷三磷酸分子。檢測(cè)DNA，無需重復(fù)解聚步驟，如果有足夠的核酸分子，本以產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。接著，從脫氧胸苷-5’-三磷酸酶的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到腺苷5’-二磷酸分子形成ATP分子，根據(jù)下面的反應(yīng):，其中P * 5’端磷酸轉(zhuǎn)移催化NDPK。最后，如此形成的ATP的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或NADH檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)。如果所需的敏感性增力口，的末端磷酸dTTP的可能被轉(zhuǎn)移到ADP形成ATP上述后跟的擴(kuò)增所產(chǎn)生的ATP。
[0005]具體實(shí)施方法:
在本發(fā)明的實(shí)施中，提供一種方法，在一個(gè)反應(yīng)體系中，檢測(cè)DNA磷酸核糖焦磷酸，腺苷5’ - 二磷酸，或它們的組合。在該方法中，免費(fèi)的脫氧核糖核苷單磷酸分子的核酸通過核酸酶消化產(chǎn)生。然后，焦磷酸基酶從磷酸核糖焦磷酸分子轉(zhuǎn)移到脫氧腺苷單磷酸分子以形成脫氧腺苷三磷酸分子根據(jù)下面的反應(yīng):磷酸核糖焦磷酸合成酶催化的。接著，從脫氧腺苷三磷酸分子的5’端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶，腺苷5’ - 二磷酸分子，根據(jù)下面的反應(yīng)形成ATP分子的dATP * + ADP.fwdarw.dADP + ATP催化由NDPK其中P *終端5’磷酸轉(zhuǎn)移。如此產(chǎn)生的ATP可被檢測(cè)到的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或NADH檢測(cè)系統(tǒng)。如果需要，也可以進(jìn)行焦磷酸轉(zhuǎn)移步驟和磷酸轉(zhuǎn)移步驟在一個(gè)單一的反應(yīng)鍋內(nèi)。如果增加的敏感性是必要的，ATP分子可能被放大，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供了一種方法，檢測(cè)的RNA，在反應(yīng)體系中，磷酸核糖焦磷酸。免核糖核苷單磷酸分子是由具有核酸酶消化的RNA。接著，從磷酸核糖焦磷酸分子的焦磷酸分子酶轉(zhuǎn)移磷酸腺苷分子，根據(jù)下面的反應(yīng)形成三磷酸腺苷分子:磷酸核糖焦磷酸合成酶催化的。如此產(chǎn)生的ATP，然后檢測(cè)由熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或NADH檢測(cè)系統(tǒng)。如果增加的敏感性是必要的，這樣生產(chǎn)的ATP可以被放大，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供了一種方法，用于確定細(xì)胞和細(xì)胞物質(zhì)存在于樣品中的存在和/或量。在該方法中，單元格的內(nèi)容被釋放以形成細(xì)胞裂解物。磷酸供體分子和腺苷_5’ -單磷酸分子，然后加入細(xì)胞裂解物中，根據(jù)下列反應(yīng)，使腺苷5’ - 二磷酸分子是由來自供體的腺苷_5’ -單磷酸酶的磷酸基轉(zhuǎn)移:存在于細(xì)胞裂解物中的內(nèi)源酶催化的。然后，所產(chǎn)生的酶的磷酸鹽轉(zhuǎn)移從供體分子，按照下列反應(yīng):本細(xì)胞裂解物樣品中的內(nèi)源酶催化腺苷5’-二磷酸分子ATP。如此產(chǎn)生的腺苷5’ -三磷酸，然后由一個(gè)熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)或NADH檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。在此實(shí)施例中的磷酸供體，可以是任一脫氧胞苷-5’ -三磷酸，5’ -三deoxyguanidine,或脫氧胸苷_5’ -三磷酸，本發(fā)明還提供一種組合物的制造從DNA，焦磷酸腺苷-5’-三磷酸的物質(zhì)，并腺苷5’-二磷酸。此組合物包括核苷二磷酸激酶，在足夠的濃度，催化產(chǎn)生ATP從DNA在約皮克微克量的DNA中所提供的核酸聚合酶的混合物，本發(fā)明，還提供了一種用于制備組合物的物質(zhì)。從DNA，磷酸核糖焦磷酸，5’ - 二磷酸腺苷三磷酸腺苷。此組合物含有足夠的濃度，催化產(chǎn)生三磷酸腺苷，從約皮克微克量的DNA中的磷酸核糖焦磷酸合成酶和核苷二磷酸激酶的混合物，本發(fā)明提供了各種用于核酸檢測(cè)的試劑盒。首先，提供了藥盒，其中包含用于檢測(cè)DNA的焦磷酸的試劑。該試劑盒包含一個(gè)容器中的核酸聚合酶和容器中的核苷二磷酸激酶。也可以設(shè)置在相同的容器中的核酸聚合酶和核苷二磷酸激酶。第二，提供了藥盒，其中包含的核酸檢測(cè)的試劑，通過核酸酶消化。該套件包含一個(gè)容器，含磷酸核糖焦磷酸合成酶和核酸酶的容器中。第三，提供了藥盒，其中包含通過焦磷酸水解RNA的檢測(cè)試劑。該套件包含的容器中的poly (A)聚合酶。第四，提供的試劑盒，包含用于檢測(cè)DNA的核酸酶消化的試劑。此套件包含磷酸核糖焦磷酸合成酶的容器中核苷二磷酸果糖激酶的容器中。的磷酸核糖焦磷酸合成酶和二磷酸核苷激酶可任選地被設(shè)置在同一個(gè)容器中，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例還提供了一種試劑盒中含有的試劑的細(xì)胞和/或細(xì)胞樣品中的材料的檢測(cè)。該試劑盒包含一個(gè)容器中腺苷5’ -單磷酸和一個(gè)容器中的高能量可能不被利用熒光素酶的磷酸供體，本發(fā)明還提供了一種在一個(gè)反應(yīng)體系中，腺苷-5’-單磷酸核苷三磷酸分子擴(kuò)增分子，高能量的磷酸供體分子，或它們的組合。在該方法中，5’端磷酸基團(tuán)從三磷酸核苷存在于樣品中的分子(XTP)酶腺苷-5’ -單磷酸分子加入到樣品中，以形成腺苷5’ - 二磷酸分子和核苷二磷酸分子轉(zhuǎn)移到(XTP，無論是核糖核苷或脫氧核糖核苷三磷酸)，按照下列反應(yīng):由第一酶可以是單磷酸核苷激酶或腺苷酸激酶催化。接著，從高能磷酸供體分子可能不被利用的第一個(gè)酶，磷酸酶轉(zhuǎn)移到腺苷5’-二磷酸分子，根據(jù)到以下反應(yīng):ADP + DP.fwdarw“的形成腺苷-5’-三磷酸分子ATP + D核苷二磷酸激酶和丙酮酸激酶催化。然后，這兩個(gè)步驟重復(fù)進(jìn)行，直到達(dá)到理想水平的擴(kuò)增。高能量磷酸供體可以是dCTP或AMP-CPP NDPK,和PEP丙酮酸激酶，本發(fā)明還提供了一種方法，用于檢測(cè)在一個(gè)反應(yīng)體系中，焦磷酸，腺苷5’-單磷酸脫氧核糖核酸或核糖核酸，和高能量磷酸供體，或它們的組合，在一個(gè)單一的反應(yīng)鍋內(nèi)。首先，核酸酶裂解終端internucleotide的磷酸二酯鍵與焦磷酸分子形成游離核糖核苷或脫氧核苷三磷酸分子(XTP) (XTP)根據(jù)反應(yīng)1:聚合酶催化的解聚在一個(gè)末端核苷酸。解聚步驟重復(fù)取得的至少兩個(gè)核苷三磷酸分子。核糖核苷三磷酸分子或脫氧核糖核苷三磷酸分子，然后擴(kuò)增酶，腺苷_5’ -單磷酸腺苷5’ - 二磷酸分子和核苷5反應(yīng)I中形成的核苷三磷酸分子5’端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移-二磷酸分子(XDP)根據(jù)第一酶:下，高能量磷酸供體分子，這是不是第一種酶的底物的磷酸基團(tuán)從2催化反應(yīng)，酶腺苷-5’ - 二磷酸的分子轉(zhuǎn)移到中產(chǎn)生的反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)3第二種酶催化的兩個(gè)放大的步驟被重復(fù)直到達(dá)到理想水平的擴(kuò)增產(chǎn)生腺苷-5’-三磷酸分子。在該方法中的酶I可能是腺苷酸激酶或核苷單磷酸激酶酶2，而可以是丙酮酸激酶或二磷酸nuceloside激酶優(yōu)選實(shí)施例的描述本發(fā)明提供了一種方法，用于檢測(cè)非常低的水平，包括各種核酸脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的生物樣品中，特別是重組蛋白的樣品。的極端敏感性，重現(xiàn)性，易于進(jìn)行的反應(yīng)，進(jìn)行反應(yīng)的速度表示當(dāng)前正在使用的低電平檢測(cè)核酸的方法。
【權(quán)利要求】
1.一種脫氧核糖核酸酶催化合成方法，該方法包括:釋放單元格的內(nèi)容，以形成細(xì)胞裂解物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽供體是選自脫氧胞苷_5’-三磷酸，deoxyguanidine 5’三磷酸脫氧胸苷5’三磷酸組成的組中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，一種組合物，用于生產(chǎn)腺苷_5’-三磷酸的DNA磷酸鹽，焦磷酸鹽，腺苷5’ -二磷酸的混合物的組合物，該組合物包括:核苷二磷酸激酶；提供足夠濃度的核酸聚合酶，核苷二磷酸激酶，核酸聚合酶催化從DNA的三磷酸腺苷的生產(chǎn)在大約皮克微克量的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸核糖焦磷酸和腺苷5’- 二磷酸的混合物的組合物，該組合物包括:用于產(chǎn)生三磷酸腺苷一個(gè)磷酸核糖焦磷酸合成酶。
5.核苷二磷酸激酶，磷酸核糖焦磷酸合成酶，在足夠的濃度，催化產(chǎn)生的三磷酸腺苷，從約皮克微克量的DNA的核苷二磷酸激酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生三磷酸腺苷分子的多個(gè)由核苷三磷酸分子中的反應(yīng)體系中，腺苷_5’ -單磷酸分子，高能量的磷酸供體分子，或它們的組合方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一酶是選自選自核苷單磷酸激酶，腺苷酸激酶。
【文檔編號(hào)】C12Q1/44GK104513850SQ201310454553
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】王阿慧 申請(qǐng)人:上海滿益科技有限公司